Name: 쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 학습하세요 쥐 뇌에서 로커스 코에룰레우스를 정확히 지역화하는 방법을. 면역조직화학법과 금속 이미징을 활용하여 신경계 질환 연구에 필수적인 분자 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

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우리는 마우스 식민지의 유지 보수에 대 한 Abigael Muchenditsi 감사합니다. 아르곤 국립 연구소에서 고급 광자 소스를 사용 하 여 미국 에너지 부, 과학의 사무실, 사무실의 기본적인 에너지 과학, 계약 번호 아래에 의해 지원 되었다: 드-AC02-06CH11357. 우리 감사 올가 Antipova와 박사 스테판 Vogt 사용자 지원 및 고급 광자 소스에서 지원. 이 작품은 SL에 건강의 국가 학회 교부 금 2R01GM101502에 의해 투자 되었다.

동물의 연구는 존스 홉킨스 대학 동물 관리 및 사용 (ACUC) 프로토콜 번호 M017M385에 의해 승인 되었다.
1. 두뇌 슬라이스
<ol><li>고정, 3 %isoflurane의 응용 프로그램에서 마우스를 anesthetize.<ol>
<li>15 mL microcentrifuge 튜브에와 isoflurane 방울과 면봉을 담근 다. 튜브에 동물의 코를 놓고는 isoflurane 흡입을 합니다. 발가락-핀치에 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이를 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그것의 뒤에 동물을 놓고 그것의 복 부에 액세스 하는 동안 T 핀 그것의 사지를 고정 하 여 고정 합니다.</li>
	<li>복 부 피부에서 캡처 하 여 동물 수술가 위로 잘라 고 가슴 지역에 피부를 통해 잘라. T 핀을 사용 하 여 피부를 고정 합니다. 다음에 가슴까지 복 막 휴식. 심장 격 막 흉 강을 크래킹 하 여 노출 합니다.</li>
	<li>동물에서 흐르는 혈액을 있도록 오른쪽 아 트리 움 잘라. 좌 심 실에 25 게이지 바늘 10 mL 주사기를 삽입 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 10 mL와 함께 perfuse. 참고:이 솔루션 전신 순환 및 출구를 통해 흐름을 수 있습니다 통해 오른쪽 아 트리 움.</li>
	<li>10 mL 주사기를 제거 하 고 60 mL 주사기에 부착 된 25 게이지 바늘을 삽입. 얼음 차가운 4 %paraformaldehyde (PFA)의 50 mL와 좌 심 실을 통해 perfuse.<ol>
<li>H2O 10 %PFA 솔루션을 희석 하 고 놀 아 요 4 ° c.에 마지막 4 %PFA 솔루션으로 얼음 찬 4 %PFA 솔루션을 준비</li>
	</ol>
</li>
	<li>마우스의 머리를 분리 하 고 두개골에서 뇌를 제거.<ol>
<li>목에서 피부를 잘라내어 다음 두개골 노출 눈 쪽으로 잘라. 코, 목에서 그리고 다른 한 안구에서 두개골 균열. 두개골 밖으로 껍질 그리고 전체 두뇌를 삭제할.</li>
	</ol>
</li>
	<li>4%에서 뇌를 품 어 PFA 4 ° c.에 24 h에 대 한</li>
	<li>가득한 30% 자당 해결책의 25 mL 50 mL 원뿔 튜브에 집게와 두뇌를 전송. 뇌 관의 바닥에 싱크 될 때까지 48-72 h 4 ° C에서 그것을 유지.</li>
	<li>잘라 성인 마우스 뇌 슬라이서와 뇌 midbrain (bregma의 후부 ~ 3 m m)를 통해 매트릭스 화관. 포함 하는 brainstem 뇌 섹션을 유지 합니다. 참고:이 두 개의 뇌 섹션-피 질 (컷의 앞쪽)의 brainstem/소 뇌 (컷의 후부) 포함 한 포함 대부분 발생 합니다. Brainstem 섹션을 사용 하 여 다음 단계에 대 한.</li>
	<li>(10 월); 최적의 절삭 온도 화합물에 의해 포위, 포함 금형의 하단에 배치 잘라 표면 brainstem 섹션 포함 -80 ° C 냉동 고에 포함 된 뇌를 이동 하 고 더 사용까지 적어도 12 h-동결.</li>
	<li>cryostat에서: 장소 cryostat;로 10 월에 뇌를 포함 된 금형 포함 cryostat는 cryostat의 두뇌 블록의 온도 조정 하는 몇 시간 동안에 그것을 품 어.</li>
	<li>껍질 멀리 두뇌를 포함 하는 10 월 블록 노출 포함 형.</li>
	<li>면도날을 사용 하 여 뇌를 건드리지 않고 10 월의 초과 블록의 표면에서 제거.</li>
	<li>10 월 블록 앞쪽 뇌의 절단된 표면 노출 cryostat의 척에 탑재 합니다.</li>
	<li>그것은 cryostat의 razorblades 동시에 지향은 뇌의 절단된 표면을 조정 합니다.</li>
	<li>100 µ m 섹션 rostrally 절단 정도에서 시작 하는 뇌를 잘라 주세요.</li>
	<li>소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 잘라 때까지 rostrally를 잘라 주세요. 50 µ m 두께에서 조각을 수집 시작 합니다. 참고: 하나의 모 수에서 rostrally 트림로 brainstem 및 소 뇌 것입니다 잘라 두 개의 별도 섹션으로. Rostral 단원의 brainstem 및 소 뇌 결국 병합 됩니다 4번째 심 실 수준에서. 일단 4번째 심 실의 측면 가장자리 제대로 구성 된 다음 소 뇌 및 brainstem 하나의 연속 조각으로 나올 것 이다.<ol>
<li>집게와 함께 10 월 포위 뇌 조각을 수집 하 고 PBS (그림 2a)으로 가득 24-잘 접시의 우물에. LC는 소 뇌와 열 등 한 colliculus ~-5.52 mm bregma (그림 1b)의 후부에 서로 만날 때 가장 눈에 띄는 될 것입니다. 참고: LC의 가장 앞쪽 부분에는 소 뇌 완전히 구분 하 고 더 이상 열 등 colliculus ~-5.34 mm bregma (그림 1c)의 후부에 주변 사라질 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunohistochemistry 도파민 β-Hydroxylase 또는 티로신 Hydroxylase (그림 2)에 대 한
<ol><li>주 1<ol>
<li>PBS에서 5 분에 대 한 세 번 선택 된 분할 영역을 씻어.</li>
		<li>0.5% 버퍼링 인산 염 세제 (PBSD) 4 ° c.에 24 h permeabilize<ol>
<li>125 µ L 세제 25 mL PBS의에서 희석.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>주 2<ol>
<li>0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.</li>
		<li>0.5%에서 1: 500의 희석에서 1 차적인 항 체, 안티 DBH 또는 안티-일 18 h 조에 대 한 추가 4 ° c.에 PBSD</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 일<ol>
<li>0.5%에서 3 시간 10 분 대 한 슬라이스를 씻어 PBSD.</li>
		<li>0.5%에서 1:1000의 희석에 원하는 이차 항 체 (488 당나귀 방지를 위한 토끼 녹색 형광) 추가 16 h에 대 한 PBSD.</li>
		<li>알루미늄에 4 ° c.에서 24 잘 접시 포장</li>
		<li>0.5%에서 5 분에 대 한 세 번 조각 씻어 PBSD.</li>
		<li>PBS에서 5 분 동안 세척.</li>
		<li>물 컨테이너에 연필 브러시와 분할 영역을 전송 합니다.</li>
		<li>탑재 된 슬라이드에 물에 떠 있는 조각.</li>
		<li>(없이 DAPI) hard-set 설치 미디어 Coverslip 섹션입니다.</li>
		<li>건조 실 온에서 30 분 동안 탑재 뇌 섹션.</li>
		<li>설정을 적절 한 이차 항 체 fluorophore 파장에서 신호를 검출 하는 confocal 또는 형광 현미경에서 이미지 뇌 조각.</li>
		<li>뇌 조각의 초점면에 현미경을 조정 하 고 단일 이미지를 10 배 확대에 걸릴.</li>
		<li>찾으려면 가능한 LC 지역 두뇌 조각에서 사용 하십시오 4번째 심 실 방향; 소 뇌는 심 실 위에 위치 하 고 있으며, 폰 스 및 brainstem는30아래 발견 된다.</li>
		<li>LC를 찾으려면 4번째 심 실;의 측면 가장자리에 초점 4번째 심 실과 폰으로 포인트의 가장자리에서 유래 하는 LC / brainstem 지역 (그림 2b, 2c).</li>
		<li>다음 이미징 및 특정 뇌 조각에 LC의 지역화 뇌 조각 4 ° c.에 포함 된 슬라이드 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 뇌 조각에 LC의 탐지
<ol><li>그림 2a와 같이 LC를 포함 하는 뇌 섹션, 찾아서, 위에서 설명한 대로 쥐의 뇌를 슬라이스 PBS에 섹션을 수집 24 잘 요리를 가득.<ol>
<li>LC의 적절 한 지역화 있도록 잘 당 하나 뇌 섹션을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뇌 당 immunostained 것 48 뇌 조각의 총을 수집 합니다. 참고: 그림 2a 에 표시 된 두 개의 요리의 모든 우물 한 동물에서 뇌 조각 포함 됩니다.</li>
	<li>Immunostain DBH, 또는 목에 대 한 모든 제 3 5 조각 가급적, 수행 분석은 그에 인접 한 그 뇌 조각의 immunohistochemistry (x 선 형광 현미경 검사 법, XFM)를 통해 추가. 참고:이 절차는 최종 분석 결과 조각에 LC의 정확한 지 방화에 대 한 수 있습니다 (그림 2a; 우물 사이의 숫자와 함께 표시).</li>
	<li>LC, 또는 그냥 거친 근사치의 가장자리와 센터의 정확한 위치를 필요로 하는 그들이 든 예를 들어, 응용 프로그램에 따라 immunostained는 뇌 조각 수를 조정 합니다.</li>
	<li>Immunohistochemistry, 다음 4번째 심 실 (그림 2b, 2c)의 양쪽에 식의 독특한 패턴을 통해 LC를 포함 하는 뇌 조각 검색. 그림 2d, 2e; 연속 뇌 조각의 lc DBH 신호의 확대 표시 됩니다. 일에 표시 스테인드 LC의 확대 이미지 그림 2f.
</li>
	<li>사용 하 여 섹션 추가 연구-그 포함 LC에 인접 한이 경우에 XFM에 대 한 계량 금속 수준 (그림 3).</li>
	<li>XFM 수행, 고분자 박막은 샘플 보유자에 장착 하 여 수는 싱크 로트 론에서 몇 군데에 10-30 µ m (설치)에 따라 얇은 코로나 두뇌 분할 영역을 수집 합니다.</li>
	<li>실 온에서 XFM에 대 한 고분자 박막에 준비는 하 고 XFM 수행 두뇌 분할 영역을 저장 합니다.</li>
</ol>4. 금속 이미징 XFM 통해 lc
<ol><li>위에서 설명한 예제 마우스 뇌를 슬라이스 하 고 결정 LC, LC를 포함 하는 이러한 뇌 조각에서 XFM 통해 금속 수준을 측정.</li>
	<li>이미지 beamline 2 ID-전자에는 고급 광자 소스 (아르곤 국립 연구소, 아르곤 IL)에서 원소 배포판.</li>
	<li>'비행'에 데이터 기록31위에서 설명한 대로.</li>
	<li>LC 프로그램 지도32,33를 사용 하 여 포함 된 뇌 조각에 원소 농도 결정 합니다.</li>
</ol>

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없음입니다.

제대로 방향을 표본이이 프로토콜의 중요 한 단계입니다. 우리를 사용 하는 뇌의 등 쪽 표면에의 해 부 기능 LC (소 뇌와 열 등 한 colliculus 사이 경계)를 찾을 수 있기 때문에 섹션 제대로 정렬 될 중요 하다. 이 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스로 뇌를 제대로 설정에 주의 해야 합니다. 앞쪽 및 후부 LC 핵 누락을 피하기 위해 더 많은 조직 ~ 500 μ m을 절단 하는 것이 좋습니다. 가장 일반적인 실수는 LC를 완전히 실종 귀착되는 너무 몇 가지 섹션을 잘라 것 이다. 따라서, 하나의 처음으로이 프로토콜에 따라, 필요한 것 보다 더 많은 부분을 절단 것이 좋습니다. 얼룩이 지기 전에 뇌 아틀라스 이미지의 주의 깊은 학문은 매우 유용 합니다. Brainstem의 외관 변경 모든 몇 백 미크론 분명 하 고, 몇 가지 경험, 그것은 섹션 가치가 단순히 거시적인 외관에 의해 얼룩이 지는 알 수 있습니다.
LC를 지역화 하는 과정에 따라 얼마나 잘 뇌 지향적인 단면 동안 신...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

로커 스 coeruleus (LC) brainstem에 노르 (NE) 생산1의 주요 사이트는 중요 한 지역 이다. LC 피 질, 해 마와 소 뇌3 뇌2 에 걸쳐 예측을 전송 하 고 circadian 리듬4,5, 주 및 메모리6를 포함 하 여 주요 생리 적 프로세스 조절 7,8, 인지 과정 및 감정9,10스트레스. LC의 부전 신경 정신병 무질서11, 파 킨 슨 병12,13,14, Alzheimer 질병14, 우울증15 포함 하 여 연루 되어 ,,1617, 양극성 질환18,19및 불안20,,2122,23, 24. 이러한 역할을 감안할 때, LC의 분석은 그것의 기능과 역 기능을 공부 하 고 중요 한.
생쥐는 생리 및 pathophysiologic 프로세스의 연구에 널리 사용 됩니다. 그들의 작은 크기로 인해 마우스 액정 구조를 찾는데 어려움을 선도 하는 ~ 300 μ m의 평균 직경이 있다. 뇌 단면, 동안 LC 코로나 또는 화살 섹션에서 쉽게 놓칠 수 수 있습니다. 사용할 수 연구 동물에서 LC의 식별을 설명 하는 단계별 프로토콜을 제공 하지 않습니다 비-전문가1,25를 따를 수 있습니다. 따라서, LC의 지역화에 대 한 지침을 제공, 우리는 몇 가지 애플 리 케이 션 (그림 1, , 그림 2 그림 3)에 대 한 쥐의 뇌에서이 영역을 찾으려고 개발 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜은 DBH26,27, 또는 양자 택일로 회24, 신중 하 게 제어 뇌 단면 및 immunohistochemical 검출을 두 효소 LC28에서 높게 풍성 하 게 적용 됩니다. LC는 immunohistochemistry 여 일단, 인접 한 뇌 조각 추가 연구, 형태학 및 대사 분석 뿐만 아니라 x-선 형광 현미경 검사 법 (XFM)29통해 금속 이미징 연구를 포함 하 여 사용할 수 있습니다. 우리는이 프로토콜 (그림 3)에서 예를 들어 XFM를 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>성인 마우스 뇌 슬라이서 매트릭스</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit secondary 항체, Alexa Fluor 488 (source - donkey)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Charged glass slides</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 절단 블레이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>가위 Mini, 9.5cm</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-디아미디노-2-페닐린돌)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>도파민 &베타;-하이드록실라제(DBH) 항체 - 자체 생산(출처 - 토끼)</td><td>B. 아이퍼</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>도파민 &beta; - 하이드 록실 라제 (DBH) 항체 - 상업적으로 사용 가능 (출처 - 토끼)</td><td>Cell Signaling</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes, 50ml</td><td>USA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forane (isofluorane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Forceps Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset mounting media</td><td>EM sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>Multi-well plates, 24 wells</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>최적 절단 온도 화합물 (OCT)</td><td>VWR / tissue tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드 (PFA) / 포르말린 10 %</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way 일회용 임베딩 금형</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>연필 브러시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>주걱</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T 핀</td><td>Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>입체 좌표의 마우스 뇌, Paxinos 및 Franklin, 3rd Edition</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (PBSD 준비용)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tyrosine hydroxylase (TH) 항체(출처 - 토끼)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr>XRF <td>SPEX 샘플 준비</td><td>용 초경량 박막</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>광시야 형광 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐의 뇌에서 로커 스 coeruleus의 지역화

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

로커 스 coeruleus (LC)는 다양 한 생리 기능을 조절 하는 신경 세포를 생산 하는 노르의 주요 허브 이다. LC의 구조적 또는 기능적 이상 피 질, 해 마와 소 뇌를 포함 하 여 여러 가지 뇌 영역에 영향을 하 고 우울증, 양극성 장애, 불안로 파 킨 슨 질환과 Alzheimer 질병에 기여할 수 있습니다. 이 질환은 종종 금속 misbalance와 관련 된 하지만 lc에서의 역할은 부분적 으로만 이해. LC의 형태 론 적과 기능 연구는 더 나은 인간의 병 리와 금속의 기부를 이해 필요 합니다. 마우스는 널리 사용 되는 실험적인 모델 이지만 마우스 LC 작은 (~0.3 m m 직경)와 비-전문가 대 한 식별 하기 어렵다. 여기, 우리는 쥐의 뇌에 LC를 지역화 하는 단계별 immunohistochemistry 기반 프로토콜을 설명 합니다. 도파민-β-hydroxylase (DBH), 및 양자 택일로, 티로신 hydroxylase (TH), 액정, 높은 표현 두 효소 뇌 조각에서 immunohistochemical 표식으로 사용 됩니다. LC 포함 된 섹션에 인접 한 섹션 x 선 형광 현미경 검사 법 (XFM) 하 여 형태학 연구, 신진 대사 테스트로 금속 영상 조직학을 포함 하 여 추가 분석을 위해 사용할 수 있습니다.

변경 (예: Cu, Fe, Zn, 그리고 미네소타) 금속 항상성에서 LC34,35에 변화를 포함 한 신경학 적 장애에서 자주 관찰 된다. 따라서, 뇌의 금속 수준 결정은 질병 메커니즘의 이해를 위해 필요 합니다. 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 뇌 섹션 잘라내기 및 LC에서 다른 금속 수준의 계량 LC 외부 지역에서 수준에 그들을 비교 하 사용할 수 있습니다. (그림 3)입니다. 우리의 예제에서는 LC, 인산, 칼륨, 극복 했다 두뇌 슬라이스 염화과 구리를 측정 했다. 유일한 구리 특히 LC에 상승 했다. (여기에 표시 되지) 높은 해상도 XFM 이미징 금속 레벨의 subcellular 분포의 검출에 대 한 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜의 가능한 응용 프로그램 풍요로 움과 세포내 분포 DBH (<st...

로커 스 coeruleus는 다양 한 생리 적 과정에에서 관여 하는 신경의 작은 클러스터. 여기, 우리는 단백질이이 핵에 금속의 연구에 대 한 마우스 뇌 섹션을 준비 하는 프로토콜을 설명 합니다.

쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

메뚜기 coeruleus의 기능 장애는 신경 및 신경 정신 장애에 연루 되었습니다., 파 킨 슨 병을 포함 하 여, 알 츠 하이 머 병, 우울증, 양극성 장애, 그리고 불안. 이러한 역할을 감안할 때, 궤적 coeruleus의 분석은 그것의 기능 및 기능 장애를 공부에 중요 하다. 마우스 뇌 절개 하는 동안, 궤 적 coeruleus 쉽게 그것의 작은 크기 로 인해 관상 또는 처상 섹션에서 놓칠 수 있습니다.따라서, 궤적 coeruleus의 국소화를 위한 지침을 제공하기 위하여는, 우리는 우리가 몇몇 응용을 위한 마우스 두뇌에 있는 이 지역을 찾아내는 것을 개발한 프로토콜을 기술합니다. 50 밀리리터 튜브에 4%PFA에 마취된 마우스의 갓 고립된 뇌를 배치하여 시작합니다. 4섭씨에서 24시간 동안 뇌를 배양합니다.집게를 사용하여 뇌를 30% 자당 용액의 25밀리리터로 채워진 50밀리리터 원추형 튜브로 전달합니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라 앉을 때까지 48 ~72 시간 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 브레인스STEM 섹션을 포함하려면 절단 된 표면을 포함 금형의 바닥에 놓고 뇌간을 둘러싸기 위해 최적의 절삭 온도 화합물을 추가하십시오.추가 사용까지 적어도 12 시간 동안 마이너스 80섭씨 냉동고에 내장 된 뇌를 동결. 뇌의 곰팡이를 극저온에 넣고 몇 시간 동안 배양하여 온도를 극저온에 맞게 조정합니다. 뇌가 포함된 OCT 블록을 노출하려면 면도날을 사용하여 금형의 네 가장자리를 바닥까지 잘라낸 다음 임베딩 몰드를 벗겨냅니다.면도날을 사용하여 블록 표면에서 10월 초과를 제거하여 뇌를 만지지 않도록 하십시오. 그런 다음 10 월 블록을 극저온의 척에 장착하여 뇌의 절단 표면을 앞쪽으로 노출시합니다. 뇌를 조정하려면, 저울증의 면도날과 평행하게 절단 된 표면을 지향한다.시편을 올바르게 지향하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 우리는 뇌의 등대 표면의 해부학적 특징을 사용하여 소뇌와 열등한 콜리큘러스 사이의 경계와 같은 LC를 찾는 것이 중요하기 때문에 섹션이 올바르게 정렬되는 것이 중요합니다. 이것은 마우스 두뇌 슬라이서 매트릭스로 두뇌를 제대로 설정하는 주의가 필요합니다.수둘라에서 시작하여 100 마이크로미터 섹션을 연일무게 절단합니다. 소뇌와 뇌간이 네 번째 심실 수준에서 하나의 연속 슬라이스로 절단시작하면 50 마이크로 미터 두께로 조각을 수집하기 시작합니다. 각 뇌 조각을 수집하고 PBS로 채워진 24 웰 플레이트의 우물에 배치하려면 집게를 사용합니다.궤적 coeruleus는 소뇌와 열등한 콜리큘러스가 bregma의 약 5.52 밀리미터 후방에서 서로 만나는 조각에서 가장 두드러질 것입니다. 첫날, PBS에서 각각 5 분 동안 24 웰 플레이트에서 뇌 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 세제로 0.5 %의 PBS를 추가하고 24 시간 동안 섭씨 4도에서 투과합니다.다음 날, 0.5 %의 PBSD로 5 분 동안 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 0.5%PBSD에서 1~500의 희석시 1차 항체를 추가하고 18시간 동안 섭씨 4도에서 배양한다. 셋째 날에는 각각 0.5%의 PBSD로 10분 동안 슬라이스를 세 번 씻은 다음 0.5%PBSD에서 1~1000의 희석시 이차 항체를 첨가한다.알루미늄 호일로 접시를 감싸고 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 각각 0.5%의 PBSD로 5분간 슬라이스를 세 번 씻은 다음 PBS에서 5분간 세척합니다. DAPI 없이 하드 셋 장착 매체를 사용하여 섹션을 덮습니다.유리 커버로 덮고 실온에서 30 분 동안 건조하십시오. 그런 다음 설정이있는 공초점 현미경을 사용하여 적절한 형광 파장에서 이미지를 이미지하는 뇌 슬라이스에 신호를 감지하십시오. 현미경을 뇌 슬라이스의 초점 평면으로 조정한 후 10배 배율을 사용하여 단일 이미지를 취합니다.소뇌 아래와 폰과 브레인스템 위에 위치한 네 번째 심실을 사용하여 뇌 슬라이스에서 가능한 LC 영역을 찾습니다. 4심실의 측면 가장자리에 초점을 맞추고 LC는 제4 심실의 가장자리에서 시작하여 폰브레인스영역을 가리킵니다. LC에서 발현된 단백질인 도파민 베타-하이드록실라제의 세포내 분포는 LC 형태학 및 뉴런 밀도를 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용하여 평가되었다.LC에서 발현된 또 다른 단백질인 티로신 하이드록실라제는 LC를 함유한 뇌 슬라이스에서 강한 녹색 형광 신호를 보였으며, 금속 항상성에 대한 변화는 종종 LC.In 신경학적 장애에서 관찰되며, 이 예에서는 LC의 변화를 포함하여 신경학적 장애에서 관찰되는 경우가 많으며, LC를 통해 절단된 뇌 슬라이스가 인산염, 칼륨, 아연 및 구리만 을 측정하였다. 핵을 놓치지 않도록 약 500미크론의 조직 전방 및 후방을 LC로 자르고, 특히 이 프로토콜을 처음 수행하는 경우 필요한 부분보다 더 많은 부분을 절단하는 것이 좋습니다. 염색하기 전에 뇌 아틀라스 이미지에 대한 주의 깊은 연구는 매우 유용합니다.일단 LC는 면역 조직화학에 의해 위치되면, 인접한 두뇌 조각은 엑스레이 형광 현미경 검사를 통해 금속 화상 진찰 연구뿐만 아니라 형태학 및 신진 대사 분석을 포함하여 추가 연구 결과, 또한 이용될 수 있습니다. 기술된 프로토콜을 사용하여 생성된 뇌 섹션은 LC의 구리 및 기타 금속 수준을 정량화하고 질병 메커니즘을 이해하는 데 필요한 LC 외부 영역의 수준과 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜의 추가 가능한 응용 프로그램은 도파민 베타 하이드록실라제, 티로신 하이드록실라제 및 LC에서 개별적으로 발현된 기타 단백질의 풍부하고 세포내 분포의 검출을 포함하며, 또는 LC 형태학 및 뉴런 밀도의 공동 염색 분석에서.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 두뇌 섹션 sectioning 마우스, 제거 및 sectioning 뇌뿐만 아니라, immunoperoxidase의 얼룩, 수지 포함하고, ultrathin의 transcardiac 재관류에 대한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 절차가 완료되면 immunostained 자료 전송 전자 현미경과 함께 시험에 대한 준비가되었습니다.

Immunoelectron 현미경을위한 마우스 뇌 조직의 준비

출처: Xavier, ALR, et al. 설치류의 수조 마그나에 캐뉼라 이식. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 마취된 마우스의 수조에 캐뉼라를 이식하는 절차를 보여줍니다. 이 기술은 바늘에 장착된 캐뉼라를 경막을 통해 거꾸로 된 삼각형 수조 대나로 안내하고 뇌척수액으로 표적으로 전달하기 위해 고정하는 것입니다.

마우스 모델에서 Cisterna Magna에 캐뉼라 이식

이 비디오는 마우스 뇌의 양측 M2 영역에서 LFP(Local Field Potential)의 생체 내 기록을 보여줍니다. 마취된 마우스가 고정되고 절차를 위해 준비됩니다. LFP를 기록하려면 복잡한 운동 움직임을 담당하는 양측 M2 영역의 목표 좌표에 미세 전극을 삽입합니다.

마우스 뇌의 양쪽 반구에서 국소 자기장 전위(Local Field Potential)의 기록

이 프로토콜은 마우스 뇌 절편에서 유전자좌 coeruleus 영역을 식별하기 위해 면역조직화학을 사용하는 방법을 설명합니다. 녹색 형광단 표지 항체로 도파민 β-하이드록실라제를 표적으로 삼음으로써, 노르에피네프린 생성 뉴런은 현미경에서 녹색 형광으로 시각화됩니다.

마우스 뇌 절편에서 유전자좌 coeruleus 영역을 식별하기 위한 면역조직화학(Immunohistochemistry)

이 비디오는 마우스 뇌 절편의 Meynert 영역의 핵 기저부에 있는 콜린성 섬유의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 절편을 차단하고 콜린 아세틸전이효소에 대한 1차 투여한 후 비오틴화된 2차 항체를 투여합니다. Avidin-biotin-peroxidase 복합체가 추가되어 2차 항체에 결합한 다음 발색 기질에 결합합니다. 그런 다음 단면을 탈수하고 장착한 후 현미경으로 시각화합니다.

마우스 뇌의 Meyner의 핵 기저부에서 신경 섬유의 면역조직화학적 염색

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

우리는 마우스의 양측 이차 모터 피질 (M2)에서 국소 전위 (LFP)의 생체 내 전기 생리학적 기록을 제시하며, 이는 반구 측면화를 평가하기 위해 적용될 수 있다. 연구 결과는 WT 통제에 비교된 APP/PS1 마우스에 있는 좌우 M2 사이 동기화의 변경한 수준을 밝혔습니다.

마우스의 보조 모터 피질에서 양측 지역 필드 전위 기록을 가진 반구 측면화의 평가

인지 성능에 대한 삼차 적 영향이 궤적 coeruleus 활동을 포함 여부를 확인하기 위해, 두 프로토콜은 츄잉에 의해 유도 된 성능과 작업 관련 동공 크기 변화 사이의 가능한 상관 관계를 평가하는 것을 목표로 제시된다. 이 프로토콜은 궤적 coeruleus 기여가 의심되는 조건에 적용될 수 있습니다.

삼차 자극에 의해 유도 된 로커스 Coeruleus 중재 각성에서 동공 연결 변경 평가

특정 신경 인구 또는 뇌 영역의 광유전학 적 조작으로, 행동은 자유롭게 움직이는 동물에 있는 높은 시간 및 공간 해상도로 수정될 수 있습니다. 만성 이식 된 광섬유와 함께 다른 광유전학 도구를 사용하여 다양한 신경 변조 및 행동 테스트를 수행 할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스에 있는 행동을 조절하기 위하여 신경 활동의 광유전학 조작

생쥐의 뇌 부위를 표적으로 삼는 입체 택시 수술은 일반적으로 두개골 뼈를 통한 접근을 포함하며 두개골 랜드 마크에 의해 안내됩니다. 여기서 우리는 뇌간 랜드 마크의 직접적인 시각화에 의존하는 cisterna magna를 통해 꼬리 뇌간과 상부 자궁 경부 척수를 목표로하는 대체 입체 택시 접근법을 개략적으로 설명합니다.

마우스의 Cisterna Magna를 통해 Caudal Brainstem과 Upper Cervical Spinal Spind를 미세 주입하는 입체 택시 외과 적 접근법

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

학습하세요 쥐 뇌에서 로커스 코에룰레우스를 정확히 지역화하는 방법을. 면역조직화학법과 금속 이미징을 활용하여 신경계 질환 연구에 필수적인 분자 메커니즘을 규명할 수 있습니다.

쥐의 뇌에서 로커 스 Coeruleus의 지역화

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