Name: 로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: 학습하세요 로봇 시스템을 활용한 쥐 조직 표본 처리 및 패라핀 임베딩 자동화 프로토콜을 통해 조직학 분석 품질을 향상시키는 방법을. 이 기술은 방법론적 변수를 줄이고 절차 표준화를 개선하여 연구 재현성을 높입니다.

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IRCCS 폴 병원, 기술 지원에 대 한 밀라노와 IEO 동물 시설 지원에 대 한의 병 리의 부를 축산에는 감사합니다.

동물 건강 (Auth. 127/15, 27/13)의 이탈리아 정부에 의해 승인 과정과 종양학 IACUC (기관 동물 관리 및 사용 위원회)의 유럽 연구소의 동물 보호 지침을 따라
1. 만성 대 장 염 유도 반복 DSS 관리
<ol><li>별도 연령과 성별 쥐 2 그룹 (치료 DSS 제어 H2O 대, 실험적인 그룹 당 적어도 5 쥐 littermates)에 일치합니다.</li>
	<li>2.5% 관리 DSS (40 kDa) 치료 그룹에 7 일 및 물 컨트롤 그룹에 대 한 식용 수에서. 참고: 이 모델은 과거 만성 장 염증9을 유도합니다.</li>
	<li>7 일 후, DSS 치료를 중지 하 고 14 일에 대 한 두 그룹에 게 물. 3 번이이 프로세스를 반복 합니다. 참고: DSS의 반복적인 관리 밀접 하 게 닮은 인간 IBD, 즉, 섬유 증9장 점 막의 변경을 유도 합니다.</li>
	<li>CO2 흡입에 의해, 즉 제도적 IACUC에 의해 승인 절차에 따라 쥐를 희생.</li>
	<li>메스와 마우스 복 부와 복을 엽니다. 참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.</li>
	<li>집게, 핀셋으로 작은 창 자에서 콜론을 구분 합니다. 족집게와 집게 콜론 삭제하시오 참고: 콜론 길이 측정 (그림 1A) colitis DSS 처리 쥐에서 발생 하는 경우 확인 하는 방법입니다.</li>
	<li>린스 차가운 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x의 10 mL를 페 트리 접시에 콜론 누르고 부드럽게 찌 재료를 제거 하.</li>
</ol>2. murine 조직 고정
<ol><li>10%의 10 mL에 각 murine 콜론 견본을 담가 중립 버퍼링 포 르 말린 (NBF) RT (실내 온도)에. 참고: 불 임은 좋지만 엄격 하 게 필요한.</li>
	<li>실시간에서 18-24 h에 대 한 조직 수정</li>
</ol>3. 콜론 구분 및 조직 준비
<ol><li>작은 핀셋으로 고정된 조직 NBF 컨테이너에서 제거 하 고 배양 접시에 넣어. 작은 핀셋으로 단면 작업 접시에 콜론을 넣어.</li>
	<li>살 균 메스와 파편 (0.3 c m 길이 0.2 c m)에서 콜론을 잘라. 이 조각 길이 카세트의 두께 초과 하기에 최적입니다.</li>
	<li>작은 핀셋 (그림 2A)으로 한 콜론 세그먼트를 선택 합니다. 작은 핀셋 (그림 2B)와 카세트를 포함 하는 방향의 파라핀의 끝을 돌출 하는 플라스틱 중 하나에 하나의 콜론 세그먼트를 삽입 합니다.</li>
	<li>카세트 당 추가 3 콜론 세그먼트 (3.2-3.3) 작업을 반복 합니다. 직물의 중복을 최소화 하기 위해 인접 튀어나온 팁에 세그먼트를 삽입 하지 마십시오</li>
	<li>신중 하 게 4 개의 가장자리 (그림 2C)을 추진 하 여 카세트를 단단히 닫습니다. 조직 손상을 방지 하기 위해 조직을 압박 하지 마십시오.</li>
	<li>플라스틱 지원 프레임에 표를 삽입 합니다. 샘플을 식별 하기 위해 지원 프레임 레이블을 지정 합니다. 각 생물 학적 샘플에 대 한 반복 합니다.</li>
</ol>4. 조직 처리
<ol><li>(그림 3A, 3B) 전원 버튼을 누르면 자동된 프로세서를 켭니다.</li>
	<li>파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀은 완전히 녹아, 전용된 아이콘 (그림 3C)의 존재를 관찰 하 여 확인 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>자동화 된 프로세서 (그림 3D)에서 제공 하는 금속 바구니에 각 방향된 카세트 (조직 표본 포함) 수동으로 삽입 합니다. 바구니 인 최적화를 서로 가까이 줄 카세트를 세로로 배치 합니다.</li>
	<li>금속 바구니 (그림 3E)를 닫습니다.</li>
	<li>말 대 꾸 (그림 3 층)의 뚜껑을 엽니다. 쌈 바구니 기계를 삽입 하는 곳입니다. (그림 3) 프로세서의 전용된 주택에 바구니를 삽입 합니다. 말 대 꾸 (그림 3 H)의 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 (그림 3I) 작업 프로토콜 정의. 솔루션, 타이밍 및 표 1에 제공 된 스키마에 따라 구현할 온도 시퀀스를 선택 합니다.</li>
	<li>전용된 컴퓨터 아이콘 (그림 3J)를 클릭 하 여 바구니를 포함 하는 통 렬 한 반박에서 실행 될 프로토콜을 지정 합니다. 시작 버튼 (그림 3 L)를 클릭 하 여 프로토콜을 시작 합니다.</li>
	<li>악기는 프로토콜의 끝을 확인 하는 전용된 아이콘의 존재 여부를 관찰 하 여 고 기계에서 나오는 경보 음색을 듣고 여 때까지 기다립니다.</li>
	<li>말 대 꾸 뚜껑을 엽니다. (그림 3 M) 프로세서에서 바구니를 제거 합니다.</li>
</ol>5. 조직 포함
<ol><li>(그림 4A) 전원 버튼을 누르면 자동된 embedder를 켭니다.</li>
	<li>파라핀 왁 스 용 해 되도록 1 시간 워밍업. 악기는 파라핀 악기의 내부 온도계에 표시 된 파라핀 욕조의 온도 관찰 하 여 녹아 완전히 확인 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>Embedder 선반에 모든 처리 카세트 프로세서 바구니에서 수동으로 전송. 각 랙 최대 32 카세트를 포함할 수 있습니다. (그림 4B, 4c).</li>
	<li>(그림 4C, 4d, 4E) 주요 embedder 뚜껑을 엽니다.</li>
	<li>악기 컴퓨터에 터치 스크린을 사용 하 여 신호는 로봇 시스템 랙 되는 삽입 (그림 4 층).</li>
	<li>입구 주택 뚜껑 (그림 4G)를 엽니다. 랙 입구 주택에 삽입 합니다. 각 embedder는 동시에 최대 4 선반을 포함할 수 있습니다 (그림 4 H, 4I). (그림 4J) 입구 주택 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>표 2 (그림 4 K)에 따라 포함 절차를 시작 하려면 악기 컴퓨터에서 터치 스크린을 사용 합니다. 참고: 32 카세트의 각 랙 포함 45 분 걸립니다.</li>
	<li>악기 전용된 아이콘 (그림 4 L)의 존재를 관찰 하 여 프로토콜의 끝을 확인 될 때까지 기다립니다.</li>
	<li>콘센트 랙 (그림 4 M)를 제거 합니다. 주요 embedder 뚜껑을 닫습니다.</li>
	<li>선반에서 포함 된 블록 (방향 격자 포함)를 제거 합니다. 스토리지 골 판지 상자에 포함 된 블록을 전송 합니다.</li>
</ol>6. 마이크로미터 단면
<ol><li>톰의 냉각 접시를 켭니다. -8 사이의 온도 설정-10 ° c</li>
	<li>증류수 2 L를 포함 하는 톰의 서 모스 탯 물 목욕을 켭니다. 42-45 ° c.에 사이 물 목욕의 온도 설정</li>
	<li>장소는 파라핀 블록 냉각 플레이트에 포함. 블록을 수 있도록 적어도 5 분 기다립니다.</li>
	<li>냉각 접시에서 한 블록을가지고 고 톰 블록 홀더에 배치.</li>
	<li>10 µ m 두께 6 번을 절단 하 여 두께 10 µ m. 트림 블록을 절단 하는 톰을 설정 합니다.</li>
	<li>10 µ m에서 3 µ m. 컷 한 3 µ m에 대 한 섹션 Hematoxylin과 오신 (H & E)에 얼룩이 지는 톰의 두께 설정을 변경 합니다.</li>
	<li>
작은 브러시로 3 µ m 섹션을 수집 합니다. 3 µ m 섹션 조직 주름을 줄이기 위해 물 표면에 그것을 신중 하 게 누워 물 욕조에 넣어. 단일 유리 슬라이드에 온도 조절 장치로 통제 물 탕에서 조직 단면도 수집 합니다.
	<ol>
<li>필요한 경우 추가 섹션을 잘라.</li>
	</ol>
</li>
	<li>샘플 id를 작성 하 여 유리 슬라이드를 레이블을 지정 합니다.</li>
	<li>적어도 10 분 동안 37 ° C 오븐에 슬라이드를 넣어.</li>
	<li>유리 슬라이드 랙 즉각적인 분석 또는 스토리지 박스에 넣어.</li>
</ol>7. hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩
<ol><li>전원 버튼을 누르면 자동된 염색기에 전환 합니다. 악기 모니터에 로딩 바의 변화를 관찰 하 여 로봇 팔의 초기화를 허용 합니다.</li>
	<li>염색기 랙, 세로 최대 30 슬라이드 삽입으로 유리 슬라이드를 삽입 합니다.</li>
	<li>적절 한 무선 주파수 식별 (RFID) 플라스틱 태그와 랙 라벨. RFID 태그 제조 인 컴퓨터에 로드 된 올바른 얼룩 프로토콜을 식별 하는 시스템입니다.</li>
	<li>랙을 염색기에 넣습니다. 자동으로 로드 하 고 RFID 태그의 인식에 따라 얼룩 프로토콜을 시작 하려면 컴퓨터를 허용 합니다. 참고: H & E 염색에 대 한 프로토콜에서 설명 하는 표 3.
</li>
</ol>8. Immunohistochemical 얼룩
<ol><li>Immunohistochemical Mallory trichrome 앞에서 설명한7얼룩을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Gibson-Corley, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+Integration+of+the+Histology+Core+Laboratory+in+Translational+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+histotechnology%22%5BJournal%5D)">Successful Integration of the Histology Core Laboratory in Translational Research.</a> Journal of histotechnology. 35, 17-21 (2012).</li>
<li>Olivier, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+modified+species+in+research%3A+Opportunities+and+challenges+for+the+histology+core+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+histotechnology%22%5BJournal%5D)">Genetically modified species in research: Opportunities and challenges for the histology core laboratory.</a> Journal of histotechnology. 35, 63-67 (2012).</li>
<li>Gibson-Corley, K. N., Olivier, A. K., Meyerholz, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+valid+histopathologic+scoring+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+pathology%22%5BJournal%5D)">Principles for valid histopathologic scoring in research.</a> Veterinary pathology. 50, 1007-1015 (2013).</li>
<li>Stolfi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+interleukin-21+in+the+regulation+of+colitis-associated+colon+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+experimental+medicine%22%5BJournal%5D)">Involvement of interleukin-21 in the regulation of colitis-associated colon cancer.</a> The Journal of experimental medicine. 208, 2279-2290 (2011).</li>
<li>Begley, C. G., Ellis, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+development%3A+Raise+standards+for+preclinical+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug development: Raise standards for preclinical cancer research.</a> Nature. 483, 531-533 (2012).</li>
<li>Peters, S. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeters%2C+SR+%22A+Practical+Guide+to+Frozen+Section+Technique%22">A Practical Guide to Frozen Section Technique</a>. , New York, N.S.N.Y. (2010).</li>
<li>Rosai, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosai%2C+J+%22Rosai+and+Ackerman%27s+Surgical+Pathology%22">Rosai and Ackerman's Surgical Pathology</a>. , Elsevier. (2011).</li>
<li>Blumberg, R. S., Saubermann, L. J., Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+mucosal+inflammation+and+their+relation+to+human+inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Animal models of mucosal inflammation and their relation to human inflammatory bowel disease.</a> Current opinion in immunology. 11, 648-656 (1999).</li>
<li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nature. 2, 541-546 (2007).</li>
<li>Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+bowel+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammatory bowel disease.</a> Annual review of immunology. 28, 573-621 (2010).</li>
<li>Cribiù, F. M., Burrello, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+an+automated+inclusion+system+for+the+histological+analysis+of+murine+tissue+samples%3A+A+feasibility+study+in+DSS-induced+chronic+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Implementation of an automated inclusion system for the histological analysis of murine tissue samples: A feasibility study in DSS-induced chronic colitis.</a> European Journal of Inflammation. 16, 1-12 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

우리 조직 분석 murine 조직의 준비 하는 동안 다른 자동화 된 단계를 사용합니다. 이 프로토콜 기술 힌트 재현성 및 따라서 최종 histopathological 평가의 전반적인 품질을 향상 하는 전체 과정의 표준화를 제공 하는 것을 목표로. 우리는 자동된 계기와 준비 및 조직, 정기적으로 인간의 표본 연구에 대 한 병 리 핵심 시설에 사용의 포함에 대 한 메서드 구현.
이 방법의 잠재적인 적용 가능성을 보여 장 염증, 만성 직장 염 DSS 유도 모델의 만성 murine 실험 설정을 선택 했습니다. 이 설정은 정교한 조직학 평가 만성 장 염증 시 발생 하는 조직 아키텍처의 심오한 변경 조사를 요구 하는 IBD 환자에서 관찰 하는 복잡 한 질병 과정을 유사 합니다. 이러한 프로세스의 조직학 평가 증가 샘플 준비 품질에서 크게 유익할 수 있습니다. 참고로,이 프로토콜 적용할 수 있습니다 다른 murine 조직 (즉, spleens, 림프절, 간, 뇌), 유일한 차이 지향된 카세트...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58654/using-robotic-systems-to-process-embed-colonic-murine-samples-for">Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Claudia&#160;Burrello and Federica Facciotti was updated from:
Department of Experimental Oncology, European Institute of Oncology
to:
Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58654/using-robotic-systems-to-process-embed-colonic-murine-samples-for">Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.

Erratum: Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

마지막 십 년간에서 인간의 질병1,2를 선도 하는 병원 성 메커니즘을 해 부를 몇 가지 실험 모델 개발 되었습니다. 질병의 심각도 평가, 연구원은 처리의 효과 평가 하 고 cytological 및 조직학 건축 변화 또는 염증3양의 공부 해야 합니다. 그 실험 모델을 사용 하 여 수행 하려면 자세한 histopathological 분석 murine 인간과 샘플4,5종종 비교 필요 하다.
또한, 인간의 샘플 일반적으로 처리 되 고 histopathology 핵심 시설에 의해 득점 하 고 경험이 인간의 병리학을 통해 표준화 histopathological 기준 및 방법. 반대로, murine 조직은 보통 고정, 임베디드 및 histopathological 프로토콜의 제한 된 경험을 가진 연구원에 의해 분석. 품질 및 histopathological 검사의 신뢰성 높은 품질 조직 단면도의 준비로 시작 합니다. 여러 가지 요인을 비판적으로 증가 또는 감소 등 고정, 거시적인 최종 분석의 품질 구분, 처리, 파라핀, 포함 및 샘플6,7의 포함에 기여.
샘플의 조작 관련 된 이러한 모든 구절 수동 샘플의 포함을 포함 하 여 수동 오류 및 낮은 범위, 단면 및 얼룩 수동 톰 대상이 됩니다. 현재, 조직학 평가 murine 조직 준비의 모든 과정은 다양 한 연구소에서 실험실 프로토콜 및 수동 프로토콜 의존 합니다. 이 연구의 목표 오류와 murine histopathological 시험에 다양성을 줄이기 위해 표준화 자동화 프로토콜을 구현 하는 것입니다.
우리의 지식, 여기 완전 자동된 조직 처리 및 murine 조직;의 조직학 평가 대 한 포함에 대 한 첫 번째 프로토콜 설명 이러한 인간의 표본 분석에 대 한 병 리 단위에서 정기적으로 사용 됩니다. 방법의 타당성의 실용적인 예를 들어, 창 자 염증의 murine 모델 분석 된, 즉, , 만성 대 장 염 모델으로 인 한 식 수8 에서에서 dextran 나트륨 황산 염 (DSS)의 반복된 관리 9. DSS 처리 동물 예를 들면, 체중 감소, 느슨한 대변 또는 설사, 및 섬유 증 뿐만 아니라 콜론의 단축 창 자 염증의 표시를 전시 하기 때문에 인간의 선 동적인 장 질병 (IBD)10 유사한 밀접 하 게이 실험 설정 8,,911. 인간의 IBD 환자에 대 한 관찰, DSS 처리는 복잡 한 질병 과정을 생성 합니다. 이러한 맥락에서 정교한 조직학 평가 조직 아키텍처의 심오한 변화를 이해 해야 합니다. 따라서, 샘플 준비 품질을 높이기 위한 기술된 프로토콜의 구현 조직학의 해석에 의존 하는 연구자를 유익할 수 있습니다 고 immunohistochemical murine 실험 설정에 대 한 분석. 조직 구조의 변경에 관련 된 인간 질병의 murine 실험 모델, 세포 조직 침투 또는 다른 조직 및 장기 (내장, 뇌, 간, 피부)에 염증의 존재의 증가 품질 사용할 수 있는 histopathological 검사를 위한 샘플 준비입니다.

<table><tbody><tr><td>절대 에탄올 무수</td><td>Carlo Erba</td><td>414605</td><td>시약</td></tr><tr><td>Absolute ETOH</td><td>Honeywell</td><td>02860-1L</td><td>시약</td></tr><tr><td>알루미늄 황산칼</td>륨 <td>SIGMA</td><td>A6435</td><td>시약</td></tr><tr><td>아닐린 블루</td><td>SIGMA</td><td>415049</td><td>시약</td></tr><tr><td>carbol Fuchsin</td><td>SIGMA</td><td>C4165</td><td>시약</td></tr><tr><td>CD11b (클론 M1/70)</td><td>TONBO biosciences</td><td>35-0112-U100</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD20 IHC (클론 SA275A11)</td><td>Biolegend</td><td>150403</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD3 (17A2)</td><td>TONBO biosciences</td><td>35-0032-U100</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD4 (GK1.5)</td><td>BD Biosciences</td><td>552051</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD45.2 (클론 104)</td><td>BioLegend</td><td>109837</td><td>항체</td></tr><tr><td>CD8 (53-6.7)</td><td>BD Biosciences</td><td>553031</td><td>항체</td></tr><tr><td>구연산염 완충액 pH 6 10x</td><td>SIGMA</td><td>C9999</td><td>시약</td></tr><tr><td>Dab</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4100</td><td>시약</td></tr><tr><td>DPBS 1x</td><td>Microgem</td><td>L0615-500</td><td>시약</td></tr><tr><td>DSS</td><td>TdB Consultancy</td><td>DB001</td><td>시약</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E9884</td><td>시약</td></tr><tr><td>EnVision Flex 과산화효소 차단 시약</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso in GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex Substrate</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso in GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex/HRP</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso in GV80011-2</td></tr><tr><td>EnVision Flex+ Rat Linker</td><td>DAKO</td><td></td><td>compreso in GV80011-2</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>VWR</td><td>1.09844</td><td>시약</td></tr><tr><td>F4/80 (클론 BM8)</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td>항체</td></tr><tr><td>Formalin</td><td>PanReac</td><td>2,529,311,215</td><td>시약</td></tr>, <tr><td>빙초산</td><td>SIGMA</td><td>71251</td><td>시약</td></tr>, <tr><td>Goat-anti-Rat-HRP</td><td>, Agilent DAKO</td><td>P0448</td><td>항체</td></tr>, <tr><td>Haematoxylin</td>, <td>DIAPATH</td><td>C0303</td><td>시약</td></tr>, <tr><td>LEICA 로터리 마이크로톰(RM2255)</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td>장비</td></tr><tr><td>: Ly6g (클론 : 1A8)</td> <td>BD Biosciences</td><td>551459</td><td>항체</td></tr><tr><td>: Mercury II, Oxide</td>, <td>SIGMA 203793</td><td></td><td>시약</td></tr>, <tr><td>Omnis Clearify Clearing Agent</td><td>DAKO</td><td>CACLEGAL</td><td>시약</td></tr><tr><td>, Omnis EnVision Flex TRS</td><td>DAKO</td><td>GV80011-2</td><td>시약</td></tr>, <tr><td>오렌지 G</td><td>SIGMA</td><td>O3756</td><td>시약</td></tr>, <tr><td>파라핀</td><td>Sakura</td><td>7052</td><td>시약</td></tr><tr><td>Peloris</td><td>LEICA</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>SIGMA</td><td>P4937</td><td>시약</td></tr><tr><td>RPMI 1640 L-글루타민</td><td>Microgem</td><td>L0501-500</td><td>시약</td></tr><tr><td>STS020</td><td>Leica</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Tissue-Teck Paraform Sectionable Cassette</td><td>SAKURA</td><td>7022</td><td>장비</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 자동 파라핀 임베더</td><td>사쿠라</td><td></td><td>장비</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>J.T.Baker</td><td>8080.1000</td><td>시약</td></tr></tbody></table>

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 murine 샘플 조직학 분석 포함

Using Robotic Systems to Process and Embed Colonic Murine Samples for Histological Analyses

인간의 질병의 이해 동물 모델의 연구 덕분에 크게 확장 되었습니다. 그럼에도 불구 하 고, 실험 모델의 histopathological 평가 인간의 샘플에 대 한 적용으로 엄격한 될 필요가 있다. 실제로, 안정적이 고 정확한 결론 비판적으로 조직 섹션 준비의 품질에 의해 좌우 된다. 여기, 우리 histopathological 분석 murine 조직 절차 동안, murine 샘플의 파라핀 포함에 초기 준비에서 몇 가지 자동화 된 단계를 구현 하는 프로토콜을 설명 합니다. 자동화 된 절차에서 엄격한 프로토콜 표준화를 통한 방법론 변수 감소 murine 병 적인 분석의 향상 된 전반적인 안정성에 기여 한다. 특히,이 프로토콜 자동된 처리의 활용에 설명 합니다 하 고 조직 처리 및 파라핀 인간의 샘플의 포함 murine 표본 장 염증의 처리를 정기적으로 사용 로봇 시스템을 포함. 우리는 murine 조직의 histopathological 검사의 신뢰성 표준화 하 고 자동화 된 기법의 도입에 따라 크게 증가 결론.

식 수에 DSS의 반복 된 관리에 의해 유도 된 실험 만성 대 장 염은 밀접 하 게 닮은 인간 IBD8,9장 염증의 murine 모델. 그림 1 은 콜론 단축 (그림 1A), DSS 유도 된 염증의 존재와 저 승 식 프로-염증 성 유전자 CXCL10 등의 점수를 널리 사용 매개 변수를 포함 한 DSS 치료의 효과를 설명 합니다. , tnf 와 mcp-1 (그림 1B). 염증 세포의 침투 cytofluorimetry (그림 1C)에 의해 분석 장 lamina propria에 면역 반응의 모집을 보여주는 DSS ...

Murine 조직 처리에 대 한 표준화의 부족 인간의 표본에 비해 murine histopathological 분석의 품질을 줄일 수 있습니다. 여기, 선물이 murine 염증 및 uninflamed 저 승 조직 처리 및 인간의 샘플을 포함에 대 한 정기적으로 사용 하는 로봇 시스템의 타당성을 보여의 histopathological 검사를 수행 하는 프로토콜.

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

The understanding of human diseases has been greatly expanded thanks to the study of animal models. Nonetheless, histopathological evaluation of ...

이 자동화 된 프로토콜은 인간 샘플의 처리 및 포함에 일상적으로 사용되는 로봇 시스템으로 뮤린 조직의 조직 병리학적 준비를 허용하여 샘플의 품질을 크게 증가시합니다. 이 기술의 주요 장점은 방법론 적 변수의 수를 줄이고 절차 단계의 표준화를 향상시킨다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 프란체스카 보기오가 될 것입니다.프란체스카 보기오는 내 실험실에서 일하는 병리학자입니다. 작은 핀셋을 사용하여 중성 완충 포르말린에서 고정 된 뮤린 결장 조직 샘플을 페트리 접시의 단면 작업 플레이트로 옮기는 것으로 시작합니다. 멸균 메스를 사용하여 결장수를 0.2~0.3센티미터 의 조각으로 자르고 핀셋을 사용하여 1개의 세그먼트를 지향파라핀 포함 카세트의 3개의 비인접 플라스틱 돌출 팁에 배치합니다.네 개의 가장자리를 조심스럽게 밀어 카세트를 닫고 그리드를 플라스틱 지지 프레임에 삽입합니다. 그런 다음 지원 프레임에 레이블을 지정하여 샘플을 식별하고 카세트를 그리드로 전송합니다. 처리 하기 한 시간 전에 자동화 된 프로세서를 설정 합니다.파라핀이 녹았다는 것을 나타내는 계측기가 자동화된 프로세서에 금속 바구니를 수동으로 삽입합니다. 모든 카세트가 삽입되면 바구니를 닫고 레토르트의 뚜껑을 엽니다. 바구니를 프로세서 전용 하우징에 삽입하고 레토르트 뚜껑을 닫습니다.계측기 컴퓨터의 터치스크린을 사용하여 테이블에 제공된 방식에 따라 구현될 솔루션, 타이밍 및 온도의 시퀀스를 선택하는 작업 프로토콜을 정의합니다. 전용 컴퓨터 아이콘을 클릭하여 카세트 바구니가 포함된 레토르트에 프로토콜을 할당하고 시작 단추를 클릭합니다. 기기가 전용 아이콘과 알람 톤으로 프로토콜의 끝을 확인하면 레토르트 뚜껑을 열고 프로세서에서 바구니를 제거합니다.조직이 포함되기 한 시간 전에 자동화 된 임베드를 켜고 파라핀이 악기의 파라핀 목욕 온도계에 의해 표시된 대로 완전히 녹을 때까지 기다립니다. 프로세서 바구니에서 임베더 랙까지 최대 32개의 가공 카세트를 수동으로 전송하고 메인 임베드리드 뚜껑을 엽니다. 터치스크린을 사용하여 랙이 삽입되고 있음을 로봇 시스템에 알리고 입구 하우징 뚜껑을 엽니다.입구 하우징에 최대 4개의 랙을 삽입하고 입구 하우징 뚜껑을 닫습니다. 그런 다음 터치스크린을 사용하여 테이블에 표시된 대로 포함 절차를 시작합니다. 계측기가 전용 아이콘으로 프로토콜의 끝을 확인하면 콘센트 랙을 제거하고 메인 임베드리드 뚜껑을 닫습니다.그런 다음 랙에서 임베디드 블록을 저장소 상자로 옮기습니다. 결장 단축, 및 프로 염증 유전자의 대장 발현은, dextran 나트륨 황산염 또는 DSS 유도 염증의 존재를 득점하기 위한 널리 사용되는 매개 변수입니다. 장 라미나 프로프리아로 염증 세포의 침투는 또한 DSS 처리에 의해 크게 강화됩니다.입증된 바와 같이 자동화에 의해 처리된 처리되지 않은 견본의 H&E 염색은, DSS 처리한 동물에게서 견본에 비교된 염증성 세포, 상피 변경 및 점막 건축에 있는 변경의 더 적은 침투를 보여줍니다. 자동화된 기기에 의해 수행된 뮤린 조직 제제 및 포함의 품질은 CD20 및 말로리 트리크롬 스테인닝을 위한 면역조직화학 염색에 의해 추가적으로 확인할 수 있다. 특히, 자동화된 샘플 처리는 수동 방법에 의해 처리된 샘플보다 조직학적 파라미터의 높은 비율을 일관되게 평가할 수 있게 한다.자동 프로세서가 준비될 때까지 기다리기 위해 그리드에 조직을 올바르게 삽입하고 파라핀이 완전히 녹을 때까지 기다립니다. 이 방법은 인간 병리학자의 뮤린 모형에서 이용될 인간 조직학 견본의 자질로, 어떤 murine 조직의 조직학 분석을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 기술은 이미 염증 성 조직 염증을 연구하기위한 성공적인 연구였으며 대장 뮤린 암 모델을 연구하는 데 유용 할 것입니다.이 프로토콜에 사용되는 일부 시약은 위험하므로 이 절차를 수행 할 때 항상 보호 장갑, 고글 및 실험실 코트를 착용해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 비만이 아닌 당뇨병/중증 복합 면역결핍증(NOD/SCID) 마우스에서 결장직장암 세포의 진행을 연구하기 위해 환자 유래 정형외과 이종이식 결장직장암 마우스 모델을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 쥐 모델은 원발성 종양 성장 및 전이 패턴을 이해하는 데 도움이 됩니다.

대장암의 PDOX 마우스 모델 생성: 쥐 모델에서 대장암의 진행 연구

이 비디오는 마우스에서 대장내시경 유도 핀치 생검을 수행하기 위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 기술은 결장 내강을 시각적으로 분석하고 자세한 연구를 위해 조직 샘플을 수집하는 데 도움이 됩니다.

마우스 모델에서 대장내시경 유도 핀치 생검: 마우스 결장에서 조직 샘플을 시각화하고 추출하는 기술

지난 몇 년 동안, 새로운 세대의 내시경은 쥐 대장염과 대장 종양을 평가하기위한 중요한 진단 연구 보조로 등장했습니다. 우리는 생쥐의 염증과 대장 종양의 내시경 적 평가뿐만 아니라 대장염과 대장 종양의 내시경 심각도를 문서화하는 진수 식별자를 사용하는 새로운 채점 시스템에 여기에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.

검증 된 내시경 채점 시스템을 사용하여 대장염과 대장 종양의 위험을 평가하기 위해 마우스의 유연한 대장 내시경 검사

전체 마운트 준비를 신속하게 준비하기 위해 마우스 창자를 자르고 '굴리는' 간단한 장치를 사용하는 것이 설명되어 있습니다.

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

여기에서는 기저에 있는 크립트 베이스 세포에서 공간적으로 구별되는 쥐 결장 상피 표면 세포를 분리하는 간단한 방법을 설명합니다.

쥐 대장 점막의 이외에 Microdissection을위한 냉동 절편 방법

장 상피 줄기 세포 (ISCS)는 Paneth 셀과 혼합된다. 이러한 세포 ISCS을 지원 항균 보호를 제공 ISC의 자손을 차별화한다. 여기에서 우리는 우리가 Paneth 세포가 장 상피 세포를 유지하는데 중요한 역할을한다는 설정하는 형질 전환 조건부 마우스 모델을 사용하는 방법을 보여줍니다.

조건을 사용하여 쥐 소장에서 재생성 Paneth 세포의 역할을 분석하기위한 프로토콜<em&gt; Cre 호텔-LOX</em&gt; 마우스 모델

여기에서, 우리는 마우스에 있는 대장 내시경 유도핀치 생검을 유도하고 실시간으로 상처 폐쇄를 추적하는 절차에 대한 상세한 설명을 제공합니다. 또한, 상처 침대의 조직학적, 면역 조직 화학 및 분자 분석을 위한 조직의 제조를 위한 방법이 제공됩니다.

마우스에서 대장 내 시경 유도 핀치 생검을 수행하고 후속 조직 변화를 평가

이 간소화된 프로토콜은 조직을 고정하는 것에서부터 시투 혼성화에서 형광을 함유한 미생물을 염색하는 것까지 복잡한 조직 샘플에서 박테리아를 감지하고 이미지화하는 워크플로우를 자세히 설명합니다.

시투 혼성화, 렉틴 염색 및 이미징에서 형광을 통한 장내 미생물군유립 상호 작용의 시각화

소장이 다양한 크기의 미립자를 처리하는 방법을 연구하기 위해 우리는 소장 통과를 결정하기 위해 확립된 생체 내 방법을 수정했습니다.

내강 미립자의 쥐 소장 기계 감지 연구

이 프로토콜은 레이저 미세 해부를 사용하여 조직학적으로 해결된 세포 집단의 농축을 위해 염색된 얇은 조직 섹션 이미지로부터 병리학적으로 확인된 관심 영역의 인공 지능 기반 세분화를 위한 고처리량 워크플로우를 설명합니다. 이 전략에는 관심 있는 세포 집단을 나타내는 경계선을 레이저 현미경으로 직접 전송할 수 있는 새로운 알고리즘이 포함되어 있습니다.

종양 미세환경의 미세스케일 프로테오믹 분석을 위한 산업화된 인공 지능 유도 레이저 미세 해부

우리는 장 조작을 통해 생성된 수술 후 장폐색의 쥐 모델을 설명합니다. 위장 통과 기능, 병리학적 변화 및 면역 세포 활성화는 수술 후 24시간 후에 평가되었습니다.

수술 후 장폐색 쥐 모델

학습하세요 로봇 시스템을 활용한 쥐 조직 표본 처리 및 패라핀 임베딩 자동화 프로토콜을 통해 조직학 분석 품질을 향상시키는 방법을. 이 기술은 방법론적 변수를 줄이고 절차 표준화를 개선하여 연구 재현성을 높입니다.

로봇 시스템을 사용 하 여 처리 하 고 저 승 Murine 샘플 조직학 분석 포함

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