Name: 격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 배우세요 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs를 분리하고 시퀀싱하는 방법을. 이 프로토콜은 소량 샘플을 위한 품질 관리 단계를 포함하여 NGS 라이브러리 구축을 용이하게 합니다.

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우리는 그들의 기술 지원에 대 한 iNANO에 감사 미스터 클로스 버스 하 양 리 타 Rosendahl입니다. 그의 ultracentrifuge의 빈번한 사용을 허용에 대 한 특별 박사 다니엘 Otzen 감사 합니다. 이 연구는 혁신 기금 덴마크 (소집 프로젝트)에 의해 지원 되었다.

참고: 중간 엽 줄기 세포 성장 매체 (MSC 미디어)은 재료의 테이블에에서 표시 된 대로 미리 준비가 되어 있습니다.
1. 세포 배양
참고: 인간 중간 엽 줄기 세포는 골 수, 지방 조직 또는 다른 소스11에서 얻어질 수 있다. 양자 택일로, hMSCs는 공급 업체를 통해 구입하실 수 있습니다. 이 프로토콜에서 사용 하는 BMSCs는 환자의 골 수에서 파생 되었고 회사에서 구입.
<ol><li>1 x 106 BMSCs MSC 미디어의 20 mL를 포함 하는 T175 플라스 크에 녹여 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 품 어 고 대체 미디어 80 %confluency 매 2-3 일.</li>
	<li>1 x PBS의 5 mL로 세포 세척 하 고 PBS를 삭제.</li>
	<li>0.05%의 5 mL을 추가 하 여 셀을 분리 트립 신-EDTA와 37 ° c.에 5 분에 대 한 세포 배양 분리를 촉진 하기 위하여 플라스 크의 측면을 누릅니다.</li>
	<li>MSC 미디어 비활성화는 트립 신, 표면, 그리고 단일 셀 정지를 아래로 피 펫에서 셀 분리의 15 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>50 mL 튜브에 스핀 아래로 작은 셀을 300 x g 에 5 분에 대 한 셀을 수집 합니다.</li>
	<li>MSC 미디어의 1 mL에 셀 resuspend과 hemocytometer를를 사용 하 여 셀. 참고: 기본 인간의 골 MSCs에서 80% confluency T175 플라스 크에 약 2 × 106 세포입니다.</li>
	<li>2, 000 셀/cm2 5 T175 플라스 크에 신선한 MSC 미디어 판 hMSCs. 5% CO2 와 37 ° C에서 세포를 성장 하 고 미디어 90% confluent T175 플라스 크 5 flasks 얻을 때까지 2-3 일 마다 교체.</li>
</ol>2. EVs와 RNA 관련 된 생체 컬렉션
참고: EV 컬렉션 미디어는 사전 준비 (Dulbecco의 수정이 글의 중간 [DMEM] 10% 태아 둔감 한 혈 청 [FBS]와 1% 페니실린/스 [P/S]). EV 컬렉션 미디어 정상적인 MSC 미디어, 하지만 상업 EV 고갈 FBS (자료 테이블)와 함께. 이 FBS, 일반적으로 exRNAs 관련 된 EVs, ribonucleoproteins, 및 단백질을 포함에서 소 exRNA 오염 방지 하는. 작은 RNA 라이브러리 준비에 대 한 MSCs의 5 confluent 플라스 크에서 파생 하는 exRNAs 도서관 건축을 활성화 해야 합니다.
<ol><li>3 세포를 씻어 플라스 크 T175 당 20 mL PBS의 x. MSCs의 confluent T175 플라스 크 당 EV 컬렉션 미디어의 20 mL를 추가 하 고 5% CO2 48 h에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>미디어를 수집 하 고 원심 300 x g 에서 10 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어</li>
	<li>상쾌한을 수집 하 고 원심 2000 x g 에서 20 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어</li>
	<li>수집 하는 상쾌한 고 원심 15500 x g 30 분 및 4 ° c.에 대 한 미디어 다음에 상쾌한을 수집 합니다.</li>
	<li>Ultracentrifuge 관에 미디어를 전송 하 고 작은 공의 100000 x g 와 4 ° C에서 90 분 exRNAs 펠 릿은 튜브의 측면에 고정 되 고 고정된 각도 터 여기 사용 됩니다. 뚜껑의 측면을 표시 하 고 펠 릿으로 예상 튜브 측에 원을 그립니다.</li>
	<li>상쾌한 제거, 흡수 성 종이에 튜브를 거꾸로 하 여 튜브의 내부를 건조 하 고 흡수 성 종이의 작은 조각을 사용 하 여 튜브의 바닥을 건드리지 않고 튜브 내부 액체를 제거. 30에 대 한 vortexing에 의해 PBS의 200 μ에 펠 릿을 resuspend s 및 20 x 위아래로 pipetting.</li>
	<li>EVs와 생체 나노 추적 분석 (NTA) (그림 2)와 함께 평가 합니다. 참고: EVs와 생체 나노 분석 (NTA), 동적 산란 (DL) 또는 전송 전자 현미경 (TEM)12추적으로 평가 될 수 있다.</li>
	<li>추가 다운스트림 실험까지 EVs와 생체-80 ° C에 저장 합니다. 참고: EVs 기능 연구에 사용 될 경우, 20% 글리세롤 파열에서 그들을 보호 하기 위해 추가 해야 합니다. 필요한 경우에 표준 절차를 사용 하 여 셀을 수집할 수 있습니다.</li>
</ol>3. EVs와 차별화 된 세포의 RNA 관련 된 생체 컬렉션
참고: EVs와 RNA 관련 된 생체 세포 분화를 받아야 하는 동안 세포 배양에서 수도 있습니다. 프로토콜에 표시 된 예제에서는 osteoblastic 감 별 법 및 하루 0와 차별화의 7에서 exRNA 컬렉션에 설명 합니다. 없는 차별화가 필요한 경우 제 3 항을 생략 하 고 섹션 4로가 서.
<ol><li>Osteoblastic 감 별 법 미디어 준비 (DMEM 10 %FBS, 1 %P / S, 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 염, 및 10 mM 1.25 비타민 D3) 신선한 모든 시간.</li>
	<li>MSCs는 80% 합칠, MSC 미디어 osteoblastic 감 별 법 미디어 변경.</li>
	<li>2-3 일 후 osteoblastic 감 별 법 미디어를 보충.</li>
	<li>차별화의 날 5, 미디어를 제거 하 고 씻어 3 셀 T175 플라스 크 당 20 mL PBS의 x.</li>
	<li>EV 컬렉션 포함 된 미디어 10 m m β-glycerophosphate, 10 nM dexamethasone, 50 μ M 하는데-2-인산 및 MSCs. 품 5% CO2 되도록 48 h에 대 한 37 ° C에서 셀 계속의 confluent T175 플라스 크 당 10 mM 1.25 비타민 D3 의 20 mL를 추가 EVs 및 생체 수집 하면서 차별화입니다.</li>
	<li>7 일 미디어를 수집 하 고 분리 EVs와 생체 단계 2.2-2.6에에서 설명 된 대로 진행.</li>
	<li>품질 관리에 대 한 씨 셀 96-웰 스 또는 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (높은 산) 활동 분석 결과 사용 하 여 차별화를 평가 하기 위해 6-우물 또는 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량), 각각. 참고: 그림 3 셀의 osteogenic 차별화를 보여 주는 예제입니다.</li>
</ol>4. RNA 추출 및 품질 관리
<ol><li>샘플 단계 얼음에 2.8에서 녹여 RNA는 RNA 격리 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 압축을 풉니다.</li>
	<li>RNase 무료 물 100 μ에 RNA 격리 키트 (자료 테이블)에서 제공 하는 열 로부터 RNA을 elute.</li>
	<li>순화 된 RNA의 100 μ로 글 리 코겐, 2 M pH 5.5 나트륨 아세테이트의 10 μ와 미리 냉장된 99% 에탄올의 250 μ 1 μ를 추가 하 여 에탄올 강 수를 통해 RNA를 집중.</li>
	<li>-20 ° C 하룻밤 RNA 침전에서 샘플을 품 어. 16000 x g 와 4 ° C에서 20 분 동안 centrifuging으로 RNA를 펠 렛 참고: 펠 릿 glycogen으로 공동 강수량 때문에 흰색입니다.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 75% 에탄올의 1 mL와 RNA 펠 릿을 세척. 16000 x g 와 4 ° C에서 5 분 동안 다시 RNA를 펠 렛</li>
	<li>에탄올을 열어두고 RNA 튜브의 뚜껑 공기를 5 ~ 10 분 건조 RNA 펠 릿. RNase 무료 물 7 μ에 RNA 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>RNA 품질 및 제조 업체의 프로토콜 도서관 건축 이전에 따라 RNA를 검출 하 칩 기반 모 세관 전기 이동 법 기계를 사용 하 여 농도 확인 하십시오. 참고: RNA의 대표적인 크기 분포는 그림 4에 표시 됩니다.</li>
	<li>필요한 경우에 상업적인 정화 키트 (자료 테이블)를 사용 하 여 세포질 RNA를 추출 합니다.</li>
</ol>5. 도서관 건설 및 품질 관리
참고: 작은 RNA 라이브러리 입력 낮은 RNA 인해 조정 상업 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 구성 됩니다. 라이브러리 건설 냉장된 블록에서 수행 됩니다.
<ol><li>얼음에 0.2 mL PCR 튜브에 대 한가 열 블록을 진정 하 고 플라스틱 단계 4.6 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 냉장된 블록에서에서 RNA의 5 μ.</li>
	<li>3' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 희석된 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 및 원심 분리기 튜브의 하단에 모든 액체를 수집 하는 짧게 위아래로 pipetting으로 RNA의 5 μ와 혼합.</li>
	<li>품 어 데워 열 cycler에 2 분 동안 70 ° C에서 RNA와 3' 어댑터 믹스 하 고 냉장된 블록에 다시 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>RNA와 3' 어댑터 혼합물으로의 결 찰 버퍼 1 μ, RNase 억제제의 0.5 μ 및 T4 RNA 리가 (삭제 돌연변이)의 0.5 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>열 cycler에서 튜브 샘플 튜브에 정지 솔루션의 0.5 μ를 추가 하 고 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 계속 15 분 동안 28 ° C에 품 어.</li>
	<li>5' 어댑터 (1:10) 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에 RNase 무료 물에 희석. 별도 RNase 무료 0.2 mL PCR 튜브, 열 데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 5' 어댑터에 5' 어댑터의 0.5 μ를 추가 하 고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>10 nM ATP, 5' 어댑터 튜브에 T4 RNA 리가의 0.5 μ의 0.5 μ 추가, 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 하단에 모든 액체를 수집을 간단히 원심. 참고: 가능한 냉장된 블록에 5' 어댑터를 유지.</li>
	<li>5.6 단계에서 샘플을 5' 어댑터 혼합물의 1.5 μ를 추가 하 고 천천히 pipetting 8 x 매우 부드럽게 혼합. 데워 열 cycler에서 1 시간에 28 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>RNase 무료 물 0.2 mL RNase 무료 PCR 튜브에서에 RT 뇌관 1시 10분 희석. 단계의 5.9, 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 샘플에 희석된 RT 뇌관의 0.5 μ를 추가 하 고 간단히 원심.</li>
	<li>데워 열 cycler에서 2 분 동안 70 ° C에서 샘플을 품 어 그리고 냉장된 블록에 샘플을 놓습니다.</li>
	<li>첫 번째 가닥 버퍼, 12.5 m m dNTP 믹스의 0.5 μ, 100 m m dithiothreitol (DTT), RNase 억제제의 0.5 μ 그리고 역전사의 0.5 μ의 0.5 μ x 5의 1 μ를 추가 합니다. 8 x 위아래로 천천히 pipetting으로 매우 부드럽게 혼합 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>CDNA를 데워 열 cycler에서 1 h 50 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
	<li>초순의 4.25 μ, PCR 혼합의 12.5 μ, 인덱스 뇌관의 1 μ 그리고 보편적인 뇌관의 1 μ는 cDNA에 추가 합니다. 8 x 위아래로 pipetting으로 혼합 하 고 짧게 원심.</li>
	<li>열 cycler에서 샘플을 놓고는 자전거 타는 사람을 다음과 같이 설정: 98 ° C 30에 대 한 s; 10에 대 한 98 ° C의 15 주기 s, 60 ° C 30에 대 한 s와 15 72 ° C s; 그리고 마지막 10 분 동안 72 ° C를 가진 주기. 참고: 준비 라이브러리 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 1 주일 동안.</li>
	<li>140 사이 젤 (젤 추출) DNA 젤에 라이브러리를 분리 하 여 RNA 라이브러리를 정화 혈압과 160 혈압과 젤 라이브러리 건설 키트에 의해 주어진 프로토콜을 다음에서 라이브러리를 방출. 참고:이 연구 단계 5.15에서에서 준비 된 라이브러리에 로드 됩니다 상업 젤 (자료 테이블)와 140 사이 도서관 혈압과 160 bp를 밖으로 정화 하는 자동화 된 DNA 크기 fractionator (자료 테이블)에 따라 여는 제조 업체의 프로토콜입니다.</li>
	<li>집중 및 단계의 5.16 열 기반 PCR 정화 키트 (테이블의 재료)를 사용 하 여 라이브러리를 세척 하 고 마침내 10 μ RNase 무료 물에 도서관을 elute.</li>
	<li>제조 업체의 프로토콜에 따라 라이브러리의 크기를 확인 하려면 DNA 칩 (자료 테이블)에 순화 된 라이브러리의 1 μ를 로드 합니다.</li>
	<li>10 m m pH 8.0에서에서 순화 된 라이브러리 (1:1000)의 1 μ 희석 Tris HCl 0.05% 폴 20와 정량 키트에 DNA 표준을 사용 하 여 라이브러리 농도 계량 하는 상용 라이브러리 정량화 키트를 사용 하 여 라이브러리를 계량 하 고.</li>
	<li>수영장 높은 처리량 시퀀싱 시스템에 시퀀싱 컴퓨터와 시퀀스의 요구에 따라 라이브러리의 동일 금액 참고: 세포질 RNA의 도서관 건축을 할 수 있습니다 키트의 표준 프로토콜에 따라 같은 키트를 사용 하 여.</li>
</ol>6. 생물 정보학 파이프라인
참고: 이것은 내부 파이프라인 및 여기에 사용 되는 프로그램에 나와 있는 테이블의 자료.
<ol><li>멀리 낮은 품질 읽기를 트림 하 고 원시 읽기에서 어댑터 시퀀스를 제거 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 읽기 RNAs의 다른 종류에 매핑됩니다.<ol>
<li>무 겁 게 수정된 tRNA 시퀀스 자주 기본 misincorporation 역전사에 의해 때문에 두 개의 불일치를 함으로써 tRNAs 주석을.</li>
		<li>매핑 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 인간의 miRNAs에 의해 miRNAs 주석을. 이후 A는 miRNAs와 U nontemplated 3' 끝 추가, 매핑되지 않는 시퀀스는 3' 최대 3 A / T 국세청 후 읽기 매핑됩니다 인간의 miRNAs와 제로 불일치를 허용 하는 miRBase v21에서 다른 miRNAs의 손질.</li>
		<li>한 불일치를 함으로써 (snRNA, snoRNA, 피 르 나, 그리고 Y RNAs) 다른 관련 작은 RNAs를 주석을.</li>
		<li>나머지 매핑되지 않은 읽기를 저하를 평가 하 긴 RNA 데이터 집합 (rRNA, Rfam, 및 mRNA에서 다른 RNA)에 매핑됩니다.</li>
		<li>인간 게놈 시퀀스를 주석을.</li>
		<li>주석을 세균성 게놈을 시퀀스.</li>
		<li>MiRNA 식 다음 수식을 사용 하 여 정규화: 미르 계산 / 모든 매핑된 miRNAs의 총 계산) x 106.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 낮은 입력된 샘플에서 차동 식 분석을 가능 하 게 exRNAs의 다음 세대 시퀀싱에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 심지어 작은 변경 (즉, ultracentrifugation 단계 또는 회전자 유형 변경)는 transcriptome 영향을 미칠 수 있기 때문에 miRNA 레벨13,14EV 및 exRNA 격리에 대 한 특정 프로토콜을 준수 하는 것이 중요 합니다. 따라서, 어떻게는 exRNA는 절연, 결과 비교할 수 실험에서 모든 샘플에 동일한 실험 및 bioinformatic 절차를 적용 하는 것이 중요 하다.
RNA 무결성은 일반적으로 bioanalyzer에 평가 됩니다. ExRNAs의 없는 상태 이므로 전체 길이 rRNA, 그들의 린 값은 매우 낮은, 그러나,이 낮은 품질 RNA 샘플을 반드시 반영 하지 않습니다. 또한, RNA 농도 exRNAs의 크게 다...

세포 외 및 순환 RNAs (exRNAs) 다양 한 체액에 존재 하 고 저항 RNases1,2쪽으로 있습니다. 그들의 높은 풍부, 안정성과 접근의 용이성 진단 및 예 후 마커3임상 평가 대 한 매력이 있습니다. ExRNAs에 대 한 전송 모드 포함 extracellular 소포 (EVs), 단백질 (예: 고밀도 지 단백;와 협회 HDL) 및 ribonucleoprotein 단지 (와 같은 Argonaute2 단지와 함께)4.
ExRNAs의 하위 집합은 작은 비 코딩 RNAs의 약 22 microRNAs (miRNAs), nt posttranscriptional 유전자 발현을 조절 하는. 전 miRNAs 셀 통신 및 세포 항상성5의 규칙에 연루 되었습니다. HDL 전-미르-223 내 피 세포 세포 접착 분자 1 (ICAM-1)를 억 누르기 위해 제공 하는 예를 들어와 염증을6. 흥미롭게도, 미르-223는 또한 더 많은 침략 형7에 그들을 프로그래밍 하는 폐 암 세포를 백혈구에서 extracellular 소포에 의해 수송 여겨진다. 따라서, 다양 한 체액 및 세포 배양 매체에서 전 miRNAs의 transcriptome 크게 전 미르 신호에 대 한 우리의 이해를 향상 됩니다.
작은 RNA 시퀀싱 (작은 RNA seq) 작은 RNAs의 transcriptomics를 이해 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 뿐만 아니라 다른 샘플 차동 표현된 알려진된 RNAs 사이 비교 될 수 있다 하지만 소설 작은 RNAs 수 또한 감지 하 고 특징. 따라서, 그것은 또한 다른 조건 하에서 차동 표현된 miRNAs 식별 하는 강력한 방법입니다. 그러나, 작은 RNA seq의 장애물 중 하나는 뇌 척수의 체액, 타 액, 소변, 우유, 혈 청 및 문화 미디어 같은 낮은 exRNA 입력된 액체에서 작은 RNA seq 라이브러리 생성 어려움입니다. TruSeq 작은 RNA 라이브러리 준비 프로토콜 Illumina에서 고품질 총 RNA의 약 1 µ g 필요 하며 뉴 잉글랜드 Biolabs에서 NEBNext 작은 RNA 라이브러리 준비 설정 프로토콜 100 ng-1 µ g의 RNA8,9. 때때로, 이러한 샘플에서 총 RNA 기존의 대 한 UV 광에 대 한 검출 한계 같습니다.
체액에서 파생 된 전 miRNAs는 잠재적으로 좋은 전조와 진단 마커. 그러나, 기능 효과 연구 하거나 특정 전 miRNAs의 원산지 결정, 세포 배양 시스템 자주 대신 사용 됩니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)는 그들의 EVs 심근 경색, Alzheimer의 질병과 접 붙이다 비교 호스트 질병10를 포함 하 여 많은 질병을 경감에 연루 되어 있기 때문에 광범위 하 게 연구 되었습니다 있다. 여기, 우리 골 수 파생 된 MSCs (BMSCs)와 작은 RNA 도서관 건설, 시퀀싱 및 데이터 분석 (그림 1)을 최적화 하는 데 사용 하는 특정 단계에서 전 miRNAs의 정화를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>골수 유래 중간엽 줄기 세포</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-012</td><td>이 프로토콜에 사용된 세포는</td></tr><tr><td>중간엽 줄기 세포 성장 매체(MSC 매체)로 명명된</td> ATCC<td>MSCGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td></tr>에서 구입했습니다.<tr><td>엑소좀 고갈 FBS</td><td>Gibco</td><td>A2720801</td><td></td></tr><tr><td>ExRNA 수집 매체: MSCGM, FBS는 엑소좀 고갈 FBS</td><td></td><td></td>로 대체되었습니다.<td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>T175 플라스크</td><td>Sarstedt</td><td>833,912</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>시그마</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>초원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 병(캡 어셈블리 포함</td>) <td>Beckman 여기에 사용된 Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Type 60 Ti</td><td></td><td></td><td>Rotor</td></tr><tr><td>NucleoCounter</td><td>Chemometec</td><td>NC-3000</td><td>Cell Counter</td></tr><tr><td>&beta;-glycerophosphate</td><td>Calbiochem</td><td>35675</td><td>골형성 분화 매체의 성분</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Sigma</td><td>D4902-25MG</td><td>골형성 분화 매체의 성분</td></tr><tr><td>2-Phospho-L-아스코르빅&nbsp; 산성 삼나트륨 염</td><td>시그마</td><td>49752-10G</td><td>골 형성 분화 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>1&alpha;,25-Dihydroxyvitamin&nbsp; D3</td><td>Sigma</td><td>D1530-1MG</td><td>골형성 분화 매체의 구성 요소</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>miRNA 및 총 RNA 정제 키트 4.8단계를 위한</td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Pico Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1514</td><td>RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩</td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939BA</td><td>RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩</td></tr><tr><td>Agilent 고감도 DNA 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td>RNA 및 DNA 분석을 위한 칩 기반 모세관 전기영동 기계 및 칩</td></tr><tr><td>KAPA 라이브러리 정량 키트 Roche</td><td></td><td>KK4824</td><td>여기에 사용된 라이브러리 정량 키트</td></tr><tr><td>TruSeq Small RNA Library Prep Kit -Set A(24 rxns) (세트 A: 인덱스 1-12)</td><td></td> 이 프로토콜에 사용된 Illumina <td>RS-200-0012</td><td>Small RNA library prepartion kit - 5단계에서 사용</td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Sage Science</td><td></td><td>이 프로토콜에 사용된 Automated DNA gel extractor; 수동 추출도 가능.</td></tr><tr><td>MinElute PCR 정제 키트</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>PCR 정제 5.1</td></tr><tr><td>FASTX_Toolkit</td> 7단계에서 <td>Cold Spring Harbor Lab</td><td></td><td>Trimming low-quality reads in step 6</td></tr><tr><td>cutadapt</td><td></td><td></td><td>6단계에서 어댑터 제거</td></tr><tr><td>6단계에서 깨끗한</td><td>읽기의 Bowtie</td><td></td><td></td> 매핑</tr><tr><td>Samtools</td><td></td><td></td><td>6단계에서 표현식 프로파일을 만들려면</td></tr><tr><td>Bedtools</td><td></td><td></td><td>6단계에서 표현식 프로파일을 만들려면</td></tr></tbody></table>

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 micrornas 분석

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

세포 외 및 순환 RNAs (exRNA)는 신체의 많은 세포 유형에 의해 생산과 타 액, 혈장, 혈 청, 우유와 소변 등 수많은 체액에 존재. 이러한 RNAs의 한 하위 집합은 posttranscriptional 레 귤 레이 터-microRNAs (miRNAs). 특정 세포 유형에 의해 생산 하는 miRNAs의 윤곽을 그리 다 생체 외에서 문화 시스템 수확 사용할 수와 프로필 exRNAs 셀의 한 하위 집합에서 파생 된. 중간 엽 줄기 세포의 secreted 요소 경감 수많은 질병에 연루 되 고 여기에 체 외 모델 시스템으로 사용 된다. 이 문서 수집의 과정, 작은 RNA의 정화 및 시퀀스 extracellular miRNAs에 라이브러리 생성에 설명합니다. 문화 미디어에서 ExRNAs 낮은 RNA 입력된 샘플, 최적화 된 프로시저를 호출 하 여 세포질 RNA에서 다. 이 프로토콜에 포괄적인 가이드를 작은 exRNA 시퀀싱 문화 미디어에서 exRNA 정화 및 시퀀싱 하는 동안 각 단계에서 품질 관리 검사점을 보여주는 제공 합니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 방법은 다음 세대 시퀀싱 MSC 문화에서 exRNA 수집 최적화 됩니다. 워크플로의 전체 체계는 그림 1 에 왼쪽에 있으며 각각 품질 관리 검사점 오른쪽에.
컬렉션에 대 한의 날에 세포의 형태학 undifferentiated (그림 3A)와 (그림 3B) 분화 세포 표시 됩니다. 또한, 7 일 대 한 유도 하는 세포의 ALP 활동의 대표적인 정규화 된 레벨 (그림 3C)에 표시 됩니다. 여기, ALP 활동은 약 2.5 배 uninduced 셀의.
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이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

이것은 세포에서 세포 외 소포에서 파생된 작은 RNA를 시퀀싱하는 기술적 문제를 해결하는 첫 번째 논문입니다. NGS 샘플은 엄격한 준비 와 품질 관리가 필요합니다. EV의 특성으로 인해 EV 샘플의 QC 프로세스는 표준에서 벗어나게 됩니다.이 프로토콜의 장점은 처음 사용자를 위한 QC 단계입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 조수 인 준이 수입니다. 시작하려면, 5개의 T175 플라스크에서 신선한 MSC 매체에서 2, 000 평방 센티미터 당 세포2, 000 세포에서 인간 중간엽 줄기 세포를 플레이트.그런 다음 5%의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 세포를 성장시키고 90%의 콘부유성 세포의 5플라스크가 얻어지을 때까지 2~3일마다 미디어를 대체한다. 다음으로 플라스크 당 PBS 20 밀리리터로 셀을 세 번 씻으세요. 각 플라스크에 EV 수집 미디어 20밀리리터를 추가합니다.그리고 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 미디어를 수집하고 원심 분리기는 섭씨 300g과 섭씨 4도에서 10분 동안 수집합니다. 그런 다음 상체를 수집하고 2, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 미디어를 원심 분리합니다.상체를 다시 수집하고, 15, 500 g 및 섭씨 4도에서 30 분 동안 미디어를 원심 분리합니다. 마지막으로 상체를 수집합니다. 다음으로 미디어를 초원심분리기 튜브로 전송합니다.60Ti 고정 각도 로터가 여기에 사용되며 펠릿은 튜브 측면에 고정됩니다. 펠릿이 예상되는 뚜껑의 측면을 표시하고 펠릿이 예상되는 튜브 측면에 원을 그립니다. 그리고 100, 000g 및 섭씨 4도에서 90 분 동안 exRNA를 펠렛.최종 원심 분리 후, 상체를 제거합니다. 튜브의 바닥을 만지지 않고 튜브 의 내부를 건조 흡수 용지의 작은 조각을 사용합니다. 그리고 흡수성 용지에 튜브를 반전.펠릿을 다시 중단하려면 각 튜브에 200 마이크로리터를 추가하고 튜브를 30초 동안 소용돌이치십시오. 파이펫을 20번 위아래로 바침합니다. 그런 다음 나노 입자 추적 분석을 통해 세포 외 소포 및 기타 생체 분자를 평가합니다.그리고 추가 실험이 될 때까지 펠릿을 영하 80도에 보관하십시오. 시료를 해동한 후, RNA 절연 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다. RNA 분리 키트에 제공된 열에서 RNA를 100 마이크로리터에 RNA가 없는 물로 엘테.에탄올 강수화를 통해 RNA를 농축하려면 글리코겐 1마이크로리터, 2-연체pH-5.5 나트륨 아세테이트 10마이크로리터, 정제된 RNA의 100마이크로리터에 미리 냉각된 99%에탄올 250마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 RNA를 침전시키기 위해 하룻밤 사이에 영하 20도에서 샘플을 배양합니다. RNA를 펠릿하기 위해 원심분리기는 16, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 합니다.다음으로, 상체를 제거하고 RNA 펠릿을 75%의 1밀리리터로 세척한다. 원심분리기는 16, 000g 및 4°C에서 5분 동안 다시 RNA를 펠릿합니다. 에탄올을 제거하고 RNA 튜브의 뚜껑을 5-10분 동안 열어 RNA 펠릿을 공기 건조시 둡니다.RNA 펠릿을 RNA 가 없는 7개의 마이크로리터에서 재중단하고 칩 기반 모세관 전기포고증 기계를 사용하여 RNA 품질 과 농도를 감지합니다. 라이브러리 구조를 시작하기 위해 RNA의 5 마이크로리터를 냉각 된 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 피펫합니다. 다음으로, 3'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNA가 없는 물에 희석합니다.희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 RNA 튜브에 넣고 혼합물을 8번 위아래로 피펫합니다. 원심 분리기는 튜브 의 바닥에있는 모든 액체를 수집하기 위해 간단히합니다. 예열된 열 사이클러에서 RNA 어댑터 혼합물을 섭씨 70도에서 2분간 배양합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 다시 놓습니다. 다음으로, 렌지 버퍼의 마이크로리터 1개, RNAse 억제제의 0.5 마이크로리터, 및 T4 RNA 리구아제의 0.5 마이크로리터를 RNA 어댑터 혼합물에 첨가한다. 피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다.그런 다음 예열 된 열 사이클러에서 1 시간 동안 28도에서 튜브를 배양합니다. 다음으로, 튜브가 열 사이클러에 머무르면서 시료 튜브에 스톱 용액의 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 피펫은 8회 오르내리며 섭씨 28도에서 15분 동안 계속 배양합니다.비약용 5'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNAe 가 없는 물로 희석하십시오. 희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 5'어댑터를 섭씨 70도에서 2분간 가열합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. T4 RNA 리개갈의 10나노몰 ATP의 0.5 마이크로리터와 0.5 마이크로리터를 5'어댑터 튜브에 추가합니다. 피펫을 위아래로 8번.그리고 원심 분리기는 바닥에 모든 액체를 수집하기 위해 간단히. 다음으로, RNA 샘플에 5'어댑터 혼합물의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫은 8번 매우 부드럽게 샘플을 1시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.cDNA를 얻으려면, 비약체가 없는 물에서 역전사 프라이머를 1대 10 부피 비율로 희석한다. 희석된 프라이머의 0.5 마이크로리터를 RNA 샘플에 넣고, 파이펫8회는 매우 부드럽게, 원심분리기를 간단히 드시면 넣습니다. 그런 다음 예열된 열 순환기에서 2 분 동안 RNA 및 프라이머 혼합물을 섭씨 70도에서 배양합니다.그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. 다음으로, 5X 퍼스트 스트랜드 버퍼 1편, 12.5밀리머 DNTP 혼합물의 0.5 마이크로리터, 100밀리머 DTT의 0.5 마이크로리터, RNAse 억제제 0.5 마이크로리터, 시료 튜브에 역전사 0.5 마이크로리터를 첨가한다. 파이펫 8 번 매우 부드럽게.그리고 원심분리기는 간단히 말했습니다. 예열된 열 순환기에서 1시간 동안 섭씨 50도에서 샘플을 배양합니다. 다음으로, 초순수 4.25마이크로리터, PCR 믹스의 12.5 마이크로리터, 인덱스 프라이머의 마이크로리터 1개, 범용 프라이머 1마이크로리터를 cDNA 샘플에 넣습니다.피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다. 마지막으로 샘플을 열 사이클러에 배치하고 원고에 따라 사이클러를 설정합니다. RNA 라이브러리를 정화하려면 자동화된 DNA 크기 분획기를 사용하여 140~160개의 기본 쌍 사이의 대역을 유수합니다.기둥 기반 PCR 정화 키트에 추출된 라이브러리를 실행하고, RNAse가 없는 물의 10마이크로리터로 라이브러리를 엘테. 라이브러리의 크기를 확인하려면 정제된 라이브러리의 마이크로리터 1개를 DNA 칩에 로드하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 도서관 농도를 정량화하기 위해 먼저 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 1대 1, 000 부피 비율로 1마이크로리터를 희석시켰다.그런 다음 상용 라이브러리 정량화 키트의 DNA 표준을 사용하여 QPCR을 실행합니다. 마지막으로 시퀀싱 기계의 요구 사항에 따라 동일한 양의 라이브러리를 풀링하고 처리량이 높은 시퀀싱 시스템에서 시퀀스합니다. 세포 외 RNA의 전엽은 RNA의 넓은 범위를 포함.대조적으로, 세포 RNA는 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA 및 28SrRNA에 대응하는 아주 뚜렷한 피크를 보여주었습니다. 두 라이브러리의 품질은 높고 비교할 수 있었습니다. 두 라이브러리의 길이 분포는 마이크로RNA와 상관 관계가 있는 22개의 뉴클레오티드에서 단일 피크를 보였다.대조적으로, 세포외 RNA의 라이브러리는 더 이질적이었고, tRNA, 반쪽 및 파편 또는 piRNA와 상관 관계가 있는 두 개의 더 많은 피크를 포함했습니다. 세포 RNA에서 읽는 65%는 인간 microRNA에 매핑되었고, 다른 작은 RNA는 매핑된 읽기의 작은 부분을 차지하였다. 대조적으로, 세포외 RNA의 단지 8%는 인간 microRNAs에 일치합니다.판독값이 매핑된 가장 풍부한 작은 RNA는 tRNA였고, 타의 추종을 불허하는 판독은 나중에 세균 성 서열과 일치합니다. 소 게놈에 비교는 FBS가 오염의 근원이 아니었다는 것을 건의했습니다. 따라서, 세포외 RNA는 일반적인 세포 RNA에 비해 비정형 프로파일을 나타낸다.라이브러리 준비는 이 프로토콜의 중요한 부분입니다. 거품이 형성되는 것을 피하기 위해 혼합은 매우 부드럽게 수행해야합니다. 이 방법은 또한 exRNAs의 기능을 공부하는 데 도움이 세포의 다른 종류에서 exRNAs의 프로파일을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

exosomes에서 안정 마이크로 RNA (miRNA에)의 존재는 생체로 및 치료 개입에 대한 경로로 자신의 잠재력 유틸리티, 간 커뮤니케이션의 새로운 형태로 엄청난 관심을 생성했습니다. 여기에 우리가 전송되는 miRNA에를 식별하는 정량 PCR에 의해 다음 혈액과 문화 미디어에서 exosome 정화를 보여줍니다.

혈액과 문화 매체에서 파생 Exosomes의 정화 및 마이크로 RNA 프로파일

중간엽 줄기세포(MSC)는 용해성 인자 또는 특정 생체 물질로 자극될 때 조골세포 계통으로 분화 가능성이 있습니다. 이 연구는 소 뼈 기질 Nukbone(NKB)을 골격으로 사용하는 인간 양막(AM-hMSC)에서 MSC를 전달하기 위한 새로운 옵션을 제시합니다.

인간 중간 엽 줄기 세포의 분리 및 다공성 뼈 매트릭스에 자신의 재배

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

담즙액은 잠재적으로 중요한 바이오마커를 포함하는 세포 외 소포체/엑소좀의 귀중한 공급원입니다. 이 프로토콜은 miRNA 프로파일링을 포함한 추가 분석을 위해 인간 담즙에서 엑소좀을 분리하는 강력한 방법을 나타냅니다.

격리 및 프로파일 링 마이크로 RNA-포함하는 인간의 담즙에서 엑소 좀을

여기서, 우리는 인간 탯줄 (UC)와 코드에 태아 태반 샘플 분리 용 (CL), 왓슨의 젤리 (WJ), 코드 - 태반 접합부 (CPJ) 태아 태반 (FP) 라이닝 박리를위한 프로토콜을 제시 상기 이식편 배양 기술을 이용하여 중간 엽 간질 세포 (MSC들)의 특성화.

인간 제대혈 및 태아 태반에서 중간 엽 기질 세포의 분리 및 특성

여기서는 작은 RNA를 격리하고, microRNAs를 보강하고, 처리량이 높은 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하기 위한 단계별 전략을 설명합니다. 그런 다음 시퀀스 읽기를 처리하고 오픈 소스 도구를 사용하여 microRNAs에 정렬하는 방법을 설명합니다.

MicroRNAs를 격리하고 시퀀싱하고 오픈 소스 도구를 사용하여 분석하기 위한 완벽한 파이프라인

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

여기서 설명된 메틸화 특이적 프로브 증폭 방법은 골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포에서 LINE-1 원소의 메틸화 수준을 분석하는 방법이다. 태아 소 혈청에서 세포 외 소포를 분리하는 인기있는 절차인 초원심분리도 입증되었습니다.

골육종 유래 세포외 소포로 처리된 중간엽 줄기 세포의 LINE-1 메틸화 분석

이 프로토콜은 간단한 실험실 규모의 벤치탑 설정으로 인간 탯줄 유래 중간엽 줄기 세포의 작은 세포외 소포(hUC-MSC-sEV)를 분리하는 방법을 보여줍니다. 분리된 hUC-MSC-sEV의 크기 분포, 단백질 농도, sEV 마커 및 형태는 각각 나노입자 추적 분석, BCA 단백질 분석, 웨스턴 블롯 및 투과 전자 현미경으로 특성화됩니다.

인간 중간엽 줄기세포에서 작은 세포외 소포를 분리하는 간단한 탁상형 여과 방법

본 프로토콜은 배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 대표적인 EV(엑소좀 및 마이크로베시클)를 분리하고 특성화하기 위한 차등 원심분리를 설명합니다. 이러한 EV의 추가 응용 프로그램도 이 기사에서 설명합니다.

배양된 인간 중간엽 줄기세포에서 세포외 소포의 분리, 특성화 및 치료적 적용

배우세요 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs를 분리하고 시퀀싱하는 방법을. 이 프로토콜은 소량 샘플을 위한 품질 관리 단계를 포함하여 NGS 라이브러리 구축을 용이하게 합니다.

격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석

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