격리, 시퀀싱 및 인간 중간 엽 줄기 세포에서 세포 외 MicroRNAs 분석
2019년 3월 8일
이 프로토콜에서는 작은 RNA 도서관 건설 및 다음 세대 시퀀싱에 대 한 세포 배양에서 세포 외 microRNAs 정화 하는 방법을 보여 줍니다. 다양 한 품질 관리 검사점 작업 exRNAs 같은 낮은 입력된 샘플을 할 때 기대 하는 것을 이해 하는 독자 수 있도록 기술 된다.
이것은 세포에서 세포 외 소포에서 파생된 작은 RNA를 시퀀싱하는 기술적 문제를 해결하는 첫 번째 논문입니다. NGS 샘플은 엄격한 준비 와 품질 관리가 필요합니다. EV의 특성으로 인해 EV 샘플의 QC 프로세스는 표준에서 벗어나게 됩니다.
이 프로토콜의 장점은 처음 사용자를 위한 QC 단계입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 조수 인 준이 수입니다. 시작하려면, 5개의 T175 플라스크에서 신선한 MSC 매체에서 2, 000 평방 센티미터 당 세포2, 000 세포에서 인간 중간엽 줄기 세포를 플레이트.
그런 다음 5%의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 세포를 성장시키고 90%의 콘부유성 세포의 5플라스크가 얻어지을 때까지 2~3일마다 미디어를 대체한다. 다음으로 플라스크 당 PBS 20 밀리리터로 셀을 세 번 씻으세요. 각 플라스크에 EV 수집 미디어 20밀리리터를 추가합니다.
그리고 48 시간 동안 5 %의 이산화탄소 환경에서 섭씨 37도에서 배양하십시오. 미디어를 수집하고 원심 분리기는 섭씨 300g과 섭씨 4도에서 10분 동안 수집합니다. 그런 다음 상체를 수집하고 2, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 미디어를 원심 분리합니다.
상체를 다시 수집하고, 15, 500 g 및 섭씨 4도에서 30 분 동안 미디어를 원심 분리합니다. 마지막으로 상체를 수집합니다. 다음으로 미디어를 초원심분리기 튜브로 전송합니다.
60Ti 고정 각도 로터가 여기에 사용되며 펠릿은 튜브 측면에 고정됩니다. 펠릿이 예상되는 뚜껑의 측면을 표시하고 펠릿이 예상되는 튜브 측면에 원을 그립니다. 그리고 100, 000g 및 섭씨 4도에서 90 분 동안 exRNA를 펠렛.
최종 원심 분리 후, 상체를 제거합니다. 튜브의 바닥을 만지지 않고 튜브 의 내부를 건조 흡수 용지의 작은 조각을 사용합니다. 그리고 흡수성 용지에 튜브를 반전.
펠릿을 다시 중단하려면 각 튜브에 200 마이크로리터를 추가하고 튜브를 30초 동안 소용돌이치십시오. 파이펫을 20번 위아래로 바침합니다. 그런 다음 나노 입자 추적 분석을 통해 세포 외 소포 및 기타 생체 분자를 평가합니다.
그리고 추가 실험이 될 때까지 펠릿을 영하 80도에 보관하십시오. 시료를 해동한 후, RNA 절연 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 RNA를 추출합니다. RNA 분리 키트에 제공된 열에서 RNA를 100 마이크로리터에 RNA가 없는 물로 엘테.
에탄올 강수화를 통해 RNA를 농축하려면 글리코겐 1마이크로리터, 2-연체pH-5.5 나트륨 아세테이트 10마이크로리터, 정제된 RNA의 100마이크로리터에 미리 냉각된 99%에탄올 250마이크로리터를 첨가한다. 그런 다음 RNA를 침전시키기 위해 하룻밤 사이에 영하 20도에서 샘플을 배양합니다. RNA를 펠릿하기 위해 원심분리기는 16, 000g 및 섭씨 4도에서 20 분 동안 원심분리기를 합니다.
다음으로, 상체를 제거하고 RNA 펠릿을 75%의 1밀리리터로 세척한다. 원심분리기는 16, 000g 및 4°C에서 5분 동안 다시 RNA를 펠릿합니다. 에탄올을 제거하고 RNA 튜브의 뚜껑을 5-10분 동안 열어 RNA 펠릿을 공기 건조시 둡니다.
RNA 펠릿을 RNA 가 없는 7개의 마이크로리터에서 재중단하고 칩 기반 모세관 전기포고증 기계를 사용하여 RNA 품질 과 농도를 감지합니다. 라이브러리 구조를 시작하기 위해 RNA의 5 마이크로리터를 냉각 된 0.2 밀리리터 PCR 튜브로 피펫합니다. 다음으로, 3'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNA가 없는 물에 희석합니다.
희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 RNA 튜브에 넣고 혼합물을 8번 위아래로 피펫합니다. 원심 분리기는 튜브 의 바닥에있는 모든 액체를 수집하기 위해 간단히합니다. 예열된 열 사이클러에서 RNA 어댑터 혼합물을 섭씨 70도에서 2분간 배양합니다.
그런 다음 샘플을 차가운 블록에 다시 놓습니다. 다음으로, 렌지 버퍼의 마이크로리터 1개, RNAse 억제제의 0.5 마이크로리터, 및 T4 RNA 리구아제의 0.5 마이크로리터를 RNA 어댑터 혼합물에 첨가한다. 피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다.
그런 다음 예열 된 열 사이클러에서 1 시간 동안 28도에서 튜브를 배양합니다. 다음으로, 튜브가 열 사이클러에 머무르면서 시료 튜브에 스톱 용액의 0.5 마이크로리터를 추가합니다. 피펫은 8회 오르내리며 섭씨 28도에서 15분 동안 계속 배양합니다.
비약용 5'어댑터를 1대 10 부피 비율로 RNAe 가 없는 물로 희석하십시오. 희석된 어댑터의 0.5 마이크로리터를 별도의 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 넣습니다. 5'어댑터를 섭씨 70도에서 2분간 가열합니다.
그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. T4 RNA 리개갈의 10나노몰 ATP의 0.5 마이크로리터와 0.5 마이크로리터를 5'어댑터 튜브에 추가합니다. 피펫을 위아래로 8번.
그리고 원심 분리기는 바닥에 모든 액체를 수집하기 위해 간단히. 다음으로, RNA 샘플에 5'어댑터 혼합물의 1.5 마이크로리터를 추가합니다. 파이펫은 8번 매우 부드럽게 샘플을 1시간 동안 섭씨 28도에서 배양합니다.
cDNA를 얻으려면, 비약체가 없는 물에서 역전사 프라이머를 1대 10 부피 비율로 희석한다. 희석된 프라이머의 0.5 마이크로리터를 RNA 샘플에 넣고, 파이펫8회는 매우 부드럽게, 원심분리기를 간단히 드시면 넣습니다. 그런 다음 예열된 열 순환기에서 2 분 동안 RNA 및 프라이머 혼합물을 섭씨 70도에서 배양합니다.
그런 다음 샘플을 차가운 블록에 놓습니다. 다음으로, 5X 퍼스트 스트랜드 버퍼 1편, 12.5밀리머 DNTP 혼합물의 0.5 마이크로리터, 100밀리머 DTT의 0.5 마이크로리터, RNAse 억제제 0.5 마이크로리터, 시료 튜브에 역전사 0.5 마이크로리터를 첨가한다. 파이펫 8 번 매우 부드럽게.
그리고 원심분리기는 간단히 말했습니다. 예열된 열 순환기에서 1시간 동안 섭씨 50도에서 샘플을 배양합니다. 다음으로, 초순수 4.25마이크로리터, PCR 믹스의 12.5 마이크로리터, 인덱스 프라이머의 마이크로리터 1개, 범용 프라이머 1마이크로리터를 cDNA 샘플에 넣습니다.
피펫을 8번 위아래로, 원심분리기는 간단히 말했습니다. 마지막으로 샘플을 열 사이클러에 배치하고 원고에 따라 사이클러를 설정합니다. RNA 라이브러리를 정화하려면 자동화된 DNA 크기 분획기를 사용하여 140~160개의 기본 쌍 사이의 대역을 유수합니다.
기둥 기반 PCR 정화 키트에 추출된 라이브러리를 실행하고, RNAse가 없는 물의 10마이크로리터로 라이브러리를 엘테. 라이브러리의 크기를 확인하려면 정제된 라이브러리의 마이크로리터 1개를 DNA 칩에 로드하고 제조업체의 프로토콜을 따릅니다. 도서관 농도를 정량화하기 위해 먼저 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 10밀리머 pH-8.0 Tris-Hcl에서 1대 1, 000 부피 비율로 1마이크로리터를 희석시켰다.
그런 다음 상용 라이브러리 정량화 키트의 DNA 표준을 사용하여 QPCR을 실행합니다. 마지막으로 시퀀싱 기계의 요구 사항에 따라 동일한 양의 라이브러리를 풀링하고 처리량이 높은 시퀀싱 시스템에서 시퀀스합니다. 세포 외 RNA의 전엽은 RNA의 넓은 범위를 포함.
대조적으로, 세포 RNA는 5StRNA, 5.8SrRNA, 18SrRNA 및 28SrRNA에 대응하는 아주 뚜렷한 피크를 보여주었습니다. 두 라이브러리의 품질은 높고 비교할 수 있었습니다. 두 라이브러리의 길이 분포는 마이크로RNA와 상관 관계가 있는 22개의 뉴클레오티드에서 단일 피크를 보였다.
대조적으로, 세포외 RNA의 라이브러리는 더 이질적이었고, tRNA, 반쪽 및 파편 또는 piRNA와 상관 관계가 있는 두 개의 더 많은 피크를 포함했습니다. 세포 RNA에서 읽는 65%는 인간 microRNA에 매핑되었고, 다른 작은 RNA는 매핑된 읽기의 작은 부분을 차지하였다. 대조적으로, 세포외 RNA의 단지 8%는 인간 microRNAs에 일치합니다.
판독값이 매핑된 가장 풍부한 작은 RNA는 tRNA였고, 타의 추종을 불허하는 판독은 나중에 세균 성 서열과 일치합니다. 소 게놈에 비교는 FBS가 오염의 근원이 아니었다는 것을 건의했습니다. 따라서, 세포외 RNA는 일반적인 세포 RNA에 비해 비정형 프로파일을 나타낸다.
라이브러리 준비는 이 프로토콜의 중요한 부분입니다. 거품이 형성되는 것을 피하기 위해 혼합은 매우 부드럽게 수행해야합니다. 이 방법은 또한 exRNAs의 기능을 공부하는 데 도움이 세포의 다른 종류에서 exRNAs의 프로파일을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
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개요
이 프로토콜은 소형 RNA 라이브러리 구성 및 차세대 시퀀싱을 위해 세포 배양 배지에서 세포외 마이크로RNA를 정제하는 방법을 보여줍니다. exRNA와 같은 저 입력 샘플을 다룰 때 기대할 수 있는 것을 독자들이 이해할 수 있도록 다양한 품질 관리 체크포인트가 설명되어 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생물학
- 세포외 소포
배경
- 세포외 소포에서 파생된 소형 RNA의 시퀀싱에 대한 기술적 문제를 다루는 최초의 논문입니다.
- NGS 샘플은 엄격한 준비 및 품질 관리가 필요합니다.
- EV 샘플의 QC 프로세스는 표준과 다릅니다.
- 프로토콜에는 처음 사용하는 사용자를 위한 QC 단계가 포함되어 있습니다.
연구 목적
- 세포외 마이크로RNA를 정제하는 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 소형 RNA 라이브러리 구성을 용이하게 합니다.
- 차세대 시퀀싱 결과를 향상시킵니다.
사용된 방법
- 제곱센티미터당 2,000개의 인간 간엽 줄기 세포를 배양합니다.
- T175 플라스크에 신선한 MSC 배지를 사용합니다.
- 프로토콜 전반에 걸쳐 품질 관리 체크포인트를 구현합니다.
- 연구 조교가 절차를 시연합니다.
주요 결과
- 세포외 마이크로RNA의 성공적인 정제.
- EV 샘플에 대한 신뢰할 수 있는 QC 프로세스의 수립.
- 저 입력 샘플 처리에 대한 이해 향상.
- NGS를 위한 소형 RNA 라이브러리 구성의 용이성.
결론
- 이 프로토콜은 exRNA를 정제하기 위한 포괄적인 접근 방법을 제공합니다.
- 품질 관리 단계는 성공적인 시퀀싱에 필수적입니다.
- 이 방법은 처음 사용하는 사용자가 자신 있게 사용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Profiling extracellular microRNAs from mesenchymal stem cells enables mechanistic de-risking of paracrine signaling pathways in regenerative medicine and immunomodulation. This protocol supports target validation by linking secreted miRNA cargo to functional phenotypes in disease-relevant systems. Quality-controlled exRNA sequencing provides predictive confidence for biomarker discovery and preclinical model alignment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by defining the miRNA signature of MSC-derived exosomes.
- Operational Value: Establish a reproducible workflow for isolating low-input exRNAs from conditioned media.
- Predictive Value: Enable functional target validation through correlation of extracellular miRNA profiles with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare standardized extracellular RNA inputs for downstream screening of modulators of exosome biogenesis.
- Operational Value: Implement QC checkpoints to ensure assay standardization and reproducibility across batches.
- Scalability: Support platform reuse for profiling exRNAs from diverse cell types in disease models.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connect in vitro MSC exRNA profiles to in vivo biomarker alignment in preclinical disease models.
- Mechanistic De-risking: Clarify pathway involvement of specific miRNAs in immunomodulatory and tissue-repair mechanisms.
- Risk-Adjusted Advancement: Inform go/no-go decisions based on exRNA cargo consistency and functional relevance.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from hypothesis testing in early discovery to lead identification and preclinical validation, supported by its focus on extracellular vesicle RNA profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining the extracellular miRNA landscape of MSCs.
- Screening: Enables assay readiness through standardized exRNA isolation and QC for reliable compound screening.
- Analytics: Generates quantitative length distribution and sequencing outputs that allow comparison of exRNA profiles across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through disease-relevant exRNA profiling and biomarker alignment potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for profiling exRNAs from various stem and progenitor cells in regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation, reduction of mechanistic ambiguity in paracrine signaling.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of low-input RNA workflows.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in cell therapy development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on exRNA biomarker consistency.
Implementation Considerations
- Requires expertise in extracellular vesicle handling and low-input RNA techniques.
- Needs access to ultracentrifugation, nanoparticle tracking analysis, and capillary electrophoresis instrumentation.
- Demands cross-team standardization of media collection, EV isolation, and RNA QC procedures.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other cell types or biofluids.
- Includes practical limitations such as low RNA yield and contamination risks from serum-derived vesicles, mitigated by rigorous washing and ultracentrifugation steps.
