Name: Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 배우세요 탈세포화 연골 유래 매트릭스를 제조하여 연골 재생을 촉진하는 방법을. 말 슬타이프 관절 연골을 사용하며 생체 내외에서 연골 형성을 지원하는 이 기법은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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저자는 건설 기계 생산에 W. 부팅을 인정 하 고 싶습니다. K.E.M. 벤더 대학 의료 센터에서 알렉산더 Suerman Stipendium에 의해 지원 됩니다. R. Levato와 J. Malda 네덜란드 관절염 재단에 의해 지원 됩니다 (부여 계약 공동-14-1-001, LLP-12, 각각).

이 프로토콜에 대 한 말 억압 연골 관절염 보다 다른 원인에서 죽 었다는 말에서 얻은 했다. 조직 기관 윤리 규정에 따라 소유자의 허가 함께 얻은 것입니다.
참고: 이 프로토콜에 체 외 조직 문화 플랫폼 등 응용 프로그램에 대 한 또는 vivo에서 이식 재생 의학 전략에 대 한 사용할 수 있는 decellularized 말 연골에서 장비의 제조를 설명 합니다. 설명 시간 순서 대로 효소 처리 단계를 수행 해야 합니다.
1. 기증자 (시체) 관절에서 관절 연골의 수확
<ol><li>앞서 수확 단계 준비 솔루션을 세척, 멸 균 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 및 1% (v/v) 암포 B. 보충 구성 된 연골의 1 L</li>
	<li>때문에 기증자는 병원 균을 수행할 수 있습니다 전체 수확 절차 중 장갑 및 실험실 외 투를 착용 합니다.</li>
	<li>연골 격리에 대 한 손상 (시체) 공동 얻을. 참고: 이 시점에서, 관절 주위 피부는 그대로 이다. 말에서 얻은 말 억압 연골이이 프로토콜에서 사용 되었다 그러나 다른 종에서 다른 관절을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>메스와 수술 족집게를 사용 하 여 관심 있는 공동 영역 주위에 피부를 제거 합니다. 또한, 기본 관절 손상 없이 과도 한 지방과 근육 조직이 필요한 경우 제거 합니다. 필요에 따라 생물 안전 캐비닛을 준비 시체를 전송 합니다.</li>
	<li>arthrotomy, 즉 수행, 공동의 분리 먼저 공동 확장 및 관절의 굴곡을 수행 하 여 articulates 위치를 정의 합니다.</li>
	<li>조심 스럽게 지방, 근육, 그리고 힘 줄 메스와 공동 영역을 열고 수술 트위터의 더 많은 레이어를 제거 합니다.</li>
	<li>공동 구멍을 도달 하는 절 개를 확인 합니다. 참고: 공동 구멍은 정확한 절 개를 수행할 때 구멍에서 똑 수 있는 활 액 액체, 가득 합니다.</li>
	<li>여 합동을 완전히 함께 관절을 유지 하는 힘 줄을 통해 절단 하 여 계속 합니다.</li>
	<li>거시적인 손상 연골을 검사 합니다. 참고: 관절 연골에는 광택 하 고 부드러운 외관 또는 분명 젖어, clefts, 또는 결함이 있는 경우 연골을 삭제 합니다.</li>
	<li>마찰의 뼈에서 연골을 제거 하는 살 균 메스를 사용 합니다. 마찰의 뼈 연골 (그림 1)의 깊은 영역 제거까지 잘라. 연골 밖으로 건조 하지 않도록 하려면 정기적으로 연골 연골에 솔루션을 세척 똑. 참고: 이 시점에서 연골 조각의 크기는 중요 하지 않습니다.</li>
	<li>세척 솔루션 (그림 2A) 이전 준비 연골을 포함 하는 50 mL 튜브에 연골 조각을 수집 합니다.</li>
	<li>관심의 모든 영역에서 연골을 수집 후 스냅 연골 조각 5 분 액체 질소에서 동결.</li>
	<li>50 mL 튜브로 연골 조각을 전송 및 즉시 동결 건조 기에서 24 h에 대 한 연골 슬라이스를 lyophilize. 동결 건조 기에서 설정 약 0.090 mbar 얼음 콘덴서는-51 ° C (그림 2B).</li>
	<li>추가 사용까지 연골 조각 실 온에서 건조 한 장소에 저장 합니다. 참고: 비 계 형성의 지점 솔루션 및 연골 필요가 없습니다 준비 하 여 살 균 방식에서으로 처리.</li>
</ol>2. 만들기 Decellularized 연골 입자
<ol><li>액체 질소에서 동결 건조 된 연골 조각을 submerse합니다</li>
	<li>수동으로 또는 밀링 기계에 직접 샘플을 갈기. 연골 조각 손으로 연 삭, 박격포 및 방 앗 공이 사용 하 여 고 분쇄 (그림 2C 및 2D) 때까지 약 45 분에 대 한 슬라이스를 갈기. 자동 연 삭 할 때 최대 1 분, 스냅-냉동 연골 조각 분쇄 된 때까지 몇 초 동안 미리 설정된 속도에 밀링 기계를 사용 합니다. 참고: 액체 질소를 추가 하 여 박격포 또는 융기의 분쇄 구획을 멋진 사전. 밀링 기계를 사용 하면 모든 입자는 지상, 그리고 아무 입자 연 삭 구획의 바닥에 남아 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>0.71 m m 매쉬의 크기와 체를 사용 하 여 큰 부품의 제거를 연골 입자 체질.</li>
	<li>실 온에서 건조 한 장소에 입자를 저장 합니다.</li>
</ol>3. 효소 Decellularization 트립 신으로 0.25%-EDTA
<ol><li>EDTA와 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 1% (v/v) 암포 B. 저장소 솔루션 4 ° c.에 보충으로 0.25 %trypsin 이루어져 소화 솔루션 준비 참고: Trypin은 연골 조직에 있는 단백질을 저하 효소 이다. 이 효소 단계는 조밀한 연골 구조를 열 것 이다.</li>
	<li>50 mL 튜브 튜브 당 약 7.5 mL의 볼륨까지 분쇄 연골 입자 채우십시오.</li>
	<li>
새로 고치 소화 솔루션 마다 4 h 동안 총에서 24 h에 대 한 37 ° C에서 준비 된 소화 솔루션 연골 입자를 품 어.
	<ol>
<li>먼저, 연골 입자를 포함 하는 각 50 mL 튜브에 소화 솔루션의 30 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>그런 다음 모든 입자는 효소 솔루션에 노출 되도록 소용돌이 또는 피펫으로 사용 하 여 입자를 resuspend.</li>
		<li>롤러에 37 ° C에서 4 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
		<li>소화 솔루션을 새로 고치려면, 연골 입자의 침전을 3113 x g 20 분에 대 한 튜브 원심. 폐기는 상쾌한. 참고: 상쾌한 모든 트립 신 잠복기와 명확 하 게 될 것 이다.</li>
		<li>3.3.1–3.3.4 단계를 반복 하 여 입자 4 h의 6 주기 위한 소화 솔루션 incubated 되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막 주기 이후 centrifuging 후는 상쾌한을 제거 하 고 두 번 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 입자를 세척 합니다. 3113 x g는 세척의 각각 사이 20 분 동안 입자 원심</li>
</ol>4. 효소 Decellularization Nuclease 치료
<ol><li>10 mM Tris HCl 해결책 pH 이온된 수 7.5에서 준비 합니다.</li>
	<li>50 U/mL deoxyribonuclease 및 1 U/mL ribonuclease A nuclease 솔루션을 얻기 위해 Tris HCl 버퍼에 추가 합니다. 참고: 이 단계는 특히 deoxyribonucleases와 ribonucleases를 저하 수행 됩니다.</li>
	<li>연골 입자 (3.4 단계)에서 솔루션을 세척 하는 연골을 제거 하려면 3,113 x g에 20 분 동안 원심 하 고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>연골 입자에 nuclease 솔루션의 30 mL를 추가 하 고 모든 입자 nuclease 솔루션에 노출 되어 있는지 확인 하 고 솔루션을 통해 입자를 저 어.</li>
	<li>4 h 37 ° c.에 대 한 롤러에 샘플을 품 어</li>
	<li>3,113 x g 에서 20 분 동안 연골 입자 centrifuging 여 nuclease 솔루션을 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>연골 입자에 10 mm Tris HCl 솔루션 deoxyribonuclease ribonuclease A 없이 30 mL를 추가 하 여 샘플을 씻으십시오. 입자를 resuspend 하 고 실 온에서 20 h에 대 한 롤러에 샘플을 둡니다.</li>
</ol>5. 세제 Decellularization
<ol><li>Octoxynol-1 PBS에서 1% (v/v)을 용 해 하 여 세제 솔루션을 확인 합니다.</li>
	<li>3,113 x g 에서 20 분 동안 centrifuging와 삭제는 상쾌한 연골 입자에서 Tris HCl 솔루션을 제거 합니다.</li>
	<li>연골 입자에 준비 된 1% 세제 용액 30 mL를 추가 합니다. 솔루션의 거품을 피하기 위해 부드럽게 연골 입자 resuspend 참고: 이 단계는 세포 막 분해.</li>
	<li>롤러는 롤러에 실 온에서 24 h에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>세제 솔루션 3,113 x g 에서 20 분 동안 원심 분리 하 여 제거 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>
Decellularization 솔루션의 나머지의 모든을 제거 하려면 솔루션을 세척 하는 연골의 30 mL에 8 h 6 사이클에서 연골 입자를 씻어. 실 온에서 롤러 세척을 수행 합니다.
	<ol>
<li>다음 세척을 변경 하려면, 원심 3,113 x g에서 20 분 동안 정지 하 고 삭제는 상쾌한 신선한 연골 세척 솔루션 추가.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마지막 세척 튜브에 두고-80 ° c.에 decellularized 연골 입자 저장</li>
</ol>6. Decellularized 입자에서 건설 기계를 만들기
<ol><li>입자-80 ° C에 저장 된, 하는 경우는 건설 기계를 만들기 전에 따뜻한 물에 연골 입자를 포함 하는 닫힌된 튜브를 녹여.</li>
	<li>원통형 금형, 예를 들어 8 m m의 직경 2 cm의 높이와 플라스틱 병에 작은 국자와 연골 입자를 전송 합니다.</li>
	<li>플라스틱 금형에 연골 입자를 배치할 때 모든 공기-거품 밖으로 비 계에 구멍을 피하기 위해 누르고 가장자리까지 금형을 채우기. 참고: 그것은 발판에 있는 균열으로 이어질 수 있는 비 계 형성 후 건설 기계 금속 금형을 더 어려울 것 이다.</li>
	<li>-20 ° c.에서 10 분 동안 연골 입자와 금형을 고정</li>
	<li>동결 건조 기에서 24 h에 대 한 그들의 금형 내 연골 건설 기계를 lyophilize.</li>
	<li>후 동결은, 금형 (그림 3) 비 계 하 고 자외선 (UV) 빛 30 cm 거리와 365와 함께 그들을 상호 링크 nm 하룻밤.</li>
	<li>생체 외에서 세포 배양 또는 vivo에서 주입은 건설 기계를 사용, 가스로, 예를 들면, 에틸렌 산화물 (토) 건설 기계를 소독. 참고: EtO 살 균은 외부 자에 의해 수행 됩니다.</li>
</ol>7. 조직학 Stainings와 Decellularized 장비의 특성
참고: 완전 한 decellularization를 보장 하 고 연골의 나머지 자연 문자 시각화 하 되며 고 오신 (H & E) 되도록 얼룩을 포함 하 여 어떤 실험에는 건설 기계를 사용 하기 전에 여러 조직학 stainings를 수행 decellularization, Safranin-O 잔여 개 그 존재를 시각화 하기 위해 얼룩, 교원 질 유형 I immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠 및 콜라겐 유형 II immunohistochemistry 콜라겐 콘텐츠를 구분 하는 것.
<ol><li>메스와 함께 약 3 m m의 얇은 조각에는 건설 기계를 절단. 참고: 경우는 건설 기계는 큰 또는 작은 크기에, 탈수 사이클의 기간 적응 시킬 필요가 있다.</li>
	<li>4% (w/v) alginate 방울에는 건설 기계를 포함 하 고 추가 비슷한 양의 3.7% 버퍼링 되지 않은 포 르 말린 20 m m CaCl2를 포함 하 여 교차 연결 유도. 참고: Alginate 포함 파라핀 포함 이전 세척 단계에 비해 더 엄격한 비 계 조각을 합니다. 경우는 건설 기계는 셀-시드 또는 vivo에서 이식, alginate 포함 필요 하지 않습니다는 장비의 구성 셀에 의해 ECM 설립으로 인해 충분히 방지 될 것 이다.</li>
	<li>등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치, 70%, 96%의 한 시간 주기 시작, 96%, 100%, 100% 에탄올, 크 실 렌의 2 개의 1 시간 주기 및 60 ° c.에 파라핀의 2 개의 1 시간 주기 끝나는 샘플을 탈수</li>
	<li>탈수, 후 형에서 샘플 파라핀 포함 하 고 샘플을 진정.</li>
	<li>5 μ m 두께의 조각에 톰으로 샘플을 잘라.</li>
	<li>얼룩이 지기 전에 반환 된 등급된 에탄올 시리즈에 그들을 배치 하 여 샘플을 rehydrate. 100%, 95%, 및 70% 에탄올 세척 당 3 분의 2 세척 뒤 5 분 동안 크 실 렌의 두 세척 시작. 마지막으로, 샘플 3 시간 2 분 동안 물에에서 씻는 다. 참고: Alginate를 사용 하 여 샘플 파라핀 포함에 대 한 처리를 하는 경우 재 파라핀 섹션의 이전 10 m m 구 연산 산 alginate 씻어 있는지 확인 합니다.</li>
	<li>얼룩 hematoxylin와 오신, 샘플 Safranin O, 콜라겐, 그리고 콜라겐 II 이전 설명된11.</li>
</ol>8. 정량 분석 Decellularized 장비의 특성
<ol><li>앞에서 설명한11장비의 papain 다이제스트를 얻습니다.</li>
	<li>형광 기반 DNA 정량화 키트 완전 한 decellularization를 위해 장비의 이중 가닥 DNA 콘텐츠를 측정 하는 시험을 수행 합니다. 제조업체에서 제공 하는 프로토콜을 따릅니다. 발판의 건조 중량 당 DNA의 양을 표현 한다.</li>
	<li>앞에서 설명한11비 계, 내 개 그의 나머지를 계량 블루 dimethylmethylene 분석 결과 수행 합니다. DNA 당 개 그에 금액을 표현.</li>
</ol>9. Decellularized 장비의 시드
<ol><li>3 m m로 6.7 단계에서 소독된 건설 기계 두꺼운 조각 잘라.</li>
	<li>6 잘 플레이트의 별도 우물에 건설 기계를 전송 합니다.</li>
	<li>발판 위에 매체의 pipetting 1 mL로 세포 배양 매체와 건설 기계를 rehydrate 하 고 30 분 동안 담가 보자 chondrocyte 또는 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 확장 매체를 사용 하 여. 참고: 동일한 매체를 사용 하 여 시드할 수 세포의 세포 배양에 관해서는 비 계 재에 대 한. 10% 열 비활성화 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스와 10 ng/mL 섬유 아 세포 성장 인자-2 (FGF-2) Dulbecco의 수정된 미디어 (DMEM) Chondrocyte 확장 매체에 의하여 이루어져 있었다. MSC 확장 매체 구성 최소 필수 중간 알파 (-MEM) 10% 열 비활성화 FBS, 0.2 m m L-아 스 코르 빈 산 2 인산, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스, 그리고 10 ng/mL FGF-2.</li>
	<li>3 m m의 높이와 직경 8 mm 각 비 계에 대 한 필요한 볼륨은 매체의 100 μ에서 3 x 106 셀을 준비 합니다. 참고: 다른 종에서 여러 세포 유형 시드에 사용할 수 있습니다. Chondrocytes 또는 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한11로 셀을 분리. Chondrocytes, 사용 하는 경우는 그들이 하지 확장 되어 P1 통행 과거 dedifferentiated chondrocytes의 수를 최소화 하려면 있는지 확인 합니다. 중간 엽 기질 세포를 사용할 경우 앞에서 설명한14멀티 혈통 차별화에 대 한 그들의 능력에 테스트 되어야 한다.</li>
	<li>피펫으로 50 μ의 세포 현 탁 액 미리 젖된 비 계 위에 준비 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 비 계를 품 어</li>
	<li>조심 스럽게 아래로, 세포 현 탁 액의 피펫으로 나머지 50 μ 거꾸로 비 계 발판의이 측면에 바뀌고 1 h 37 ° c.에 품 어</li>
	<li>부 화, 후 웰 스, 매체의 3 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 셀 시드 건설 기계 문화 셀의 분리를 피하기 위해 부드럽게 문화 접시를 처리 합니다.</li>
	<li>실험에 필요한 시간 동안에 건설 기계를 문화 고 2-3 회 매체를 변경 합니다. 피펫으로 천천히 그리고 최대한 발판에서 떨어져.</li>
	<li>셀 시드 발판의 경작, 후에 건설 기계를 반으로 잘라 고 조직학 및 생화학 분석에 대 한 그들을 처리 합니다.</li>
</ol>

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<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li>
<li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine%3A+mechanisms+of+in+vivo+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

관절 연골의 ECM은 매우 조밀 하 고 아주 다른 효소 치료에 탄력. 이 문서에서 설명 하는 여러 단계 decellularization 프로토콜 같은 저항을 해결 하 고 성공적으로 decellularized 행렬을 생성 합니다. 달성 하기 위하여는, 과정은 몇 일 동안 걸쳐. 다른 유형의 조직18, 많은 decellularization 프로세스를 제안 하 고이 문서 연골의 decellularization에 대 한 적합 한 프로토콜을 설명 합니다. 그러나이 프로토콜에서는,, 모든 셀을 제거 하기 위하여 세제 단계 효소 치료를 수행 하는 데 필요한입니다. DNA의 양을 트립 신와 함께 치료를 포함 하는 처음 몇 단계에서 현저 하 게 점감 하 고이 단계를 나가는 하지 귀 착될 것 이다 적절 한 decellularization11.
이 프로토콜은 말 연골 조직의 decellularization 기반 참...

충격적인 사건으로 인 한 무릎 관절 연골 결함, 불편으로 이어질 수 있습니다 그리고 특히 젊고 활동적인 인구1,2,3의 생활에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 젊은 나이에 연골 손상을 인생4나중에 관절염의 더 급속 한 발병 될 수 있습니다. 현재, 무릎의 일반화 된 관절염에 대 한 유일한 구조 치료는 합동 보충 수술입니다. 연골은 hypocellular, aneural, 및 avascular 조직, 재생 능력은 심각 하 게 제한 됩니다. 따라서, 재생 의학 접근은 원조 하 고 네이티브 조직의 재생 능력을 자극 후 모색. 이 목적을 위해 건설 기계 설계 되며 신체의 기본 셀5중 세포 운반대로 또는 차별화와 조직의 재생을 incites 유도 물자로 사용.
Decellularized 건설 기계 재생 의학6내에서 널리 공부 되었습니다. 그것은 했다 약간의 성공을, 예를 들어 피부7,8, 복 부 구조 및 힘 줄9의 재생성을 방 조에. Decellularized 건설 기계를 사용 하 여의 장점은 그들의 자연적인 근원 및 그들의 능력을 모두 유치 하 고 조직 수리6,10에 필요한 적절 한 혈통으로 세포 분화를 유도 하는 생리 활성 신호 유지. 또한, 세포 외 기질 (ECM)은 자연 소재 decellularization 세포 또는 유전자 콘텐츠를 제거 하 여 잠재적인 면역 반응을 방지 하는 때문에, 생체 적합성 및 biodegradability에 관한 문제는 극복 됩니다.
연골에서 파생 된 매트릭스 (CDM) 건설 기계 mesenchymal stromal 세포11시드 때 체 외 실험에서 잠재적인 큰 chondrogenic을 보여왔다. 또한, 이러한 건설 기계 vivo에서 설정12소성 위치에 endochondral 나오고 통해 양식 뼈 조직에 잠재력을 보여왔다. CDM 건설 기계 가이드의 형성 둘 다 뼈 고 연골 조직, 이러한 건설 기계 연골 수리 이외에 osteochondral 결함 수리에 대 한 잠재적인 취소 될 수 있습니다.
이 문서에서는 설명 합니다 양에서 적응 프로토콜 외. (2010)13 말에서 decellularized CDM 장비의 생산에 대 한 억압 연골. 이 건설 기계 콜라겐 유형 II에 셀, 없는 풍부 하 고 decellularization 후 어떤 있다 (개 그)를 포함 하지 않습니다. 이러한 건설 기계를 사용 하 여 (osteo) chondral 결함 수리에 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>시체 관절</td><td></td><td></td><td>이것은 지역 정육점 또는 수의학 센터에서 휴식 재료로 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>멸균 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7.5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 데옥시리보뉴클레아제 I</td> 소의 췌장에서 추출한 <td>시그마-알드리치</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>리보뉴클레아제 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100(옥톡시놀-1)</td><td>시그마-알드리치</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>파파인</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>구연산삼나트륨 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>알긴산</td><td>시그마-알드리치</td><td>180947</td><td></td></tr><tr><td>포르말린</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>자일렌</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 옥사이드 살균</td><td>Synergy Health, Venlo, 네덜란드</td><td></td><td></td></tr><tr>말 기증자<td></td><td></td>, MSC 및 연골 <td>세포의 다분화능 기질 세포/연골 세포</td>는 <td>지역 정육점 또는 수의학 센터에서 오는 휴식 물질인 기증자 관절에서 분리할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>MEM alpha</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22561</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2-인산</td>염 <td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2)</td><td>R & D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>DNA 정량 키트(Quant-iT PicoGreen dsDNA 시약)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>1,9-Dimethyl-Methylene Blue 아연 클로라이드 이중 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>SALMENKIPP</td><td>ALPHA 1-2 LD plus</td><td></td></tr><tr><td>분석 밀</td><td>IKA</td><td>A 11 basic</td><td></td></tr><tr><td>mortar/pestle</td><td>Haldenwanger 55/0A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>롤러 플레이트</td><td>CAT</td><td>RM5</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(50 mL 튜브용)</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>캡슐(원통형 몰드)</td><td>TAAB</td><td>8 mm flat</td><td></td></tr><tr><td>Superlite S UV</td><td>Lumatec</td><td>2001AV</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>체 (메쉬 크기 0.71 mm)</td><td>VWR</td><td>34111229</td><td></td></tr><tr><td>메스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>메스 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>스몰 래들</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral 결함 기능 소리 뼈와 연골 조직을 재생 하기 충분 한 내장 복구 용량을 부족 합니다. 이 정도로 연골 연구 재생 장비의 개발에 집중 했다. 이 문서는 완전히 말 기증자에서 오는 자연 연골 세포 외 매트릭스에서 파생 된 장비의 개발을 설명 합니다. 장비의 잠재 애플리케이션으로 이식 연골 수리, osteochondral 조직 공학, 생체 외에서 모델 연구 조직 형성을을 제공 하 고 발판으로 봉사에 대 한 생산. Decellularizing 조직, 여 기증자 세포 제거 됩니다, 하지만 많은 천연 생리 활성 신호 유지 될 것으로 생각 되. 종합적으로 생산된 비 계에 비해 자연 비 계를 사용 하 여의 주요 장점은 고분자의 아무 더 기능화 드라이브 osteochondral 조직 재생 하는 데 필요한입니다. 연골에서 파생 된 매트릭스 건설 기계는 vivo에서 그리고 생체 외에서 설정에서 뼈와 연골 조직 재생을 위해 사용할 수 있습니다.

조직학 stainings를 사용 하 여 뿐만 아니라 DNA 잔재의 양을 측정 하 DNA 정량화를 사용 하 여 CDM 장비의 decellularization 항상 확인 되어야 한다. 부족 한 decellularization vivo에서 설정15,,1617결과 영향을 주는 원치 않는 면역학 응답 발생할 수 있습니다. 이 특정 decellularization 메서드에 대 한 DNA 검출 범위 13.6 ± 2.3 ng/mg DNA/드라이 무게에서 시작 되었다 (n = 3). 이 프로토콜을 사용 하 여 전체 decellularization는 풍부한 콜라겐 유형 II (그림 4C) 이며 세포 (그림 4A) 나 ...

Decellularized 연골 파생 된 건설 기계 osteochondral 조직을 재생 하 가이드 연골 수리를 발판으로 및 수단으로 사용할 수 있습니다. 이 종이 decellularization 프로세스를 자세히 설명 하 고 생체 외에서 설정에서 이러한 건설 기계를 사용 하 여 제공 합니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

이 방법은 연골 재생에 사용될 수 있는 네이티브 조직에서 파생된 스캐폴드를 만드는 방법을 제시한다. 이 기술의 주요 장점은 기본 연골의 구성 요소가 시험관 내 및 생체 내에서 연골 형성 및 재생을 촉진 할 수있는 스캐폴드에 보존된다는 것입니다. 이러한 방법은 말의 연골을 사용하여 관절을 억누르지만 다른 관절의 연골도 사용할 수 있습니다.시작하려면, 연골 격리를 위한 손상되지 않은 카다브릭 관절을 얻고 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 피부 과잉 지방 및 근육 조직을 제거한다. 다음으로, 조인트의 확장 변곡점을 수행하여 관절이 관절이 명료하는 위치를 정의한다. 조인트 캐비티에 도달하기 위해 수평 절개를 합니다.다음으로, 관절 영역을 열어 수직 절개를합니다. 관절 구멍은 올바른 절개를 수행 할 때 공동에서 떨어지는 가능성이 활액으로 채워집니다. 과도한 지방, 근육 및 힘줄을 제거하고 관절을 함께 유지하는 힘줄을 절단하여 관절을 완전히 열어 보십시오.연골을 주의 깊게 검사하여 거시적 손상이 있는지 검사합니다. 관절 연골이 광택이 매끄러운 외관을 가지고 있지 않거나 증거, 물집, 갈라진 또는 결함이 있는 경우 연골을 버리고 다시 시작합니다. 멸균 메스를 사용하여 뼈에서 연골을 제거하십시오.깊은 영역 연골을 제거하기 위해 아전드랄 뼈까지 모든 방법을 잘라. 이전에 준비된 연골 세척 용액을 포함하는 50 밀리리터 튜브에서 제거된 연골 조각을 수집합니다. 가공 하는 동안, 정기적으로 연골에 연골 세척 용액을 드립 연골 건조에서 연골을 방지 합니다.관심있는 모든 영역에서 연골을 수집 한 후, 5 분 동안 액체 질소에 연골 조각을 동결 스냅. 그런 다음 연골 조각을 50 밀리리터 튜브로 옮기고 냉동 된 조각을 동결 건조기에 즉시 놓습니다. 동결 건조기와 함께 24 시간 동안 연골 조각을 lyophilize합니다.완료되면, 실온에서 건조 한 장소에 동결 말린 연골 조각을 저장합니다. 수동 처리를 위해 박격포를 미리 식히고 액체 질소로 유봉한 다음 lyophilized 연골 조각을 박격포에 넣고 침수하고 액체 질소를 담급니다. 샘플을 충분히 분쇄 할 때까지 약 45 분 동안 손으로 직접 분쇄합니다.또는 밀링 기계를 사용하여 자동으로 샘플을 분쇄하려면 액체 질소를 추가하여 밀링 기계의 연삭 구획을 미리 냉각하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 lyophilized 연골 조각을 추가하고 최대 1 분 동안 몇 초 동안 미리 설정된 속도로 샘플을 밀링합니다. 모든 파티클이 접지되고 파티클이 연삭 구획의 맨 아래에 남아 있지 않도록 하십시오.마지막으로, 스캐폴드를 형성하기 전에 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 탈세포화 기법과 함께 따르십시오. 작은 라벨이 있는 연골 입자를 원통형 플라스틱 금형으로 옮기습니다. 모든 기포를 눌러 비계의 구멍을 피하고 금형을 완전히 채웁니다.스캐폴드S의 충치를 피하려면 금형을 연골 입자로 채우는 동안 기포를 압착해야 합니다. 형성 후 영하 20도에서 10 분 동안 금형을 동결하십시오. 그런 다음 동결 건조기에서 24 시간 동안 금형 내의 연골 비계를 lyophilize합니다.lyophilization 후, 조심스럽게 금형에서 비계를 제거합니다. 365 나노미터 파장 UV 빛 아래에 스캐폴드를 놓고 하룻밤 사이에 교차 연결합니다. 멸균 된 비계를 3 밀리미터 두께의 조각으로 절단하여 스캐폴드 디스크를 형성합니다.그런 다음 비계를 6 개의 우물 판의 별도의 우물로 옮기. 스캐폴드 위에 1밀리리터의 콘드로사이클 확장 매체를 추가하고 30분 동안 수분을 보충할 수 있습니다. 비계가 재수화되는 동안, 미리 담근 비계 위에 준비된 세포 현탁액의 세포 및 파이펫 50 마이크로리터를 준비한다.그런 다음 37 °C에서 1 시간 동안 비계를 배양하십시오. 연골세포를 사용할 때, 분화된 세포의 수를 최소화하기 위해 첫 번째 통로를 지나 확장되지 않았는지 확인하십시오. 1 시간 후, 문화 후드에 접시를 반환하고 조심스럽게 비계를 뒤집어.스캐폴드에 남은 50마이크로리터의 세포 현탁액을 피펫하고 섭씨 37도에서 또 다른 시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 비계로 우물에 3 밀리리터의 매체를 추가합니다. 비계에 직접 배지를 파이프하지 말고 세포의 분리를 피하기 위해 배양 판을 부드럽게 처리하십시오.플레이트를 인큐베이터와 배양 세포에 섭씨 37도에서 양보한 비계에 반품한다. 조직학적 염색과 DNA 정량화의 조합은 이 문서에서 제시된 방법이 충분한 연골 비계 탈세포화를 초래한다는 것을 보여주기 위해 사용되었습니다. 결과 발판은 DNA의 탐지할 수 없는 수준과 더불어 어떤 세포도 포함하는 것을 찾아냈습니다.그(것)들은 또한 글리코아미노글리칸이 부족하고 콜라겐 II.Here가 풍부합니다, 네오 매트릭스 형성은 4 주 동안 배양된 중간엽 줄기 세포로 양보된 비계에서 관찰됩니다. 글리코아미노글리칸의 형성은 4주 후에 풍부합니다. 이 절차를 시도한 후 모든 응용 프로그램에서 사용하기 전에 탈세포화가 성공했는지 여부를 검사하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 서양 블롯 분석기 와 같은 추가 생화확적인 분석은 성장 인자와 같은 그밖 분대의 존재에 관하여 특정 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다. 이 기술은 조직 공학 분야의 연구원들이 동종 및 합성 소스에서 탈세포 조직을 사용하여 연골 재생 전략을 탐구하는 길을 열었습니다. 실험실 코트와 장갑착용 등의 예방 조치는 항상 취해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 전기 분무에 의한 세포 외 기질 유래 마이크로캐리어 제조 절차를 보여줍니다. 이러한 마이크로캐리어는 네이티브 조직 특이적 미세환경을 시뮬레이션하며 장기 3D 체외 세포 배양 모델에서 안정적입니다.

전기분무에 의한 바이오스캐폴드 제작: 탈세포화된 조직의 세포외 기질에서 파생된 마이크로캐리어 스캐폴드를 생성하는 기술

연골 복구는 충족되지 않은 의학적 도전을 나타내며 인간의 관절 연골을 엔지니어링하기 위한 세포 기반 접근 방식은 유망한 솔루션입니다. 여기에서는 3차원(3D) 생체 모방 하이드로겔을 인간 관절 연골 세포의 확장 및 성숙을 위한 이상적인 도구로 설명합니다.

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줄기 세포에서 연골은 배양 조건 미세 조정이 필요합니다. 여기, 우리는 세포를 응축위한 자기 접근 방식을 제시 필수적인 단계는 연골을 시작합니다. 또, 생물 반응기의 동적 숙성은 셀룰러 구조에 기계적 자극을 적용 연골 세포 외 기질 생산 향상을 보여준다.

연골 재생을위한 3D 자기 줄기 세포 집계 및 생물 반응기 성숙

조직 특이 적 세포 외 기질 (ECM)는 세포 기능의 중요한 매개체이다. 이 문서에서는 순수 ECM 파생 폼 및 체외 세포 배양 모델에서 고급 3D 애플리케이션 또는 프로 재생 bioscaffolds 화학적 가교 결합을위한 필요없이 문화에 안정 마이크로을 합성하는 방법을 설명합니다.

조직 특이 적 세포 배양 및 전달 플랫폼과 같은 세포 외 기질 유래 거품과 마이크로 담체의 제조

여기에 우리가 현재, 및 대비 2 프로토콜 decellularize 식물 조직 하는 데 사용: 세제 기반 접근 및 세제 무료 접근. 두 방법 모두 다음 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 건설 기계로 활용 될 수 있습니다 사용, 식물 조직의 세포 외 매트릭스 뒤에 남겨두고.

Decellularization 식물 조직의 조직 공학 응용 프로그램에 대 한 두 가지 방법

이 프로토콜의 구조 조직 구조 엔지니어링 3D 인쇄를 decellularized 행렬 (DM)를 포함 하는 임베디드 polylactic 산 (PLA) 스피어와 polycaprolactone (PCL) 필 라 멘 트의 생산을 설명 합니다.

3D 인쇄에 대 한 새로운 과정 Decellularized 행렬

이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

이 프로토콜은 야누스 염기 나노 튜브 (JBNts), 마트린 -3 및 형질 전환 성장 인자 베타 -1 (TGF-β1)을 순차적으로 추가하여 층별 야누스 염기 나노 매트릭스 (JBNm) 스캐 폴드의 조립을 설명합니다. JBNm은 제작되고 특성화되었습니다. 또한 우수한 생리활성을 나타내어 부착, 증식 및 분화와 같은 세포 기능을 촉진했습니다.

연골 재생을 촉진하기 위한 층별 야누스 베이스 나노매트릭스의 제작 및 특성 분석

이 논문은 탈세포화된 연골 세포외 기질(DC-ECM) 하이드로겔의 합성을 위한 새로운 방법을 소개합니다. DC-ECM 하이드로겔은 생체 적합성이 우수하고 세포 성장을 위한 우수한 미세환경을 제공합니다. 따라서 이상적인 세포 스캐폴드 및 생물학적 전달 시스템이 될 수 있습니다.

탈세포화된 연골 세포외 기질 하이드로겔의 합성

탈세포화된 비장 매트릭스(DSM)는 간 조직 공학 분야에서 유망한 응용 분야를 보유하고 있습니다. 이 프로토콜은 쥐 비장 채취, 관류를 통한 탈세포화, 결과 DSM을 평가하여 특성을 확인하는 것을 포함하는 쥐 DSM을 준비하는 절차를 간략하게 설명합니다.

Rats에서 유래한 Decellularized Spleen Matrix의 제작

이 프로토콜은 메타크릴화 젤라틴(GelMA) 하이드로겔에 박힌 인간 골세포를 이용해 탈세포화된 세포외기질을 보충하여 3D 골 구조물을 제작하는 과정을 설명합니다. 이 방법은 저비용, 확장 가능, 기본 실험실 장비와 호환되어 근골격계 질환 과정을 연구할 수 있는 번역 플랫폼을 제공합니다.

인간 골격계와 탈세포화된 세포외기질을 이용한 근골격계 질환 모델링을 위한 3D 골배양 플랫폼

배우세요 탈세포화 연골 유래 매트릭스를 제조하여 연골 재생을 촉진하는 방법을. 말 슬타이프 관절 연골을 사용하며 생체 내외에서 연골 형성을 지원하는 이 기법은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

Decellularized 연골 파생 매트릭스 건설 기계 제조

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