Name: Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 배우세요 대식세포에 siRNA를 효율적으로 전달하는 폴리에틸렌이민 코팅 산화철 나노입자 기법입니다. 이 방법은 체내외에서 유전자 침묵을 유도하여 만성 염증성 질환과 암 치료에 활용될 수 있습니다.

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이 작품은 국립 자연 과학 재단의 중국 (81772308)와 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (No. 2017YFA0205502)에 의해 지원 되었다.

관련 된 동물 동물에 따라 수행한 모든 방법을 조심 하 고 동남 대학, 중국의 지침을 사용 하 여.
1입니다. 페이 SPIONs의 준비
<ol><li>
올레산 수정 SPIONs의 준비
	<ol>
<li>FeCl3•6H2O와 FeSO4•7H2O N2의 보호 아래 물에 용 해.<ol>
<li>비 커에 FeCl3•6H2O의 28 g와 FeSO4•7H2O 이온된 물 80 mL에 20 g을 추가 합니다. 유리 도관을 통해 물에 N2 를 소개 하 고 고체 물질 해산 했다 때까지 저 어.</li>
			<li>반응 혼합물 암모니아 물 (28%)의 40 mL의 추가 의해 따라 800 rpm의 교 반 속도로 72 ° C에가 열. 5 분 동안 저 어.</li>
		</ol>
</li>
		<li>위에서 언급 한 솔루션에 dropwise 올레산의 9 mL를 추가 하 고 3 h 72 ° C에서 그것을 저 어.</li>
		<li>차가운 실내 온도 (RT) 결과 솔루션. 자력 분리를 통해 솔루션을 침전.</li>
		<li>SPIONs 3를 포함 하는 침전 물은 세척 절대 에틸 알코올로 x, N-헥 산 100 mL에 침전을 분산 하는 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
산 수정 dimercaptosuccinic SPIONs의 준비
	<ol>
<li>올레산 (OA)의 800 밀리 그램을 추가-수정 SPIONs N-헥 산, 200 mL에 분산 및 dimercaptosuccinic 산 (DMSA)의 400 밀리 그램 60 ° c.에 물 욕조에 3 목 플라스 크에 아세톤, 200 mL에 분산 참고: 이전 단계에서 얻은 OA 수정 스파이의 농도 결정 하기 위해 스파이 분산의 작은 볼륨 (예: 1 mL)을 받아, N-헥 산 volatilize와 무게 결과 분말.</li>
		<li>1000 rpm으로 교 반 환류와 위에서 언급 한 솔루션에 dropwise triethylamine의 200 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>5 h 교 반 및 환류, 후 자력 분리 하 여 검은 침전을 얻을.</li>
		<li>균질 하거나 수산화를 사용 하 여 솔루션의 pH를 조정 하 여 이온을 제거 된 물에서 친수성 SPIONs를 분산.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
페이-SPIONs의 준비
	<ol>
<li>기계적 교 반 2 h 1000 rpm에서 500 mL 3 목 플라스 크에서 페이 솔루션 (10 kDa)에 dropwise DMSA 수정 스파이 콜 로이드 솔루션을 추가 (승철: W페이 = 1:3). 참고: 충전 및 페이 SPIONs의 크기 W W페이Fe 의 비율에 따라 다릅니다. 승철: W페이 비율 1: 3의 합성 siRNA 전달에 적합 페이 SPIONs에 대 한 좋은 출발점이 될 수 있습니다.</li>
		<li>100 kDa의 분자량 컷오프 및 15 mL;의 콘텐츠는 한 튜브에 결과 솔루션 추가 다음, 원심 분리기 5400 x g에서 10 분 때까지 나머지 솔루션은 1 mL. 이온된 수 볼륨 15 mL를 다시 만들고 10 위의 과정을 반복을 솔루션에 추가 최종 제품을 얻기 위해 x. 그런 다음, 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 4 ° c.에서 최종 제품을 저장</li>
		<li>Phenanthroline17를 사용 하 여 색도계 방법으로 페이-SPIONs의 Fe 농도 결정 합니다. 페이-SPIONs 1mg Fe/mL의 농도에 이온된 살 균 수 희석 및 4 ° c.에 그것을 저장합니다</li>
		<li>10 μ 페이 스파이 솔루션 (1 mg Fe/mL)의 이온을 제거 된 물; 1 mL를 희석 그런 다음 동적 빛 산란 장치에 의해 유체역학 크기와 제타 잠재적인 테스트. 참고:에 대 한의 범위에서 페이 SPIONs 준비 30-50 nm. 이 크기 범위에 siRNA 바인딩 및 세포질 통풍 관에 NP 크기의 효과 중요 하다 표시 되지 않습니다. 페이 SPIONs 베어링 평균 제타 잠재력 이상 +37 mV transfection, 복용량 범위에 유독 할 수 있다 그리고 세포 독성 분석 실험 안전을 보장 하기 위해 수행 되어야 합니다. 표면 충전 및 유체역학 크기는 나노 입자의 페이 콘텐츠를 조정 하 여 원하는 범위 내에서 제어할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 및 페이-스파이/siRNA NPs의 Agarose 젤 전기 이동 법
<ol><li>SiRNA RNase 무료 20 μ M (0.26 μ g/μ)의 최종 농도를 물으로 희석.</li>
	<li>5 RNase 무료 microcentrifuge 튜브 0, 1, 2, 4, 및 8 개를 준비 합니다. 레이블을 다른 Fe: siRNA 무게 비율을 나타냅니다. 피펫으로 3 모든 튜브 (~0.8 μ g siRNA/튜브)에 siRNA 솔루션의 μ.</li>
	<li>3.2, 1.6, 0.8, 0을 추가 하 고 관에 페이-SPIONs의 형태로 Fe의 6.4 μ g 표시 0, 1, 2, 4, 및 8, 각각. 20 μ 각 튜브의 전체 샘플 볼륨을 유지. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 혼합.</li>
	<li>페이-스파이/siRNA 복잡 한 형성 수 있도록 30 분 RT에 혼합물을 품 어. 이 기간 동안 3 %agarose 젤 높은 순도 agarose로 확인 합니다. 참고: 추가 페이-스파이/siRNA 단지 다른 Fe: siRNA 비율 (예를 들어, 5 또는 6) 준비 및 테스트 될 수 있습니다.</li>
	<li>6 x 5 μ 샘플 당 DNA 로딩 버퍼 1 μ를 추가 하 고 신중 하 게 혼합. 모든 샘플을 로드 하 고 bromophenol 블루 젤의 길이의 2/3까지 마이그레이션합니다 때까지 5 V/cm에서 전기 이동 법을 실행 합니다. Ethidium 평범한 사람 (EB) 15-20 분와 젤 얼룩. 참고: 갓된 전기 이동 법 버퍼와 EB 솔루션 사용 되어야 한다.</li>
	<li>자외선 이미징 시스템에서 siRNA 밴드를 시각화 합니다. 페이-SPIONs와는 siRNA 양식 단지에 Fe: siRNA 비율을 확인 하 고, 그 결과, 무료 siRNA를 대표 하는 밴드는 저 능 아 또는 하지 감지.</li>
</ol>3. transfection RAW264.7 세포에서 생체 외에서 의
<ol><li>DMEM을 사용 하 여 10 cm 접시에 문화 마우스 대 식 세포와 같은 RAW264.7 세포 완료 중간 포함 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 100 U/mL 페니실린 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 100 μ g/mL 스 당 당 합니다.</li>
	<li>한 전날 transfection, 세포에서 중간 발음 하 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (pH 7.4)와 함께 그들을 씻어. 10 cm 접시에 0.25 %trypsin 1 mL를 추가 합니다. 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 약 5-10 분 RAW264.7 세포 trypsinize</li>
	<li>세포의 대부분은 (5-10 분) 후 분리 했으면 때 비활성화 된 트립 신을 접시 DMEM 완전 한 매체의 5 mL를 추가 합니다. 단일 셀에 셀 클러스터 분산을 위아래로 피펫으로.</li>
	<li>살 균 15 mL 원뿔 튜브에 세포 현 탁 액을 전송. 원심은 실시간 제거에서 3 분에 대 한 300 x g에는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 신선한 DMEM 완전 한 매체의 5 mL와 셀과 셀.</li>
	<li>접시 9 x 104 셀 당 완전 한 DMEM 매체의 2 mL와 함께 6 잘 플레이트에 고 약 24 시간 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 품 어. 참고: 서로 다른 크기의 접시를 사용 하는 경우 세포 transfection 시 80 %confluency 도달 되도록 상대 면적에 비례하여 도금된 셀 밀도 조정 합니다.</li>
	<li>셀 confluency 80% 이면 세포에서 매체를 제거 하 고 잘 당 DMEM 완전 한 매체의 1 mL와 함께 그것을 대체. 페이-스파이/siRNA 단지 준비 된 사용 (약 30 분)에 대 한 준비가 될 때까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>페이-스파이/siRNA 단지 준비: 페이-스파이/siRNA 단지 transfection 실험에 필요한 금액을 계산. 1.5 mL RNase 무료 microcentrifuge 튜브, 주어진된 Fe: siRNA 비율로 siRNA와 페이-SPIONs의 적절 한 금액을 믹스. 예를 들어, 4의 Fe: siRNA 비율로 Fe의 100 µ g를 포함 하는 페이-스파이/siRNA NPs를 준비 하려면 추가 100 µ L (1 mg Fe/mL) 페이-SPIONs의 siRNA (0.26 μ g/μ)의 96 μ에는 micropipette 부드럽게 그것을 혼합 하 여 다음. 실시간에서 30 분 동안 품 어 참고: 페이-스파이/siRNA 복잡 한 부수적 손해에 대 한 계정 총 최종 질량 초과 10%의 볼륨을 준비 합니다. 낮은 철: siRNA 비율는 siRNA 분자는 페이 SPIONs에 완전히 로드 된 및, 따라서, 적은 양의 페이 SPIONs 잠재적인 세포 독성을 최소화 하기 위해 사용할 수 있습니다에서 페이-스파이/siRNA 단지를 확인 합니다. Fe: siRNA 비율의 최적화에 대 한 파일럿 실험 (젤 지체 분석 결과)가 필요 합니다.</li>
	<li>인큐베이터 (단계 3.7)에서 6-잘 접시를 꺼내. 각 우물에 dropwise 페이-스파이/siRNA 복합물의 필요한 볼륨을 추가 하 고 동등한 배급을 보장 하기 위해 신중 하 게 접시에 소용돌이. 세포질 통풍 관 또는 유전자 최저 효율 (1-3 d)의 평가까지 인큐베이터에 접시를 반환 합니다. 참고: ~ 15 μ g Fe/mL의 농도에서 페이-스파이/siRNA와 Transfecting 세포 잠재적인 세포 독성을 최소화 하면서 transfection 효율을 극대화할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 조직 배달 siRNA의 쥐 실험 관절염 세포
<ol><li>특정 병원 체-무료 남성 Wistar 쥐 7 주 오래 된 얻을. 7 사용 전에 d 쥐를 길 들 하 고 충분 한 음식과 물을 함께 그들을 제공 합니다. 앞에서 설명한18로 쥐에서 보조 관절염 (AA)를 유도.</li>
	<li>페이-스파이/siRNA 단지 3.8 단계에서 설명한 대로 준비 합니다.</li>
	<li>페이-스파이/siRNA NPs (siRNA/kg의 0.3 m g)는 AA 쥐를 통해 꼬리 정 맥에 주사. 평가는 세포질 통풍 관을 통해, 예를 들어, cytometry, 조직 biodistribution 통해, 예를 들어, 이미징 시스템, 실시간 형광 또는 치료 효과에 따라, 예를 들어, 임상, 조직학, 방사선 원하는 시간에 분석18점. 참고: 휴대 및 조직 biodistribution 연구, 치료 원하는 NPs;의 단일 주사와 쥐 치료 연구, 세 연속 주 동안 일주일에 x 테스트 1 nps 쥐를 주사.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

대 식 세포는 일반적으로 사용 되 nonviral 접근, electroporation, 양이온 리 등 지질 종에 의해 transfect 내 화물. 여기 우리 transfect siRNA와 대 식 세포를 안정적이 고 효율적인 방법을 설명 합니다. 현재 프로토콜을 사용 하 여, 이상 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 (그림 2B)와 쥐 복 막 대 식 세포18 의 90% 수 수 페 세포 생존 능력의 중요 한 장애 없이 siRNA와. 이 메서드는 nanocarrier의 산화 철의 코어와 PEI의 셸 구성 전달 플랫폼 페이-스파이에 따라 다릅니다. 그래서, 프로토콜의 첫 번째 주요 단계 페이-SPIONs siRNA 전달에 적합의 합성입니다. 일반적으로, 페이 코팅 SPIONs 준비가 올레산 코팅 SPIONs에서 있는 올레산은 직접 교환 SPIONs의 표면에서 페이 또는 그 파생 상품15, 리...

대 식 세포는 다른 금액에도 불구 하 고 모든 신체 조직에 배포 하는 타고 난 면역 세포의 유형입니다. 생산 함으로써 다양 한 cytokines 및 다른 중재자, 그들은 중요 한 역할을 재생 하는 미생물 병원 체 침입에 대 한 호스트 방어, 다음 부상, 조직 복구 및 조직의 항상성1를 유지 하. 그들의 중요성 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 주제 되었습니다 합니다. 그러나, 유전자 조절 및 기능 연구에 있는 그것의 보급에도 불구 하 고 중재 하는 siRNA 유전자 침묵은 대 식 세포 때문에 성공 가능성이 이러한 셀-특히, 주 대 식 세포-는 종종 transfect 어렵다. 이 독성 연관 있는 세포 막 화학은 가장 잘 설립 transfection 접근 (예를 들면, 고분자와 지질)의 상대적으로 높은 수준의 관찰 작용 수 있다 또는 육체적으로 (예를 들어, electroporation 여 고 유전자 총) 교차 하는 그로 인하여 크게 줄이고 세포의 생존2,3막 siRNA 분자를 방해 합니다. 또한, 대 식 세포는 전용된 phagocytes degradative 효소 풍부. 이러한 효소 siRNA, 유전자 특정 siRNA의 셀3,4로 전달 하는 경우에 그 입을 효율성 약화의 무결성을 손상 수 있습니다. 따라서, 효과적인 macrophage 대상으로 siRNA 전달 시스템 납품4siRNA의 안정성과 무결성을 보호 하기 위해 필요 합니다.
역 기능 세포 개시와 자가 면역 질환, 동맥 경화, 고 암 같은 특정 일반적인 임상 질환의 진행에 연루는 점점 더 분명 하다. 이러한 이유로, 대 식 세포 기능을, 예를 들어, siRNA, 변조 치료 이러한 장애5,,67에 대 한 매력적인 방법론으로 신흥 되었습니다. 많은 진행 했다, siRNA 기반 치료 전략의 주요 과제는 체계적으로 관리 siRNA와 대 식 세포, 따라서 원치 않는 부작용으로 이어질에 의해 부족 한 siRNA 통풍 관의 불 쌍 한 세포 특이성. 일반적으로 최적의 셀 선택도 부족 하 고 종종 오프 대상 부작용, 약물 로드 (NPs), 나노의 reticuloendothelial 시스템에 의해 점령 되 고 그들의 자발적인 성향 때문으로 이어질 무료 핵 산 치료제와 비교 수동 타겟팅 세포에 vivo에서, 최소한의 부작용8향상 된 치료 효능에 대 한 수 있도록 설계 될 수 있다. 현재 NPs RNA 분자의 배달에 대 한 탐험 등 무기 nanocarriers, 다양 한 리, 고분자9. 그 중 polyethyleneimine (페이), 양이온 고분자 바인딩 및 안정된 NPs로 집 광 하는 핵 산의 종류 용량9,10를 제공 하는 가장 높은 RNA를 보여줍니다. 페이, 세포 막에 걸쳐 그들의 전송을 중재 및 그들의 세포내 방출 촉진 효소와 nonenzymatic 저하에서 핵 산을 보호 한다. 비록 처음 DNA 배달 시 약으로 도입, 페이 이후에 로컬 하나 siRNA 전달 vivo에서 또는 체계적으로9,10매력적인 플랫폼으로 시연 했다.
Superparamagnetic 산화 철 나노 입자 (SPIONs) 생물의 약, 그들의 자기 특성, 생체 적합성, 생물학으로 중요 한 개체, 높은 표면 지역에 양 비율에 비해 크기 때문에 큰 약속을 보여왔다 고 쉽게 적응 표면 bioagent 첨부 파일11. 예를 들어, 그들의 잠재적인 유틸리티 대조 대리인 및 대 식 세포에 의해 급속 한 통풍 관으로, 때문에 SPIONs 이미지 조직 대 식 세포12좋아하는 임상 도구로 떠오르고 있다. 문학에 대 한 캐리어로 SPIONs의 몇 가지 보고서가 포함 되어 동안 SPIONs 또한 광범위 하 게 연구 핵 산 배달 차량11,13,,1415, 우리의 지식, 대 식 세포를 대상으로 siRNA 전달입니다. SPIONs에 의해 유전자 배달에 대 한 그들의 표면은 일반적으로 친수성 양이온 폴리머는 부정적으로 위탁 된 핵 산 정전 끌었다 고 수 곁의 층으로 입힌 다. 여기, 우리가 그 표면 낮은 분자-무게 (10 kDa), 분기 페이 (PEI SPIONs) 수정 됩니다 SPIONs을 합성 하는 방법을 제시. 이러한 자기 nanoplatforms 다음 셀에 siRNA 전송 수 있도록 페이-스파이/siRNA 복합물을 형성 하는 siRNA를 압축 하는 채택 된다. 우리 reticuloendothelial 시스템16의 세포에 의해 SPIONs의 자발적인 먹어서 그 이유, 바인딩의 강한 능력이 함께 하 고 페이 SPIONs를 siRNA에의 효율적인 전송에 적합 렌더링 응축 핵 산 페이, 여 대 식 세포입니다. 여기에 제시 된 데이터 지원으로 문화 뿐만 아니라 vivo에서세포에 페이 스파이/siRNA-중재 된 유전자 침묵의 타당성.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>37°C에서 웜; C 사용 전 수조</td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(1.5ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>테트라졸륨 기반 MTS 분석 키트</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>세포독성 분석용</td></tr><tr><td>RAW 264.7 세포주</td><td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트(6-well)</td><td>코닝</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 (10cm)</td><td>코닝</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 튜브 (1.5 ml)</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>원심 분리기 튜브 (15 ml)</td><td>코닝</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Wistar 쥐</td><td>상하이 실험 동물 센터 중국어 아카데미 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>바실러스 칼메트&ndash; 구에큐트; 린 동결 건조 분말</td> 쥐에서 <td>보조 관절염을 유발하기위한</td><td>중국 식품 의약 통제</td><td></td> 국립 연구소</tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (상하이, 중국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (광저우, 중국)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 이민 (10 kDa)</td><td>알라딘 화학 시약 (주)</td><td></td><td></td>E107079</tr><tr><td>암모니아 물</td><td>알라딘 화학 시약 Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>올레산</td><td>알라딘 화학 시약 Co., Ltd.</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Aladdin 화학 시약 Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&bull; 7H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., 주식</td><td>회사 10012118</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&bull; 6H2O</td><td>Sinopharm 화학 시약 Co., Ltd</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Dimercaptosuccinicic acid</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>D107254</tr><tr><td>한외여과 튜브</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylammonium hydroxide solution</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>입자 크기 및 제타 전위 분석기</td><td>Malvern, England</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 rna의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 vivo에서

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

면역 반응 조절에 그들의 중요 한 역할 때문에 세포 지속적으로 집중적인 연구의 대상이 되고있다 하 고 자가 면역 질환, 동맥 경화, 암 등 여러 질환에 유망한 치료 대상 대표. 프로브; 대 식 세포 기능을 조작 하는 선택의 귀중 한 접근은 RNAi 중재 한 유전자 침묵 그러나, siRNA와 대 식 세포의 transfection 종종 기술적으로 도전으로 간주 하 고, 현재, 대 식 세포를 siRNA 전송에 전념 하는 몇 가지 방법론을 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 siRNA의 세포 타겟된 배달에 대 한 차량으로 polyethyleneimine 코팅 superparamagnetic 철 산화물 나노 입자 (페이-SPIONs)를 사용 하 여 프로토콜을 제시. PEI SPIONs 바인딩 및 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 완전히 siRNA를 콘 덴 싱의 고 위에 할 수 있다. 생체 외에서이러한 나노 수 효율적으로 제공 siRNA transfection에 대 한 최적의 복용량에서 손상 세포 생존 능력 없이 대 식 세포와 같은 RAW 264.7 세포 라인에 뿐만 아니라 기본 세포로 하 고, 궁극적으로, 그들은 유도 siRNA 중재 대상 유전자 침묵입니다. SiRNA transfection 생체 외에서 사용 되 고, 떨어져 페이 SPIONs 세포에서 vivo에서를 siRNA를 제공 하기 위한 유망한 도구 있습니다. 자기적 성질 및 유전자 침묵 능력의 결합된 기능에 비추어 체계적으로 관리 페이-스파이/siRNA 입자 뿐만 아니라 대 식 세포 기능 조절 뿐만 아니라 몇 군데를 추적 세포 활성화 예상 된다. 페이-SPIONs 대 식 세포를 siRNA 전달, 안전, 간단 하 고 효과적인 nonviral 플랫폼을 대표 하는 본질적으로, 모두 생체 외에서 그리고 vivo에서.

크기와 제타 페이-SPIONs이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 잠재력 29-48 nm의 범위에 있었다 (증가할수록 인덱스: 0.12-0.23) 및 30-48 mV, 각각. 그들은 분명 집계 없이 12 개월 동안 4 ° C에 물에서 안정 되어 있었다. 능력을 바인딩 그들의 siRNA를 평가 하려면 페이 SPIONs 다양 한 Fe: siRNA 무게 비율에 siRNA와 혼합 했다. 그림 1 는 Fe: siRNA 무게 비율에 도달 하면 4 그리고 위에, 무료 siRNA의 밴드 완전히 누락, 암시 하는 페이 SPIONs 성공적인 siRNA 바인딩을 보여 줍니다. 생물 의학 응용 프로그램에서 PEI의 주요 관심사는 그것의 독성, 높은 분자 무게와 높은 복용량에서 특히 강한 긍정적인 책임의 결과 이다. 같이 그림 2A, 페이-SPIONs는 제타와의 잠재적인 30.5 37 mV...

Polyethyleneimine (페이)를 사용 하는 방법 설명-siRNA와 transfecting 세포에 대 한 superparamagnetic 산화 철 나노 입자를 코팅. 이러한 나노 입자 세포 생체 외에서 그리고 vivo에서 및 침묵 대상 유전자 발현을 효율적으로 siRNA를 제공할 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

이 측정값은 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 인문학 분야에서. 병리학적 조건에 생리적 끝에 있는 대식세포 의 기능에 있는 그 대답.이 기술의 주요 장점은 코팅 된 폴리에틸렌네이민이 세포를 손상시키지 않으면서 효율적으로 생체 외에서 할 수 있다는 것입니다. 최적의 복용량에서. 이 기술의 의미는 많은 만성 염증 성 장애및 암의 치료와 진단으로 확장됩니다.대식세포가 병인에 필수적인 역할을 하는 곳. 절차를 시연하는 것은 나지아가 될 것입니다. 내 실험실에서 대학원생.그리고 Kaixuan 왕 박사 샤오화 박사의 실험실에서 대학원 생. 아렐산 수정 슈퍼 파라자성 산화나노입자 또는 SPION의 첫 번째 28그램의 파라클로리드 헥사하이드레이트를 준비한다. 그리고 20 그램 의 파라는 탈이온 화 물의 80 밀리리터를 포함하는 비커에 heptahydrate.그리고 유리 도관을 사용하여 용액에 질소를 도입하십시오. 고체 물질이 용해될 때까지 저어줍니다. 반응 혼합물을 섭씨 72도로 가열하여 분당 800회전에서 저어줍니다.그리고 비커에 28 %의 암모니아 물 40 밀리리터를 추가합니다. 5분 후 9밀리리터의 아일산 드롭을 현명하게 추가합니다. 그리고 연속 교반과 3 시간 동안 섭씨 72도에서 혼합물을 유지합니다.인큐베이션의 끝에서 실온에 대한 결과 솔루션을 냉각시. 및 표준 프로토콜에 따라 자기 분리를 통해 혼합물을 침전한다. 그런 다음 침전을 함유한 SPION을 절대 에틸 알코올로 세 번 씻는다.그리고 n-헥산의 100 밀리리터에 침전을 배분. 디메카토 아크릴산을 준비하려면 변형된 SPION의 800 밀리그램의 아를랄산 변형 SPION의 추가. 200밀리리터의 n-헥산과 400밀리그램의 이압성 아크릴산에 분산되어 200밀리리터의 아세톤에 60°C의 수조에서 3개의 목 플라스크에 분산되어 있습니다.다음으로 분당 1000회전에서 교반하고 역류를 가하는 플라스크에 트리에틸라민 드롭 200마이크로리터를 넣습니다. 검은 침전은 5시간 후에 자기 분리에 의해 얻어질 수 있다. 그런 다음 테트라메틸람모늄 수산화를 사용하여 용액의 pH를 조절하여 탈이온화된 물에서 수성 성 SPION의 동질 분산용 용액을 조절한다.퇴화 폴리에틸렌네이민 코팅 SPION's는 디메카토 아크릴산을 첨가하여 SPION의 콜로이드 용액을 10킬로달톤 폴리에틸렌네이민 용액으로 현명하게 떨어뜨립니다. 500 밀리리터에서 2 시간 동안 분당 1000 회전에서 기계적 교반 에서 세 목 플라스크. 인큐베이션의 끝에서 100킬로달톤의 분자량이 차단되고 15 밀리리터의 함량을 가진 울트라 여과 튜브에 결과 용액을 추가합니다.나머지 용액이 1밀리리터 부피에 도달할 때까지 샘플을 센트라퓨즈합니다. 용액에 탈이온화된 물을 추가하여 볼륨을 15 밀리리터로 되돌려 보세요. 그리고 단지 입증된 바와 같이 10배 더 솔루션을 다시 수분하고 재수화합니다.그런 다음 섭씨 4도에서 보관할 수 있도록 22미크론 필터를 통해 용액을 필터링합니다. siRNA 나노 입자를 준비하기 위해 먼저 5 개의 라벨이 부착 된 RNA의 무료 마이크로 센트로아프로폰 튜브에 갓 준비 된 20 마이크로 몰라 siRNA 솔루션 3 마이크로 리터를 추가합니다. 그리고 각각 0, 8, 1.6, 3.2 및 6.4 마이크로그램의 폴리에틸렌네이민 SPION을 0, 1, 2, 4 및 8로 표시한 튜브에 추가합니다.부드러운 파이펫팅과 혼합한 후, 실온에서 30분 동안 시료를 배양하여 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체가 형성되도록 합니다. 그리고 순도 아가로즈와 함께 3% 아가로즈 젤을 준비합니다. 인큐베이션의 끝에 각 튜브에 샘플의 5 마이크로 리터 당 6X DNA 로딩 버퍼의 하나의 마이크로 리터를 추가하고 신중하게 혼합.그런 다음 모든 샘플을 젤에 로드합니다. 그리고 전기 전도를 센티미터당 5볼트로 실행합니다. 브로모페놀 블루 염료가 겔 길이의 3분의 2를 이동할 때까지.1일 전에 는 PBS를 사용하여 RAW264.7 세포 배양과 같은 마우스 미세파기를 세척한다. 그리고 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 5~10분 동안 25%의 트립신1밀리리터로 세포를 치료합니다. 세포의 대다수가 분리되었을 때.완전한 DMEN의 5 밀리리터와 트립신을 비활성화합니다. 그런 다음 모든 셀 클러스터를 분산시키기 위해 용액을 여러 번 배분합니다. 세포 현탁액을 멸균 15 밀리리터 코나켈 튜브로 전달하여 원심분리를 한다.그런 다음 계산을 위해 신선한 완전한 DMEN의 5 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 완전한 DMEN 농도의 밀리리터 당 4 세포에 4.5 배 10 배 세포를 희석. 그리고 세포 배양 인큐베이터에서 24 시간 배양에 대한 6 개의 웰 플레이트의 각 웰에 2 밀리리터를 추가합니다.다음날 1.5 밀리리터 RNA 스트림 미세 원심분리기 튜브에서 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 나노입자의 적절한 비율을 준비하여 부드럽게 혼합한다. 그리고 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 나노입자 복합체의 적절한 부피를 신선한 배지의 1밀리리터로 대체하였다. 폴리에틸렌네이민 스피온 시 복합체를 준비한다.이 경우 폴리에틸렌네이민 SPION의 더 많은 달이 사용될 수 있으므로 잠재적인 독성을 최소화할 수 있다. 그런 다음 플레이트를 조심스럽게 소용돌이어 우물 바닥에 걸쳐 나노 입자의 균일 한 분포를 달성합니다. 후속 세포 업데이트 또는 유전자 녹다운 결핍 분석까지 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 반환합니다.30.5 및 37 밀리볼트의 제타 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION은 밀리리터 당 최대 30 마이크로그램의 철분 농도에서 명백한 사이토 독성을 나타내지 않습니다. 이는 일반적으로 세포 형질에 사용되는 농도보다 약 2 배 고용이다. 폴리에틸렌네이민 스피온의 제타 잠재력 48 밀리볼트는 그러나 독성이 있다.심지어 가장 낮은 복용량에서 검사. 유동 세포측정에 의해 분석된 바와 같이, 세포의 90% 이상이 밀리리터당 15마이크로그램의 철분에서 형광으로 표지된 폴리에틸렌아이민 SPION siRNA 복합체로 전염될 수 있다. 블루 스테인링을 분쇄하여 세포 내화에 대한 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 농도의 효과에 대한 평가는 밀리리터 당 7.5 마이크로그램의 철분에서 최소한의 검출 가능한 염색을 보여줍니다.그러나 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 섭취량으로 인해 더 높은 농도의 철분농도에서 증가하지 않는 밀리리터당 15 마이크로그램의 철분에서 명확하게 눈에 띄는 반점이 명확하게 드러난다. 폴리에틸렌아이민 SPION의 특정 siRNA항구로 감염된 회리세포는 비특이적 siRNA에 비해 타지 mRNA 수치가 현저한 감소를 나타낸다. siRNA는 RNA 간섭 기계에 도달하기 위하여 세포질로 내세포 소포에서 탈출할 수 있다는 것을 건의합니다.또한 1회 투여량의 폴리에틸렌에이민 스피온 siRNA 나노입자 복합체의 정맥 주사 후 CD11b 양성 및 CD3 양성 세포의 flocentimetrical 분석을 통해 검사된 모든 기관에서 CD3 양성 세포보다 더 효율적인 세포세포를 발현하는 CD11b에 의한 나노입자의 보다 효율적인 섭취를 나타낸다. 이 절차를 시도하는 동안 37 밀리볼트보다 높지 않은 평균 데이터 잠재력을 가진 폴리에틸렌네이민 SPION의 준비를 기억하고 낮은 철에 폴리에틸렌네이민 SPION siRNA 복합체를 siRNA 비율에 준비하는 것이 중요합니다. 이 기술은 연구원이 암과 같은 인간 질병의 동물 모터에 있는 대식세포를 표적으로 하는 치료 잠재력을 탐구하는 필요를 비교합니다.

polyethyleneimine-coated-iron-oxide-nanoparticles-as-vehicle-for

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

생쥐의 양이온 liposomes/siRNA/ITSN-1s 단지 24 일 동안 72 시간마다 반복적으로 복고풍 궤도 주사 효율적으로 75 %에 ITSN - 초 발현 및 단백질 발현을 감소 마우스 폐 미세 혈관에 siRNA의 양면을 제공합니다. 이 기술은 동물 모델에서 높은 재현성, 부작용이없고 사망을 방지합니다.

양이온 성 리포좀을 통해 특정의 siRNA 반복 전달하여 마우스 폐 Intersectin-1의 장기 침묵. 전자 현미경에 의한 넉다운 효과의 평가

이 프로토콜에서는 Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System을 사용하여 쥐 대식세포 세포주를 siRNA로 효율적으로 transfection하고, 지질다당류로 대식세포를 자극하고, 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

마우스 대 식세포의 타고난 면역 반응을 조사하기 위해 RNA 간섭을 사용하여

배달은 작은 간섭 RNA (siRNA의)의 치료 구현을위한 주요 과제로 남아. 이 프로토콜은 아르기닌 및 폴리에틸렌 이민 다공성 실리콘 그래프트 미립자로 구성된 다기능 및 생체 적합성의 siRNA 전달 플랫폼의 사용을 포함한다.

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

이 원고는 PEI / MNP 벡터와 자신의 자화에 의해 내피 세포 수 미르 효율적인 비 바이러스 성 전달을 설명합니다. 따라서, 유전자 변형뿐만 아니라,이 방법은 자기 세포 안내와 MRI의 검출 능력 수 있습니다. 이 기술은 치료 세포 제품의 특성을 개선하는 데 사용할 수 있습니다.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자화 특성의 내피 세포를 미르 변성

이 원고는의 리에 이중 가닥 RNA의 구강 섭취를 통해 독일 바퀴벌레는 midgut에 유전자 발현의 고갈 보여 줍니다.

RNA 방해의 실용적인 사용: Liposome 캐리어 바퀴벌레에 대 한 이중 가닥 RNA의 구두 납품

이 프로토콜에서는 안전 하 고 효율적인 절차 CD133 수정+ 조 혈 줄기 세포. 제시 비 바이러스 성, 자기 polyplex 기반 접근 자기 공명 화상 진 찰을 통해 관리 셀 제품 모니터링에 관해서는 뿐만 아니라 치료 줄기 세포 효과의 최적화를 위한 기반을 제공할 수 있습니다.

성인 골 수 유래 조 혈 줄기 세포로 세포 공학 자기 대상으로 함께 있도록 예측에 관한 전송을 위한 프로토콜

조직 관련 예측에 관한 저해는 예측에 관한 분야에서 저 개발 하는 기술 이다. 여기, 우리가 성공적으로 마음에서 myoblast 셀에서 미르-181 예측에 관한 가족을 억제 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다. Nanovector 기술 한 예측에 관한 중요 한 비보에 심장 관련 미르-181 가족 억제를 보여 주는 스폰지 제공 하는 데 사용 됩니다.

Vivo에서 심장 관련 예측에 관한-스폰지의 Nanovector 납품

여기 우리가 드라이 필름 방식에 기반 하 고 안전에 대 한 사용할 수 있습니다 양이온 nanoliposomes의 생성에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 효율적인 전달 체 외에 문자 메신저 RNA.

체 외에서 의 효율적인 배달 양이온 Nanoliposomes의 세대 문자 메신저 RNA

여기에서 우리는 여러 신장 질환 마우스 모델에서 비바이러스 벡터 및 폴리에틸렌이민 나노입자의 꼬리 정맥 주입을 통해 외인성 인공 합성 miRNA 모방체를 신장에 전달합니다. 이로 인해 신장에서 표적 miRNA가 크게 과발현되어 여러 마우스 모델에서 신장 질환의 진행이 억제되었습니다.

여러 신장 질환 마우스 모델에서 폴리에틸레니민 나노입자를 사용하여 신장에 외인성 인공 합성 miRNA 모방체의 전달

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

혈액-뇌 장벽은 치료법이 없는 질병인 교모세포종에 대한 치료법을 전달하는 데 중요한 장애물입니다. 여기에서, 우리는 크기 덕분에 이러한 생리적 장벽을 우회하고 종양에 축적될 수 있는 in vivo image-guided iron oxide therapeutic nano platform을 보고합니다.

Glioblastoma multiforme animal model에서 oligonucleotide payload의 나노입자 전달

배우세요 대식세포에 siRNA를 효율적으로 전달하는 폴리에틸렌이민 코팅 산화철 나노입자 기법입니다. 이 방법은 체내외에서 유전자 침묵을 유도하여 만성 염증성 질환과 암 치료에 활용될 수 있습니다.

Polyethyleneimine 코팅 된 산화 철 나노 입자 작은 간섭 RNA의 세포에 배달 하는 수단으로 생체 외에서 그리고 Vivo에서

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