Name: 신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 배우세요 차가운 대기 플라즈마를 이용한 신경 줄기 세포 분화 촉진 방법을 체외에서. 이 기술은 파킨슨병 등 신경계 질환 치료에 활용될 수 있는 안전한 세포 이식용 세포를 제공합니다.

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이 작품은 소 학자 프로그램, Huazhong 대학의 과학 및 기술 (No. 2018KFYYXJJ071), 그리고 국가 자연 과학 재단의 중국 (No. 31501099와 51707012)의 독립적인 혁신 기금에 의해 지원 되었다.

1. 세포 문화 및 Predifferentiation
<ol><li>
신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
	<ol>
<li>Coverslips 폴 리 D lysine 코팅을 준비 합니다. 12-잘 접시에 메 마른 coverslip (지름 20 mm)을 넣어. 다음 단계에 따라 더 나은 세포 접착에 있는 coverslips에 대 한 물 (재료의 테이블)에 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 커버 유리를 코트. 참고: 최적의 조건 각 셀 라인 및 응용 프로그램에 대 한 결정 해야 합니다.<ol>
<li>Aseptically 폴 리-D-라이 신, 0.1 %w / v, 물에 coverslip의 표면 코트. 부드럽게 coverslip 표면에 코팅 되도록 바위.</li>
			<li>하룻밤 (~ 12 h) 37 ° C에서 배양 후 폴 리-D-리 솔루션을 제거 하 고 씻어 표면 3 살 균 물의 1 mL x.</li>
			<li>그들을 뿌리기 전에 셀 적어도 30 분을 건조.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
C17.2 (C17.2-NSC) 문화 murine 신경 줄기 세포 및 predifferentiation
	<ol>
<li>C17.2-NSCs Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 5% 말 혈 청 (HS), 및 1% 페니실린/스 ~ 2-3 d 37 ° C, 5% CO2 보충에 25 c m2 플라스 크에서 품 어.</li>
		<li>셀 85% 합류에 도달, 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS로 세포 세척 한 신선한 trypsin (0.25%)의 1 mL 플라스 크에 추가. 1 분;에 대 한 둬 그런 다음, 플라스 크 및 단일 세포 현 탁 액을 위해 여러 번 왔다 갔다 피 펫 문화 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>정지는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 밀도 계산. 2 × 104 셀/mL의 최종 셀 농도 주고 세포 현 탁 액의 필요한 볼륨을 계산 합니다.</li>
		<li>씨 C17.2 NSCs 코팅된 coverslips에 ~ 잘 당 104 셀 x 2의 밀도와 12-잘 접시에. 현미경으로 세포 밀도 확인 합니다. 참고: 더 나은 결과 위한 최적의 셀 밀도 면역 형광 실험 하기 전에 결정 되어야 합니다.</li>
		<li>첨부 파일에 대 한 있도록 12 h에 대 한 셀 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
		<li>첨부 후 씻어 셀 2 x 1 mL의 PBS로 1 %N2 플라즈마 치료 전에 48 h에 대 한 보완과 DMEM/F12 이루어진 차별화 매체와 셀을 육성.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기본 쥐 신경 줄기 세포 배양 및 predifferentiation
	<ol>
<li>5 x 105 세포의 밀도에 uncoated T25 플라스 크에 쥐 NSC 성장 매체에서 주 쥐 NSC 정지 문화. 참고: 기본 쥐 NSCs Xie 그 외 의 프로토콜을 따르고 고립 됐다 9.</li>
		<li>거꾸로 현미경 neurospheres의 형성을 확인 하십시오. neurospheres의 형태 전시 구형 하 고 투명 한 다세포 단지 다는 것을 확인 하십시오.</li>
		<li>neurospheres 직경 3 m m 이상에 도달, 전송 neurosphere 정지는 15 mL 메 마른 분리기 관 고는 neurospheres 중력에 의해 정착.</li>
		<li>신중 하 게 매체의 최소한의 볼륨에는 neurospheres를 떠나 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>Neurospheres 1 린스는 neurospheres 중력에 의해 침전 PBS의 5 mL x. PBS의 최소한의 볼륨을 떠나 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>차별 매체 12 ~ 15 밀리 리터 당 neurospheres에 셀 밀도 조정의 적합 한 볼륨을 추가 합니다. 기본 쥐 NSCs 차별화 매체 구성 DMEM/F12, 2 %B27, 및 1 %FBS.</li>
		<li>씨 12-잘 접시에 각 코팅된 coverslip에 neurosphere 서 스 펜 션의 1 mL. 참고: 격판덮개는 neurospheres은 고르게 분포 되도록 부드럽게 흔들어. 이 단계는 더 나은 면역 형광 검사 결과 대 한 중요 한.</li>
		<li>인큐베이터에 접시를 놓고 플라즈마 치료 전에 24 h에 대 한 predifferentiate에 그것을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. 플라즈마 제트의 준비
<ol><li>2 m m 내부 직경 및 외부 직경 4 m m.의 반 오픈 석 영 튜브 튜브 2 m m의 직경을 가진 높은 전압 와이어 삽입 선택 하십시오.</li>
	<li>5 mL 주사기로 높은 전압 와이어와 석 영 튜브를 삽입 하 고 주사기의 센터 마운트 홀더를 사용 하 여. 1 cm에서 석 영 튜브의 봉인된 끝과 주사기 끝 사이의 거리를 설정 합니다.</li>
	<li>주사기의 열린 끝을 (와 12 m m 내부 직경) 1 m 실리콘 고무 파이프를 연결 하 고, 다음, 순서 대로 유량 계 및 가스 밸브에 연결.</li>
</ol>3입니다. 제트기의 수집
<ol><li>그림 1과 같이 회로 연결 합니다. 플라즈마 제트 장치에 전원 공급 장치의 출력 와이어를 연결 하 고, 다음, 높은 전압 프로브 끝 전압을 출력 와이어 연결. 출력 전압의 정보를 기록 하는 오실로스코프에 고전압 프로브의 다른 쪽 끝을 연결 합니다. 전체 회로 확인 하 고 전원 공급 장치, 오실로스코프, 그리고 높은 전압 프로브 모두 접지 되어 있는지 확인 하십시오.</li>
	<li>가스 라인을 확인 합니다. 가스 튜브; 플라즈마 제트 장치에 연결 되어 있는지 확인 다음, 헬륨 (볼륨 분수, 99.999%)와 산소 (볼륨 분수, 99.999%)의 가스 밸브를 열고 L:0.01 1 L/min (그: O2)를 가스 흐름을 설정 합니다. 참고: 처음으로 전원 공급 장치를 켜기 전에 몇 분 동안 가스 흐름을 보자.</li>
	<li>펄스 진폭, 주파수, 및 펄스 폭을 8로 설정 kV, 8, 및 1600 ns, 각각. 회로 다시 확인 하 고, 출력 버튼을 플라즈마 제트를 생성, 설정. 주의: 언제 든 지 높은 전압 와이어를 만지지 마십시오.</li>
</ol>4. 플라즈마 처리 신경 줄기 세포의
<ol><li>주사기의 노즐 및 15 mm 셀 잘 구멍 사이의 거리를 설정 합니다. 참고: 거리 12-잘 접시 배치 됩니다 플랫폼의 하단에서 측정 됩니다.</li>
	<li>인큐베이터에서 12-잘 접시를가지고 고 신선한 차별화 매체의 800 µ L predifferentiated 셀의 변경.</li>
	<li>3 개의 그룹으로 셀 분할: 치료 되지 않는 통제 그룹, 60 s 그 O2 (1%) 가스 흐름 처리 그룹, 그리고 60 s 플라즈마 처리 그룹. 참고:가 아무 명백한 액체 치료 조건 하 에서입니다.</li>
	<li>플라즈마 제트 아래 12-잘 접시, 주사기 노즐 각 구멍의 중심에 고정 되어 있는지 확인 하십시오 놓고 4.3 단계에서 언급 한 다른 그룹에 관련 된 치료를 제공 합니다. 참고: 치료 컨트롤 실험 절차를 균일 한 치료 조건 동안 실 온에서 차별화 매체에 유지 했다. 그 O2 (1%) 가스 흐름 치료 그룹은만 그 치료와 O2 (1%) 가스 흐름, 플라즈마 생성 없이. 모든 치료는 3 중에서 수행 되어야 합니다.</li>
</ol>5. 신경 줄기 세포 분화
<ol><li>치료 후, 원래의 문화를 제거 하 고 각 우물에 새로운 차별화 매체의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>6 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어 d. 변경 매체 매일.</li>
	<li>거꾸로 단계 대조 조명 현미경 아래 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인 하십시오. 임의로 적어도 12 필드를 선택 하 고 형태학 상 변화를 기록 하는 사진을 찍는.</li>
</ol>6. 면역 형광 염색
<ol><li>
세 정
	<ol>
<li>셀 인큐베이터에서 샘플을 받아 고 포부에 의해 매체를 제거 합니다. 1 셀 린스 1 mL의 PBS와 x. 참고: 차별화, 후 셀은 쉽게 분리. 그것은 세포에서 세척 하지 않으려면 문화 우물의 측면에서 PBS를 추가 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
고정
	<ol>
<li>실 온에서 20 분 동안 4 %paraformaldehyde 500 µ L로 셀을 수정 합니다. 고정, 후 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS 5 분 각, 잔여 4 %paraformaldehyde 제거. 참고: 셀 고정을 위한 최적의 시간 포인트 셀 유형에 따라 결정 되어야 합니다. 고정, 후 문화 우물의 측면에서 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 테이블에는 샘플을 두고. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Permeabilization
	<ol>
<li>0.2% 샘플 permeabilize 실 온에서 10 분에 대 한 PBS에 TritonX-100. Permeabilization, 후 3 시간, 5 분 각 1 mL PBS와 부드럽게 셀 린스. 참고: 셀 permeabilization에 대 한 최적의 시간 포인트 셀 형식에 따라 결정 되어야 합니다. Permeabilization, 후 5 분에 대 한 테이블에는 샘플 두고 문화 우물의 측면에서 1 mL PBS를 추가. 셀의 최소 손실 되도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
차단
	<ol>
<li>각 샘플에 PBS에 10% 염소 혈 청 1 mL을 추가 하 고 어떤 일반적인 상호 작용을 차단 하는 1 시간에 대 한 테이블에는 샘플을 두고. 참고: 셀 슬라이드에서 분리 되지 않도록 실험실 셰이 커를 사용 하지 마십시오. 린스는이 단계에서 필요 하지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1 차적인 항 체를 가진 외피
	<ol>
<li>1 차적인 항 체 희석 버퍼를 사용 하 여 1 차적인 항 체 희석. 참고: 최적의 결과 대 한 1 차적인 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다. (대 한 미 분화 줄기 세포), 안티 Nestin의 희석 비율 (신경)에 대 한 안티-β-Tubulin III, 안티-O4 (oligodendrocyte)에 대 한, 안티-NF200 (대 한 성숙한 뉴런), (대 한 해 신경), 반대로 채팅 안티-LHX3 (모터 신경)에 대 한 안티-GABA ( GABAergic 신경), (대 한 serotonergic 신경), 항 세로토닌 및 안티-일 (대 한 dopaminergic 신경)는 1:80, 1: 200, 1: 100, 1: 100, 1: 100, 1: 200, 1: 100, 1: 200, 그리고 1: 100, 각각.</li>
		<li>300 µ L 희석된 주 항 체의 다른 샘플에 적용 됩니다.</li>
		<li>4 ° c.에 하룻밤 셀 샘플을 품 어 참고: 배경 및 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 4 ° C에서 1 차 항 체를 품 어에 추천 된다.</li>
		<li>1 차 항 체를 제거 하 고 부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
이차 항 체를 가진 외피
	<ol>
<li>Cy3 활용 또는 알 렉 사 Fluor 488 활용 된 이차 항 체 3% 염소 혈 청을 사용 하 여 PBS에 희석. 참고: 최적의 결과 대 한 이차 항 체의 최종 희석 비율은 예비 시험에 의해 결정 되어야 합니다.</li>
		<li>각 1 차적인 항 체를 검출 하기 위하여 관련 2 차 항 체의 300 µ L를 적용 합니다. 참고: 모든 후속 단계 형광 냉각을 방지 하기 위해 어둠 속에서 수행 해야 합니다.</li>
		<li>실 온에서 2 h에 대 한 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.</li>
		<li>2 차 항 체를 제거 하 고 실 온에서 10 분에 대 한 PBS의 1 mL와 함께 부드럽게 셀 린스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
핵 얼룩
	<ol>
<li>Hoechst 33258 작업 솔루션을 셀 샘플을 담가의 500 µ L를 적용 합니다.</li>
		<li>핵을 실 온에서 8 분 동안 어둠 속에서 셀 샘플을 품 어.</li>
		<li>부드럽게 씻어 셀 3 x 1 mL의 PBS, 10 분 각, 빛 으로부터 보호. 참고: 셀의 최소한의 손실, 최적의 세척 조건 결정 되어야 합니다 경험.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
장착
	<ol>
<li>microslide의 중심에 장착 매체의 한 방울을 배치 합니다.</li>
		<li>핀셋을 사용 하 여 (샘플)와 coverslips에서 하 고 신중 하 게 장착 매체 위에 샘플 위치. 공기 방울을 피하십시오.</li>
		<li>흡수 성 종이 초과 설치 매체를 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 현미경 관찰
	<ol>
<li>Hoechst 33258, 알 렉 사 Fluor 488, 및 Cy3 필터 장착 형광 현미경 아래 샘플을 관찰 합니다. 각 샘플에 대 한 무작위로 선택 적어도 8-12 필드와 레코드 이미지 카메라와 함께 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Jamur, M. C., Oliver, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Cell Membranes.</a> Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

C17.2-NSCs 일종 이다 신생아 마우스 소 뇌 세분화 된 계층 셀에서 불멸 하 게 신경 줄기 세포 선의10,11스나이더 및 다른 사람에 의해 개발. C17.2-NSCs 신경, 이다, 그리고 oligodendrocytes로 분화 할 수 있다 하 고 신경 과학12에서 널리 이용 된다. 우리의 이전 연구에서 모자 뉴런으로 C17.2 NSCs의 차별화를 향상 시킬 수 있습니다. 증거의 원리 연구 또한 실행 되었다 주 쥐 NSCs를 사용 하 여 고 주 쥐 NSCs에 플라즈마 노출의 효과 C17.2 NSCs, 뉴런의 강력한 차별화의 질적으로 유사 했다. 모자, 새로운 물리 화학적 기술, Alzheimer의 질병, PD, 척수 손상 등 신경 질환 치료를 위한 유망한 도구를 나타낼 수 있습니다.
모자 치료 C17.2 NSC와 기본 쥐 NSC ...

조직 교통에 대 한 특정 계보에 NSCs의 감독된 분화 신경 및 neurotraumatic 질병1에 대 한 가장 유망한 요법 중 하나 간주 됩니다. 예를 들어 catecholaminergic dopaminergic 신경 세포는 특히 파 킨 슨 병 (PD) 치료에 원하는 됩니다. 그러나, 교통에 대 한 원하는 세포를 준비 하는 전통적인 방법 화학 독성, 흉터 형성, 또는 다른 사람, 재생 의학2NSCs의 애플 리 케이 션을 크게 저해 하는 등 많은 단점이 있다. 따라서, 그것은 매우 NSC 차별화에 대 한 소설과 안전한 방법의 찾을 필요가 있다.
플라즈마 문제, 다음 고체, 액체, 가스의 제 4 상태 이며, 그것은 구성 하는 전체 우주에서 문제의 95% 이상. 플라즈마 전기 중립 중립 입자와 언바운드 긍정적/부정적 이며 일반적으로 실험실에서 고압 방전에 의해 생성 됩니다. 지난 2 년간에 의학에서 플라즈마의 응용 프로그램 차가운 대기압 플라즈마 기술 개발으로 세계적으로 큰 관심을 모으고 있다. 이 기술 덕분에 안정적인 저온 플라즈마 아크 형성 없이 분위기에 주위 공기에 생성 될 수 있습니다 및 종의 다양 한 반응, 반응 질소 종 (RNS), 반응성 산소 종 (선생님), 자외선 (UV)로 구성 되어 방사선, 전자, 이온, 및 전기 분야3. 모자는 마이크로-유기 체 비활성화, 암 치료, 상처 치유, 피부 질환, 세포 증식, 세포 감 별 법4,5,,67의 치료에 대 한 독특한 장점이 있다. 이전 작품에서는, 우리가 보여주는 차가운 대기 플라즈마 제트 murine 신경 줄기 세포 C17.2 (C17.2-NSCs)에 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSCs의 분화를 향상 시킬 수 있습니다는 감독에 대 한 강력한 도구가 될 큰 잠재력을 전시 NSCs8분화 NSC 차별화의 모자 향상의 기계 장치는 완전히 이해 되지 않습니다 아직, 비록 모자에 의해 생성 된 NO는 과정에서 핵심 요소가 될 것 입증 되었다. 이 작품에서는, 우리는 NSCs 생체 외에서셀 준비 및 전처리, 거꾸로 한 현미경으로 형태학 관찰의 치료는 대기압 헬륨/산소 플라즈마 제트를 사용 하 여 자세한 실험 프로토콜을 제공을 목표로 하 고 면역 형광 염색 법의 형광 현미경 관찰입니다.

<table><tbody><tr><td>Coverslip</td><td>NEST</td><td>801008</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 배지</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01B</td>는 <td>4°C에 보관됩니다. C</td></tr><tr><td>DMEM/F12 매체</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01B</td><td>는 4°C에 보관됨; C</td></tr><tr><td>N2 보충제</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>-20°C에 보관됩니다. C와 가벼운</td></tr><tr><td>B27 보충</td>교재 <td>Gibco</td><td>17504044</td><td>-20 &deg에 저장되는 것을 보호하십시오; C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>HyClone</td><td>SH30084.03</td><td>-20 &deg에 저장; C, -</td></tr><tr>20 &deg에서 tored<td>Donor Horse serum</td><td>HyClone</td><td>SH30074.03</td> 동결 및 해동을 반복하지 마십시오<td>. C,</td></tr><tr>4°C에 저장된<td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td> 반복적으로 동결 및 해동하지 마십시오<td>. C</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>HyClone</td><td>25300054</td><td>4°C에 저장됩니다. C</td></tr><tr><td>PBS 솔루션</td><td>HyClone</td><td>SH30256.01B</td>는 <td>4°C에 저장되었습니다. C</td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드</td><td>Beyotime</td><td>P0098</td>은 <td>-20°C에 저장되었습니다. C</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>일반 염소 혈청 차단 솔루션</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000-20</td><td>4°C에 저장; C</td></tr><tr><td>anti-Nestin</td><td>Beyotime</td><td>AF2215</td>는 <td>-20 &deg에 저장되었습니다. C,</td></tr><tr><td>안티 -&deg에 저장된 Tubulin III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2200</td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C, 동결 및 해동을 반복하지 마십시오</td></tr><tr><td>Anti-O4</td><td>R & D Systems</td><td>MAB1326</td><td>-20 &deg에 저장됩니다. C,</td></tr><tr>-200 °°C에 보관<td>된 반 NF200</td><td>시그마</td><td></td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C,</td></tr><tr>-20 &deg에 저장된<td>반 ChAT</td><td>시그마</td><td></td>를 반복적으로 동결 및 해동하지 마십시오<td>. C,</td></tr><tr>-20 &deg에 저장된<td>반 LHX3</td><td>시그마</td><td></td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C,</td></tr><tr>-20 &deg에 저장된<td>반 GABA</td><td>시그마</td><td></td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C,</td></tr><tr>-20 &deg에 저장된<td>안티 세로토닌 Abcam</td><td>, Cambridge, MA</td><td></td>의 동결 및 해동을 반복하지 마십시오<td>. C,</td></tr><tr>-20 &deg에 저장된<td>반 TH Abcam</td><td>, Cambridge, MA</td><td></td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C, 4°C에</td></tr><tr>저장된<td>Immunol 염색 1차 항체 희석 완충액</td><td>Beyotime</td><td>P0103</td>의 반복적인 동결 및 해동을 피하십시오<td>. C</td></tr><tr><td>Cy3 표지 염소 안티 토끼 IgG</td><td>Beyotime</td><td>A0516</td><td>-20 °°에 저장; C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- -</td>20 &deg에 저장된 염소 <td>Beyotime</td><td>A0428</td>로 표시되어 있습니다<td>. C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>안티-마우스 IgG&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12-웰 플레이트</td><td>corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 플라스크</td><td>corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258</td><td>Beyotime</td><td>C1018</td><td>-20 &deg에 저장; C 및 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>장착 매체</td><td>Beyotime</td><td>P0128</td><td>은 -20°C에 저장됩니다. C와 빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>광 현미경</td><td>Nanjing Jiangnan Novel Optics Company</td><td>XD-202</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경 Nikon</td><td></td><td>80i</td><td></td></tr><tr><td>High &ndash; 전압 전력 증폭기</td><td>지시 에너지</td><td>PVX-4110</td><td></td></tr><tr><td>DC 전원 공급 장치</td><td>Spellman</td><td>SL1200</td><td></td></tr><tr><td>함수 발생기</td><td>Aligent&nbsp;</td><td>33521A</td><td></td></tr><tr><td>오실로스코프</td><td>Tektronix</td><td>DPO3034</td><td></td></tr>전압 <tr><td>프로브</td><td>Tektronix</td><td>P6015A</td><td></td></tr></tbody></table>

신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해

Nerve Stem Cell Differentiation by a One-step Cold Atmospheric Plasma Treatment In Vitro

으로 실제 플라즈마 기술, 차가운 대기 플라즈마 (모자) 개발 오염, 암 치료, 상처 치유, 루트 운하 치료, 등에서 널리 조사 되어, 플라즈마 의학 이라는 새로운 연구 분야를 형성. 전기, 화학, 및 생물학적 반응 종의 혼합물 이기 때문에, 모자 나타났습니다 신경 줄기 세포 분화를 향상 시키기 위해 그들의 능력 둘 다 생체 외에서 vivo와 는 신경 질환 치료를 위한 유망한 방법 고 미래. 훨씬 더 흥미로운 뉴스 이며 그 모자를 사용 하 여 한 단계, 깨닫지 안전 감독, 신경 줄기 세포 (NSCs)의 조직 교통. 여기 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 신경 줄기 세포, NSC 차별화를 강화 하는 성가 모자 제트 장치를 사용 하 여 뿐 아니라 셀 운명으로 거꾸로 관찰 하 고 형광 현미경 검사 법의 자세한 실험 프로토콜을 설명 합니다. 면역 형광 검사 기술 얼룩의 도움으로 우리 모두는 NSCs 치료 그룹 보다 가속된 차동 속도 보였다 발견 하 고는 NSCs의 ~ 75%는 주로 성숙 하 고 해, 모터 신경에 선택적으로 분화 신경입니다.

셀 형태 모자 치료 후 매일 거꾸로 현미경 관찰 되었다. 그림 2 는 두 셀 라인에서 세포 분화의 일반 거꾸로 단계 대조 조명 현미경 이미지를 보여준다. 플라즈마 처리 그룹 가속된 분화 속도 및 제어 및 가스 흐름 그룹에 비해 높은 차별화 비율을 전시 한다.
Immunofluorescent 결과 C17.2 NSCs 및 기본 쥐 NSCs 후 치료 각각그림 4 , 그림 3 에 표시 됩니다 6 d에 대 한 양식입니다. Nestin (+, 녹색) 감소, β-Tubulin III (+, 레드)이 크게 증가 하 고 O4 (+...

이 프로토콜 신경 줄기 세포 및 분화 향상을 위한 면역 형광 검출에 차가운 대기 플라즈마 처리의 자세한 실험 단계를 제공 하는 것을 목표로.

As the development of physical plasma technology, cold atmospheric plasmas (CAPs) have been widely investigated in decontamination, cancer treatment, ...

이 방법은 체외에서 신경 줄기 세포의 분화를 강화하고 파킨슨 병과 같은 신경 질환의 치료에 기여할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 차가운 대기 플라즈마가 조직 이식을 위한 신경 줄기 세포의 안전한 지시분화를 위해 한 단계로 적용될 수 있다는 것입니다. 차가운 대기 플라즈마는 짧은 처리 기간 내에 신경 줄기 세포 분화를 향상시킬 수 있습니다.그리고 이식을 위해 원하는 세포를 제공하는 세포에 더 많은 손상이 필요합니다. 25센티미터 정사각형 플라스크에서 다섯 번째 뮤린 신경 줄기 세포에 약 5회 10번 을 시드하여 시작합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 2~3일 동안 5밀리리터의 완전한 DMEM을 함유하고 있습니다.세포가 85%의 합류에 도달하면 PBS의 1밀리리터로 배양을 씻으시다. 치료 하기 전에, 1 밀리 리터와 함께 25 1 분 동안 % 트립신. 세포가 분리되면 배양 배지의 1 밀리리터로 반응을 중지하십시오.그리고 파이펫은 단일 셀 서스펜션을 생성하기 위해 여러 번. 계산 후, 밀리리터 농도 당 네 번째 세포에 2 회 10으로 세포를 희석. 줄기 세포의 1 밀리리터를 12 세포 배양 판의 9개의 우물에서 잘 당 폴리 D-lysine 코팅 커버 슬립에 시드.현미경의 밑에 세포 조밀도를 확인하십시오. 그리고 세포를 인큐베이터로 12 시간 동안 반환합니다. 세포가 부착되면, 커버는 세척 당 PBS의 1 밀리리터로 두 번 미끄러짐을 세척하고 48 시간 동안 분화 매체로 세포를 치료하십시오.제트 획득을 위해 먼저 전원 공급 장치의 출력 와이어를 플라즈마 제트 장치에 연결합니다. 그리고 전압을 검출하는 출력 와이어와 고전압 프로브의 끝. 그런 다음 고전압 프로브의 다른 끝을 오실로스코프에 연결하여 출력 전압에서 정보를 기록합니다.전원 공급 장치, 오실로스코프 및 고전압 프로브가 모두 접지되었는지 확인하기 위해 전체 회로를 확인하십시오. 그리고 가스 라인을 확인하여 가스 튜브가 플라즈마 제트 장치에 연결되어 있는지 확인하십시오. 다음으로 헬륨 및 산소 가스 밸브를 열고 가스 흐름을 분당 01리터에서 산소에 대한 밀리엄 비율로 설정합니다.회로를 다시 확인하고 출력 버튼을 눌러 플라즈마 제트를 만듭니다. 신경 줄기 세포를 플라즈마 처리하려면 주사기 노즐과 세포의 첫 번째 우물 사이의 거리를 15 mm로 설정합니다. 신경 줄기 세포 배양에 있는 supernatants를 신선한 분화 매체의 800 마이크로리터로 대체하십시오.그리고 플라즈마 제트 아래에 접시를 배치합니다. 주사기 노즐이 각 우물의 중앙에 고정되어 있는지 확인합니다. 처리당 60초 동안 플라즈마로 3개의 우물을 만들고, 치료당 60초 동안 헬륨과 산소 가스가 1%인 3개의 우물을 만듭니다.세 개의 우물을 컨트롤로 처리하지 않고 둡시합니다. 그런 다음 슈퍼네티를 신선한 분화 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 그리고 6 일 동안 인큐베이터에 세포를 반환합니다.반전 된 위상 대비 빛 현미경에서 매일 다른 그룹의 분화 상태를 확인합니다. 치료 후, 세포가 상체를 신선한 분화 배지로 대체하기 전에 약 1 시간 동안 조건 배지에서 완전히 평형화되도록 합니다. 면역 불경증 분석을 위해 실온에서 20 분 동안 잘 4 % 파라 포름 알데히드의 500 마이크로 리터로 배양을 수정합니다.그 다음에는 3개의 부드러운 5분간 헹구고, 세척당 PBS 1밀리리터가 있습니다. 다음으로, PBS에서 2%의 Triton X-100을 실온에서 10분 동안 고정 시료를 투과합니다. 그 다음에는 부드럽게 헹군다.마지막 세척 후, 실온에서 1 시간 동안 샘플 당 PBS에서 1밀리리터의 1밀리리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 하룻밤 관심의 1 차 적인 항체의 300 마이크로 리터로 각 우물에 있는 세포를 레이블. 그 다음에는 PBS에서 세 번의 세 번의 세가지 세차정이 시연되었습니다.마지막 세척 후, 적절한 이차 항체의 300 마이크로리터로 세포를 라벨. 빛으로부터 보호, 실온에서 2 시간 동안 배양. 그런 다음 실온에서 10 분 동안 잘 당 PBS의 1 밀리리터로 부드럽게 세포를 헹구십시오.적절한 필터가 장착된 형광 현미경의 세포를 이미지합니다. 플라즈마 처리 된 신경 줄기 세포는 가속 분화 속도를 나타내며, 처리되지 않은 대조군및 가스 흐름 처리 줄기 세포에 비해 더 높은 분화 비. 플라즈마 처리 후 네신은 감소합니다.베타-투불린 III 크게 증가. 및 O4는 처리된 대조군 및 가스 흐름 처리 줄기 세포에 비해 약간 증가한다. 또한, 60초의 혈장 치료 후 성숙한 뉴런, 콜린성 뉴런 및 운동 신경 마커의 견고한 발현이 관찰된다.아주 몇몇 GABAergic 및 세로토너기신경, 그리고 아무 도파민지 뉴런 검출. 이러한 절차를 시도하는 동안, 기억 하는 것이 중요 하다, 적절 한 플라즈마 복용량으로 세포를 치료, 길고 강렬한 플라즈마 치료 기간 세포 세포 세포 세포 또는 괴 사를 유도 하기 때문에. 다운스트림 응용 프로그램 전에 셀 생존 가능성을 미리 테스트해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

이 비디오는 인간 배아 줄기 세포(hESCs)가 영양 세포나 중간 단계를 사용하지 않고 신경 전구 세포로 직접 분화되는 과정을 보여줍니다. 뼈 형태 유전 단백질(BMP)의 선택적 억제와 성장 인자-베타 또는 TGF-β 신호 전달 경로의 변형은 hESC를 신경 전구 세포(NPC)로 분화시킵니다.

인간 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 분화

이 비디오는 저온 대기 플라즈마를 활용하여 신경 줄기 세포에서 분화를 유발하는 방법을 제시합니다. 이것은 자외선과 반응성 분자를 생성하여 신경 세포가 돌기를 생성하도록 자극하여 신경 세포 분화를 나타냅니다.

Cold Atmospheric Plasma Treatment를 이용한 신경줄기세포 분화 자극

이 동영상은 인간 배아 줄기 세포에서 희소돌기아교세포 전구세포(OPC)를 생성한 후 OPC가 희소돌기아교세포로 성숙하는 과정을 보여줍니다. 이러한 희소돌기아교세포(oligodendrocyte)를 생성하는 과정은 알츠하이머병을 포함한 신경퇴행성 질환의 연구와 치료를 개선할 수 있는 수많은 길을 열어줍니다.

인간 배아 줄기 세포를 희소돌기아교세포로 분화

직접 방법 말초 혈 세포로부터 농축 조혈 전구 세포로부터 인간 신경 줄기 세포를 유도하기 위해 개발되었다.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

분화된 인간 신경 줄기세포(hNSCs)에서 miRNA의 변화를 특성화하기 위한 목적으로 3차원 시스템에서의 hNSC 분화, miRNA PCR 어레이에 의한 microRNA 발현 변화 평가, miRNA 표적 예측을 위한 컴퓨터 분석 및 이중 루시페라제 분석에 의한 검증에 대해 설명합니다.

3 차원 문화, 마이크로 RNA의 분석 및 추정 적 표적 유전자에 인간의 신경 줄기 세포 라인의 차별화

이 프로토콜은 기본 양수 액체와 막 중간 엽 줄기 세포의 화학적으로 완벽 하 게 정의 된 조건에서 비 통합 episomal 접근을 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 설명 합니다. 추출, 문화, 프로그래밍, 그리고 엄격한 방법으로 결과 유도 만능 줄기 세포의 특성의 절차 자세히 나와 있습니다.

기본 양수 및 Pluripotency 이종 무료 조건에서 막 셀 프로그래밍

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 분화 된 세포 유형을 생성하는 것은 훌륭한 치료 약속을 보유하고 있지만 여전히 도전적입니다. PSC는 종종 적절한 신호 세트로 자극된 경우에도 차별화할 수 없는 고유한 무능력을 나타냅니다. 여기에 설명된 간단한 도구는 다양한 PSC 라인에서 다중 라인 차별화를 향상시키는 간단한 도구입니다.

분화를 촉진하기 위해 DMSO를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포의 일시적인 치료

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.

지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축

배우세요 차가운 대기 플라즈마를 이용한 신경 줄기 세포 분화 촉진 방법을 체외에서. 이 기술은 파킨슨병 등 신경계 질환 치료에 활용될 수 있는 안전한 세포 이식용 세포를 제공합니다.

신경 줄기 세포 분화는 원스텝 차가운 대기 플라즈마 치료에서 체 외에 의해

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