Name: 폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 배우세요 쥐의 폐에서 염증 유전자를 조절하는 microRNA 발현을 평가하는 방법을. 발정 주기 단계와 오존 노출이 miRNA 수준에 미치는 영향을 탐색하여 폐 면역 상호작용 이해를 돕습니다.

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이 연구는 NIH K01HL133520 (PS) 및 K12HD055882 (PS)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 오존 노출 실험을 가진 원조에 대 한 박사 조 안 나 Floros를 감사합니다.

여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 펜실베니아 주립 대학에 의해 승인 되었습니다.
1입니다. Estrous 주기 단계의 평가
<ol><li>제대로 C57BL/6 마우스 (8-9 주 이전)을 사용 하 여 한 손으로 마우스 억제 기술 Machholz 외.10에서 설명 하는 여성을 제 지 하십시오.</li>
	<li>매우 순수한 물 10 μ로 살 균 플라스틱 피 펫을 채우십시오.</li>
	<li>질에 플라스틱 피 펫 팁을 소개 합니다.</li>
	<li>부드럽게 플러시 액체 4-5 회 샘플을 수집.</li>
	<li>질 액체 유리 슬라이드에 포함 된 최종 플러시를 놓습니다.</li>
	<li>20 x 목적으로 가벼운 현미경 흠 없는 질 플러시를 관찰 합니다. 참고: 일반 사이클 pseudopregnancy 또는 다른 원인으로 인해 표시 되지 않는 동물 실험에서 제외 될 필요가 있다. Cyclicity 확인을 3 개 이상 연속 사이클에 대 일 분 비 물 매일 수행 하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>2입니다. 오존에 노출
<ol><li>Ad libitum 와이어 메쉬 뚜껑, 그리고 물 두 1.2 L 유리 용기에 최대 4 마우스를 놓습니다.</li>
	<li>오존 챔버와 필터링 된 공기 노출 챔버에 다른 한 유리 용기를 넣어.</li>
	<li>정기적으로 2 ppm 및 모니터 오존 수준 오존 농도 조정 합니다. 참고: 레 귤 레이트 된 공기 흐름을 제공 하는 오존 장치 (> 30 공기 변화/h)와 제어 온도 (25 ° C) 및 상대 습도 (50%). 시스템 모니터링 하 고 앞에서 설명한11자외선 오존 분석기 및 질량 유량 컨트롤러에 의해 제어 되는 전기 방전 오존 발생기에 의해 오존을 생성 합니다.</li>
	<li>오존/필터링 공기 노출의 3 h 후 유리 컨테이너를 제거 합니다. 침구, 음식, 그리고 물 ad libitum 케이지를 동물을 반환 합니다.</li>
</ol>3. 폐 컬렉션
<ol><li>노출 후 4 h anesthetize는 케 타 민/xylazine 칵테일 (마 취 제 90 mg/kg, 10mg/kg xylazine)의 복 주사와 동물. 참고: 마 취의 적절 한 수준을 확인 하려면 체크는 페달에 대 한 마우스 (회사 발가락 핀치) 반사 고 필요에 따라 마 취를 조정.</li>
	<li>70% 에탄올과 마우스 피부를 적십니다.</li>
	<li>2 cm 중간 절 개를 베 나 정 맥을 노출 하는 운영가 위 및 수술 핀셋을 사용 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>의해 transection 베 나 정 맥과 대동맥의 쥐를 희생. 필요한 경우, exsanguination 전에 혈액을 수집 하는 신장 정 맥 위에 베 나 정 맥에 21 G 게이지 바늘을 삽입 합니다. 또는 심장 찔린 다음 표준 프로토콜을 통해 혈액을 수집 합니다.</li>
	<li>복 부 구멍을 자르면 갈비뼈 쪽으로 위쪽으로 이동 하는 피부/위 근육을 제거 하는 수술가 위를 사용 합니다.</li>
	<li>수술가 위를 사용 하 여 횡 경 막 펑크. 참고: 폐는 횡 경 막에서 붕괴 됩니다.</li>
	<li>컷 멀리 심 혼 및 폐를 노출 하는 수술가 위를 사용 하 여 흉 곽.</li>
	<li>집게를 사용 하 여, 1.5 mL microcentrifuge 튜브 RNase 무료 고 튜브를 채우기 위해 액체 질소에 잠수함. 참고: 보호 장갑 및 고글을 사용 하 여 액체 질소를 처리 하.</li>
	<li>폐를 제거 하 고 스냅-동결 조직에 액체 질소로 채워진 RNase 무료 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 넣어 액체 증발 될 때까지 몇 초 동안 기다립니다.</li>
	<li>관 뚜껑 닫고 사용까지 조직-80 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>4. RNA 준비
<ol><li>스테인리스 스틸 조직 분쇄기를 사용 하 여 전체 폐 격파 참고: 조직 분쇄기를 사용 하기 전에 액체 질소에 배치 될 필요가 있다. RNAse 솔루션과 각 사용 후에 분쇄기를 청소.</li>
	<li>분할 분쇄 폐 고 두 1.5 mL 튜브 (각 반 폐) 합니다.</li>
	<li>샘플 튜브 당 guanidinium 안산의 500 µ L을 추가 하 고 섞으십시오.  각각 18 G, G 21 및 23 G 바늘를 사용 하 여 각 샘플 균질 참고: 샘플 108 사본의 작은 RNA 스파이크에 컨트롤 (종)에서 추출 진행 하기 전에 x 5.6 아군 될 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플을 15 소용돌이 에탄올의 500 µ L를 추가 s.</li>
	<li>로드 컬렉션 튜브를 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기에서 회전 열에 혼합물을 통해 흐름 폐기.</li>
	<li>
DNase 대 나 치료 (서 열);
	<ol>
<li>12000 x g 1 분 동안에 RNA 워시 버퍼 및 원심 분리기의 400 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>RNase 무료 튜브에 추가 5 DNase의 µ L 나 DNA 소화 x 1의 75 µ L 버퍼와 혼합. 직접 열 매트릭스를 믹스를 추가 합니다.</li>
		<li>15 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>12000 x g 에서 원심 분리기 1 분 통해 흐름 삭제에 대 한 열을 RNA prewash 솔루션의 400 µ L을 추가 하 고이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>열에 RNA 워시 버퍼의 700 µ L을 추가 하 고 1 분에 12000 x g 에서 원심 분리기를 통해 흐름 삭제.</li>
	<li>12000 x g 2 분 나머지 버퍼 제거에서 원심. RNase 무료 튜브로 열을 전송 합니다.</li>
	<li>RNA을 elute 열 매트릭스 1.5 분 12000 x g 에서 원심 분리기에 직접 DNase/RNase 무료 물 35 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>총 RNA 농도 측정 (260 nm)와 순도 분 광 광도 계를 사용 하 여. Aliquot 1.5 µ L 샘플에서 RNA 정량화를 수행 하는 지침을 따릅니다. 차입에 대 한 사용 하는 DNase/RNase 없는 물으로 악기를 빈. 참고: ~2.0의 260/280 비율 이다 RNA에 대 한 "순수"로 일반적으로 수용 된다. 전형적인 RNA 농도 일반적으로 750와 2500 ng / µ L 사이 범위.</li>
	<li>-80 ° c.에 게</li>
</ol>5. 미르 프로 파일링
<ol><li>
레트로-작은 RNAs, 사용 200 ng 총 RNA의 녹음.
	<ol>
<li>(반응 당 총 볼륨은 20 µ L) 얼음에 반전 녹음 방송 반응 혼합을 준비 합니다. 각 반응에 대 한 버퍼, 뉴클레오티드 혼합 10 x 2 µ L, 역전사의 2 µ L RNase 무료 물 2 µ L x 5의 4 µ L를 추가 합니다. 모든 구성 요소와 600 µ L RNAse 무료 플라스틱 튜브 (혼합 반응 당 10 µ L)에서 약 수를 혼합. 참고: 리버스-전사 마스터 믹스 템플릿 RNA 제외 하 고 첫번째 물가 cDNA 합성에 필요한 모든 구성 요소를 포함 합니다. 참고: 믹스 마스터를 준비할 때 초과 볼륨 (10%)를 계산 합니다.</li>
		<li>추가 서식 파일 RNA (200 10 µ L에서 ng) 리버스 전사 마스터 믹스를 포함 하는 각 관에. 믹스, 15에 대 한 원심 분리기 1000 x g, s thermocycler 또는 건조 블록 배치까지 얼음에 그들을 저장 하 고.</li>
		<li>37 ° c.에 60 분 동안 품 어</li>
		<li>95 ° C에서 5 분 동안 incubate 고 얼음에 튜브를 놓습니다.</li>
		<li>각 20 µ L 반전 녹음 방송 반응에 RNase 무료 물 200 µ L을 추가 하 여는 cDNA를 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
실시간 PCR PCR 배열 마우스 염증 반응 및 면역 미르를 사용 하 여 수행 합니다.
	<ol>
<li>반응 혼합 (총 볼륨 1100 µ L) 준비: 각 반응에 대 한 추가 2 x PCR 마스터 믹스의 550 µ L, 보편적인 뇌관 믹스 x 10의 110 µ L, RNase 무료 물, 340 µ L 및 템플릿 cDNA (희석된 반응 단계의 5.1.5)의 340 µ L.</li>
		<li>사전 로드 된 miRNA PCR 배열 사용 하 여 멀티 채널 pipettor의 각 음에 반응 혼합의 10 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>MiRNA 광학 접착제 필름으로 PCR 배열 접시를 봉인.</li>
		<li>거품 제거를 실 온에서 1000 x g 에서 1 분 동안 접시 원심</li>
		<li>실시간 cycler, PCR 초기 활성화 단계 95 ° C에서 15 분, 15에 대 한 3 단계 자전거 포함 변성 프로그램 s 30에 대 한 어 닐 링 94 ° C에서 55 ° C와 30에 대 한 확장에서 s s 40에 대 한 70 ° C에서 사이클 수. 참고: 따라 제조 업체의 사이클링 실시간 cycler 설정 지침 조건. 실시간 cycler 소프트웨어에 내장 된 분리 곡선 단계를 수행 합니다.</li>
		<li>데이터 분석을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 데이터 분석
<ol><li>분석 소프트웨어는 각 샘플에 대 한 실시간 PCR 소프트웨어에서 Ct 값을 추출 합니다. 참고: A Ct 값 34의 구분으로 간주 됩니다. 샘플 포함 스파이크 컨트롤 (예:, cel-미르-39), 각 샘플에 대 한 제어에 스파이크를 Ct 값을 표준화 됩니다. 임계값 값을 수동으로 설정 해야 합니다. 초기 계획 값을 자동으로 설정 됩니다.</li>
	<li>6 미르 가사 컨트롤의 평균 Ct Ct 값 정상화: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, 다음 수식을 사용 하 여: ΔCt (Ct_Target − Ct_housekeeping) =</li>
	<li>겹 변경 계산, 상대 식 수식12를 사용 하 여 컨트롤로 특정 샘플을 사용 하 여 ΔΔCt 값을 계산: miRNA 상대 식: 2-∆∆Ct, 어디에-∆∆Ct =-[∆Ct 테스트-∆Ct 제어] 참고: 200의 배 변화 구분으로 간주 됩니다.</li>
	<li>수출 배 Bioconductor8 limma 패키지를 사용 하 여 R에 통계 분석을 수행 하기 위해 식 값을 변경 합니다.</li>
	<li>13Benjamini Hochberg 메서드 사용 하 여 여러 비교에 대 한 수정. 참고:  R 스크립트의 사본은에서 유효 하다: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. 데이터 집합 및 데이터 분석된 번호 GSE111667에서 유전자 식 옴니 버스에서 사용할 수 있습니다 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. 데이터 분석: 기능 분석 소프트웨어
<ol><li>데이터 집합을 정렬 합니다. MiRNAs와 그들의 각각 식 로그 비율 및 p-값이 포함 됩니다. 특정 데이터 집합 형식에 대 한 표 1 을 참조 하십시오.</li>
	<li>오픈 기능 분석 소프트웨어 (버전 01-10).</li>
	<li>다음 형식을 사용 하 여 데이터 집합을 업로드: 파일 형식: "유연한 형식", 포함 하는 열 머리글: "예", 식별자 종류 선택: "miRBase (성숙)", 실험을 위해 사용 하는 배열 플랫폼: 배열 플랫폼 선택. 참고: 파일 형식을.txt은 허용 (탭 구분 텍스트 파일).xls (엑셀 파일), 및.diff (파일 cuffdiff 파일).</li>
	<li>"유추 관측"를 선택 하 고 실험적인 그룹 라벨 올바른지 확인 합니다.</li>
	<li>"데이터 집합 요약" 매핑된 및 매핑되지 않은 miRNAs의 총 금액을 수정 하려면로 이동 합니다.</li>
	<li>
상단에 "새" 버튼을 클릭 프로그램의 왼쪽. "새로운 예측에 관한 대상 필터"를 선택 하 고 예측에 관한 데이터 집합을 업로드.
	<ol>
<li>소스 설정: TarBase, 창의력 전문가 연구 결과, miRecords.</li>
		<li>신뢰 설정: 실험적으로 관찰 또는 높은 (예측).</li>
		<li>다양 한 종, 질병, 조직, 경로 등 대상에 대 한 생물학적 정보를 포함 하도록 "열 추가"를 선택 합니다.</li>
		<li>실험에서 식 변경 된 대상에 초점을 선택 "추가 / 대체 mRNA 데이터 집합". 동일 하거나 다른 식 레벨 microRNAs 찾으려고 "식 페어링"을 사용 합니다. 참고: 필터 분석 예측에 관한 이름과 기호, mRNA 대상, 대상 관계, 그리고 예측된 관계 (그림 2)의 신뢰 수준을 설명 하는 소스를 제공 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"추가를 내 통로" 통로 캔버스에 필터링 된 데이터 집합을 전송 하 고 더 많은 생물 학적 관계를 찾아보기를 클릭 합니다.</li>
	<li>경로 디자이너를 사용 하 여 예측에 관한 효과의 게시-품질 모델을 만듭니다.</li>
	<li>
대체 옵션 코어 분석을 만드는 것입니다.
	<ol>
<li>핵심 분석 유형에 대 한 "식 분석"을 선택 합니다.</li>
		<li>측정 유형에 대 한 "Expr 로그 비율"을 선택 합니다.</li>
		<li>분석 필터 요약: 고려 분자 또는 관계 어디: (종 = 마우스)와 (자신감 = 실험적으로 관찰)와 (데이터 원본 = "창의력 전문가 연구 결과", "창의력 ExpertAssist 발견", "miRecords", "TarBase", 또는 " TargetScan 인간 ")입니다.</li>
		<li>P-값의 구분 선택 = 0.05.</li>
		<li>분석을 실행 합니다. 참고: 보고서 포함 됩니다: 정식 경로, 업스트림 레 귤 레이 터 분석, 질병 및 기능, 레 귤 레이 터 효과, 네트워크, 분자 및 더 많은.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+and+Usability+of+Bioinformatics+Tools+to+Analyze+Pathways+Associated+with+miRNA+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Informatics%22%5BJournal%5D)">Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression.</a> Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).</li>
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저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

예측에 관한 프로 파일링 질병 진단 및 기계 론 적인 연구에 대 한 유리한 기술입니다. 이 원고에 다른 estrous 주기 단계에 있는 오존에 노출 여성 쥐의 폐에 염증 유전자를 조절 하는 것으로 예측 하는 miRNAs의 식을 평가 하는 프로토콜을 정의 했습니다. Estrous 주기 시각 탐지 방법 등의 결정에 대 한 방법이 설명된16되었습니다. 그러나, 이러한 1 회 측정에 의존 하 고 따라서 신뢰할 수 있는 하지 않습니다. 정기적으로 주기 여성에서 모든 estrous 주기 단계를 정확 하 게 식별 하려면 여기에 설명 하는 방법은 것이 좋습니다. 또한,이 간단한 프로토콜 매일 호르몬 변동에 쥐를 직접 추정 하도 사용할 수 있습니다. 매일 한 번만 수행 되어야 하는 요구를 샘플링 질 자극으로 인해 원치 않는 염증 성 반응의 활성화 방지를 위해. 사이클 길이에 영향 주택 가변성, 이므로 2 ~ 3 주기 단계를 고려 하는 실험에서 동물을 사용 하기 전에 완전 한 사이클에 대 한 프로토콜을 ...

microRNAs (miRNAs)는 짧은 (19-25의 뉴클레오티드), 자연스럽 게 발생, 비 코딩 RNA 분자. MiRNAs의 순서는 진화 생리 기능1조절에 miRNAs의 중요성을 제안 하는 종에 걸쳐 보존 이다. 예측에 관한 식 프로 파일링 miRNAs 다양 한 면역 반응, 세포 분화, 발달 과정 및 apoptosis2를 포함 하 여 프로세스의 규칙에 중요 한 식별 하는 데 도움이 될 입증 되었습니다. 더 최근에, miRNAs 질병 진단 및 치료에 그들의 잠재적인 사용에 대 한 인정을 받고 있다. 유전자 규칙의 기계 장치를 공부 하는 연구원에 대 한 측정 미르 식 수 계몽 규제 프로세스의 시스템-레벨 모델 미르 정보가 mRNA 프로 파일링과 다른 게놈 규모 데이터3병합 하는 경우에 특히. 다른 한편으로, miRNAs mRNAs 견본 종류의 범위에서 보다 더 안정적인 것으로 표시 되었습니다 또한 되며 또한 단백질4보다 큰 감도와 측정. 이 폐 병을 포함 한 다양 한 분자 진단 응용을 위한 생체로 miRNAs의 개발에 상당한 관심을 주도하 고 있다.
폐, miRNAs 개발 프로세스 및 항상성 유지에 중요 한 역할을 재생합니다. 또한, 그들의 비정상적인 식 개발 및 다양 한 폐 질환5진행 관련 된 되었습니다. 공기 오염에 의해 유도 된 염증 성 폐 질환 큰 심각도 및 여성, 호르몬과 estrous 주기 환경 문제에 대 한 응답에서 폐 선 천 적 면역과 미르 식 규제 수 나타내는에서 가난한 예 후를 시연 하고있다 6.이 프로토콜을 사용 하 여 오존 노출, 대기오염의 주요 구성 요소인 적응 면역의 부재에서 발생 하는 여성 쥐에서 폐 염증의 형태를 유도. 오존을 사용 하 여 우리 기도 상피 세포 손상 및 호 중구 증가 염증 성 중재자 인접 항공7에 관련 된 기도 hyperresponsiveness의 개발을 유도 하. 현재, 거기에 잘 설명된 프로토콜 특성화 및 오존 노출 쥐에서 estrous 주기 miRNAs 분석 되지 않습니다.
아래, 우리 estrous 주기 단계 및 오존에 노출 여성 쥐의 폐 조직에서 miRNA 식을 식별 하는 간단한 방법을 설명 합니다. 우리는 또한 효과적인 생물 정보학 전산 생물학에 대 한 강조와 함께 미르 검색 및 대상 식별, 접근 주소. Limma, 진 식 실험8에서 데이터 분석을 위한 통합된 솔루션을 제공 하는 R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 microarray 데이터 분석. Limma 에서 PCR 배열 데이터의 분석 비교 식 배열/샘플 작은 수를 사용 하는 경우 t-검정에 근거한 절차를 통해 권력의 측면에서 장점이 있다. MiRNA 식 결과의 생물 학적 맥락 이해, 우리는 다음 기능 분석 소프트웨어를 사용. Transcriptional 변화를 조절 하는 메커니즘을 이해 하 고 예측 가능성이 결과, 소프트웨어 미르 식 데이터 집합 및 문학9에서 지식을 결합 합니다. 이것은 통계 농축 miRNAs의 세트에 중복에 보면 소프트웨어와 비교 하면 이점이 다입니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J 마우스</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>8주 된</td></tr><tr><td>초순수</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>멸균 플라스틱 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>용량: 1.7mL</td></tr> 젖<tr><td>빛 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>광학 현미경</td><td>Microscope World</td><td>MW3-H5</td><td>10x 및 20x 대물렌즈</td></tr><tr><td>Ketathesia- 케타민 HCl 주입 USP</td><td>Henry Schein 동물 건강</td><td>55853</td><td>90 mg/kg. 규제 약물.</td></tr><tr><td>자일라진 멸균 용액</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg/kg. 규제 약물.</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>물로 70% 에탄올로 희석합니다.</td></tr><tr><td>21 G 게이지 바늘</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>작동 가위</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, 날카롭고/뭉툭한, 곡선 및 9 cm, 직선, 세밀한 날카로운 팁</td></tr><tr><td>핀셋 키트</td><td>세계 정밀 기기</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>스펙트럼&nbsp; Bessman 조직 분쇄기</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>용량: 10 - 50 mg</td></tr><tr><td>RNase-free 마이크로fuge 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12400</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RT 키트</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>마우스 염증 반응 & 자가면역 miRNA PCR 어레이</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>얇은 벽, DNase-free, RNase-free PCR 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12225</td><td>for 20 &mu; L 반응</td></tr><tr><td>miRNeasy 혈청/플라즈마 스파이크 인 제어</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>독창성 경로 분석</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R 소프트웨어</td><td>R 재단</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>열 순환기 또는 냉각/가열 블록</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실시간 PCR 사이클러</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td>다중</tr><tr><td>채널 피펫터</td><td>일반 실험실 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 세척 버퍼</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>DNA 분해 완충액</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 mL</td></tr><tr><td>RNA 사전 세척 완충액</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>자외선 오존 분석기</td><td>Teledyne API</td><td>모델 T400</td><td></td></tr><tr><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 질량 유량 컨트롤러</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

(미르) 예측에 관한 프로 파일링 생물학과 의학의 다양 한 연구 분야에서 일 하는 연구원에 게 관심사의 되고있다. 현재 학문은 보여준다는 약속 miRNAs 및 폐 질환 진단에 사용의 미래. 여기, 우리 미르 규제는 오존 유발 기도 염증 마우스 모델의에서 폐 조직에 염증 유전자를 예측 하는 miRNAs의 그룹의 관계 되는 풍부를 측정 하는 프로 파일링에 대 한 프로토콜을 정의 합니다. 보였다는 순환 호르몬 수준의 영향을 미칠 수 여성에서 폐 타고 난 면제의 규칙, 때문에이 방법의 목적은 프로 파일링 프로토콜 estrous 주기를 고려 하는 여성 쥐에는 염증 미르 설명 하 오존 노출 시간에 각 동물의 단계. 우리는 또한 limma, R/Bioconductor 소프트웨어를 사용 하 여 미르 검색 및 대상 식별 방법에 적용 가능한 생물 정보학 접근 주소 및 생물 학적 컨텍스트 및 경로 이해 하기 기능 분석 소프트웨어와 관련 된 차동 미르 식입니다.

얼룩에 관찰 하는 다른 세포 유형 마우스 estrous 주기 단계 (그림 1)를 식별 하는 데 사용 됩니다. 이러한 세포 형태학에 의해 식별 됩니다. Proestrus, 동안 세포는 거의 독점적으로 라운드 모양, 올바른 nucleated 상피 세포 (그림 1A)의 클러스터. 마우스 발 정기 단계에 있을 때 셀 cornified 편평 상피 세포, 밀도가 포장된 클러스터 (그림 1B)에 있습니다. Metestrus, 동안 cornified 상피 세포와 백혈구 polymorphonuclear 볼 수 있습니다 (그림 1C). Diestrus, 백혈구 (작은 세포)는 일반적으로 더 널리 (그림 1D).
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여기 우리가 폐 식 평가 하는 방법을 설명 예측 하는 miRNAs의 염증 유전자를 조절 하기 위해 마우스를 사용 하 여 오존에 노출 또는 estrous 주기의 여러 단계에서 공기를 필터링.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

이 방법은 폐 내의 염증성 유전자를 조절할 것으로 예상되는 microRNAs의 발현을 평가하는 방법에 대한 폐 면역 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 폐 microRNA 발현에 순환 호르몬의 기여를 확인하는 간단한 방법을 제공합니다. 에스트라스트 사이클 스테이지를 평가하기 위해 8~9주된 암컷 마우스를 수동으로 억제하고 매우 순수한 물로 채워진 플라스틱 10 마이크로리터 파이펫의 끝을 질에 도입합니다.샘플을 수집하기 위해 4~5회 부드럽게 세척하고 질 액의 최종 플러시를 유리 슬라이드에 증착합니다. 그런 다음 20배 배율에서 광 현미경으로 얼룩지지 않은 질 플러시를 관찰한다. 오존 및 여과된 공기 노출의 경우 와이어 메쉬 뚜껑이 있는 2개의 개별 1.2 리터 유리 용기 중 하나에 최대 4마리의 마우스를 배치합니다.오존 챔버에 유리 용기 1개를 넣고 1개를 여과된 공기 노출 챔버에 넣습니다. 그런 다음 오존 농도를 백만 개당 2 부로 조정하여 3 시간 후에 용기를 제거합니다. 노출 후 4시간 후, 첫 번째 실험 마우스의 노출된 피부 표면을 70%에탄올로 소독하고 흉곽을 잘라 심장과 폐를 노출시합니다.집게를 사용하여 액체 질소에 1.5 밀리리터 RNase 가없는 마이크로 원심 분리기 튜브를 침수하고 액체 질소에서 수확 된 폐를 동결합니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 조직 분쇄기를 사용하여 전체 폐를 마스레이트하고 분쇄 된 조직을 두 개의 1.5 밀리리터 미세 원심 심분리기 튜브 로 분할합니다. 모든 동물로부터 폐를 수확하고 분쇄한 후 각 시료에 500 마이크로리터를 추가하고 각 시료에 18, 21 및 23 게이지 바늘로 각 조직을 순차적으로 균질화합니다.마지막 균질화 후, 15 초 동안 소용돌이전에 각 샘플에 에탄올의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 원심분리를 위해 개별 수집 튜브의 개별 스핀 컬럼에 혼합물을 적재하고 흐름흐름을 폐기합니다. DNase 1 처리를 위해, 또 다른 원심분리를 위해 각 컬럼에 400 마이크로리터의 RNA 세척 버퍼를 추가하고 RNase 가 없는 관에 있는 견본 당 DNA 소화 완충제의 5개의 마이크로리터를 혼합합니다.실온에서 15분 간 배양하기 위해 컬럼 행렬에 직접 믹스를 추가한 다음 400마이크로리터 RNA 세세척 용액 2개를 원심분리로 씻어낸다. RNA를 elute하기 위하여는, 최종 원심분리를 위해 각 컬럼 매트릭스에 DNase RNase 가

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 간단한 비 침습적 수집 및 질을 뛰어 넘는 샘플 cytological 평가하여 손쥐 생식 (proestrus, 발정, metestrus, 또는 diestrus)의 단계를 확인하는 방법에 대해 설명합니다. 우리는 더 질 세포학은 손쥐 생식주기를 통해 전환을 하부 호르몬 수준을 순환 반영 방법에 대해 설명합니다.

마우스 Estrous 사이클 스테이징 확인을 위해 질 세척, 크리스탈 바이올렛의 착색 및 질 Cytological 평가를 수행

두 운동의 패러다임은 운동 능력과 운동 심장 적응에 폐경의 영향을 조사하기 위해 새로 개발 된 화학적으로 유도 된 폐경의 마우스 모델에서 테스트되었다.

쥐의 운동 능력과 심장 적응에 화학적으로 유도 된 난소 실패의 영향을 연구하는 방법

이 연구는 반복적으로 오존의 높은 농도에 쥐를 노출 하 여 새로운 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD) 동물 모델의 성공적인 세대를 설명 합니다.

반복된 오존 노출에 의해 쥐에 만성 폐쇄성 폐 질환 모델의 생성

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

RNA 무결성을 유지하면서 개별 세그먼트의 수집을 허용하는 마우스 배반의 미세 절제 방법이 제시된다. 또한, 비효소 성 배관 세포 해리 절차가 설명된다. 이 방법은 기능적으로 상이한 배반 분과 및 해리된 배관 세포의 후속 유전자 및 단백질 분석에 적합합니다.

뮤린 오비덕트의 미세 절제 및 해리: 개별 세그먼트 식별 및 단일 세포 격리

이 프로토콜에서 번역 리보솜 친화성 정제(TRAP) 방법과 특정 세포 유형에서 태그된 핵의 분리(INTACT) 방법은 Cyp17a1-Cre 마우스 라인과 교차하는 NuTRAP 마우스 모델을 사용하여 세포 특이적 난소 전사체와 후성유전체의 쌍을 이루는 조사에 최적화되었습니다.

마우스 난소 후성유전체와 전사체의 세포 특이적 쌍 조사

다양한 성선외 조직과 장기의 난포 자극 호르몬(FSH)은 여러 질병의 발병과 관련이 있습니다. 난소 절제술 및 난포자극호르몬 처리 마우스 모델(OVF)을 사용하여 난포자극호르몬의 성선외 작용을 탐색할 수 있습니다.

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model (생쥐 모델에서 모낭 자극 호르몬의 생체 내 독립 효과 탐색)

본 논문은 흡입된 환경오염물질 노출이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향을 평가하기 위한 매몰식품 검사와 사회적 악취 차별 실험에 대해 자세히 설명한다.

흡입된 환경 오염 물질이 마우스의 후각 기능에 미치는 영향 연구

여기에서는 신생아 마우스에서 다양한 산소 농도로 통제된 환경에서 투여하여 저산소증을 유도하는 프로토콜을 제시합니다. 출생 시 산소 변화에 노출된 마우스 모델은 자폐증과 같은 행동 표현형 변화의 유도에 관여하는 miRNA의 발현을 지속적으로 변화시켰습니다.

저산소증은 마우스에서 자폐증 스펙트럼 장애의 비멘델 유전과 관련된 miRNA 수준을 변경합니다.

배우세요 쥐의 폐에서 염증 유전자를 조절하는 microRNA 발현을 평가하는 방법을. 발정 주기 단계와 오존 노출이 miRNA 수준에 미치는 영향을 탐색하여 폐 면역 상호작용 이해를 돕습니다.

폐 예측에 관한 프로 파일링 걸쳐 the Estrous 사이클 오존에 노출 된 쥐에

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