Name: 단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: 학습하세요 열 이동 분석과 나노시차 형광법을 이용한 단백질 열 안정성 평가 방법을. 이 기술은 약물 발견 및 단백질 구조 연구에 최적의 완충 조건을 식별하여 단백질 안정성을 향상시킵니다.

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이 프로젝트는 유럽 연합의 수평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 685778) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받았다. 이 작품은 생명 공학 및 생물 과학 연구 위원회에 의해 지원 되었다 (BBSRC, 부여 번호 BB/M011186/1, BB/J014516/1). DB는 BBSRC 박사 교육 파트너십 뉴캐슬-리버풀-더 럼은 재학에 대 한 더 럼 대학 부의 생물 과학이이 자금으로 기여에 대 한 감사. 우리는 그의 도움에 대 한이 안 에드워즈와 더 럼 대학 부의 화학 질량 분석 학과 그들의 경 음악 분석을 위한 단백질 X 감사합니다. 우리는 대출 하 고이 프로젝트에 대 한 프로 메 테우 스 NT.48 시스템 지원에 대 한 바이러스-X 프로젝트, 그리고 클레어 Hatty를 NanoTemper GmbH에 또한 감사와 그의 작품에 대 한 Arnthor Ævarsson에 감사. 마지막으로, 감사 합니다 프랜시스 Gawthrop 하 Tozer 씨앗 BBSRC 회 어워드의 일환으로 그들의 지원에 대 한.

1입니다. 단백질 샘플 준비
<ol><li>96 잘 블록에 500 µ L aliquots로 안정성 화면을 공식화 하 고 스토리지에 대 한 인감. (그림 4)시간을 절약할 수 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 96 잘 접시의 해당 안정성 화면의 각 조건의 10 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>적절 한 버퍼 시스템에는 약 1 밀리 그램 mL-1 단백질 해결책의 1 mL를 준비 합니다. 적절 한 버퍼의 구성은 각 단백질 샘플 따라 다르지만, 시도 하는 좋은 첫 번째 버퍼 10 m m 100 mm NaCl, pH 7.2 인산 나트륨 이다. 참고: 허용 가능한 단백질 농도-의해-경우, 다르지만 0.5-5 mg mL-1 의 농도 범위는 일반적으로 analyzable 커브를 생성 합니다. 희석 버퍼 각 조건의 효과 마스킹 하지 않으려면 안정성 스크린과 함께 사용 하기 위해 권장 됩니다. 일반적인 버퍼 구성 약 100 m m NaCl 약 10 mM 버퍼입니다.</li>
	<li>TSA 실험을 수행 하는 경우 20 x의 최종 농도에 단백질 샘플을 SYPRO 오렌지 염료를 추가 합니다. 반전 또는 개요 vortexing에 의해 혼합.</li>
	<li>준비 단계 1.1 (그림 4B)에서 96 잘 접시의 각 음에 단백질 해결책의 10 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>봉인 하 고 원심 600 x g 단백질 샘플 및 화면 구성 요소 (그림 4C) 혼합 되도록 2 분에 대 한 96 잘 접시.</li>
	<li>다시 seal 안정성 화면 깊은 우물 블록 하 고 최대 4 개월까지 4 ° C에서 화면을 저장 합니다. 일부 구성 요소는 감광 어둠 속에서 소금 화면을 저장 합니다.</li>
	<li>NanoDSF 실험을 수행 하는 경우 2 단계로 계속 합니다. TSA 실험을 수행 하는 경우 4 단계로 건너뜁니다.</li>
</ol>2. nanoDSF 실험 준비
<ol><li>장비 샘플 랙 근처 먼지에 특히 주의 지불 하는 깨끗 한 있는지 확인 합니다. 시스템에 있는 경우 backscattering 거울, 에탄올과 보풀 티슈를 사용 하 여 그것을 청소.</li>
	<li>오픈 서랍 버튼을 눌러 샘플 서랍을 엽니다. (그림 5A).</li>
	<li>솔루션으로 모 세관의 한쪽 끝을 감동 하 여 96 잘 접시의 각 우물에서 약 10 µ L로 모세 혈관 로드 다음 샘플 랙 (그림 5B)의 해당 모 세관 소유자에 그들을 배치 합니다. 지문, 등은 모세 혈관의 중간을 오염 하지 않도록 주의 하십시오.이 실험을 통해 형광 신호를 방해할 수로.</li>
	<li>마그네틱 씰링 스트립 (그림 5C) 모세 혈관 무력화</li>
</ol>3. 프로그래밍 nanoDSF 실험
<ol><li>위치와 강도 증가 검색 검색 탭에서 검색 검색 시작 버튼을 누르면 각 모 세관의 검색 또는 감소까지 10%의 초기 전원에서 사고 여기 강도 예비 검사를 시작 합니다 모든 모 세관 검사의 피크는 4000-12000 단위 (그림 5D) 사이입니다.</li>
	<li>샘플 접혀 이며 충분히 집중 되도록 가파른 온도 기울기와 초기 용융 검사 것이 좋습니다. 녹는 스캔 탭에서 녹아 7.0 ° C 분-1, 시작 온도 25 ° c와 최종 온도 95 ℃, 온도 기울기 옵션 설정 하 여 검색 다음은 nanoDSF를 실행 하는 프로그램은 를 눌러 실험 녹는 시작 버튼. 녹아 그 결과 곡선 표시 감지 곡점, 추가 샘플을 집중 또는 단백질 제대로 접혀 경우 검사를 고려 하십시오.</li>
	<li>2.1-2.4 전체 실험에 대 한 샘플 준비 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>녹는 스캔 탭에서 눌러 녹아 1.0 ° C 분-1, 시작 온도 25 ° c와 최종 온도 95 ℃, 온도 기울기 옵션 설정 하 여 검색 다음은 nanoDSF를 실행 프로그램 실험 녹는 시작 버튼입니다.</li>
</ol>4. TSA 실험 수행
<ol><li>윈도우의 오른쪽에 들여쓰기를 단단히 눌러 샘플 서랍을 엽니다. 다시 왼쪽 (그림 4D) 잘 a 1으로 RT-PCR 시스템에 96-잘 트레이 놓습니다.</li>
	<li>TSA 실험 설정을 시작 하려면 새로운 실험 버튼을 클릭 합니다.</li>
	<li>실험 속성 탭에서 때 녹아 커브 옵션을 클릭 실험의 어떤 종류를 설정 하려면 원하는? 와 다른 옵션 때 는 시 약 검색 대상 시퀀스를 사용 하 여 원하는?
</li>
	<li>에 플레이트 설치 / 정의 목표와 샘플 탭, 대상의 이름을 입력 한 다음 기자 를 이용한 및 끄 는 None으로 설정.</li>
	<li>에 플레이트 설치 대상 및 샘플 할당 / 탭을 이전 단계에서 입력 한 대상 이름에 96 잘 접시의 모든 잘 할당. 같은 탭에서 None으로 수동 참조로 사용 하 여 염료를 선택 을 설정 합니다.</li>
	<li>실행 방법 탭에서 때까지 총 3 단계를 삭제 합니다. 시간 00:05; 25.0 ℃, 램프 비율 100%, 첫 번째 단계를 설정 95.0 ℃, 램프 속도 1%, 두 번째 단계 시간 01:00; 95.0 ℃, 램프 비율 100%, 제 3 단계 시간 00시 05분. 수집 데이터 드롭다운 메뉴를 사용 하 여 데이터를 수집 하도록 선택 하거나 데이터 컬렉션 아이콘 (그림 6).</li>
	<li>20 µ L을 잘 당 반응 볼륨 을 설정 합니다.</li>
	<li>TSA 실험을 시작 하려면 실행 시작 버튼을 누릅니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
<ol><li>파장으로 용융 곡선을 플롯을 선택 합니다. NanoDSF 실험, 330에 형광 강렬의 비율 및 350 nm (비 극성 및 극 지 환경에서 트립토판 각각 해당)13 일반적으로 사용 됩니다. 대부분 TSAs 염료 방출 최대는 용융 곡선 그래프에 적합 (SYPRO 오렌지의 방출 최대는 569 nm)12.</li>
	<li>각 용융 곡선의 굴절 포인트를 확인 하 여 각 조건의 Tm 값을 계산 합니다. 대부분의 nanoDSF 시스템은 자동으로 데이터 수집 후 용융 곡선의 숫자 차별화 하 여 Tm 값을 계산합니다. 데이터 분석 및 다운스트림 처리는 heatmap 요약 Tm 을 생산 하는 옵션을 주는 나 미11 등, 무료, 대체 GUI 기반 소프트웨어 자동화할 수 있는 경우 사용 하는 소프트웨어는 자동으로 Tm 값을 계산 하지 않습니다, 전체에 대 한 값 (동반 기준 지침 및 리소스 데이터 처리를 제공 합니다 나 미와) 96-잘 실험.</li>
	<li>조사는 모든 조건의 Tm 값을 비교 합니다. 안정성 화면 각 화면 (a 1과 A2)에 물만을 포함 하는 두 개의 우물을 포함 되어 있습니다. 벤치 마크로 서 물 전용 값을 가져와 δ Tm 값, 체계적인 오류를 해결 하 고 안정화 효과의 쉬운 비교를 허용의 계산을 허용 한다. Tm 값이 높을수록 하류 사용 하기 위해 권장 되는 열 안정화 조건을 나타냅니다. 유망한 조건 종종 그들의 안정화에 농도 의존을 보여줍니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

프로토콜 내에서 중요 한 측면에는 원심 분리 단계 및 TSA 실험 (단계 1.5)에 대 한 96 잘 접시의 적절 한 씰링 포함 됩니다. 원심 분리 하면 단백질 샘플 화면 상태 접촉 및 혼합. 또한, 봉인 되지 않은 접시 사용 하는 경우 TSA 실험에 대 한 실험을 통해 증발, 샘플 농도 있는 증가 일으키는 원인이 되 고 조 단백질 집단의 기회를 증가 하는 용 매에 상당한 위험이 있다.
TSAs와 nanoDSF는 의무가 다양 한 단백질 견본; 샘플의 대부분 hydrophobicity 기반 기자 염료 또는 염료 무료 nanoDSF 해석할 용융 곡선을 생성할 수 있습니다. 만약 표준 형광 소스 단백질에 적합 하지 않습니다, 탐구 될 수 있는 프로토콜에 대 한 간단한 수정 fluorophore의 선택입니다. 여러 대체 염료 TSA 실험에 적합 될 수 있습니다. 예로 N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide (CPM)는, thiol27, 및 4-반응 후 fluoresces 화합물 (dicyanovinyl) julolidine (DCVJ)를 기반으로 하는 형광 화합물은 환경, 그것의 형광 단백질 샘플으로 증가의 강성 펼쳐져28,29 (후자 염료는 종종 샘플의 높은 농도 필요).
용융 곡선 분석의 다른 방법 Tm 은 악기 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 되지 않습니다 사용할 수 있습니다. 데이터는 동종을 하나만 변성 단계는 용융 곡선에서 잘린된 데이터 집합 다음 방정식으로 sigmoid 볼츠만에 맞을 수 있다:
<img alt="온도에 따른 단백질 접힘 곡선을 묘사하는 방정식; 생화학 분석과 관련이 있습니다." src="/files/ftp_upload/58666/58666eq1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1">
온도 T에서의 형광 강도, F분 및최대 F F가 전에 형광 강렬 이며 변성 전환 후 각각 Tm 변성 전환 및 C의 중간점 온도 Tm에서 비탈길이 이다. 이 방법은 잘 간단한 2 단계 변성 과정, 하는 동안 복잡 한 용융 곡선 여러 전환 위해 적당 하다.
TSA의 주요 장점 중 하나는 접근; TSA 실험 고용 형광 염료에 대 한 적합 한 파장에서 필터 어떤 RT-PCR 시스템에서 수행할 수 있습니다. 이 소모품, 작업과 확인 TSA 프로젝트 비늘, 모두 업계와 학계에서의 광범위 한 귀중 한 기술, 필요한 단백질의 상대적으로 낮은 금액의 용이성의 저렴 한 비용으로 결합.
유리한 버퍼 상태를 나타내는 뿐만 아니라 화면 샘플 단백질 내의 구조 금속의 존재에 단서를 제공할 수 있습니다 일부 우물을 포함 되어 있습니다. 소금 화면에 특히 관심이 있을 수 있습니다 웰 스는 G6 G7, 5 mM EDTA 및 EGTA, 5mm를 각각 포함 하는. 이 우물에 상당한 열 불안은 chelants에 의해 분리 된 단백질에서 중요 한 금속 이온의 표시 될 수 있습니다. Osmolyte 화면 내에서 화합물 또한 잠재적으로 단백질의 기능에 단서를 제공할 수 있습니다. 화면에서 화합물의 많은 효소의 일반적인 기질 분자의 클래스에 속합니다. 예를 들어 lysozyme 대 saccharides (우물 A11-B10에에서 존재)에서 제공 하는 일반적인 안정화 효소, N-acetylglucosamine 올리고30의 설립된 기판에 그들의 구조적 유사성을 표시 될 수 있습니다.
위에서 설명한 TSA와 nanoDSF 프로토콜 또한 단백질-리간드 상호작용 연구에 적용할 수 있습니다. 단백질에 특히 묶는 ligands는 단지 내에 새로운 상호 작용을 도입 하 여 그것의 열 안정성을 높일 수 있습니다. 복용량-의존 긍정적인 변화 단백질 Tm 에 성공적인 단백질-ligand 상호 작용의 유망한 표시 이다. 속도, 처리량 및 낮은 비용 심사 TSAs 화합물 라이브러리의 했다 그것은 매우 인기 있는 방법을 초기 단계 약물 발견에.
대상 단백질 그리고 그들의 ligand 복합물의 버퍼 조건 최적화 될 수 있습니다 프로젝트의 성공을 위해 필수적인 많은 문학 예31,32,,3334를 보여 줍니다. 설치 시간 포함 2 시간 미만 복용 하는 일반적인 분석 결과 함께 TSAs 및 nanoDSF 안정성 화면 함께 버퍼 최적화를 위한 빠르고, 저렴 한 기술을 나타냅니다.

바이러스 소스에서 발생 한 많은 biotechnologically 유용 효소와 같은 담배 엣지 바이러스 (TEV) 효소1 인간의 이노 입력 3 C (HRV 3 C) 프로 테아 제2. Horizon2020 바이러스 X 프로젝트 (그림 1)3. 이 프로그램의 목적은 (a) 알려진된 효소 가족의 속성의 범위를 확장 하 고 (b)를 아직 알 수 없는 함수 (효소 X)의 새로운 효소의 특성입니다. 결정학 구조 결정 단백질 시퀀스 인식4넘어 진화 했습니다 경우에 특히 대상 단백질 특성에 중추적인 역할을 하고있다. 단백질 안정성; 결정 화 과정에서 중요 한 요소 이다 샘플 양식 높은-품질, 결정 diffracting 시간의 기간 동안 conformationally 균질 성 및 구조적으로 소리 되어야 합니다. 또한, 단백질 또한 유리한 분자 환경에 의해 촉진 될 수 있습니다 그들의 활성 구조에 존재 하는 활동 분석 실험을 위해 필수적 이다.
Crystallographers에 사용할 수 있는 기술 개발에도 불구 하 고 단백질 결정 화 시간과 노동 집약적인 경험적 프로세스5남아 있습니다. 솔루션에서 단백질 안정성 향상을 위해 예비 생물 실험 단백질 결정 화에 대 한 더 나은 출발점을 명확 하 게 제공 하 고 일반적으로 비교적 적은 양의 단백질 샘플6,7, 소비 8,9. 이 프로젝트에서 공부 될 대상 단백질의 다 수 또한 확장성, 높은 처리량 안정성 분석을 필요로 합니다. 사전 결정 화 단백질의 생물 특성에 대 한 가장 인기 있는 방법 중 하나는 열 교대 분석 실험 (또한 TSA 또는 시차 fluorimetry, DSF)10,11.
TSAs는 단백질의 열 변성을 추적 하는 환경에 민감한 형광 염료를 사용 합니다. 많은 염료는 일반적으로 사용 되는 그들의 환경, 종종 소수 환경에서 높은 형광 출력을 표시 하지만 극 지 환경12에 냉각 하는 빠른 진행의 극성에 따라 가변 형광 활동. 단백질은 일반적으로 그들의 소수 성 중 핵 변성, 단백질 집계 (그림 2)을 시작으로 종종 매우 높은 온도에서 염료 형광 감소 다음 중 노출 될 염료 형광에서 뚜렷한 증가 일으킬.
Hydrophobicity에 민감한 염료는 종종 일반 사용 TSA 염료에 대 한 좋은 선택, 그것은 수 있습니다 종종 해롭게 높은 배경 형광 표시 하는 큰, 용 매에 노출 된 소수 성 영역 단백질에 적합. 작업의 다른 모드와 Fluorophores 존재 (내용 참조), 하지만 대신 nanoDSF와 본질적인 단백질 형광 통해 변성을 추적 하는 것이 좋습니다 있을 수 있습니다.
330의 방출 최대 형광 단백질의 비 극성 지구에 묻혀 있는 트립토판 잔류물 nm. 단백질 견본 펼쳐진다 고이 잔류물은 극 지 용 매에 노출 될, 그들의 방출 최대 350 nm13bathochromic 변화를 겪 습. nanoDSF 외부 fluorophores14에 대 한 필요 없이 단백질 샘플의 전개을 최대 방출에 있는이 교대를 이용 한다.
녹여 곡선 표시 단일 변성 단계 볼츠만 자형 모델에 데이터를 피팅 하 여 분석할 수 있습니다. 펼쳐진 전환 (Tm)의 굴절 점에서 온도 다른 조건의 favorability 비교 단백질 열 안정성의 정량적 측정 및 벤치 마크로 사용 됩니다.
다른 조건에서 동일한 단백질의 용융 곡선 때로는 볼츠만 자형 피팅 unfeasible 만들 수 있는 성분의 정도를 소유한 다. 고전적인 곡선 토폴로지에서 벗어나는 데이터에서 Tm 값을 분별, 수치 방법 나 미, 오픈-소스 TSA 데이터 분석 프로그램11에 같이 사용할 수 있습니다. 다른 열역학 프레임 워크 ProteoPlex 방법론15등 여러 변성 단계와 더 복잡 한 곡선 분석을 사용할 수 있습니다.
안정성 화면 빠르게 대상 단백질에 대 한 유리한 조건을 식별 하기 위해 TSA와 nanoDSF 실험에 사용 하기 위해 설계 되었습니다 (그림 3, 화면 구성을 사용할 수 있습니다는 보충 정보에). 결정학 파이프라인 등의 많은 단계에서 스크린으로 수집한 정보를 사용할 수 있습니다: 저장; 샘플 정화, 단백질 정화 과정; 전개를 통해 생산량 손실을 최소화 디자인, 강화 열 안정화 버퍼 및 마지막으로 결정 화, 합리적으로 설계 결정 화 실험을 지도 함께 활동 분석 실험에서 단백질 기능 분석
단백질 견본에 대 한 적당 한 버퍼 시스템으로 선택 하는 것은 매우 중요; 호환 되지 않는 pH 값 비활성화 또는 단백질의 변성 될 수 있습니다. 그러나, x 선 결정 구조 (표 1)의 많은 수에서 해결 하는 공동 결정된 버퍼 분자의 존재 또한 수은 간단한 pH 규정에 별도 화학 물질에서 비롯 된 대신 안정화 효과의 지표 버퍼 분자의 특징입니다.
다른 일반적으로 생물학적으로 호환 버퍼 시스템 함께 좋은 버퍼17,,1819 의 몇 가지를 사용 하 여 공식화, pH 화면에 버퍼 분자의 화학 효과 deconvolute 하도록 설계 결과 솔루션의 실제 pH에서 단백질 안정성. 각 버퍼 시스템에 대 한 세 가지 pH 값을 제공 하 고 pH 값 중복 서로 다른 시스템 간의 통합, 유리한 pH 값 및 대상 단백질에 대 한 유리한 버퍼 시스템 pH 화면 식별할 수 있습니다.
소금 스크린은 일반적으로 chaotropes, chelants, 중 금속 및 감소 시키는 대리인으로 실험실 소금 포함 되어 있습니다. 화면 높은 이온 힘을 가진 환경에 단백질 샘플의 선호도 대 한 일반적인 표시를 줄 수 있지만 화합물의 각 하위 그룹 또한 단백질의 잠재적인 구조에 정보를 제공할 수 있습니다. 예를 들어 크게 불안정 한 단백질 chelant 샘플 내에서 중요 한 구조상 금속을 나타내는 수 있습니다. 샘플 화면 내에서 금속 양이온에 의해 안정화도 강력 하 게 하는 경우이 추가 구조 실험에 대 한 유망한 출발점을 제공할 수 있습니다.
Osmolytes는 그들의 환경의 삼 투 속성에 영향을 주는 수용 성 화합물. 실제로, 그들은 무질서 단백질의 폴딩 및 스트레스 조건20,,2122에 특히 그들, 안정화 "화학 보호자"로 사용할 수 있습니다. 이러한 특성을 그들 매력적인 첨가제 단백질 결정학; 크리스탈 수확 하는 동안 cryoprotectants로 사용할 수, 장착 및 스토리지23을처리 합니다. Osmolytes의 잠재적인 사용은 또한 단백질의 정화를 확장합니다. 대장균 에서 표현 하는 재조합 형 단백질의 상당한 비율이 불용 성 고 표준 정화 방법을 사용 하 여 원래 상태에 복구 하기 어려운 될 수 있습니다. Osmolytes 안정화 및 불용 성 분수에서 단백질 회수를 사용할 수 있습니다, 그리고 증가 정화 수익률24.
Osmolyte 화면 설립된 화합물에 단백질 데이터 은행 항목25 및 Dragon Explorer of Osmoprotection-Associated 경로 (DEOP)26 데이터베이스를 사용 하 여 설계 되었습니다 하 고 반복적으로 표준 단백질을 사용 하 여 최적화 된. 화면 osmolyte의 약 8 하위 만들어집니다: 글리세롤, 설탕과 폴리올, 비 세제 sulfobetaines (NDSBs), betaines 및 그들의 아날로그 organophosphates, dipeptides, 아미노산와 그들의 유도체 및 최종 기타 그룹. 여러 농도 용 해도 비교에 대 한 효과적인 농도 범위에 따라 각 osmolyte가 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Lysozyme</td><td>Melford Laboratories</td><td>L38100</td><td>결정화 및 동결건조 닭고기 달걀 흰자 라이소자임.</td></tr><tr><td>더럼 pH 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-101</td><td>96웰 단백질 안정성 스크린. 내용은 위를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>더럼 소금 스크린</td><td>분자 치수</td><td>MD1-102</td><td>96웰 단백질 안정성 스크린. 내용은 위를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Durham Osmolyte Screen</td><td>Various</td><td>#N/A</td><td>96-well protein stability screen, 발표 당시 상업적으로 이용 가능하지 않음. 내용은 위를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>SYPRO Orange</td><td>Invitrogen</td><td>S6651</td><td>겔 및 DSF의 단백질 염색에 널리 사용되는 형광 염료입니다.</td></tr><tr><td>96웰 PCR 플레이트</td><td>Starlab</td><td>1403-7700</td><td>AB 7500 Fast RT-PCR 시스템과 함께 사용하기 위한 세미 스커트 투명 플라스틱.</td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR 시스템</td><td>Applied Biosystems</td><td>4362143</td><td>96웰 형식의 RT-PCR 시스템. 대체 시스템을 사용할 수 있습니다. 무료 오픈 액세스 소프트웨어인 NAMI를 사용하여 수행된 데이터 분석. 7500 Fast를 사용한 DSF 실험에 맞춤화된 AB 소프트웨어는 추가 비용으로 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Prometheus NT.48</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>#N/최대</td><td>48개 시료 용량의 무표지 DSF 시스템. 풀림 온도(Tm 및 Tonset), 임계 변성 농도(Cm), 자유 접힘 에너지(&Delta; G 및 &Delta; &델타; G) 및 내장 소프트웨어를 사용한 집계 결과(Tagg)를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Prometheus NT.48 시리즈 나노DSF 등급 표준 모세관</td><td>NanoTemper Technologies</td><td>PR-C002</td><td>Prometheus NT.48 시리즈 nanoDSF 등급 표준 모세관 "고감도" 변형체는 저농도 샘플(< 200 &마이크로; g ml-1)입니다.</td></tr></tbody></table>

단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 x 프로젝트에서 fluorimetry

How to Stabilize Protein: Stability Screens for Thermal Shift Assays and Nano Differential Scanning Fluorimetry in the Virus-X Project

Horizon2020 바이러스 X 프로젝트는 선택 된 극단적인 생활권의 virosphere를 탐구 하 고 새로운 바이러스 성 단백질을 발견을 2015 년에 설립 되었다. 이러한 단백질, 단백질의 분석의 잠재적인 공학적 가치를 평가 하 구조와 기능에이 프로그램 중앙 도전 이다. 단백질 샘플의 안정성은 의미 있는 분석 결과 제공 하는 대상의 crystallizability 증가 필수적 이다. 열 교대 분석 실험 (TSA), 형광 기반 기술, 단백질 안정성 높은 처리량에 대 한 조건을 최적화 하기 위한 인기 있는 방법으로 설정 됩니다. TSAs, 고용된 fluorophores에 외부, 환경에 민감한 염료. 대신, 비슷한 기술은 나노 단백질 천연 형광에 의존 하는 fluorimetry (nanoDSF), 검사 차동 이다. 선물이 여기 소설 osmolyte 화면, 예비 TSA 실험을 통해 결정 화 실험을 안내 하도록 설계 된 유기 첨가제의 96-조건 화면. 이전 개발 pH 및 소금 스크린, 3 스크린의 집합 버퍼 시스템 및 첨가제의 넓은 범위에서 단백질 안정성에 대 한 포괄적인 분석을 제공합니다. 스크린의 유틸리티는 lysozyme 단백질 X, 바이러스 X 프로젝트의 대상 단백질의 TSA와 nanoDSF 분석에서 보여 줍니다.

Lysozyme 안정성 스크린으로 분석 했다 고 단백질 X, 바이러스 X 프로젝트에서 대상 단백질 osmolyte 화면으로 분석 했다. 일반적으로 생산 하는 두 단백질 녹여 TSA와 nanoDSF 실험 (참조 대표 곡선에 대 한 수치를 동반)에 명확 하 게 정의 된 변성 전환 곡선. 경우에는 몇 가지 샘플을 정의 된 변성 전환으로 해석할 커브를 생성 하지 않았다 변성 및에 포함 되지 않은 Tm 비교로 해석 되었다.
그림 7 열 stabilising 속성 lysozyme 향해 염화 암모늄의 예증 소금 화면에서 예제 결과 보여 줍니다. 위에 표시 된 것과 같은 농도 종속성 종종 유망한 조건의 표시 하지만 열 안정화에서 일반적으로 발생 하는 경우를 볼 몇 가지 다른 소금 이온 농도 증가의 결과 비교 하는 것이 유용할 수 있다는 버퍼 이온 강도에 증가 또는 추가 안정성 특정 이온의 존재에 수 여 하는 경우.
전화 화면 (그림 8)와 lysozyme의 Tm 값의 비교 두 가지를 정보를 보여준다. 첫째, pH 값을 감소와 안정성을 증가의 일반적인 추세가입니다. 둘째, 동일한 pH 값을 가진 서로 다른 버퍼 시스템을 사용 하 여 얻은 범위의 Tm 값은 중요 한 수 있습니다.
그림 8에서 데이터 제안 TSA와이 실험에서 nanoDSF 사이의 합의 일반적으로 좋은, 하지만 nanoDSF 보여줍니다 약간 높은 Tm 값을 식별 하는 경향이 TSA 보다 약간 더 큰 Tm 이동. 그러나, 8.5 위의 pH 값으로 어떤 우물 TSA와 nanoDSF에서 가져온 Tm 값 사이의 큰 차이 보여줍니다. 차이 다른 pH 값, 단백질의 변성을 잠재적으로 표시 될 수 수 있습니다. 예를 들어 hydrophobicity에 민감한 염료는 비교적 낮은 Tm 읽기 경우 단백질의 소수 성 영역 될 노출 용 매에 트립토판 잔류물 변화 환경 보다 훨씬 더 빨리 극성에 줄 수 있습니다.
그림 9 heatmap lysozyme osmolyte 화면을 사용 하 여 얻은 Tm 값을 보여 줍니다. 조건 제어 웰 스 (웰 스 a 1과 A2, 이온된 물 포함)에 비해 높은 Tm 증가와 진한 파란색 색깔은. 그림 9 에서 확인 된 특히 안정화 조건에는 글리세롤, 1 M D-솔 비 톨, 100 m m hypotaurine과 10mm Ala Gly (우물 A4 A6, A9, E7, F8, 각각) 포함 됩니다.
그림 10 heatmap 단백질 X. TSA와 가져온 Tm 값의 표시 및 Osmolyte 스크린 nanoDSF 실험 공개 osmolytes 테스트의 대부분 Tm (1 ° C) 이내에 어느 사소한 증가 게 또는 해로운 영향 에 단백질의 안정성. 특히, 10 mM (잘 D1)의 농도에 dipicolinic 산 변성 실 온에서 샘플을 나타납니다. TSA와 nanoDSF 결과 신속 하 게 단백질을 작업할 때 피해 야 하는 단백질 X에 대 한 호환 되지 않는 첨가물으로 dipicolinic 산을 식별 합니다. D-솔 비 톨의 arabinose (웰 스 A9 및 B9, 1 M에) 그럼에도 불구 하 고, 높은 농도 글리세롤와 TMAO (우물 A4 A6 및 E1, 각각) 열 안정화로 확인 되었다.
Lysozyme에 대 한 각 안정성 화면에서 가장 높은 Tm 값을 항복 조건의 조합 시너지 결합된 효과 대 한 조사를 테스트 했다. 그림 11 에서는 일반적인 증가 Tm 값 버퍼 시스템의 더 많은 구성 요소 (pH, 소금, osmolyte) 추가 됩니다. MES, 암모늄 염, D-솔 비 톨, 경우 Tm 10 ° C 관찰 될 수 있다 때 모든 구성 요소가 MES 혼자에 비해 큰 증가. 그림 11 개별 구성 요소는 버퍼의 최적화와 안정성 화면 함께 때 눈에 띄는 시너지 효과 발생할 수 있습니다 보여줍니다.
보다 일반적인 메모에서 그림 11 은 또한 TSA와 nanoDSF에서 실험 관찰 될 수 있다 δ Tm 값의 크기를 보여 줍니다. Δ Tm 달성의 크기 크게 단백질 시스템에 따라 다르지만 주위와 5 ° C 이상 δ Tm 값은 종종 도움이 안정화 효과 나타내는.
<img alt="지열 현장 연구, 연구원들은 온천, 열 활동, 경관 탐사를 분석합니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : Bioprospecting. 바이러스-X 프로젝트에서 극단적인 환경에서 샘플 컬렉션입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="단백질 안정성 다이어그램, 형광 강도 대 온도, 변성, 단백질 응집." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: TSA 회로도. TSA 실험에서 얻은 전형적인 용융 곡선의 주석이 추가 된 예제. 이 커브는 고전적인 "2-상태" 단백질 전개의 특성, 감지 부분적으로 접혀 중간체 없이 변성 접혀 샘플 모집단에서 전환. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="최적화된 버퍼 프로세스 순서도; pH, 염, 삼투압 역할; 완충 시스템 안정화." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3 : 안정성 워크플로 화면. 안정성 스크린을 사용 하 여 버퍼 최적화의 표준 워크플로. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="피펫팅 공정 및 플레이트 리더 분석을 보여주는 96웰 플레이트 ELISA 실험 설정." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4 : TSA 안정성 화면 실험 표준의 워크플로. 왼쪽에서 오른쪽: 96 잘 접시에 안정성 스크린의 Pipetting aliquots (A). (B) pipetting 접시에 형광 염료와 단백질 견본. (C) 원심 분리 하기 전에 접시를 바다 표범 어업. (D) RT-PCR 시스템에 접시를 배치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Prometheus NT.48 시스템의 정적 평형; 다이어그램은 단백질 안정성 분석 설정 및 결과를 보여줍니다." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: 표준 nanoDSF 실험의 워크플로. (A) 모 세관 랙 로드 여. (B) 선반에는 모세 혈관을 로드. (C) immobilizing 마그네틱 씰링 스트립 모세 혈관. (D) 실험 프로그래밍. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="용융 곡선 분석; 그래프; PCR 워크스테이션; DNA 변성; 온도 상승 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6 : RT-PCR 시스템에 대 한 사용자 인터페이스. TSA 실험 프로그래밍 되어있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="염화암모늄의 온도 영향과 농도를 보여주는 형광 분석 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig7.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 7"> 그림 7 : 화면 샘플 데이터를 소금. (A) lysozyme과 라벨 무료 nanoDSF 실험에 대 한 350 nm 대 330 nm에 형광 강렬의 비율. 샘플 소금 화면 (1.5 M-염화 암모늄 0.2 M)의 C7 C12 우물에 해당합니다. 각 조건에 대해 계산 된 Tm 값은 줄거리에 겹쳐 있다. (Tm 값의 요약 B) 그림 7A에서 제공 된 데이터에서 계산. (C) 형광 강렬에서 590 nm lysozyme hydrophobicity에 민감한 기자 염료를 사용 하 여 TSA 실험에 대 한. 그림 7A, 처럼 샘플 소금 스크린의 C7 C12 우물에 해당합니다. 계산 된 Tm 값은 그래프에 겹쳐 있다. (D) Tm 값의 요약 데이터 그림 7C에 계산. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="pH 대 ΔTm 플롯; 단백질 안정성 분석; Thermofluor, nanoDSF 비교 차트." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig8.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 8"> 그림 8: 전화 화면 샘플 데이터. 로 얻은 lysozyme 및 pH 화면 Tm 교대의 요약. 각 포인트는 독립적인 상태를 나타냅니다. 포인트 같은 pH 값에서 동일한 pH에 다른 버퍼 시스템입니다. Tm 교대 TSA 실험 68.0 ° C와 nanoDSF 실험 71.9 ° C의 제어 Tm 를 기준으로 계산 됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="색상으로 구분된 히트맵 다이어그램; 수치 데이터 분석; 온도 변화 그리드; 과학적 연구." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig9.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 9"> 그림 9 : Osmolyte 화면 샘플 데이터 (lysozyme). Tm 값 lysozyme와 osmolyte 화면의 각 잘 레이블 무료 nanoDSF 실험에서 얻은의 요약. Tm 값 (° C) 물 컨트롤을 포함 하는 우물 a 1과 a 2에 비교 됩니다. 히트 맵 비교 하는 δ Tm 값에 따라 생성 된 (블루 나타냅니다 Tm 증가 레드 Tm 감소). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="형광 데이터를 묘사하는 히트 맵 및 그래프; 온도가 반응에 미치는 영향." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig10.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 10"> 그림 10: Osmolyte 화면 샘플 데이터 (단백질 X). (A) 단백질 X와 osmolyte 화면 라벨 무료 nanoDSF 실험에서 얻은 Tm 값의 요약. Tm 값은 웰 스에 a 1과 A2 물 컨트롤을 포함 하는 비교 됩니다. 히트 맵 비교 하는 δ Tm 값에 따라 생성 된 (블루 나타냅니다 Tm 증가 레드 Tm 감소). (B) nanoDSF 곡선 잘 A9에서 얻은 (1 M D-솔 비 톨, 안정화 조건) 및 D1 (10 mM dipicolinic 산, 불안정 상태). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig10large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="안정화 연구에서 아세트산 및 MES의 Tm°C와 첨가제를 비교한 막대 차트." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58666/58666fig11.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 11"> 그림 11 : Tm에 최적화 효과 버퍼. TSA Tm 값 lysozyme의 Tm에 가장 큰 증가 받으면 각 화면의 조건와 결합. 100 mM 아세트산, pH 4.2, 및 100 mM MES, pH 5.6, 1.5 M 염화 황산 염 소금으로 함께 버퍼 시스템으로 선정 됐다. Osmolyte 농도 osmolyte 화면에 동일 했다: 10mm Ala-Gly, 1 M D-솔 비 톨, 50 m L-리 신 m와 100 m m hypotaurine. 오차 막대는 6 개의 복제의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/58666fig11large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>분자</td>
			<td>PDB 코드</td>
			<td>공동 띠는의 주파수</td>
		</tr>
<tr>
<td>인산 염</td>
			<td>PO4</td>
			<td>5132</td>
		</tr>
<tr>
<td>아세테이트</td>
			<td>법</td>
			<td>4521</td>
		</tr>
<tr>
<td>2-(N-Morpholino)-Ethanesulfonic 산 (MES)</td>
			<td>MES</td>
			<td>1334</td>
		</tr>
<tr>
<td>트리 스 (hydroxymethyl) aminomethane (트리 스)</td>
			<td>TRS</td>
			<td>1155</td>
		</tr>
<tr>
<td>편대</td>
			<td>FMT</td>
			<td>1072</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 단백질 데이터 은행 (PDB) 항목에서 버퍼 분자 공동 화 주파수의 요약. PDBsum16 144,868 항목 (12 년 5 월 18 일 현재로 정확한)의 총에서 통해 얻은 데이터입니다.
보충 정보. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Information.docx" target="_blank">제발이이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭</a>합니다. 
보충 표 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_1.xlsx" target="_blank">제발이이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭</a>합니다. 
보충 표 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_2.xlsx" target="_blank">제발이이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭</a>합니다. 
보충 표 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58666/Supplementary_Table_3.xlsx" target="_blank">제발이이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭</a>합니다.

빠르게 열 교대 분석 실험 및 차동 스캔 fluorimetry 나노 통해 조건의 다양 한 단백질의 열 안정성을 테스트 하는 프로토콜 제공 됩니다. 버퍼 시스템, 소금 및 첨가물, 함께 기능 및 구조 연구에 대 한 적당 한 버퍼를 식별 하는 단백질 분석은 3 독특한 안정성 화면 구성.

단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry

The Horizon2020 Virus-X project was established in 2015 to explore the virosphere of selected extreme biotopes and discover novel viral proteins. To ...

이 방법은 단백질 화학 및 약물 발견에 대한 질문에 어떤 조건이 단백질을 안정시키는가? 효소의 열안정성에 어떤 돌연변이가 영향을 미각을 가하는가? 그리고 어떤 리간드가 단백질 표적에 결합합니까?이 기술의 주요 장점은 표준 실험실에서 빠르고 쉽게 수행되며 중간에서 높은 처리량 응용 프로그램에 완벽하게 적합하다는 것입니다. 단백질 시료를 준비하기 위해 안정성을 한 각 상태의 10 마이크로리터를 다중채널 파이펫을 이용하여 96웰 플레이트의 해당 웰 플레이트로 전달하여 시간을 절약한다. 그런 다음 적절한 완충 계통에서 밀리리터 단백질 용액당 약 1밀리리터를 준비합니다.열 시프트 분석기를 수행하는 경우 단백질 샘플에 SYPRO 오렌지 염료를 20배의 최종 농도로 추가합니다. 반전이나 간단한 소용돌이로 섞으세요. 이제 단백질 용액의 10 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트의 각 우물로 전달합니다.96웰 플레이트를 600배G로 밀봉하고 원심분리하여 단백질 샘플과 스크린 성분이 혼합되도록 합니다. 안정성 화면을 잘 차단하고 최대 4개월 동안 섭씨 4도에 화면을 저장합니다. TSA 실험을 수행하려면 서랍의 오른쪽에 있는 들여쓰기를 단단히 눌러 샘플 서랍을 엽니다.96 웰 트레이를 RTPCR 시스템에 배치하고 A-one을 왼쪽 에 잘 배치합니다. TSA 실험을 설정하려면 새 실험 단추를 클릭합니다. 실험 속성 탭에서 어떤 유형의 실험을 설정하시겠습니까?그런 다음 다른 옵션을 클릭하면 대상 시퀀스를 감지하는 데 사용할 시약이 있습니까? 플레이트 설정에서 대상 및 샘플 탭을 정의하고 대상 이름을 입력한 다음 리포터를 ROX로 설정합니다. 그리고 아무도로 Quencher.플레이트 설정에서 대상 및 샘플 탭에 할당할 때 설정은 수동 참조로 사용할 염료를 없음으로 선택합니다. 동일한 탭에서 96 웰 플레이트의 모든 웰을 이전 단계에서 입력한 대상 이름에 할당합니다. 메서드 실행 탭에서 총 3개가 있을 때까지 단계를 삭제합니다.첫 번째 단계를 섭씨 25도로 설정하고 경사로 속도는 100%이고 5초의 시간으로 설정합니다. 두 번째 단계를 섭씨 95도로 설정하고 경사로 비율은 1%이고 1분이 소요됩니다. 마지막으로, 경사로 속도가 100%이고 5초의 시간으로 세 번째 단계를 섭씨 95도로 설정합니다.수집 데이터 드롭 다운 메뉴를 사용하거나 데이터 수집 아이콘을 클릭하여 데이터 수집을 선택합니다. 잘 당 반응 볼륨을 20 마이크로리터로 설정합니다. TSA 실험을 시작하려면 시작 실행 버튼을 클릭합니다.NanoDSF는 외외염의 사용 없이 단백질 열 안정성을 탐사하는 데 사용될 수 있다. 샘플은 프로토콜에 이전에 설명된 것과 같이 96 개의 잘 플레이트에서 제조 될 수 있지만 SYPRO 오렌지 염료를 추가하지 않고 제조 할 수 있습니다. 서랍 열기 버튼을 눌러 샘플 서랍을 엽니다.장비가 깨끗하고 샘플 랙 근처의 먼지에 특별한주의를 기울이도록 하십시오. 시스템에 백 산란 거울이있는 경우 에탄올과 보풀이없는 조직을 사용하여 청소하십시오. 모세혈관의 한쪽 끝을 용액에 터치하여 96 웰 플레이트의 각 웰에서 약 10 마이크로리터로 모세혈관을 적재합니다.그런 다음 모세관을 샘플 랙의 해당 모세관 홀더에 넣습니다. 실험 전반에 걸쳐 형광 판독을 방해할 수 있기 때문에 모세혈관의 중간을 지문으로 오염시키지 않도록 주의하십시오. 마그네틱 밀봉 스트립으로 모세 혈관을 고정합니다.디스커버리 스캔 탭에서 시작 디스커버리 스캔 버튼을 눌러 각 모세관의 위치와 강도를 감지하기 위해 예비 검사를 시작합니다. 모든 모세 혈관 스캔의 피크가 4, 000 에서 12, 000 단위 사이일 때까지 사고 흥분 강도를 10 %의 초기 전력에서 증가 또는 감소시 강도. 용융 스캔 탭 프로그램에서 온도 경사 옵션을 분당 7.0도로 설정하여 용융 스캔합니다.섭씨 25도까지 온도를 시작합니다. 그리고 95도까지 온도를 종료합니다. 그런 다음 시작 용융 버튼을 눌러 나노DSF 실험을 시작합니다.전체 실험을 위해 샘플을 준비하려면 다음 단계를 반복합니다. 전체 실험이 설정되면 용융 스캔 탭으로 이동하여 온도 경사 옵션을 분당 섭씨 1.0도로 설정하여 용융 스캔을 프로그래밍합니다. 섭씨 25도까지 온도를 시작합니다.그리고 95도까지 온도를 종료합니다. 마지막으로 시작 용융 버튼을 눌러 나노DSF 실험을 시작합니다. Tm은 벤치마크에서 단백질 열 안정성의 정량적 척도로서 사용되어 다른 조건의 호의성을 비교합니다.여기에 표시된 염분 화면에서 샘플 결과, 리소지멜로염암모늄의 열 안정화 특성을 예시한다. pH 화면과 리소지메의 T m 값을 비교하면 TSA와 나노DSF 간의 계약이 일반적으로 양호하지만 나노DSF는 TSA보다 약간 더 큰 T m 교대에서 약간 더 높은 T m 값을 식별하는 경향을 보여줍니다. pH 값이 감소하면서 안정성을 높이는 일반적인 추세가 있습니다.동일한 pH 값을 가진 다른 버퍼 시스템을 사용하여 얻은 T m 값의 범위는 중요할 수 있습니다. 리소지메 조합의 경우 각 안정성 화면에서 가장 높은 TSA T m 값을 산출하여 시너지 결합 효과를 테스트했습니다. 버퍼 시스템의 구성 요소가 더 많이 추가됨에 따라 T m 값이 전반적으로 증가합니다.버퍼의 개별 구성 요소를 최적화하고 안정성 화면과 결합할 때 눈에 띄는 시너지 효과가 발생할 수 있습니다. 이 기술에 따라 결정화와 같은 다른 방법은 단백질의 3차원 구조를 결정하고 리간 드렌전을 위한 분자 기초를 해명하는 데 사용될 수 있다. 또한 Virus-X 프로젝트의 일환으로 단백질 안정성에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 이 기술은 광범위한 약물 발견 및 개발 시스템에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

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뉴 클레오 캡시드 소둔 매개 전기 영동 (NAME) 분석은 HIV-1 뉴 클레오 캡시드 억제제의 신속한 식별을 할 수 있습니다

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우리는 바이러스성 다단백질에 내장된 상동 호스트 병원체 단백질 서열(SSHHPS)의 짧은 스트레칭을 확인하기 위한 일반적인 프로토콜을 제시한다. SSHHPS는 바이러스 성 프로테아제에 의해 인식되고 여러 그룹 IV 바이러스에 의해 특정 숙주 단백질의 표적 파괴를 지시한다.

시험관 내 및 실리코 방법을 사용한 그룹 IV 바이러스 성 SSHHPS 분석

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

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단백질을 안정화 하는 방법: 열에 대 한 안정성 화면 이동 분석 및 나노 시차 바이러스 X 프로젝트에서 Fluorimetry

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