Name: 불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: 배우세요 불연속 밀도 그라디언트를 사용하여 캡슐 양에 따른 박테리아를 분리하는 방법입니다. Klebsiella 및 다양한 세균 종에서 캡슐 조절을 연구하고 돌연변이체를 분리하는 데 활용할 수 있습니다.

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우리가 공급 하는 긴장, 및 유용한 토론의 Parkhill 그룹의 구성원에 대 한 진 타운 왕 고 수 잔나 염 감사 합니다. 이 작품은 Wellcome 생어 연구소 (Wellcome 그랜트 206194), 그리고 각 하 헨리 Wellcome 박사 친목 F.L.S. (그랜트 106063/A/14/Z)에 의해 투자 되었다. M.J.D.는 Wellcome 생어 연구소 박사 재학 하 여 지원 됩니다.

참고: 그 어떤 위험 평가 세균성 긴장에 적용 준수 하 경작 하 고 샘플을 처리 하는 경우 확인 하십시오. 한 번에 너무 많은 그라디언트를 설정 하는 관련 된 느린 pipetting에서 관절에 압력 때문에 근 골격 계 질환으로 이어질 수 있습니다 다는 것을 유의 하십시오. 작업을 계획 하 고 부상을 피하기 위해 주의.
1. 세균성 긴장 또는 돌연변이 라이브러리의 준비
<ol><li>
적절 한 한 천 배지에서 테스트할 긴장 밖으로 행진. 이들은 실험에 대 한 재고 번호판입니다.
	<ol>
<li>단일 식민지를 달성 하기 위해 원하는 온도에서 하룻밤 접시를 품 어. 이 실험이, Luria 국물 (파운드) 한 천 미 균 (23F 야생 유형 및 23F Δcps) 37 ° C에서 37 ° c.에 습도 초 항아리에 혈액 한 천에에 K. 균 (NTUH-K2044 및 ATCC43816 변종) 문화</li>
	</ol>
</li>
	<li>
메 마른 루프 또는 칵테일 막대기를 사용 하 여 적절 한 국물의 10 mL를 접종 하는 주식 접시 (단계 1.1)에서 단일 식민지를 선택 합니다. 무작위 돌연변이 라이브러리의 심사에 대 한 무작위 돌연변이 라이브러리 (TraDIS 라이브러리)의 10 µ L로 국물을 접종.
	<ol>
<li>떨고, 37 ° C에 낮은 소금 파운드 미디어에서 K. 균 긴장과 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 미디어, 37 ° c.에 정적으로 미 균 긴장을 품 어</li>
		<li>15 mL 튜브와 양동이 15 mL 튜브 삽입 및에 어로 졸 꽉 뚜껑 밖으로 스윙에서 3200 x g에서 10 분 동안 벤치 가기 원심 분리기에 원심 분리기를 숙박 문화를 전송 합니다.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1의 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 참고: 표면에 뜨는 통해 의 폐기는 실험실에서 적절 한 액체 생물 학적 폐기물 경로. 원심 분리 및 물의 resuspension 단계 (1.2.2, 1.2.3)의 목적은 그라데이션에 쉽게 시각화를 위한 박테리아를 집중 하는 것입니다. 세균성 문화 선호 하는 경우 그라디언트에 직접 로드할 수 있습니다. 무 겁 게 capsulated 긴장 단단한 펠 릿을 형성 하지 않을 수 있습니다. 이 경우 제거 만큼 상쾌한 가능한 모든 세균성 세포를 제거 하지 않고 1 x PBS 5 mL의 최종 볼륨을 더하고 펠 릿 resuspend. 계속 단계 1.2.5 프로토콜.</li>
		<li>비 mucoid 변종에 대 한 단계 2로 이동 합니다.</li>
		<li>1.2.2 단계에서 설명한 대로 튜브 원심.</li>
		<li>삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 2 mL에 펠 릿을 resuspend. 셀 이제 사용할 준비가 됩니다. 참고: 세균성 세포 현 탁 액의 밀도 중요 하지 않습니다 하지만에서 시각화에 대 한 충분 합니다. 최소 세600 (600에서 광학 밀도 nm) 4의 제안 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 그라데이션 희석 및 미니 그라데이션 테스트 준비
<ol><li>
그라데이션 희석을 준비 합니다. 참고: 좋은 분리를 달성 하기 위해 밀도 기울기에 필요한 밀도 그라데이션 매체 (예, Percoll)의 정확한 농도 사용 세균성 긴장 및 성장 조건에 따라 달라 집니다. 미니 그라데이션 테스트 최고의 분리를 줄 것 이다 농도 식별 하기 위해 먼저 수행 됩니다. 이들은 500 µ L 2 mL 튜브에 단일 희석의 구성. 경우 박테리아는 그라데이션에서 추출 하 고 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 subcultured 것입니다, 다음이 단계는 무 균 조건 하에서 수행 되어야 합니다.<ol>
<li>결합 밀도 그라데이션 중간 밀도 그라데이션 희석 수 있도록 1 x PBS. 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 및 80%의 희석을 확인 (예:, 2 mL 밀도의 그라데이션 매체 플러스 8 mL 1 x PBS의 20% 밀도 그라데이션 매체의 10 mL =).</li>
		<li>테스트할 각 변형에 대 한 2 mL 튜브에 그라데이션 20% 희석의 aliquot 500 µ L (예:, 4 긴장 20% 그라데이션 희석의 500 µ L을 포함 하는 4 관 =).</li>
		<li>그라데이션 희석의 나머지 부분에 대 한 단계 2.1.2를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
박테리아는 그라디언트를 적용 합니다.
	<ol>
<li>1.2.3 단계와 단계에서 1.2.6 다음 단계 각 그라데이션 희석의 상단에 준비 하는 세균성 세포의 100 µ L를 적용 합니다.<ol>
<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 셀의 100 µ L를가지고 고 바로 미니 그라데이션의 초승달 아래 튜브 측에 피 펫 팁을 배치.</li>
			<li>그들은 모든 인터페이스의 혼합 없이, 그라디언트 상단 레이어 구성 그라데이션에 세균성 세포를 매우 천천히 발음.</li>
			<li>테스트할 모든 변종에 대 한 단계 2.2.1.1–2.2.1.2를 반복 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>에 어로 졸 꽉 뚜껑 고정된 각도 터를 사용 하 여, 원심 8000 x g에서 10 분 동안 microcentrifuge에 있는 준비 관.</li>
		<li>원심, 후 바로 원심 분리 다음 그라디언트 레이어 위에 세포를 유지 하는 데 필요한 최소 그라데이션 희석을 시각화 하는 랙 튜브를 전송 합니다.</li>
		<li>결과 명확 하지 않습니다, 경우 단위로 5% 밀도 그라데이션 중간 희석 위의 미니 그라데이션 테스트를 반복 그리고 농도에 정의 된 아래 2.1.1 단계 (예:, 25%와 35% 희석 테스트 해야 30% 결과가 모호한 경우). 참고: 그림 2A 단일 밀도 그라데이션 중간 희석에 전형적인 결과 대 한 참조 하십시오.</li>
		<li>2.2.3–2.2.4 단계에서에서 결과 사용 하 여 대규모 불연속 그라디언트에 세포를 분리 하는 데 사용할 이상적인 그라데이션 희석을 결정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 주요 실험에 대 한 셀의 준비
<ol><li>
1.2 단계에 설명 된 대로 적절 한 국물의 10 mL를 접종 하 여 신선한 숙박 문화를 준비 합니다.
	<ol>
<li>1.2.1 단계에 설명 된 대로 적절 한 조건에서 숙박 문화를 품 어.</li>
		<li>1.2.2 단계에서 설명한 대로 숙박 문화를 펠 렛.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1.2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 씻어.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1 x PBS의 1 mL에 펠 릿을 resuspend. 긴장과 mucoid은 쉽게 작은 하지 않습니다, 경우 최대 2 ml PBS 또는 잔여 미디어의 펠 릿을 resuspend. 셀 이제 사용할 준비가 됩니다.</li>
</ol>4입니다. 불연속 밀도 기울기의 준비
참고: (이상 집중)를 피 펫을 사용 하 여 맨 아래 (가장 집중)에서 그라데이션 준비의 다른 방법은 7 단계에서 설명 되어 있습니다.
<ol><li>
피펫으로 5ml 폴 리 프로필 렌으로 가장 희석 밀도 그라데이션 희석의 1 mL 라운드 하단 튜브 그라데이션의 맨, 가장 희석 층을 형성 하. 참고: 더 집중된 그라데이션 희석의 후속 레이어 레이어 방해를 하지는 바늘을 사용 하 여이 레이어 아래 추가 됩니다. 2의 최소 및 최대 3 개의 그라디언트 레이어 1 mL의 강력한 분리 및 박테리아의 쉬운 시각화 권장 됩니다.<ol>
<li>1.5 인치 1 mL 일회용 주사기를 사용 하 여 바늘 연결 된, 다음 가장 집중된 밀도 그라데이션 중간 희석의 주사기에 1 mL. 하지 마십시오 어떤 공기 차지 거품 그라데이션 레이어를 혼란 시킬 수 있다.</li>
		<li>첫 번째 레이어를 포함 하는 튜브의 아래쪽에 바늘 끝을 놓습니다. 인터페이스를 혼합 하지 않으려면 매우 천천히 주사기 내용을 발음. 참고: 두 희석의 인터페이스는 더 집중된 그라데이션 희석 추가 상승할 것 이다. 빛 또는 외부 창 들고 하 여 인터페이스를 관찰 합니다. 없는 독특한 인터페이스를 관찰 하는 경우 그라디언트를 삭제 하 고 다시 시작 합니다.<ol>
<li>그라데이션에서 바늘을 제거 아주 부드럽게 다른 그라데이션 희석 사이의 인터페이스를 방해를 하지 않도록 합니다. 똑바로 유지에 적합 한 랙 튜브를 놓습니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>3 다른 희석을 사용 하는 조밀 희석 하단에 단계 4.1.1–4.1.2.1를 반복 합니다. 그라데이션 성공적으로 생성 된 인터페이스에 아무 혼합과 세 가지 레이어 있을 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 그라디언트를 원심 분리 하 여 분리 준비 셀 추가
<ol><li>추가 준비 셀의 600 µ L 단계 3.3에서에서 그라데이션 튜브에서의 상단에 매우 천천히 그리고 인터페이스를 혼합 하지 않고 단계 2.2에서에서 설명한 대로.</li>
	<li>
튜브 어댑터에서 튜브를 배치 하 고 그들은 균형을 보장 하기 위해 결합 된 어댑터와 튜브 무게.
	<ol>
<li>벤치 가기 원심 분리기 내의 고정된 각도 터 튜브 어댑터를 놓습니다. 3000 x g에서 30 분 동안 원심 분리기.</li>
		<li>원심, 후 조심 스럽게 제거 튜브, 적당 한 선반에 넣어 하 고 기록으로 결과 사진.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
다음 단계 6 uronic 산 정량화 또는 DNA 추출에 대 한 세균 분수를 복구 합니다.
	<ol>
<li>경우 다운스트림 응용 프로그램 필요 하지 않습니다, 폐기 를 통해 샘플/그라디언트는 실험실에서 적절 한 액체 생물 학적 폐기물 경로. 참고: 그것은 박테리아의 새로운 종/변종에 대 한 분리의 유효성을 검사 해야 합니다. 그라데이션에서 개별 분수 uronic 산 성 시험 (8 단계), 또는 다른 적합 한 양적 분석 각 분수의 캡슐 형을 확인 하 여 현미경 검사 법에 의해 시험 되어야 한다. 목표 하는 경우 집계 또는 셀 크기에 따라 분리, 독립 적절 한 분석 실험을 사용 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 샘플 분수와 선택적 파생물 단계 복구
<ol><li>
제거 하 고 해당 계층 내에서 세균 분수 없는 경우 최고 희석에서 액체를 삭제 하 여 그라데이션에서 분수를 복구할.
	<ol>
<li>최고 분수를 제거 하려면 P200 피 펫을 사용 하 여 부드럽게 분수, 그라데이션을 통해 피 펫 팁을 전달 하 고 분수를 차지. 1.5 mL 튜브에 분수를 배치 하 고 적절 하 게 라벨.</li>
		<li>여전히 P200 피 펫을 사용 하 여 추가 분수를 복구 하는 팁 부드럽게 분수에 그라디언트를 통해 삽입 하 고 신선한 1.5 mL 튜브에 분수를 복구 합니다. 분수는 그라디언트 아래로 낮은 액세스 초과 그라디언트를 제거 합니다.</li>
		<li>매우 낮은 셀 번호를 포함 하는 분수에서 DNA 추출 단계의 더 많은 세포를 얻기 위해 선택적 파생물에 대 한 6.2는 프로토콜에 따라 필요 (예를 들어, 밀도-TraDISort), subculture 분수 경우. 참고: 분수를 위에서 아래로 제거 됩니다으로 낮은 조각으로 그라데이션 맨 셀에서 carryover의 낮은 수준 있을 것입니다. 신중 하 게 협력 하 여 이것을 최소화 고 carryover 결과 영향을 미칠 수 있는 매우 낮은 풍부 샘플-정화를 수행 하 여 낮은 분수를 제거 하는 바늘을 사용 하 여 그라디언트, 혼합 수 없습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
적절 한 액체 미디어의 5 mL으로 단계 6.1.1–6.1.2에서 복구 된 낮은 풍부 분수에서 전송 셀. 인큐베이터에 배치 하 고 37 ° c.에서 2 h 동안 성장
	<ol>
<li>2 h의 성장 또는 샘플 1의 OD600 에 도달 했습니다 때, 후 15 mL 튜브에 문화를 전송 합니다. 양동이에 어로 졸 꽉 뚜껑 밖으로 스윙을 원심 분리기에 3200 x g 에서 10 분 동안 튜브 원심 삭제는 상쾌한</li>
		<li>1 x PBS의 1 mL에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 신선한 단일 농도 밀도 그라디언트를 준비 합니다. 바로 위에 원래에서 분수의 위치에서 그라데이션 농도 사용 하 여 (예: 그림 2D에 15% 밀도 그라데이션 매체 사용 될 것 이라고 표시 된 ΔslyA 돌연변이의 정화). 참고: 이-정화 단계는 선택적입니다.<ol>
<li>셀 그라데이션 2.2 및 5.1 단계에 설명 된 대로 원심 분리기의 상단에 적용 됩니다.</li>
		<li>원심 분리기에서 튜브를 제거 하 고 적절 한 선반에 장소. 그라데이션 사진 하 고 DNA 추출 6.1-6.1.2에 설명 된 대로 분수를 복구. 참고: 이 예제는 지금 DNA 추출 또는 기타 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 준비.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 대체 방법 (이상 집중)를 피 펫을 사용 하 여 맨 아래 (가장 집중)에서 그라데이션 준비
<ol><li>
2.2.3 단계에서 결정 된 그라데이션 희석 사용 합니다. 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여, 5 mL 튜브에 조밀 그라데이션 희석의 1 mL를 추가 합니다.
	<ol>
<li>200 µ L 피 펫을 사용 하 여 추가 다음 짙은 그라데이션 희석의 200 µ L 매우 느리게 인터페이스를 혼합에 하지 튜브에서 레이어의 상단에. 또 다른 200 µ L 고 다음은 최종 600 µ L. 여러 작은 볼륨 제공 더 pipetting 속도 제어 및 인터페이스의 혼합 방지 추가 추가 합니다. 인터페이스 믹스, 삭제 하 고 다시 시작 합니다.</li>
		<li>3 희석 사용 되는 경우 셋째, 최소한 빽빽한 그라데이션 농도로 7.1.1 단계를 반복 합니다. 튜브는 이제 2 mL 또는 단계 2.2.3에서에서 결과 따라 3 mL의 그라디언트 있어야 합니다.</li>
		<li>셀을 추가 하 고 실험을 계속 하는 프로토콜의 단계 5로 이동 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 캡슐 크기 Uronic 산 분석 결과의 측정
<ol><li>PBS 가진 희석에 의해 각 복구 된 분수 4.0의 OD600 를 조정 합니다. 이전에 게시1uronic 산의 정량화와 함께 진행 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없습니다 금융 관심 있다.

캡슐은 공화국 균3, 연쇄 상 구 균 균9, Acinetobacter10, Neisseria11 종 등 많은 세균성 종에는 중요 한 독성 요소 이다. 다양 한 방법을 정량화 및 세균성 캡슐의 시각화에 대 한 존재, 현재 거기 방법은 널리 사용 되 육체적으로 capsulated와 비 capsulated 셀을 별도의. 이 문서에서는, 우리 함께 다른 업스트림 또는 다운스트림 프로토콜 여러 잠재적인 응용 프로그램 세균성 인구의 캡슐 기반 분리에 대 한 강력한 방법을 증명 하고있다.
표면 캡슐의 존재는 세균성 세포 밀도, 밀도 그라데이션 원심 (그림 2D)에 의해 분리 수 있습니다 줄일 수 있습니다. 우리 K. 균 NTUH K204412 , ATCC4381613 뿐만 아니라 구 균 23F14 및 그것의 Δcps 돌연변이15이 방법을 확인 했습니다. 이 방법을 사용 하 여 Percoll16 은 이러한 기준에 부합 하는 다른 물질 박테리아-원칙적에서으로 낮은 점도 아무 독성을 가진 코팅된 콜 로이드 실리 카 입자의 정지 밀도 기울기의 주요 구성 수 밀도 기울기를 설정 하는 데 사용.
그것은 서로 다른 밀도의 레이어 때 밀도 그라디언트, 혼합 하지 마십시오 하 고 발생 않으면 혼합 분리 방법 깨끗 한 결과 포기 하지 않을 전하실 수 있습니다. 우리는 바늘 또는 한 피 펫을 사용 하 여 그라디언트를 따르고 두 가지 대체 방법 포함-모두 효과적인, 그리고 사용 하는 방법은 단순히 취향의 문제. Pipetting 그라디언트 레이어 위에 물질 (세균 현 탁 액, 또는 더 희석 그라디언트 레이어)를 포함 하는 모든 단계에 대 한 작은 볼륨의 여러 aliquots를 pipetting 쉽게 수 있습니다 그것은 어떤 계층의 혼합 없이 날카로운 인터페이스를 달성 하기 위해.
이 프로토콜의 한계는 다른 세균 종족과 그 성능을 보장할 수 없습니다. 따라서, 그것은 중요 한 새로운 세균성 종 또는 스트레인 밀도 기반 분리, 독립 캡슐 정량화 방법을 사용 하 여 유효성을 검사 하는 경우. 적절 한 캡슐 얼룩으로 현미경으로 각 분수에 박테리아를 시각화는 상세한 프로토콜은 사용할 수 있는17신뢰할 수 있는 방법입니다. 또는, uronic 산 (그 대장균 과 K. 균) 등을 포함 하는 캡슐 그림 2B1와 같이 특정 분석 결과 의해 측정할 수 수 있습니다. 이 분석 결과 또한 세균성 세포의 밀도에 따라 원심 기반 mucoviscosity 테스트는 독립적인 유효성 검사 방법으로 부적 하다.
이 방법의 또 다른 한계는 캡슐 생산 문화 조건, 그리고 성장 매체, 온도, 심지어 작은 변화에 아주 과민 하다 또는 폭이 분석이 결과의 결과 영향을 미칠 수 있습니다. 이 문제를 최소화 하기 위해 연구원 수 정의 성장 매체 또는 일괄 일관 된 복잡 한 매체를 사용 하 여, 다른 모든 성장 매개 변수를 동일 실험, 유지 및 예기치 않은 결과의 해석 수 있도록 적절 한 제어 긴장을 포함 . 일부 세균성 캡슐 연약한 고 때 문화 pipetted 셀에서 전단 수 있습니다. 캡슐의 기울이기 피하기 위해, 문화는 centrifuged 고 더 이상 두 번 그라데이션에 선적을 위해 준비 하는 동안 resuspended 될 해야 합니다. 문화의 농도 동안 캡슐의 손실 문제가 있는 경우, 세균성 문화에 적용할 수 있는 밀도 그라데이션 직접 추가 세균 현 탁 액의 더 큰 볼륨으로 시각화를 위해 필요한 경우.
이 방법의 미래 응용 프로그램은 다른 세균 종에 적용 하 고 다른 업스트림 및 다운스트림 기술와 함께에서이 분리를 사용 하. 밀도-TraDISort8, 뿐만 아니라 capsulated 박테리아의 밀도 그라데이션 분리 혼합된 문화 또는 복잡 한 샘플에서 capsulated 셀의 정화에 대 한 변경 된 캡슐과 돌연변이의 절연을 위해 사용 될 수 것이 좋습니다. 급속 한 여러 변종에 캡슐 생산의 프로 파일링입니다. 마지막으로,이 기술은 집계 등 다른 세균성 고기 검사 사용 될 수 있습니다.

많은 세균성 종의 면역 체계에 의해 인식 및 살인 및 다양 한 물리적 스트레스에서 세균성 세포를 보호 하는 다 당 류 캡슐을 생산. Klebsiella 균, 캡슐 생산에서는 감염1,2대 한 절대적인 요구 사항입니다. K. 균 캡슐 항균 성 펩 티 드에 대 한 저항, 보완-중재 살인, 먹어서, 예방 및 타고 난 면역 반응3의 탄압에 저항을 중재 한다. 초과 캡슐 생산 증가 독성 및 감염 (nosocomial) 보다 지역 사회 인수4와 연결 됩니다.
다양 한 양적 및 질적 테스트 캡슐 생산 조사 사용할 수 있습니다. Klebsiella 종,이는 문자열 테스트5, 식민지에 게 감동이 쑤 시 게 위쪽으로 당겨 및 생성 하는 문자열의 길이 측정, 그리고 mucoviscosity 분석 결과6의 느린 원심 분리를 포함 포함 뒤에 상쾌한의 광학 밀도 측정 하는 문화. 이 메서드는 간단 하 고 신속 하 게, 하지만 부족 감도 클래식 Klebsiella 에 사용 될 때 캡슐 overproducing 긴장 보다 변종. 캡슐 정량화의 다른 방법은 uronic 산 분석 결과, 기술적으로 도전 이며 집중된 한 황산1사용 해야 합니다. 마지막으로, 캡슐 현미경 검사 법 (그림 1A)에 의해 직접 표시 됩니다. 이러한 방법 중만 현미경 사용자에 게 단일 인구 내의 다른 capsulation 상태를 관찰 하 고 아무도 이러한 메서드의 capsulated 및 비 capsulated 박테리아의 물리적 분리를 가능 하 게.
그라데이션 원심 분리에 의해 밀도 기반 분판 정기적으로 다른 진 핵 세포 유형7, 정화 세포 생물학에서 사용 하지만 거의 미생물 연구에 사용 됩니다. Klebsiella 의 mucoviscosity 분석 결과 매우 capsulated 박테리아, 원심 분리 하 여 펠 렛을 더 많은 시간이 걸릴 그리고 우리 capsulated 세포의 감소 된 전반적인 밀도 인해 있을 수 있습니다이 권유 관찰을 기반으로 합니다. 여기 나와 있는 메서드 캡슐 크기, 조밀도 기온 변화도 원심 분리 (그림 1)를 사용 하 여 물리적으로 K. 균 인구를 분리 하기 위하여 개발 되었다. 이 메서드는 구 균, 다른 세균 종에 적용 되는 나타내는에 성공적으로 적용 되었습니다. 포화 transposon 돌연변이 라이브러리의 밀도 기울기 분리 결합 transposon 삽입 시퀀싱 (밀도-TraDISort) 캡슐 생산 및 규제8에 관련 된 유전자를 식별 하는 데 사용 되었습니다. 마찬가지로,이 방법은 비 capsulated K. 균 을 무작위 프라임 연쇄 반응 (PCR) 개별 식민지의와 함께에서 사용 되었다 돌연변이. 이 메서드는 또한 다른 인구와 조건, 또는 복잡 한 샘플 (그림 1B)에서 capsulated 박테리아 정화 캡슐 생산의 빠른 비교를 위해 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 셀 크기 또는 집계 등 밀도 영향을 주는 다른 고기를 시험 하는 옵션이입니다.
이 원고 새로운 세균성 종 또는 스트레인에 대 한 절차를 최적화 하는 방법을 보여을 건설 및 불연속 밀도 그라디언트 하이퍼-capsulated, capsulated 및 capsulated 비 박테리아 분리의 실행을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R(Rotor A-4-81 및 500 mL 버켓 포함)</td><td>Eppendorf</td><td>5810 718.007</td><td></td></tr><tr><td>15 mL tube용 어댑터</td><td>Eppendorf</td><td>5810 722.004</td><td></td></tr><tr><td>Fixed andgle rotor F-34-6-38</td><td>Eppendorf</td><td>5804 727.002</td><td></td></tr><tr><td>2.6 to 7 mL tube adapter</td><td>Eppendorf</td><td>5804 739.000</td><td></td></tr><tr><td>로터 FA-45-24-11</td>, <td>Eppendorf</td><td>5424, 000.460</td><td></td></tr>, <tr><td>2 mL 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>0030, 120.094</td><td></td></tr>, <tr><td>1.5 mL 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>0030, 120.086</td><td></td></tr>, <tr><td>5 mL 폴리프로필렌, 둥근 바닥 튜브</td><td>, Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr>, <tr><td>1 mL 일회용 주사기, Luer slip,</td><td>Becton, Dickinson,</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>를 포함한 원심분리기 5424AGANI 바늘 21G 녹색 x 1.5"</td> <td>Terumo</td><td>AN 2138R1</td><td></td></tr><tr><td>P1000 피펫 및 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 피펫 및 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

캡슐은 중재 면역 회피 및 다양 한 물리적 스트레스에 저항 하는 많은 세균성 종에 주요 독성 요소 이다. 많은 방법이 계량 하 고 서로 다른 변종 또는 돌연변이 사이 캡슐 생산 비교를 사용할 수 있지만, 방법은 없습니다 널리 박테리아 기반 정렬 얼마나 많은 캡슐에 그들이 생산. 불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리 하는 방법을 개발 했습니다. 이 메서드는 문화, 변경 된 캡슐 생산, 돌연변이 체를 분리 하 고 복잡 한 샘플에서 capsulated 박테리아 정화 사이 반 양적 캡슐 금액을 비교 하는 데 사용 됩니다. 이 방법은 또한 transposon 삽입 시퀀싱 캡슐 규제에 관련 된 유전자를 식별 하 결합 될 수 있습니다. 여기, 메서드는 새로운 세균성 종 또는 스트레인, 그라데이션 조건을 최적화 하는 방법 등 생성 밀도 그라디언트를 실행 하는 방법을 자세히 보여 줍니다.

대표 결과 그림 2에 표시 됩니다. 기대 하는 정확한 결과 세균 종의 밀도 기울기의 설정에 따라 달라 집니다 및 단일 스트레인 또는 돌연변이의 풀 사용자는 검토 여부. 그림 2A 와 같이 대부분 종자는 그라데이션 내에서 단일 위치로 마이그레이션됩니다 및 2D. 세균성 돌연변이 라이브러리 메서드 적용 그라데이션, 그라데이션, 그리고 맨 아래 (그림 2B)에 작은 acapsular 분수의 최고 층을 통해 배포 적은 밀도 밴드 위에 주요 밴드 상승을 줄 것 이다. 이 분수 uronic 산 (그림 2B)에 대 한 분석 결과에서 보는 바와 같이 캡슐 금액에 차이가 있습니다. K. 균 ATCC43816의 캡슐 생 합성 로커 스에 대 한 같이 다른 그라데이션 분수 내 특정 돌연변이의 명확한 지역화에 개별 분수의 transposon 삽입 시퀀싱 결과 (그림 2C). K. 균 NTUH-K2044 및 미 균그리고 다른 캡슐 생 합성 또는 규제 돌연변이의 순수한 문화에 대 한 대표적인 결과 그림 2D에 표시 됩니다.
<img alt="밀도 구배 원심분리를 이용한 박테리아 캡슐 정제; 트랜스포존 시퀀싱 방법의 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58679/58679fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : 박테리아 캡슐, 그리고 그것의 신청에 따라 별도로 밀도 원심 분리 방법의 도식. (A) capsulated Klebsiella 균 의 전자 현미경 이미지 셀입니다. 캡슐 셀의 외부에 조밀한 레이어로 표시 됩니다. (B) capsulated 박테리아의 학문에 밀도 원심 분리에의 응용 프로그램입니다. (Bi) 밀도 분리 transposon 돌연변이 도서관의 높은-, 낮은-, 및 아니오 캡슐 분수를 생성 하는 데 사용 하 고 transposon 삽입 시퀀싱 캡슐 생산에 영향을 주는 유전자를 정의 하 여 다음 수 있습니다. (Bii) 복잡 한 샘플에서 capsulated 박테리아의 정화입니다. (Biii) 샘플 사이의 캡슐 금액의 빠른 비교에 대 한 밀도 기반 분리의 사용. 이 방법은 또한 수 이기종 캡슐 생산의 시각화 세균성 인구에서 (Biii)와 같이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58679/58679fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Percoll 구배 원심분리; 침전물 분획 분석; 게놈 데이터 시각화; 클레브시엘라 종" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58679/58679fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2 : 대표적인 결과. (A) 미니 그라데이션 테스트에서 출력의 예입니다. 2 다른 K. 균 종자 15% 밀도 그라데이션 매체의 1 mL에 centrifuged 했다. ATCC43816 (이 게 적은 캡슐) 레이어의 아래쪽 마이그레이션합니다 동안 hypermucoviscous NTUH K2044 스트레인 밀도 그라데이션 중간 레이어 위에 유지 됩니다. (Bi) 3 조각으로 transposon 돌연변이 라이브러리를 분리 하는 밀도 그라데이션의 사용. 참고 바닥 분수 돌연변이의 낮은 비율을 포함 하 고이 사진에 표시 되지 않습니다. (Bii) 위쪽, 중간, 및 바닥 분수 uronic 산에 대 한 분석 결과 사용 하 여 다른 캡슐의 유효성 검사. 셀 위쪽, 중간, 및 능가 해 바닥 분수 고립 되었고 4,600 명이 PBS에 resuspended에서 다음 캡슐 다 당 류 추출 및 uronic 산 측정1. (C) 예 밀도 TraDISort 결과. 변이 위치 식별 염색체 다이어그램 위에 파란색 라인으로 표시 됩니다. 뮤턴트 캡슐 부족 그 입력된 라이브러리에 존재 하지만 캡슐 생 합성 로커 스8에 대 한 그림과 같이 바닥 분수에서 농축 되는 동안 최고 분수에 고갈로 식별할 수 있습니다. (D) 야생 유형 및 K. 균 NTUH-K2044 및 미 균 23F의 돌연변이 체 긴장 사이 캡슐 금액 비교 조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58679/58679fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

캡슐 생산에 따라 세균성 인구를 분리 하기 위하여 불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여를 설명 합니다. 이 메서드는 문화 사이 캡슐 금액 비교, 특정 캡슐 형으로 돌연변이 체를 분리 하거나 캡슐 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 사용 됩니다. 여기에 설명 된 최적화 및 분석 결과의 실행 이다.

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

이 방법은 캡슐 및 관련 악성 종양을 조절하기 위하여 어떤 유전자가 이용되는 것과 같은 Klebsiella 필드에 있는 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 캡슐화 및 비 캡슐화된 균주를 물리적으로 분리하는 수단을 제공하고 캡슐 생산균 사이의 신속한 비교에도 사용될 수 있다는 것입니다. 이 방법은 Klebsiella에서 캡슐 조절을 연구하기 위하여 개발되었지만, 또한 다른 세균성 종에 적용될 수 있습니다.일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 개인은 그라데이션을 붓고 세포를 그라데이션에 추가하는 것이 매우 어려울 수 있기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 마스터하기 어려운 기술을 보여 주므로 사용자를 돕기 위한 제안 및 팁을 제공하는 데 매우 중요합니다. 시작하려면 멸균 루프가 있는 스톡 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 적절한 국물의 10 밀리리터를 접종합니다.하룻밤 문화를 배양하십시오. 그런 다음 문화를 15 밀리리터 튜브 및 원심분리기로 옮기습니다. 다음으로, 상체를 버리고 PBS의 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오.원심분리를 반복하고 결과 상체부를 폐기합니다. 그런 다음 PBS의 2 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 밀도 그라데이션 희석을 만들려면 밀도 그라데이션 배지와 PBS를 결합합니다.그런 다음 각 그라데이션 희석의 600 마이크로리터를 개별 2 밀리리터 튜브로 알리쿼트합니다. 200 마이크로리터 파이펫으로 100마이크로리터의 셀을 차지하고, 많은 그라데이션 중 하나의 반월 상 연골 바로 아래에 피펫 팁을 놓습니다. 세균 세포를 매우 천천히 그라데이션에 흡인하여 인터페이스를 혼합하지 않도록 주의하십시오.8, 000g에서 10 분 동안 준비 된 튜브를 원심 분리합니다. 그 후 튜브를 랙으로 옮겨 그라데이션 층 바로 위에 세포를 유지하는 데 필요한 최소 그라데이션 희석을 시각화합니다. 첫째, 가장 희석밀도 그라데이션 희석제 1밀리리터를 5밀리리터 라운드 하단 튜브로 옮킨다.1.5 인치 바늘주사기를 사용하여 다음 가장 집중 된 밀도 그라데이션의 1 밀리리터를 차지하십시오. 바늘을 튜브 바닥에 놓고 주사기의 내용을 매우 천천히 주입합니다. 밀도 그라데이션의 각 단계에서 명확한 인터페이스가 있어야 합니다.층이 혼합되면 박테리아의 깨끗한 분리를 달성하지 않습니다. 그라데이션 희석제 사이의 인터페이스를 방해하지 않도록 그라데이션에서 바늘을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 튜브를 랙에 놓습니다.조심스럽게 튜브의 그라데이션의 상단에 준비 된 세포의 600 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 튜브 어댑터에 튜브를 배치하고 균형을 보장하기 위해 어댑터로 튜브의 무게를 측정합니다. 그 후, 튜브 어댑터를 벤치 상단 원심분리기 내에 고정 각도 로터에 놓고 튜브를 300g에서 30분 동안 원심분리합니다.마지막으로 원심 분리 후 튜브를 조심스럽게 제거하고 랙에 배치하고 결과를 촬영합니다. 이 프로토콜에서 밀도 그라데이션 원심분리는 생산하는 캡슐의 양에 따라 세균균을 분리하는 데 사용되었습니다. 정확한 결과는 세균성 종에 따라 달라지지만 대부분의 균주는 그라데이션 내의 단일 위치로 이동합니다.세균 돌연변이 라이브러리에 이 방법을 적용하면 그라데이션 위의 주요 대역, 그라데이션의 최상위 층을 통한 밀도가 떨어지는 대역, 하단의 작은 캡슐 분획을 생성해야 한다. 이 절차를 시도하는 동안 그라데이션 인터페이스를 혼합해서는 안 되며 그라데이션에는 기포가 포함되어서는 안 된다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 절차에 따라, 비뇨기과산 분석또는 현미경 검사법과 같은 검증 방법은 캡슐 양을 검사하기 위해 수행되어야 한다.이것은 새로운 균주에 대 한이 기술을 사용 하는 경우에 특히 중요 한. 위험 그룹 2 병원균과 함께 일하는 것은 위험할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 교정 보호 장비, 위험 평가 준수 및 문화 간 올바르게 폐기와 같은 예방 조치는 이 절차를 수행하는 동안 항상 취해야 합니다.

separating-bacteria-capsule-amount-using-discontinuous-density

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

출처: Cian, M. B. et. al., Acinetobacter baumannii에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 세포 외피를 내막 및 외막 분획으로 분리. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 자당 구배 초원심분리를 사용하여 그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획을 분리하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인 분획은 멤브레인 특정 성분의 표적 분석을 위해 정제 및 저온에서 저장됩니다.

그람 음성 박테리아의 내막 및 외막 분획의 분리

출처: Feltwell, T., et.al. 불연속적인 밀도 구배를 사용하여 캡슐 양으로 박테리아를 분리합니다. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 다양한 캡슐 생산을 가진 박테리아 균주의 준비 및 특성화를 보여줍니다. 캡슐 관련 유전자에 서로 다른 돌연변이를 가지고 있는 병원성 균주를 배양하고, 액체 배지에서 성장시키고, 원심분리하여 펠릿 밀도를 기반으로 캡슐 표현형을 구별합니다. 완충액 처리는 캡슐 구조를 보존하면서 세포를 세척하고 안정화하는 데 사용됩니다.

캡슐 형성 병원성 박테리아 균주의 배양 및 분리

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

Source: Rustad, M., et.al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the purification of bacteriophages from a suspension containing host bacterial debris using a sucrose density gradient. It shows how the density gradient separates phages by buoyant density, enabling recovery of a visible band for resuspension and further analysis.

Purification of Bacteriophages Using a Sucrose Density Gradient

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

이 논문에서 우리 밀도 그라데이션 원심 분리 기술 및 정자 생리학 연구에 응용 프로그램의 성능에 설명 하고자 합니다.

조밀도 기온 변화도 원심 분리를 사용 하 여 차동 품질의 정자 컬렉션

그람 음성 박테리아는 두 개의 공간적으로 분리된 막을 일으킵니다. 외부 멤브레인은 자두 및 펩티도글리칸 층에 의해 내부 막으로부터 분할됩니다. 이 세균의 이중 이중 층을 격리하는 기능은 그들의 생리학 및 병인을 이해하는 것을 위해 중요했습니다.

아시네토박터 바우만니에 대한 기술적 조정을 통해 그람 음성 박테리아에 대한 셀 봉투를 내부 및 외부 멤브레인 분획으로 분리

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

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이 연구는 밀도 구배 원심분리(DGC)를 통해 인간의 대변에서 농축된 박테리아 세포외 소포체(BEV)를 분리 및 정제하는 방법을 설명하고, 형태, 입자 크기 및 농도에서 BEV의 물리적 특성을 식별하고, 임상 및 과학 연구에서 DGC 접근 방식의 잠재적 응용 분야에 대해 논의합니다.

Density Gradient Centrifugation을 사용한 인간 대변에서 박테리아 세포외 소포의 분리 및 정제

우리는 밀리유체 연속 배양 장치(MCCD)에 대한 프로토콜을 제시하는데, 이는 수백 나노몰 농도까지 지속된 저영양 조건이나 시간적 영양분 변동 조건에서 세균 집단을 미세한 시간 척도로 배양할 수 있게 합니다.

영양소가 낮고 변동하는 상태에서 대 장 균 연구를 위한 연속 배양 밀리플루이딕 장치

배우세요 불연속 밀도 그라디언트를 사용하여 캡슐 양에 따른 박테리아를 분리하는 방법입니다. Klebsiella 및 다양한 세균 종에서 캡슐 조절을 연구하고 돌연변이체를 분리하는 데 활용할 수 있습니다.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

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