Name: 반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 소량의 혈액으로 반복 측정이 가능한 CD8+ T 세포 검출 방법을. Tetramer 기술을 활용하여 바이러스 및 transgene 특이성 CTL을 동시에 정량화하고, 흐름 세포측정법으로 면역 반응을 분석합니다.

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이 프로젝트는 FWF 오스트리아 과학 기금 (프로젝트 번호 P 25499-B13)와 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 부여 계약 번호 681032. NIH Tetramer 핵심 시설을 통해 얻은 다음 시 약: 클래스 I MHC Tetramer vesicular 구내 염 바이러스 nucleoprotein (RGYVYQGL)에 대 한.

모든 방법을 설명 했다 오스트리아 국가 동물 실험 법 ("Tierversuchsgesetz")에 따라 수행 하 고 오스트리아 국가 당국에 의해 동물 재판 권한이 부여 되었다.
1. 버퍼 준비 및 컬렉션 샘플
참고: 사용 마우스 스트레인 분석 epitope에 따라 달라 집니다. MHC 형식 예: 마우스, 표현 된, H-2 Kb C57BL/6 마우스는 적절 한 tetramer 선택 하십시오. 성별 및 나이 동물의 과학적인 질문에 따라 달라 집니다. 설명 하는 실험의 대부분에 대 한 여기를 사용 하 여 여성 쥐 나이의 6-8 주에 실험, 즉, 1. 접종 시작.
<ol><li>FACS 버퍼 (인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) + 1% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) + 0.1% 나트륨 아 지 드 + 2 m m Ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 및 FACS 고정 버퍼 (PBS에 1.5% (v/v) 포름알데히드) 준비. 참고: 두 버퍼에 미리 준비 하는 것이 좋습니다. 사용 될 때까지 4 ° C에 저장.</li>
	<li>혈액: EDTA 코팅 튜브에 마우스의 꼬리 정 맥에서 혈액 마우스 당 20 µ L를 수집24위에서 설명한 대로. 참고: 또한 다른 노선, 예:, 베 나 facialis 또는 복고풍 궤도 부 비 동에 의해 피를 수집 수 있습니다. 그러나, 혈액 수집 방법 국가 동물 실험 법 및 동물 시험 응용 프로그램을 준수 하고있다. 꼬리 정 맥에서 혈액의 컬렉션은 반복적으로 적은 양의 혈액이 필요한 곳 연구에 이상적입니다. 추가 자료는 보상 제어 및 비-얼룩진 제어 필요 합니다.</li>
	<li>비장: 기관 분리 하 고, 주사기의 플런저의 도움으로, 70 nm 및 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 키를 누릅니다. 수 6 단계에 설명 된 대로, 적혈구의 세포를 수행 합니다. 1 x 107 셀/ml PBS에 농도 조정 합니다. 샘플 당 1 x 106 세포가 필요 합니다. 참고: 항상 모의 예방 접종 일부를 포함 하거나 부정적인 제어 벡터 예방 접종 동물을 제어. 위해 ovalbumin (OVA)-긍정적인 컨트롤로 tetramer, OT 1 쥐에서 샘플을 사용할 수 있습니다. 흠 없는 잊지 마세요 및 계산에 보상 컨트롤. 필요한 경우 다른 동물 실험에서에서 샘플이 풀링된 수 있습니다.</li>
	<li>샘플 수집 후는 얼룩과 직접 진행 합니다.</li>
</ol>2. 착 색 설정
<ol><li>각 샘플에 대 한 하나의 FACS 튜브를 준비 합니다. 튜브를 제대로 분류와 각 관으로 장기 정지 (1 x 106 셀)의 100 μ 또는 혈액의 20 μ를 전송.</li>
	<li>비장: Centrifuge 600 x g 4-8 ° c에서 5 분 하 고는 상쾌한 삭제. Resuspend 셀 펠 릿을 소용돌이입니다. 참고: 이 약 20 µ L, 혈액 샘플에 대 한 볼륨으로 유사한의 나머지 볼륨 발생 합니다.</li>
	<li>각 채널도 사용할 수에 대 한 보상 샘플에 대 한 하나의 FACS 튜브를 준비 합니다. 흠 없는 컨트롤로 한 추가 샘플을 준비 합니다.</li>
</ol>3. tetramer 얼룩
<ol><li>
각 샘플에 대 한 tetramer 희석의 50 μ를 사용 합니다. 제안 된 tetramers 및 최적화 된 희석, 표 1을 참조 하십시오. 참고: Tetramers 또는 항 체를 사용할 경우 캐비닛 안전의 빛을 해제 하 고 빛 으로부터 샘플을 보호 합니다.<ol>
<li>FACS 버퍼 튜브 준비 (볼륨 = 샘플 50 μ × 수 플러스 pipetting 오류에 대 한 보상을 총 볼륨의 10% 추가).</li>
		<li>표 1에 나열 된 최적의 희석에 tetramer(s)를 추가 합니다. 소용돌이 솔루션입니다. 참고: 나열 된 fluorophores와 전체 항 체 패널 (CD3, CD8, CD43, CD44, CD62L)를 사용 하 여, (PE에 APC) 두 tetramers 포함 될 수 있습니다. 두 tetramers는 단일 얼룩에 결합 될 수 있다 , 즉, 두 tetramers 셀의 얼룩을 동시에 수행할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Tetramer</td>
			<td>펩 티 드 순서</td>
			<td>대립 유전자</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>희석</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC I / OVA</td>
			<td>SIINFEKL</td>
			<td>H-2 Kb</td>
			<td>APC</td>
			<td>1:25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC I/VSV-NP</td>
			<td>RGYVYQGL</td>
			<td>H-2 Kb</td>
			<td>PE</td>
			<td>1:25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC I / EGFP</td>
			<td>HYLSTQSAL</td>
			<td>H-2Kd</td>
			<td>PE</td>
			<td>1:25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC I/LCMV-GP</td>
			<td>KAVYNFATC</td>
			<td>H-2Db</td>
			<td>APC</td>
			<td>1:25</td>
		</tr>
<tr>
<td>MHC I / HPV 16 E7</td>
			<td>RAHYNIVTF</td>
			<td>H-2Db</td>
			<td>APC</td>
			<td>1:10</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: tetramers와 최적의 희석을 제안 했다. 모델 항 (Ovalbumin (OVA)와 향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP)) 또는 병원 체 구성 요소 (Vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) nucleoprotein (NP), 림프 Choriomeningitis 바이러스 (LCMV 일부 immunodominant 펩 티 드에 대 한 권장된 tetramers ) 당단백질 (GP)와 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) E7 oncoprotein (E7)). 각, 펩 티 드 순서 및 해당 대립 유전자, 뿐만 아니라 권장된 fluorophore 및 최적화 된 희석 나열 됩니다.
<ol start="2"><li>각 샘플을 소용돌이 tetramer 희석의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다. 보상 제어 하 고 흠 없는 샘플만 (tetramer) 없이 FACS 버퍼를 추가 합니다.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 하는 37 ° C에서 20 분에 대 한 샘플을 품 어. 얼룩이 지는 항 체를 tetramer에서 원활 하 게 전환할 수 있도록, 인큐베이션 기간 동안 4 단계에서 설명한 대로 항 체 믹스를 준비 합니다. 참고: 각 개별 tetramer에 대 한 최적의 조건 (희석, 보육 시간 및 온도) 조정 될 필요가 있다.</li>
</ol>4입니다. 항 체의 준비
<ol><li>
각 샘플에 대 한 항 체 혼합의 50 µ L를 준비 합니다.
	<ol>
<li>FACS 버퍼 튜브 준비 (볼륨 = 샘플 50 μ × 수 플러스 pipetting 오류 보상 총 볼륨의 10% 추가).</li>
		<li>표 2에 나열 된 항 체는 희석에 추가 합니다. 참고: 과학적인 질문에 따라 여기에 설명 된 것 외에도 다른 마커 조합은 사용할 수 있습니다. 패널에서 CD3와 CD8 항 체를 항상 포함 해야 합니다.</li>
		<li>소용돌이 솔루션입니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>항 체</td>
			<td>Fluorophore</td>
			<td>희석</td>
			<td>µ g/샘플</td>
			<td>표식</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>0.05</td>
			<td rowspan="3">Ctl (CD3+CD8+)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">CD8</td>
			<td>태평양 파랑</td>
			<td>1:750</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>V450</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD43</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>0.25</td>
			<td>활성화 (CD43+)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD44</td>
			<td>PE-Cy5</td>
			<td>1: 250</td>
			<td>0.04</td>
			<td rowspan="2">순 (CD44-CD62L+) & 이펙터 (CD44+CD62L-)</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD62L</td>
			<td>APC-Cy7</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 항 체가 프로토콜에 최적의 희석 사용. 권장된 표면 마커 (CD3, CD8, CD43, CD44 및 CD62L) 첫 번째 열에 나열 됩니다. 각각에 대 한 권장된 fluorophore, 최적화 된 희석 및 항 체/샘플의 양을 표시 됩니다. 지난 칼럼에서 각 표식으로 식별 되는 셀 형식 지정 됩니다.
<ol start="2"><li>
보상 제어에 대 한 항 체를 준비 합니다. 각 보상 제어에 대 한 각 색에 CD8에 대 한 항 체를 사용 합니다.
	<ol>
<li>각 채널에 대 한 200 μ FACS 버퍼의 튜브를 준비 하 고 각 색에 CD8에 대해 1: 200 희석 항 체의 1 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>소용돌이 튜브.</li>
	</ol>
</li>
	<li>즉시 얼룩과 진행 합니다.</li>
</ol>5. 샘플의 얼룩
<ol><li>4-8 ° c.에 600 x g 에 FACS 버퍼 및 5 분 동안 원심 분리기의 ~ 1 mL를 추가 하 여 샘플을 한 번 씻어 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수. 참고: 남아 있는 액체를 배출 하는 경우 피를 사용할 때는 주의 해야 합니다. 적혈구의 세포의 용 해 이전 혈액 FACS 튜브의 하단에 충실 하지 것입니다. 또는,는 상쾌한 발음.</li>
	<li>각 셀 펠 릿과 소용돌이를 항 체 혼합의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.</li>
	<li>해당 보상 제어 및 소용돌이의 셀 펠 릿에 각 보상 혼합의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.</li>
	<li>흠 없는 제어 및 소용돌이의 셀 펠 릿에 FACS 버퍼의 50 μ를 부드럽게 추가 합니다.</li>
	<li>빛 으로부터 보호 4 ° C에서 30 분 동안 모든 샘플을 품 어.</li>
	<li>기관으로 작업할 때: 6 단계를 건너뜁니다. 한 번 ~ 1-2를 추가 하 여 세척 FACS 버퍼와 600 x g 4-8 ° c.에 5 분에 대 한 원심 분리기의 mL 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수.</li>
	<li>혈액으로 작업할 때: 6 (적혈구의 세포) 단계로 진행.</li>
</ol>6입니다. 적혈구의 세포의 용 해
<ol><li>각 샘플 및 부드럽게 소용돌이에 ACK (염화 염화 칼륨) 버퍼25 의 500 μ를 추가 합니다. 참고: ACK 버퍼 삼투성 붓기와 세포, 특히 적혈구의 이어질 것입니다.</li>
	<li>어둠 속에서 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>4-8 ° c.에 600 x g 에 FACS 버퍼 및 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 스택 종이 수건에 나머지 액체를 배수. 참고: 때 펠 릿은 오히려 빨간색, 적혈구의 세포의 용 해를 반복 합니다.</li>
	<li>한 번 ~ 1-2를 추가 하 여 세척 mL FACS 버퍼 및 4-8 ° c.에 600 x g 에 5 분 동안 원심 분리기 원심, 후는 상쾌한 삭제 및 종이 타 올의 스택에 남아 있는 액체를 배수.</li>
</ol>7. 흐름 Cytometric 측정 및 분석
<ol><li>150-300 μ FACS 고정 버퍼의 각 튜브를 추가 하 고 vortexing에 의해 혼합. 혈액의 20 µ L에 대 한 버퍼의 150 µ L은 충분 합니다. 참고: 고정, 전에 세포는 덩어리의 형성을 방지 하기 위하여 다시 정지 잘 있는지 확인 합니다. 흐름 cytometric 측정을 가능한 한 빨리 진행.</li>
	<li>보상 제어를 측정 하 고 어떤 스펙트럼 중복 수정.</li>
	<li>
C d 3에 대 한 선택 하려면 그림 1 에서 같이 순차 게이츠 설정+/CD8+ 세포.
	<ol>
<li>앞으로 및 측면 분산형 (지역) (비-눈금)를 사용 하 여 세포에 게이트.</li>
		<li>림프 구 인구 내에서 앞으로 분산형 폭 vs 지역 (비-눈금)를 사용 하 여 단일 셀에 게이트.</li>
		<li>단일 셀 세포 CD3 / CD8 채널 (눈금)를 사용 하 여 플롯 합니다. CD8 식별 게이팅 CD3에 의해+ T 세포+/CD8+ 세포.</li>
		<li>CD8 플롯+ vs Tetramer+ 세포와 CD8에 게이트+ + Tetramer 세포, 그림 2에서 같이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>만약에 가능 하다 면는 c d 3에서 20000 셀 (적어도 5000 혈액에서) 기록+/CD8+ 각 샘플에 대 한 게이트, FCS 파일로 저장. 참고: 기록 하는 셀의 크기의 항 원 특정 셀의 주파수에 따라 조정할 수 할 수도 있습니다.</li>
	<li>적절 한 분석 소프트웨어로 FCS 파일을 분석 합니다. (7.3 단원) 위에서 설명한 대로 제어 전략을 사용 하 고 계량 CD8+ + Tetramer 셀.</li>
</ol>

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</ol>

Dorothee 폰 Laer VSV GP의 발명가 이며 소수 생명 공학 회사 ViraTherapeutics GmbH, VSV GP에 대 한 지적 재산권을 보유 하 고 있는 주식을 보유 하 고 있습니다. 다른 작가 대 한 아무 경쟁 금융 관심사는 존재 한다.

Tetramer 얼룩 표현 형 및 펩 티 드 T 림프 톨의 특이성을 분석 하는 오히려 간단 하 고 단순한 프로토콜입니다. 분석을 위한 혈액의 사용, 여기에 설명 된 대로 최소한 침략 적 이며 수 있습니다 지속적인 모니터링, 예를 들어 백신 연구에. 예방 접종의 분야, 벡터 및 항 원 특정 응답의 정량화는 관심, 벡터 특정 응답 백신 항 원28에 대 한 효과적인 면역 반응을 방해 수 있습니다. 메모는 여기에 설명 된 프로토콜, 두 인구 수 측정할 수 동시에 단일 tetramer 얼룩에 줄여 착 색 다양성 및 샘플입니다. 그러나, 몇 가지 단계를 신중 하 게 해야 할 적절 한 측정 및 신뢰할 수 있는 데이터를 확인 해야 합니다. 꼬리 정 맥에서 혈액을 분석에 사용 하는 경우 하나 미리 엷게24를 유도 하기 위해 동물을 따뜻하게 해야 합니다. 따라서, 짧은 시간에 충분 한 혈액을 수집할 수 있습니다, 동물에 대 한 스트레스 감소 하 고 분석은 훨씬 더에 비해 서 피는 천천히 수집 하는 경우. 또한, 샘플 수집 (혈액 또는 기관), 후 직접 얼룩 좋습니다 TCR downregulation 틀린 부정적인 결과 피하기 위해. 같은 모든 후속 단계에 대 한 적용: 절차 중단 하지 해야 하 고 모든 세척 단계 (프로토콜에 명시 된)로 최소한의 수를 감소. 모든 솔루션 및 이전 및 부 화 후 샘플을 보장 하기 위해 적절 한 얼룩 배려 소용돌이를 한다. 이것은 세포의 응집 방지 하려면 샘플을 수정 하기 전에 특히 중요입니다.
프로토콜을 수정 하면, 측면에서 다른 표면 마커 및 tetramers 사용할 수 있습니다, 분석의 목표에 따라. 그러나, 모든 시 약은 다음 수 적정, 최적의 패널 얼룩 전체와 함께에서 해야 합니다. 여기에 지정 된 tetramers의 일부에 대 한 최적화 공개 우리는 제조업체에서 권장 하는 희석을 증가 시킬 수 있습니다 (1시 10분 권장, 최적화 된 1시 25분) (표 1). 스펙트럼 중복 보상, 보상 구슬 스테인드 셀 대신 사용할 수 있습니다. 에 대해서 tetramer 결합 하는 형광 색소의 선택 하나 상상 한다 밝은 형광을 사용 하 여 신호가 낮을 때에 특히이 탐지-을 용이 하 게 하는으로. 통 정 국제 및 동료29, 우리는 하나의 얼룩과 CD8 완벽 하 게 결합 될 수 있는 PE 또는 APC 결합 tetramers를 사용 하 여 선호+ T 단일 항 원 특이성을 가진 세포는 잘 될 수 있습니다 (그림 2)를 감지. 온도 및 시간, 다양 한 조건 얼룩 tetramer 보육에 관한 존재 한다. 우리의 최적화 과정에서 우리는이 문제를 해결 하 고 tetramer 다른 조건 (예: 4 ° C, 실내 온도 또는 37 ° C)에서 얼룩을 수행. 얻은 결과에서 문학30,31일치에 있는 37 ° C에서 20 분 동안 얼룩에 좋습니다. 장시간된 보육으로 국제화 tetramer30 및 false 네거티브 결과의 발생할 수 있습니다 피해 야 한다.
CD8의 검출에 대 한 오른쪽 항 체의+ 셀 (그리고 잠재적으로 적응) 신중 하 게 고려 하는 또 다른 중요 한 문제 이다. 이 특정 안티-CD8 항 체 복제 인간의32 마우스33 샘플에 있는 TCR tetramers의 블록 바인딩 사실에서 발생 한다. 우리의 tetramer 얼룩 프로토콜, 우리 클론 53-6.7 murine CD8에 대 한 얼룩을 선택+ 셀-복제를 차단 하지 않습니다, 하지만 오히려 tetramer 착 색을 향상 시킵니다.
예를 들어 T 세포 응답의 저명한 면역 응답을 분석할 때 tetramer 얼룩 다소 복잡 한입니다. 그러나, 인구는 좀 더 '문제'는 있을 수 있습니다. 이러한 예로 낮은 친 화력 항 원에 대 한 셀 특정 (종양, 자기), 최근 활성화 이후에 아래로 통제 되는 세포를 그들의 수용 체 또는 드문 셀 하위 집합 (예:. 순진한 전조 또는 메모리 셀 인구). 이러한 경우에, 프로토콜을 얼룩이 지는 클래식 tetramer 개선 하거나 다른 방법으로 결합을 해야 합니다. 예를 들어 단백질 키 니 아 제 억제제 (PKI) dasatinib TCR 국제화를 억제 하 고 tetramer 얼룩이 지기 전에 포함 될 수 있습니다. Tetramers 또한 tetramer 얼룩 후 안티 형광 색소 결합형된 기본 Abs를 포함 하 여 안정 될 수 있습니다. 또한, 형광 강도 두 번째 반대로 Ab 형광 색소 활용 된 Ab29,,3435,36의 추가 의해 증가 될 수 있다. 우리는이 프로토콜에 지정 된 tetramers에 대 한 선택적으로 조건을 최적화 하 고 PKI 또는 추가 Abs를 포함 하지 않았다. 그러나, 다른 tetramer에 대 한 최적의 조건을 개별적으로 조정할 수 있다. 드문 인구에 관해서는 tetramer 얼룩 해야 자기 농축11과 결합 합니다.
촉진 및 FACS tetramer 얼룩의 분석을 확인, 부정과 긍정적인 컨트롤이 포함 되어야 합니다. 부정적인 컨트롤, 우리는 항상 관심의 우리의 tetramer로 같은 스트레인의 순진한 마우스의 세포 얼룩. 또는, 샘플 tetramers 없는 펩 티 드, 하지만 관심 tetramer로 같은 형광 색소와 스테인드 수 있습니다. 이러한 컨트롤은 거짓 긍정적인 신호를 제외 하려면 필수 예., 죽어가는 세포에서 발생. 이것 이외에, propidium 요오드 화물 (PI) 등 라이브/죽은 얼룩을 포함 하는 것이 좋습니다. 이것은 특별 한 중요성의 세포는 격리 후 직접 얼룩이 않을 경우입니다. Autofluorescence 배경 제거를 또 다른 전략은 한 채널에 여러 개의 T 세포 마커를 포함 될 수도 있습니다. 이 채널에서 셀 긍정적인 제외, T 세포 인구를 제외할 수 있습니다. 긍정적인 컨트롤로 OT 1 마우스에서 샘플 사용할 수 있습니다 OVA tetramer, 대 한 예. 다른 tetramers에 대 한이 개별적으로 선택 될 수 있다 (예를 들어., 여러 번 접종 했다 마우스에서 샘플). 모두 다른37, 우리 또한 관찰 CD8 수용 체의 다운 규제 효과 기 T 세포 응답의 하루 7 CTL 활성화 하는 동안. 따라서, 활성화 tetramer+ 효과 기 T 세포의 감소를 방지 하려면 좋습니다 분석에 CD8낮은 셀을 포함 하도록 (적어도 이펙터 단계에서 측정 하는 경우).
하나이 프로토콜에서 검색할 수 있는 정보의 양과 질 공부 하는 항 원에 대 한 지식, 가용성 및 FACS 기계 (레이저와 사용할 수 있는 감지기의 수)의 품질과 tetramer의 특이성에 따라 달라 집니다. 동물 샘플 작업은 면역 반응에 변화는 자연스럽 고 피할 수 없는 것입니다. 따라서, tetramer 얼룩에서 의미 있는 결과 얻으려면, 적어도 3-5 동물 분석 되어야 합니다. 경우 여기에 설명 된 프로토콜 (한 실험에서 모범적인 결과 보충 표 1에서에서 찾을 수 있습니다) 안정적이 고 재현 가능한 결과 줄 것 이다. 이 방법은 완벽 하 게 표현 형 및 CD8의 항 원 특이성을 계량에 적합 하기 전에 설명 했 듯이,+ T 세포 (그림 3, 4; 추가 그림 1), 뿐만 아니라 인간에서에서 마우스에 뿐만 아니라. 그러나, CD8 분석+ T 세포 효과 기 기능, granzyme 유도 된 세포 죽음, IC 또는 ELISpot 수행 해야 같은. 그러나, 하나는 T 세포 기능, 생체 외에서 자극에 의해 측정 된 vivo에서 실제 상황을 나타내지 않을 수 있습니다 마음에 두어야 합니다. Vivo에서 진압 환경 T 세포 기능 체 외 측정은 방지할 수 있습니다.
자체, tetramer에 얼룩 제공 하지 않습니다 모든 정보, 하지만 그것은 T 세포 응답을 특성화 하 고 매우 민감한 방식으로38에 생체 외에서 T 세포 부분 집합을 계량 하는 필수적인 방법 될 진화. Tetramers만을 사용할 수 없습니다 특정 하위 척도를 하지만 또한 그39격리, 제자리 교 잡19,20 지역화 및 낮은 선호도 항 종양 관련40, 등 공부 41. tetramer 기술4의 발견 이후 tetramer 얼룩 되고있다 T 세포 분석 및 응용 프로그램의 범위에 필수적인 도구.

이 방법의 목표는 시간이 걸리는 펩 티 드 자극에 대 한 필요 없이 흐름 cytometric 분석 하 여 마우스에서 (다) 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 응답의 주파수를 평가. 이 메서드는 단일 얼룩에 CTL 하위 집합의 표현 형 및 항 원 특이성을 분석합니다. 우리 중요 한 조직 적합성 복잡 한 최적화 나 (MHC I) tetramer VSV-GP, G의 VSV 당단백질에 의해 대체 되었습니다 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV)의 새로운 변종 등 새로운 백신 접근의 효능을 분석 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 당단백질 림프 choriomeningitis 바이러스 (LCMV)1,2의 GP. 체액 반응 이외에 백신의 유효성의 중요 한 읽기 하나 또는 여러 개의 항 원에 대 한 CTL 반응의 유도 이다. 일관성과 세포질 응답의 내구성 이런이 맥락에서 중요 하다, 그것은 같은 동물에서 CTL 응답의 활동을 모니터링 하는 데 유리한. 이 또한 동물 숫자, "3Rs"3의 원리에 대 한 중요 한 측면의 감소를 이어질 것입니다. 따라서, 혈액의 약간 20 µ L에서 분석이 목적을 위해 최적입니다.
Tetramers는 90 년대 후반에 개발 되었다4 T 세포 면역학의 분야에서 중요 한 도구가 되었다. Tetramers는 붙일 표시 된 단지 4 개의 MHC의 나 / 바인딩할 TCRs, 단일 펩 티 드에 대 한 특정 펩 티 드 분자. 요즘, 그들은 구입하실 수 있습니다 하거나 기성 품5, 사용자 정의 주문에 모리 대학6 NIH Tetramer 핵심 시설에 무료 또는 랩7에 제작. MHC I와 II tetramers는 CD8에 즉 사용할 수 있는, + 와 CD4+ T 세포, 각각. 시간 절약, 오히려 간단 하 고 쉽게8 프로토콜, 및 감도9표준화 tetramer 얼룩의 힘에 있다. 또한, 동물 희생 될 필요가 없는 작업 경우 혈액, 그리고 최소 양의 샘플 필요 합니다. 1 측정 한 항 원에 국한 되지 않습니다 하지만 여러 가지 항 때 다른 fluorophores와 활용 tetramers 결합 한 얼룩에 분석 될 수 있다. 펩 티 드 화면에서 예를 들어 새로 발견된 된 항 원은 쉽게 tetramers에 통합 하 고 T 세포 부분 집합의 정량화에 대 한 사용 수 있습니다.
Tetramer 얼룩만 특이 하지만 CTL 기능 (즉., cytokine 생산, 이펙터 기능)에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. T 세포 기능, (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine 또는 효소 연결 된 면역 자리 (ELISpot) 분석 결과 요구에 대 한 정보를 얻기 위해 수행8,10. Tetramer 얼룩 및 IC/ELISpot 중복 되지 않습니다 하지만 오히려 서로 보완. ICS/ELISpot cytokine 생산을 유도 하기 위해 생체 외에서 자극은 원래 T 세포 표현 형을 변경 됩니다. Tetramer 얼룩이, 반면에, 나뭇잎 T 세포 손길이 닿지 않은; 원래 형 보존 되 고 분석 될 수 있다. 또한, tetramers의 또 다른 큰 장점은 그 얼룩 결합 될 수 있다 자석 정렬 및 항 원 특정 셀11의 농축입니다. 정렬된 셀 정의 항 원 특이성의 경작 뿐만 아니라 희귀 한 인구의 분석에 대 한 수 있습니다-기능을 하지 다른 방법으로 가능.
여기에 설명 된 프로토콜, tetramer 얼룩으로 IC/ELISpot를 사용 하 여 수행할 수 있습니다 한 기관에서 때문에 아주 작은 물질 (혈액: 20 µ L; 비장: 1 x 106 셀) tetramer 얼룩에 필요한. 그러나, 관심사의 항 원 특정 세포의 주파수에 따라 각각 TCR 및 실험적인 상황의 강도, 필요한 세포의 양을 하기 하거나 자기 농축 적용 해야 할 수 있습니다.
Tetramers 널리 이용 된다, (antitumor) 백신12,13,,1415 또는 immunotherapy16,17, phenotypic 분석의 유효성을 평가 하기 위해 예 공간 T 세포 항 원 특정 하위 집합18,19,20,21,,2223지역화 여기 설명 하는 방법을 정량화 및 phenotypic 분석 murine 항 원 특정 CD8의 포함 하는 것을 목표로 연구에 대 한 적합 한 신속 하 고 편리한 방식으로 그들의 분석에서+ T 세포.

<table><tbody><tr><td>안전 캐비닛 클래스 2</td><td>VWR</td><td>LBCP302411030</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기 (예: FACSCanto II)</td><td>BD</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석을 위한 분석 플랫폼 (예: FlowJo)</td><td>Fisher Scientific Co. L.L.C.</td><td></td><td></td>NC0887833</tr><tr><td>쌍안 현미경, VisiScope 100</td>, <td>VWR</td><td>630-1553</td><td></td></tr>, <tr><td>Vortex mixer</td>, <td>Phoenix Instrument</td><td>RS-VA 10</td><td></td></tr>, <tr><td>FACS 튜브에 적합한 원심분리기(예: Rotanta 460R),</td> <td>Hettich</td><td>5660</td><td></td></tr>, <tr><td>멸균 메스 블레이드, Nr. 10</td>, <td>Braun</td><td>BB510</td><td></td></tr>, <tr><td>Cell strainer 40 &micro; m</td><td>시그마</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>셀 스트레이너 70 &마이크로; m</td><td>Sigma</td><td>CLS431751</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 계수 챔버</td><td>VWR</td><td>630-1506</td><td></td></tr><tr><td>피펫 (20 &mu; L, 200 &마이크로; L 및 1000 &mu; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4924000037, 4924000061, 4924000088</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, sterile (20 &micro; L, 200 &마이크로; L, 1,000 &마이크로; L)</td><td>Biozym</td><td>770050, 770200, 770400</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Boy</td><td>Integra</td><td>155 000</td><td></td></tr><tr><td>멸균 피펫(5 mL, 10 mL, 25 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001</td><td></td></tr><tr><td>다단계 피펫, HandyStep S</td><td>BRAND</td><td>705110</td><td></td></tr><tr><td>12.5 mL Combitips 다단계 피펫</td><td>BrandTech Scientific</td><td>702378</td><td></td></tr><tr><td>Microvette CB 300 K2E</td><td>Sarstedt</td><td>16.444</td><td></td></tr><tr><td>멸균 반응 튜브(1.5 mL, 50 mL)</td><td>Sarstedt</td><td>72.692.005, 62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브(비멸균)</td><td>Szabo Scandic</td><td>BDL352008</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>LONBE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>열 불활성화 FCS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드</td><td>Roth</td><td>4979.1</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy7 쥐 안티 마우스 CD3 분자 복합체</td><td>BD</td><td>560591</td><td>클론 17A2; 로트 # 7235504</td></tr><tr><td>태평양 블루 랫 안티 마우스 CD8a</td><td>BD</td><td>558106</td><td>클론 53-6.7; Lot # 5058904</td></tr><tr><td>V450 쥐 안티 마우스 CD8a</td><td>BD</td><td>560469</td><td>클론 53-6.7; Lot # 5205945</td></tr><tr><td>FITC 안티 마우스 CD43</td><td>BioLegend</td><td>121206</td><td>클론 1B11; 로트 # B233778</td></tr><tr><td>PE-CY5 쥐 안티 마우스 CD44</td><td>BD</td><td>553135</td><td>클론 IM7; Lot # 85660</td></tr><tr><td>APC-Cy7 쥐 안티-마우스 CD62L</td><td>BD</td><td>560514</td><td>클론 MEL-14; 로트 # 7215801</td></tr><tr><td>OVA-테트라머/APC</td><td>MBL</td><td>TB-5001-2</td><td>SIINFEKL, H-2Kb; 로트 # T1702008</td></tr><tr><td>VSV NP-테트라머/PE</td><td>MBL</td><td>TS-M529-1</td><td>RGYVYQGL, H-2Kb; 로트 # 007</td></tr><tr><td>EGFP-사합체/PE</td><td>MBL</td><td>TS-M525-1</td><td>HYLSTQSAL, H-2Kd; 로트 # 004</td></tr><tr><td>LCMV-GP-테트라머/APC</td><td>MBL</td><td>TB-5002-2</td><td>KAVYNFATC, H-2Db; 로트 # T1412006</td></tr><tr><td>HPV 16 E7-테트라머/APC</td><td>MBL</td><td>TB-5008-2</td><td>RAHYNIVTF, H-2Db; 로트 # T1804003</td></tr></tbody></table>

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 cd8의 동시 정량화+ t 세포가 mhc를 통해 내가 tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

바이러스 성 감염, 항 원 특정 CD8 시+ 세포 독성 T 세포 (Ctl) 발생 및 병원 균의 확산을 방지 하기 위해 감염 된 세포의 제거에 기여. 따라서, 항 원 특정 Ctl의 주파수는 특정 항 원에 대하여 T 세포 반응의 강도 나타내는. 이러한 분석은 기본적인 면역학, 백신 개발, 암 immunobiology 및 적응형 면역학에서 중요 한. 백신 분야에서 CTL 응답 바이러스 성 벡터의 구성 요소에 대 한 감독 공동 결정 합니다 (예:, transgene)의 항 원에 대하여 항 원 특정 세포의 생성은 얼마나 효과적. 항 원 특정 Ctl 중 세포내 cytokine 얼룩 또는 항 원 특정 T 세포 수용 체 (TCRs) 및 분석의 직접 얼룩 cytometry 뒤 특정 펩 티 드와 자극에 의해 감지할 수 있습니다. 첫 번째 방법은 오히려 시간이 걸리는 장기에서 세포를 분리 하는 동물의 희생 필요로 하기 때문입니다. 또한, 그것은 수행 하기 어려운 작은 동물에서 혈액의 격리가 필요 합니다. 두 번째 방법은 오히려 빠른, 적은 양의 혈액으로 쉽게 할 수 이며 특정 effector 기능, cytolytic 활동에 의존 하지 않습니다. MHC tetramers 항 원 특정 TCRs를 감지 하는 이상적인 도구입니다.
여기, 우리는 동시에 항 원 특정 바이러스 성 벡터 VSV GP의 immunodominant 펩 티 드에 대 한 Ctl (LCMV GP, VSV NP)와 MHC에 의해 transgenes (OVA, HPV 16 E7 eGFP)를 감지 하는 프로토콜을 설명 난 tetramer 얼룩이 지 고 교류 cytometry. 얼룩이 혈액에서 직접 또는 장기, 비장 등의 단일 셀 정지에서 가능 하다. 혈액 이나 장기의 단일 셀 정지 tetramers와 알을 품는. CD3와 CD8 항 체와 얼룩, 후 항 원 특정 Ctl cytometry에 의해 정량 된다. CD43, CD44, CD62L 또는 다른 사람에 대 한 항 체 항 원 특정 CD8의 정품 인증 상태를 확인 하려면 포함 될 수 있습니다 필요한 경우,+T 세포 및 naïve 및 이펙터 세포 사이 차별을.

그림 1 이 프로토콜, 즉 CD3의 대상 셀에 올바르게 게이트 하는 방법을 보여 줍니다+/CD8+ 세포. 그것은 종종 downregulate T 세포 수용 체26,27 세포는 활성화 하 고, 따라서, CD3낮은 셀도는 게이팅에 포함 되어야. CD3 게이팅 후+/CD8+ 셀, 셀 수 있는 긍정적인 tetramer 식별 (그림 2). 대표 몰아내고 부정적인 제어 (순) 마우스에 대 한 뿐만 아니라 동물 중 어느 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA)와 예방 접종 또는 OVA 표현 VSV-GP (VSV-GP-OVA) 표시 됩니다. 두 개의 서로 다른 낮은 말에서 보듯이 tetramers 얼룩에 대 한 같은 튜브에 결합할 수 있습니다. 그러면 두 개의 서로 다른 CTL 특이성의 동시 정량화: 바이러스 (VSV N) 관련 및 transgene 전용 (OVA) Ctl. 우리는 단일 및 이중 tetramer stainings 주는 긍정적인 세포의 유사한 백분율 사용 하 여 각 tetramer에 대 한 확인. 이 프로토콜, 다른 바이러스 관련 (예:., LCMV GP, HPV 16 E7)를 사용 하 여 또는 transgene 전용 (예:., GFP) T 세포 인구 수 분석 (추가 그림 1). 추가 표 1, VSV-GP-OVA와 예방 접종 후 5 동물에 대 한 결과 표시 됩니다-tetramer 얼룩의 견고성을 나타내는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58680/58680fig1.jpg"> 그림 1: CD8 분석 전략 게이팅 대표+ T 세포 혈. 흐름 cytometric 분석에 사용 되는 제어 전략의 도식 적인 표현입니다. Tetramer 얼룩 및 흐름 cytometric 측정 후 데이터 분석 했다. 세포는 전방 및 측면 분산형 (지역) (비-눈금)로 확인 되었다. 그들에서 단일 셀은 앞으로 분산형 폭 vs 지역 (비-눈금)를 적용 하 여 확인 되었다. CD8+ T 세포 게이팅 CD3에 의해 확인 되었다+/CD8+ 세포 (눈금). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58680/58680fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58680/58680fig2.jpg"> 그림 2: OVA 및 N 특정 CD8 계량 게이팅 전략 대표+ T 세포가 혈액에. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 적인 표현입니다. CD3+/CD8+ 세포 tetramer 분석을 위해 사용 되었다. 위와 중간 패널: CD8 마커 각각 tetramer (눈금)에 대 한 표시 했다. 하단 패널: 두 tetramers 서로 (눈금)에 대 한 표시 했다. 왼쪽: 컨트롤 (순) 마우스; 중간: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 오른쪽: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58680/58680fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/58680/58680fig5.jpg"> CD3의 대표적인 결과 추가 그림 1:+/CD8+ + tetramer 세포 접종 후. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화의 도식 대표. CD3+/CD8+ 와 CD8 마커 각각 tetramer (눈금)에 대 한 플롯은 셀 tetramer 분석을 위해 사용 되었다. 왼쪽: 마우스 했다 순진한, 오른쪽: 마우스 VSV-GP (위 패널) 접종 했다, 녹색 형광 단백질 (eGFP)를 향상-VSV-GP (중간 패널) 또는 VSV GP 인간 유 두 종 바이러스 (HPV) E7 oncoprotein (E7) 표현 표현 (하단 패널). 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 된 고 tetramers (LCMV GP, eGFP HPV E7)으로 물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58680/58680fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
여기에 설명 된 프로토콜의 하나의 큰 장점은 적은 양의 혈액 각 측정에 필요한로 동일한 마우스에서 T 세포 응답 시간이 지남에 따라 할 수 있습니다. 그림 3 시간이 지남에 T 세포 응답에 대 한 훌륭한 결과 보여준다. 항 원 특정 Ctl의 수량, 뿐만 아니라 그들의 표현 형 또한 분석할 수 있습니다 (그림 4)이이 프로토콜을 사용 하 여.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58680/58680fig3.jpg"> CD8의 대표적인 결과 그림 3:+ T 세포 혈 예방 접종 후에 운동. Tetramer+ 세포의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 대표. CD3+/CD8+ 세포 tetramer 분석을 위해 사용 되 고 두 tetramers 서로 (눈금)에 대 한 표시 했다. 상위 패널: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 패널을 낮추는: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 혈액은 3, 7, 10 및 14 일 접종 후에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58680/58680fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58680/58680fig4.jpg"> CD8의 대표적인 결과 그림 4:+ T 세포 활성화 및 예방 접종 후 순 진하고 effector 세포로 분화. 의 흐름 cytometric 정량화에 대 한 사용 제어 전략의 도식 표현 활성화 (CD43+), 순 (CD44-/CD62L+)와 이펙터 (CD44+/CD62L-) CD3+/CD8+ (세포 로그 소수 자릿수)입니다. 왼쪽: 컨트롤 (순) 마우스; 중간: 마우스 OVA 은닉 아 데 노비 루스 5 (Adeno-OVA); 접종 했다 오른쪽: 마우스 ovalbumin (OVA) 접종 했다-VSV-GP (VSV-GP-OVA)을 표현. 피 접종 후 7 일에 꼬리 정 맥에서 수집 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58680/58680fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td># 마우스</td>
			<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="5"></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

이 방법은 T 세포 면역학 및 바이러스 벡터 백신의 발달 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 동일한 마우스에서 반복 측정을 허용하는 소량의 혈액만 필요하다는 것입니다. 또한, 바이러스 및 유전자 특이적 CTL은 동일한 샘플에서 검출될 수 있다.절차를 시연하는 것은 기술자인 재스민 린도피너와 대학원생 인 아니카 로슬러가 될 것입니다. 샘플을 측정하고 분석하는 것은 졸탄 뱅키( Zoltan Banki)입니다. 먼저 텍스트 프로토콜에 따라 마우스를 안전하게 절제합니다.마우스의 꼬리 정맥에서 EDTA 코팅 튜브에 20 마이크로리터의 혈액을 수집합니다. 비장구로 작업 할 때 비장을 분리하고 주사기의 플런저를 사용하여 세포 여과기를 통해 조직을 누릅니다. 적혈구에 용해를 수행 한 후, 세포를 계산하고 샘플의 농도를 조정합니다.각 샘플에 대해 하나의 Facs 튜브를 준비하고 라벨을 붙이고, 100마이크로리터의 장기 현탁액 또는 20 마이크로리터의 혈액을 튜브로 이송합니다. 비장으로 작업 할 때, 원심 분리는 5 분 동안 장기 현탁액을 제거하고 상퍼를 폐기하십시오. 그런 다음 튜브를 소용돌이쳐 세포 펠릿을 재일시 중단합니다.각 채널을 사용할 수 있도록 보상 샘플을 위해 Facs 튜브를 준비합니다. 스테인드 컨트롤로 한 개의 추가 샘플을 준비합니다. 최적의 희석제에 테트라머와 팩 버퍼와 튜브를 준비, 혼합 소용돌이.다음으로, 각 샘플에 테트라머 희석제 50마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다. 테트라머없이 Facs 버퍼를 보정 컨트롤과 스테인드되지 않은 샘플에 추가합니다. 다음으로, 어두운 조건에서 샘플을 섭씨 37도에서 20분 동안 배양합니다.샘플이 인큐베이션하는 동안 튜브에 Facs 버퍼를 추가합니다. 이어서, 텍스트 프로토콜의 표 2에 지정된 희석제에 따라 완충제에 항체를 추가하고, 용액을 소용돌이시다. 과학적 질문에 보류 중인 마커 조합, 떨어져 여기에 설명 된 것 에서, 사용할 수 있습니다.항상 패널에 CD3 및 CD8에 대한 항체를 포함해야 합니다. 각 채널에 대해, 200 마이크로리터의 Facs 버퍼로 튜브를 준비하고, 각각의 색상에 CD8에 대한 항체 희석제 1마이크로리터를 추가하고, 혼합하는 소용돌이를 추가한다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 지정된 바와 같이 항체 희석제를 저장합니다.샘플을 세척하려면 샘플 및 원심 분리기에 Facs 버퍼 1mililiter를 추가합니다. 그런 다음 상체를 버리고 남은 액체를 종이 타월로 배출합니다. 혈액으로 작업 할 때, 남아있는 액체를 배출 할 때주의하십시오.적혈구의 용해 이전에, 혈액은 관의 바닥에 충실하지 않습니다. 또는, 당신은 슈퍼 나탄을 흡인 할 수 있습니다. 다음으로, 각 세포 펠릿에 항체 용액의 50 마이크로리터를 추가하고 부드럽게 소용돌이를 넣습니다.각 보상 믹스의 50 마이크로리터를 해당 보정 제어에 추가하고, 50 마이크로리터의 Facs 버퍼를 스테인드 컨트롤의 세포 펠릿에 넣고, 소용돌이를 부드럽게 넣습니다. 비장구로 작업할 때, 항체가 1~2밀리리터의 팩 버퍼, 원심분리기로 직접 염색한 후 샘플을 5분간 세척한다. 그런 다음 상체를 버리고 종이 타월에 남은 액체를 빼내십시오.각 혈액 샘플에 500 마이크로리터의 ACK 버퍼를 추가하고 부드럽게 소용돌이를 추가합니다. 그런 다음 실온에서 5 분 동안 어둠 속에서 샘플을 배양합니다. 샘플 및 원심분리기에 Facs 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.그런 다음 상체를 버리고 남은 액체를 종이 타월로 배출합니다. 적혈구의 적절한 용해는 Facs 측정을 용이하게하는 중요한 단계이므로 펠릿이 다소 젖으면 적혈구의 용해를 반복합니다. 이전에 설명한 대로 샘플을 다시 세척합니다.그런 다음 상체를 버리고 종이 타월에 남은 액체를 배출합니다. 고정하기 전에 덩어리형성을 방지하기 위해 세포가 잘 재주중단되어 있는지 확인하십시오. 각 튜브에 버퍼를 고정하는 Facs의 150~300마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다.그런 다음 가능한 한 빨리 유동 세포 측정을 진행합니다. 먼저 보상 컨트롤을 측정하고 스펙트럼 중복에 대해 수정합니다. 그 후 CD3 양성 및 CD8 양성 셀에 대해 선택하도록 순차 게이트를 설정합니다.전방 및 측면 산란 영역을 사용하여 림프구의 게이트. 그런 다음 림프구 인구 내에서, 전방 분산 폭대 면적을 사용하여 단일 세포의 게이트. CD3 및 CD8 채널을 사용하여 단일 셀 림프구를 플롯합니다.CD3 양성 및 CD8 양성 셀에 게이팅하여 CD8 양성 T 세포를 식별합니다. CD8-낮은 셀이 게이팅에 포함되어 있는지 확인합니다. CD3/CD8 양성 셀에서 전파하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다.세포의 활성화는 종종 CD3 및/또는 CD8의 다운 조절으로 이어지기 때문에 CD3/CD8-낮은 세포도 포함되어야 합니다. 그 후, CD8 양성 세포 대 테트라머 세포를 플롯하여 CD8 양성/테트라머 양성 세포에서 게이팅합니다. 가능하면 각 샘플에 대해 CD3 양성 및 CD8 양성 게이트에서 20, 000 셀을 기록하십시오.마지막으로 측정값을 FCS 파일로 저장합니다. 이 프로토콜에서, 항원 특이적 CD8+T 세포는 혈액 및 조직 샘플에서 정량적으로 검출되었다. CD3 양성 및 CD8 양성 세포를 게이팅한 후 테트라머 양성 세포가 확인되었습니다.두 개의 서로 다른 테트라머는 염색을 위해 동일한 튜브에 결합되어 두 개의 서로 다른 CTL 특이성을 동시에 정량화할 수 있었습니다. 이 프로토콜을 사용하여 각 측정에 소량의 혈액만 필요하므로 동일한 마우스의 T 세포 반응을 시간이 지남에 따라 추적할 수 있습니다. 또한 항원 특이적 CTL의 표현형을 분석할 수 있다.이 절차를 시도하는 동안, 이것은 T 세포 수용체의 내재화로 이어질 수 있기 때문에 장기간 잠복기를 피하는 것이 중요합니다. 테트라머 기술이 발견된 이래, 테트라머 염색은 T 세포 분석을 위한 필수 도구이자 테트라머 를 포함한 광범위한 응용 분야가 되었습니다. 밝은 테트라머를 위한 밝은 미래.

simultaneous-quantification-anti-vector-anti-transgene-specific-cd8-t

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

현장 tetramer의 얼룩과 현장 하이브리드화 (ISTH)의 결합 기술은 시각화, 매핑 및 분석들은 바이러스에 감염된 대상으로 바이러스에 특정한 CD8 + T 세포의 공간적 근접의 이러한 면역 effectors와 대상 사이의 양적 관계의 결정을 가능하게 감염 결과 수 있습니다.

동시에 바이러스 특정 CD8 + T 세포 바이러스에 감염된 세포를 시각화하는 기술 현장에서</em

의 생성에 대한 신속, 간단하고 비용 효율적인 프로토콜 기증자 파생 CMV, EBV 감염 또는 교수실을 개발하는 위험 allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 수신자에게 주입을위한 multivirus 특정 CTLs (rCTL을). 이 제조 과정은 GMP 준수하고 전문 센터 이외 T - 세포 immunotherapy의 광범위한 구현을 보장한다.

Multivirus 특정 T 세포 생성 Allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 후 바이러스 감염을 예방 / 치료

이 비디오는 펩타이드 주요 조직적합성 복합체 클래스 I(pMHC-I) 사량체를 사용하여 원숭이 면역결핍 바이러스(SIV)에 특이적인 CD8+ 메모리 T 세포를 특성화하는 방법을 보여줍니다. pMHC-I 사량체는 SIV 특이적 펩타이드에 결합하고 형광단에 접합된 4개의 MHC-I 분자의 복합체입니다. 이러한 사량체는 SIV 특이적 CD8+ T 세포의 T 세포 수용체(TCR)에 선택적으로 결합하여 이러한 세포의 특성화를 용이하게 합니다.

SIV 특이적 CD8+ 기억 T 세포를 분석하기 위한 펩타이드-MHC-I 테트라머 염색 기법

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

여기에서는 AIDS 바이러스를 붉은 털 원숭이 CD8 + T 세포를 열거하고 특성화하기위한 최적의 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 HIV의 면역학 분야에뿐만 아니라, CD8 + T 세포 반응이 질병의 결과에 영향을 미치는 것으로 알려져있다 생물 의학 연구의 다른 영역뿐만 아니라 유용합니다.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석 + 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

여기, 우리가 immunohistochemistry 지역화, 표현 형, 및 조직에서 항 원 특정 T 세포의 양을 결정 하에 현장에서 MHC tetramer 얼룩 결합 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 다른 세포 유형 및 조직 구조 항 원 특정 CD8 T 세포의 공간 및 phenotypic 특성을 결정 하는 데 사용 됩니다.

제자리에서 MHC tetramer 얼룩 및 정량 분석 위치, 풍부, 및 조직에서 항 원 특정 CD8 T 세포의 표현 형을

선물이 여기 표준 면역학 기술에 대 한 응용 프로그램 (CFSE 스테인드 OT-내가 확산) 빠르게 보조 중재 된 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 세대를 모니터링 하기 위한 vivo에서. 이 빠른 CTL 용량 추정 세포내 병원 체에 대 한 예방 백신으로 치료 암 백신의 개발에 대 한 유용합니다.

급속 한 비보에 평가 보조의 세포 독성 T 림프 톨 생성 기능의 백신 개발에 대 한

이 프로토콜 설명 합니다 자세한 워크플로 생성에 대 한 immunomodulators, 예를 들어 bispecific T 세포 engagers를 인코딩 하는 홍 역 바이러스를 사용 하 여 표현 위한 oncolytic 바이러스의 비보 특성화 전. 응용 프로그램 및 다른 벡터 플랫폼 및 transgenes 적응 임상 번역 소설 immunovirotherapeutics의 개발을 가속화할 것 이다.

종양 대상 Immunomodulation에 대 한 paramyxoviruses: 설계 및 평가 전 비보

클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

본 프로토콜은 생체 외 자극과 유세포 분석을 결합하여 일본 뇌염 바이러스 (JEV) 예방 접종을받은 어린이 내의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서 다기능성 T 세포 (TPF) 프로파일을 분석합니다. JEV 특이적 TPF의 검출 방법 및 유세포분석 색 구성표를 테스트하여 유사한 연구에 대한 참조를 제공했습니다.

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