Name: Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: 배우세요 생쥐 갈색 지방 조직에서 효율적인 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq) 방법을 통해 히스톤 변형 및 비히스톤 단백질의 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 기법입니다.

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프로토콜의 동물 처리 단계는 보스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 되었습니다.
1. 주 1: 해 부와 Chromatin Immunoprecipitation (칩)에 대 한 박쥐의 준비
<ol><li>이산화탄소 (CO2) 챔버를 사용 하 여 마우스를 안락사 하 고 해 부를 즉시 수행 이후에. 절 개 전에 70% 에탄올 스프레이 마우스 모피. 다음 자르면 목 따라 피부는 다시 위로 향하도록 마우스를 놓습니다. 어깨 사이 피부 바로 아래 박쥐를 찾습니다 (interscapular; 그것은 신중 하 게 해야 하는 흰색 지방의 얇은 층으로 나비 모양의 두 엽 제거7나타납니다). 참고: 마우스에 대 한 3 개월 된 C57BL/6J 일반 차 다이어트 (27과 30 g 사이이 연령 범위에 마우스 무게)을 먹이, 각 박쥐 엽 약 1 ㎝ 길이입니다. 박쥐 디포의 총 무게는 남성 및 여성 쥐에 있는 약 0.15 g 이다.</li>
	<li>1 박쥐 패드를 사용 하 여 3 칩. 여러 개의 박쥐 패드 쥡니다까지 동시에 처리할 수 있습니다.</li>
	<li>Crosslink 각 박쥐 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 포함 1% 포름알데히드 실내 온도 (RT)에서 150 rpm에 회전 하는 15 분의 10 mL에 패드.</li>
	<li>실시간에서 150 rpm 회전 5 분 125 m m의 최종 농도에 2.5 M 글리신을 추가 하 여 가교를 끄다</li>
	<li>침투성 세포의 용 해 버퍼 (10 mM HEPES, 1.5 m m MgCl2, 10 m m KCl, 0.5 m m DTT, 0.2 밀리미터 PMSF)의 500 µ L를 박쥐 패드를 전송 하 고 추가 2 스테인리스 구슬 (크기: 3.2 m m 직경 재료의 표참조) 각 박쥐 패드에 대 한. 구슬-기반 조직 균질 화기를 사용 하 여 조직 분쇄기를 (참조 테이블의 자료).</li>
	<li>최대 전력에서 5 분부터 시작. 필요한 경우 조직 무 균 때까지 시간을 확장 하 고 단일 셀 구분 됩니다. 새로운 튜브와 10 분 동안 16000 x g 에서 4 ° C에서 원심 분리기 샘플을 전송 합니다.</li>
	<li>원심, 후는 상쾌한 새로운 튜브로 전송 하 고 얼음에 셀 펠 릿을 유지 합니다. 셀의 손실을 방지 하기 위해 10 분 동안 16000 x g에서 4 ° C에서 상쾌한 원심 최종 상쾌한 취소 및 SDS 세포의 용 해 버퍼의 300 µ L에 두 셀 펠 릿을 함께 resuspend (SDS 1%; EDTA 10 밀리미터; Tris-HCl pH 8, 50mm) protease 억제제 x 1 ( 재료의 표참조). 10 분 동안 얼음에 품 어.</li>
	<li>긴 DNA 파편 200-500 기본 쌍을 생성 하 lysates sonicate 쥡니다, 후 4 ° C에서 16000 x g 에서 10 분 동안 원심 분리 하 여 파편을 제거 하 고 쥡니다 통해 DNA 전기 이동 법의 1 %agarose 젤에 성공을 확인 합니다. -젤 120 V;에서 실행 좋은 분리 45 분 후에 이루어집니다. 참고: 쥡니다 최적화 파편의 적절 한 크기를 달성 하기 위해 필요할 수 있습니다. 선택한 sonicator와 ( 재료의 표참조)에서 30 s/30 s의 사이클을 사용 하 여이 320 W 출력 파워에 10 분, 20 KHz 주파수 2 배 필요 합니다.</li>
	<li>표면에 뜨는 분수를 10 배 희석 (최종 볼륨은 각 박쥐 패드 3 mL) 칩 희석 버퍼에서 (SDS 0.01%; 트리톤 1.1%; EDTA 1.2 m m; Tris HCl pH 8, 16.7 m m; NaCl 167 mM) protease 억제제 x 1. 옆으로 칩 입력으로이 chromatin 솔루션 (30 µ L 3 ml 같음)의 1%를 유지. 입력 하룻밤 4 ° C에서 (까지 계속 단계 2.4). 참고: 위의 분수 DNA immunoprecipitation 전에 각 샘플에 존재의 금액에 비해 immunoprecipitated 소재의 상대 정량화에 대 한 기준 입력된을 제공할 것입니다.</li>
	<li>칩 항 체를 추가 (사용 하는 항 체에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오 예를 들어 여기) chromatin 솔루션의 1 mL에 회전 4 ° C에서 밤새 품 어 고. 해당 사전 면역 IgG, 가능한 경우, 또는 동일한 종의 정상 IgG 병렬 immunoprecipitation을 수행 (예. 일반, IgG 항 체는 토끼에서 생산 하는 경우에, 토끼). 또는, 아니오-항 체의 제어를 위한 chromatin 솔루션의 1 mL를 저장 합니다. 참고: 항 체의 최적의 금액 결정 되어야 합니다 실험적으로 각 새로운 항 체에 대 한 항 체 농도 알 수 없는 경우. 그렇지 않으면, 2-5 µ g 항 체의 사용 하 여 합리적인 시작 금액입니다. 가능 하다 면, 칩 급 항 체 또는 검증 된 항 체를 사용 하 여 immunoprecipitation에 대 한.</li>
</ol>2. 면역성이 있는 복합물의 제 2 일: 수집
<ol><li>면역성이 있는 복합물을 단백질 A Agarose 50% 슬러리의 50 µ L을 추가 하 고 회전 150 rpm으로 4 ° C에서 1 시간에 품 어.</li>
	<li>
4 ° c.에 100 x g 에서 1 분 동안 원심 분리 하 여 구슬을 펠 렛 증가 엄중의 버퍼와 구슬의 순차적 세척을 수행 합니다.
	<ol>
<li>첫째, 낮은 소금 워시 버퍼 (150 m m NaCl; 세척 Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2 밀리미터; 트리톤-X 1%; SDS 0.1%), 그 후에 높은 소금 워시 버퍼 (500 m m NaCl; Tris HCl pH 8, 20 밀리미터; EDTA 2mm, 트리톤 X1%; SDS 0.1%), 다음 LiCl 세척 (0.25 M LiCl; Tris HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 밀리미터; Igepal 1%; deoxicholate 1%), 그리고 마지막으로 1 x 테 (Tris HCl pH 8, 10 mM;와 EDTA)입니다.</li>
		<li>첫 번째 전송 낮은 소금 워시 버퍼의 500 µ L를 사용 하 여 열에 구슬 0.45 μ m PVDF 원심 필터 열 (자료 테이블)에 모든 세척을 수행 합니다. 2500 x g에서 3 분에 대 한 열에 구슬 작은 통해 흐름 무시 하 고 단계 2.2.1에에서 나열 된 모든 워시 버퍼에 대 한 1 시간을 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 완료 차입 버퍼 1 %SDS, 0.1 M NaHCO3의 300 µ L을 추가 하 여 면역 복합 elute) 열에서 수송과 구슬에. RT에서 400 rpm에서 통에 30 분 동안 품 어. eluate 신선한 튜브에 2500 x g 에서 3 분에 대 한 열 아래로 회전 하 여 수집 합니다.</li>
	<li>잠복기 eluate와 하룻밤 65 ° C에서 1.9 단계에서 수집 하는 입력으로는 crosslinks를 반대로.</li>
</ol>3. 주 3: 페 놀/클로 프롬 추출 된 DNA의 복구
<ol><li>페 놀: 클로 프롬: IAA, eluate 및 입력을 1: 1의 300 µ L를 추가 합니다. 10 소용돌이 s.</li>
	<li>21000 x g에서 15 분 동안 4 ° C에서 회전 합니다. 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 글 리 코겐, 3m 나트륨 아세테이트, 30 µ L 및 감기 100% 에탄올의 750 µ L의 3 µ L를 추가 합니다. 2 h-80 ° C에서 10 s. 저장소에 대 한 소용돌이.</li>
	<li>20 분 동안 4 ° C에서 21000 x g에서 스핀 다운, 펠 릿, 유지 하 고는 상쾌한 삭제. 워시 펠 릿 찬 70%의 1 mL EtOH, 다음 5 분에 4 ° C에서 21000 x g 에 아래로 회전은 상쾌한 삭제와 펠 릿을 건조.</li>
	<li>DNAse 무료 물 70 µ L에 펠 릿을 resuspend.</li>
	<li>정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)에 의해 특정 게놈 지역에 chromatin 인을 테스트 하기 위한 4 단계 또는 시퀀싱에 대 한 샘플을 준비 하는 5 단계를 진행 합니다.</li>
</ol>4. 정량 (Single/Multiple 유전자 해독)를 사용 하 여 칩의 분석
<ol><li>희석 단계 표준 참조 커브를 생성 하는 3.4에서에서 입력 DNA. 직렬 희석의 1/10, 1/100, 1/1000는 일반적으로 선형 범위를 캡처하는 데 충분 하지만 더 희석 집중된 샘플에 대 한 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>각 뇌관 쌍에 대 한 (여기, 우리는 NDUFV1 및 TOMM20 프로모터를 대상으로 하는 뇌관), 사용 정량 반응의 두 세트를 준비: 3.4 단계에서 immunoprecipitation에 의해 고립 된 DNA 샘플 단계 4.1, 및 두 번째에서 희석된 입력된 샘플을 사용 하 여 한. 3 중 각 반응을 수행 합니다. 참고: 반응 96-또는 384-잘 접시를 사용 하 여 여러 개의 유전자에 대 한 동시에 설정할 수 있습니다.</li>
	<li>2 x PCR 혼합 (자료 테이블)의 5 μ와 잘 당 10 μ의 반응 볼륨 설정, 뇌관의 1 μ (1 μ M 앞으로 뇌관 및 역방향 뇌관 1 μ M)을 혼합 하 고, 그리고 DNA 칩 (또는 입력된 컨트롤)에서 4 μ.</li>
	<li>짧게 접시 아래로 회전 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 반응에서 실시간 PCR 시 약 검색 (자료 테이블)에 대 한 제조 업체에서 권장 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 합니다. 여기 우리가 다음 조건 사용: 1) 1 개 주기; 95 ° C에서 1 2) 1 20 뒤에 s 95 ° C에서 45 주기; 60 ° C에서 s 3) 15 s 95 ° C에서 60 다음 s 60 ° C에서 15 다음 1 주기 동안 95 ° C에서 s. 참고: 분리 곡선 확인: 열 분리 음모에서 한 피크의 존재 제안 단일 amplicon PCR 반응에서 생성 됩니다. 하나 이상의 피크 시각 이다, 이것이 잠재적으로 나타내는 여러, 일반적인 amplicons; 어떤 경우에, 대체 뇌관 쌍의 디자인을 좋습니다.</li>
	<li>각 뇌관 단계 4.1에서에서 희석된 genomic DNA의 일련을 사용 하 여 표준 곡선을 계산 하 여 설정에 대 한 PCR 반응의 지 수 증폭의 선형 단계를 결정 합니다. Ct (사이클 임계값) 값에 따라.</li>
	<li>DNA 칩 및 입력된 제어에서의 Ct 값 선형 Ct 값 안에 있다면, DNA 칩 및 단계 4.1에서에서 입력된 컨트롤의 희석 비율에 따라 입력을 기준으로 DNA 칩에서의 농축을 계산 합니다.</li>
</ol>5. 높은 처리량 (게놈 넓은 판독) 시퀀싱에 대 한 칩에서 DNA의 증폭
참고: 이 단계 시퀀싱 기능 사용할 수 없을 때 사내 학술 핵심 시설 또는 상업적인 시퀀싱 회사 아웃소싱 될 수 있습니다.
<ol><li>적절 한 칩 라이브러리 준비와 추출 된 DNA에서 DNA 도서관을 준비 ( 재료의 표참조) 키트 제조업체의 지침에 따라.</li>
	<li>시퀀스 판독으로 50 bp 싱글-엔드를 사용 하는 높은 처리량 시퀀싱 시스템 라이브러리 ( 재료의 표참조). 참고: 지침에 따르면 칩 seq 인코딩6에 의해 제안, 포유류 게놈 10 백만 읽기의 최소 권장 합니다.</li>
</ol>6. 원시 데이터 분석
<ol><li>FastQC8를 사용 하 여 원시 연속 읽기에서 품질 관리를 수행 합니다. 참고: 일반적인 시퀀싱 품질 통계 기준 시퀀스 품질 당, 기본 시퀀스 콘텐츠 당, 시퀀스 GC 내용, 시퀀스 길이, 및 시퀀스 중복 수준 당 포함 됩니다. 일반적으로, 읽기 품질 평가 점수 Q의 > 30 각 기본 위치에 걸쳐 높은-품질 시퀀싱 결과 나타내는 것입니다. 모든 읽기에 걸쳐 GC 콘텐츠의 유통을 피크 종 실제 게놈 GC 컨텐츠 비율을 중심으로 정규 분포를 닮은 약 한다.</li>
	<li>모든 시퀀싱 어댑터 오염 및 낮은 품질 유틸리티 Trimmomatic9트리밍 읽기를 통해 읽기를 제거 합니다. 참고: 구현 된 기본 매개 변수 지정 플랫폼 종속 어댑터 제거, 선행 및 후행 낮은 품질 기지의 제거 및 손질 때 읽고 4 기반 넓은 슬라이딩 윈도우를 사용 하 여 지정된 된 임계값 아래 기본 상품 당 평균 품질.</li>
	<li>기본 매개 변수를 사용 하 여 Bowtie2 aligner11 마우스 MM10 참조 게놈10 처리 읽기를 맞춥니다.</li>
	<li>정렬 된 읽기 Bowtie2 매핑 품질에 그들을 제거 하 여 필터링 (MAPQ) 10 미만 Samtools12를 사용 하 여 점수.</li>
	<li>% 읽기 매핑된, 스트랜드 교차 상관, 누적 읽을 적용률과 샘플 재현성 복제와 같은 다양 한 후 맞춤 품질 통계를 확인 합니다. 참고: SPP13를 포함 한 다양 한 패키지, ChIPqc14및15 Deeptools 사용할 수 있습니다 이러한 품질 메트릭을 계산 하.</li>
	<li>피크 입력된 컨트롤 또는 기본 매개 변수가 있는 MAC 알고리즘 (MACS2)16 을 사용 하 여 적절 한 코 샘플 호출 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>Bedtools18를 사용 하 여 mm10 주석에서 알려진된 블랙 리스트 지역17 와 겹치는 모든 라는 봉우리를 제거 합니다. 참고: 블랙 리스트는 높은 신호 또는 읽기 수 독립적으로 세포 선 또는 시퀀싱 기법을가지고 표시 되었습니다 게놈에 있는 지역. 이 지역 기능 게놈 시퀀싱 실험에서 필터링 할 수 있는 게놈의 특정 지역에서 인위적으로 높은 유물 신호를 표시 합니다. 모든 복제는 파이프라인을 통해 개별적으로 처리 되어야 합니다 그리고 irreproducibility 검색 속도 (IDR)에 사용할 수 있습니다. IDR 리, 갈색, 황, 및 강사19,20에 의해 설명 된 대로 메서드를 통해 복제 사이 결과의 재현성을 측정 하기 위해 채택 된다. IDR 메서드는 양적 복제 사이의 일관성을 평가 하 고 그들의 칩 seq 지침의 일환으로 인코딩 및 modENCODE에 의해 권장 합니다.</li>
	<li>통계적으로 중요 한 봉우리를 사용 하 여 유전자 온톨로지21,22, 농축, 또는 주제 분석23등 다양 한 다운스트림 분석에 대 한.</li>
</ol>

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</ol>

여기에 설명 된 프로토콜 murine 조직, 갈색 지방 조직 최적화에서 칩을 수행 하기 위한 유용한 도구를 나타냅니다. 조직에서 수행 하는 칩에 큰 과제 중 하나는 샘플 준비 하는 동안 세포의 충분 한 수를 회복 됩니다. 박쥐는 정식 유리 유 봉 대신 스테인리스 구슬 크게 결합 조직 균질 화기 믹서 기를 사용 하 여 전단 파손 되지 않는 조직으로 인해 손실 된 세포의 수를 줄입니다. 또한, 소형 버퍼에서 직접 조직 조직 지질 다음 쉽게 분리 하 고 수 있는 고속 원심 분리를 통해 핵에서 제거의 릴리스를 수 있습니다.
적절 한 쥡니다 일관 되 고 재현 가능한 칩 분석 실험을 수행 하기 위한 중요 한 이기도 합니다. 물 목욕 울트라 sonicator 사용할 여러 샘플, chromatin 전단 및 샘플 교차 오염의 위험을 감소 시키기의 재현성 향상의 동시 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 쥡니다 온도 제어 시스템의 사용은 항 체 epitope 인식의 손실과 샘플 저하를...

반면 흰색 adipose 조직 (WAT)는 에너지 저장을 위해 전문화 된다, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 열 에너지를 통해 미토 콘 드리 아 연결을 푸는1탄수화물과 지질을 변환 하는 기능으로 인해 열 형태로 에너지 없어져 요. 이 특수 기능 때문에 박쥐 디포는 생리 적 조건에 찬 노출에 대 한 응답에 체온의 유지 보수를 위해 필요 합니다. 진 식 변화와 박쥐 차별화 동안 thermogenic 스트레스에 따라 vivo에서 그리고 생체 외에서 광범위 하 게 공부 되었다, 그러나 분자 메커니즘 기본이 변경 되었습니다 주로 불멸 하 게 세포에 해 부와 기본 vivo에서 몇몇 예외 사전 adipocytes,2,3,,45를 공부 한다.
Transcriptional 규칙을 통해 특정 유전자 식 프로그램의 조정된 변화 chromatin 구조를 통해 다양 한 녹음 방송 요인 및 공동 작업 요인에 의해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 DNA 이러한 요소의 채용 조사 및 프로 파일링 chromatin 풍경에 관련 된 변화에 대 한 귀중 한 분자 생물학 접근 이다. 칩 실험의 성공에 대 한 핵심 요인 가교 조건 및 적절 한 시작 물자 및, 특히, 항 체의 품질의 다른 예제를 통해 chromatin 전단 일관성의 최적화를 포함합니다. 전체 조직에서 칩을 수행할 때 그것은 또한 중요 한 고려 하는 샘플의이 고 핵 격리의 효율성을 개선 하기 위해 프로토콜 최적화, 후자와 되 고 특히 민감한 단계 때문에 지방 조직에서 작업할 때 상승 된 지질 내용입니다. 사실, 전체 지방 창 고에서 분자 격리 기술을 높은 수준의 트리 글리세라이드의 존재에 의해 복잡은 고 chromatin 격리의 양을 증가 시키는 프로토콜을 최적화 해야 합니다. 마지막으로, 높은 처리량 시퀀싱 칩-DNA 분리 후 수행 될 때 시퀀싱 깊이 봉우리는 자신 있게 검색의 수를 결정 하기 위한 중요 합니다.
여기, 우리 작업 표준 및 인코딩 및 modENCODE 컨소시엄6 모범 사례에 대 한 권장 하는 칩 seq 실험에 대 한 일반적인 지침을 참조 하 고 우리는 칩 seq 박쥐에서 최적화 된 프로토콜에 대 한 단계별 설명에 초점. 설명된 프로토콜 chromatin 지방 조직에서의 효율적인 절연에 대 한 더 확산 신호와 히스톤 부호 뿐만 아니라 잘 정의 된 봉우리 DNA 바인딩 요소에 대 한 게놈 넓은 시퀀싱을 수행 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>총알 블렌더 조직 균질화기&nbsp;</td><td>다음 어드밴스&nbsp;</td><td>BBX24</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 비즈 3.2 mm 직경</td><td>다음 Advence&nbsp;</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>Bioruptor Sonicator</td><td>Diagenode</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 튜브 TPX 플라스틱&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C30010010-5</td><td></td></tr><tr><td>완전한-프로테아제 억제제</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836145001</tr><tr><td>단백질 A 아가로스 슬러리&nbsp;</td><td>인비트로젠&nbsp;</td><td></td><td></td>101041</tr><tr><td>GPS2 항체</td><td>In house</td><td></td><td>Rabbit polyclonal, Ct 항체 (Cardamone et al., Mol Cell 2018)</td></tr><tr><td>Pol2 항체&nbsp;</td><td>Diagenode</td><td>C15100055</td><td></td></tr><tr><td>h3K9me3 항체</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>05-1242</td><td></td></tr><tr><td>Fast Syber Green Master Mix</td><td>Aplied Biosytem</td><td>4385612</td><td></td></tr><tr><td>ViiA7</td><td>Aplied Biosytem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TruSeq ChIP 라이브러리 준비 키트</td><td>Illumina&nbsp;</td><td>IP-202-1012</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2000&nbsp;</td><td>일루미나&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue

대부분 세포 프로세스는 특정 유전자 프로그램의 transcriptional 변조에 의해 통제 된다. 이러한 변조 다양 한 녹음 방송 요인 (TFs) 및 공동 인자 중재 transcriptional 활성화 또는 염색 질 구조에 변화를 통해 억압의 결합 된 행동을 통해 이루어집니다. Chromatin immunoprecipitation (칩)은 히스톤 수정 매핑 및 다른 하는 동안 발생 하는 동적 핵 변화의 스냅숏으로 제공 녹음 방송 요인/공동 인자 dna 바인딩 프로 파일링을 위한 유용한 분자 생물학 접근 생물 학적 프로세스입니다.
공부 하 고 지방 조직에 transcriptional 규칙, 체 외에서 세포 배양의에서 파생 된 샘플 불후 또는 1 차 셀 라인 시작 물자의 풍부 때문에 칩 분석 실험에 종종 선호 하 고 생물 다양성을 감소. 그러나, 이러한 모델 생명체에서 실제 chromatin 상태의 제한 된 스냅숏을 나타냅니다. 따라서, 동물 모델에서 파생 된 지방 조직 샘플에 칩을 수행 하기 위해 최적화 된 프로토콜에 대 한 중요 한 필요는.
여기 우리는 히스톤 수정 및 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 고립에 있는 비 히스톤 단백질의 효율적인 칩 seq에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 관심과 지방 저장소 사이 형태학 상으로 그리고 생리 적으로 뚜렷한 조직 박쥐에 epigenetic 마커 단백질의 게놈 넓은 지역화를 조사 하 고 최적화 되어 있습니다.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58682/58682fig1.jpg"> 그림 1: 정량 하 여 유효성 검사를 칩. 대표 GPS2의 칩 정량 분석 대상으로 H3K9 메 틸 화 및 GPS2 및 Pol2 바인딩 수준에서 상대적 변화를 보여주는 WT 및 GPS2-아카 호 쥐의 박쥐에 유전자 NDUFV1 (왼쪽)와 TOMM20 (오른쪽). 막대 그래프와 함께 3 복제의 표본 평균이 대표 * p &lt; 0.05와 * * p &lt; 0.01 계산 스튜던트 t-검정으로. 이 그림은 Cardamone에서 수정 외.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58682/58682fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 ...

여기는 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐)는 마우스에서 분리의 높은 처리량 DNA 연속 (칩 seq) 다음 효율적인 chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 프로토콜에 설명 합니다. 이 프로토콜은 히스톤 수정 매핑와 관심 비보의 비 히스톤 단백질의 게놈 넓은 지역화 조사에 적합 합니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

Most cellular processes are regulated by transcriptional modulation of specific gene programs. Such modulation is achieved through the combined actions of ...

마우스로부터 분리된 갈색 지질 조직에서 에스테르 와 비 에스테르 단백질의 효율적인 ChIP 시퀀싱을 수행하는 데 사용되는 미터. 이 기술의 주요 장점은 프로토콜이 지질 조직에서 크로마틴 관련 복합체의 효율적인 면역 침전을 위해 최적화되었다는 것입니다. 절개하기 전에 안락사 마우스를 70 %에탄올로 스프레이하십시오.마우스를 등을 위로 향하게 한 다음 목을 따라 절개를 합니다. 다음으로, 어깨 사이의 피부 바로 아래에 BAT를 배치하고 조심스럽게 백색 지방의 얇은 층을 제거합니다. 각 BAT 패드를 실온에서 150 RPM에서 15분 동안 1%포름알데히드를 함유한 PBS 10 밀리리터로 교차 연결합니다.15분 후 BAT에 2.5 개의 어어 글리신을 추가하여 교차 연결을 담금질하여 125 밀리머의 최종 농도를 생성합니다. 실온에서 150 RPM에서 회전, 5 분 동안 셰이커에 배치합니다. 그 후 BAT 패드를 저혈압 용해 버퍼 500 마이크로리터로 옮기고 각 BAT 패드에 두 개의 스테인레스 스틸 구슬을 추가합니다.그런 다음, 비드 계 조직 균질화제를 사용하여 조직을 분쇄한다. 최대 전력에서 5분으로 시작합니다. 필요한 경우 조직이 균질화되고 단일 세포가 분리 될 때까지 시간을 연장하십시오.샘플을 새로운 튜브로 옮기고 원심분리기는 16도, 000 G에서 10분 동안 섭씨 4도에서 전달합니다. 10분 후, 상체관을 새로운 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다. 16, 000 G에서 섭씨 4도에서 상피분리하여 부동 세포의 손실을 방지합니다.그런 다음 최종 상체를 버리고 SDS 용해 버퍼의 300 마이크로 리터에서 두 세포 펠릿을 1 회 프로테아제 억제제로 다시 중단하십시오. 10분 동안 얼음에 배양하세요. 다음으로, 리세이츠를 초음파 처리하여 DNA 단편을 200 내지 500개의 기본 쌍을 길게 생성한다.초음파 처리 후, 섭씨 4도에서 16, 000G에서 10 분 동안 원심 분리하여 파편을 제거하십시오. 면역 침전을 수행하기 위해 ChIP 입력으로 크로마틴 용액의 1 %를 제쳐두고 밤새 입력을 섭씨 4도에서 유지하십시오. 다음으로, ChIP 항체를 크롬틴 용액의 1밀리리터에 추가하고 동일한 종의 해당 전면역 IgG 또는 정상 IgG와 병행 면역 침전을 수행한다.또는 항체 제어가 없는 크로마틴 용액 1밀리리터를 저장하십시오. 회전과 섭씨 4도에서 하룻밤 을 배양. 면역 복합체를 수집하려면 면역 복합체에 50 마이

chromatin-immunoprecipitation-of-murine-brown-adipose-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

여기에 제시된 방법은 18 F-Fluorodeoxyglucose를 사용 (18 F-FDG) 양전자 방출 단층 촬영 / 전산화 단층 촬영 (PET-CT) 및 지방 물 분리 자기 공명 영상 (MRI), 각각 thermoneutral에 2 시간 노출 (24 ° C 다음 스캔 ) 및 성인 인간을 대상으로 갈색 지방 조직 (BAT)을지도하기 위해 추운 환경 (17 ° C).

인간의 갈색 지방 조직의 종점은 자동으로 양전자 방출 단층 촬영 / 전산화 단층 촬영 분단과 자기 공명 이미지 등록

우리는 cross-linked 마우스 골격근으로부터 고품질의 핵을 분리하기위한 여과 기반의 프로토콜을 제시했습니다. 우리는 초 원심 분리의 필요성을 제거하여 쉽게 적용 할 수있게했습니다. 우리는 핵에서 준비한 염색질이 염색질 면역 침전 및 염색질 면역 침전 시퀀싱 연구에 적합 함을 보여줍니다.

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

염색 질 chromatin immunoprecipitation 근육 섬유에 있는 유전자 규칙의 학문에 적응 하는 성인 마우스 골격 근육에서의 준비에 대 한 새로운 프로토콜 제공 됩니다.

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

본 간행물은 성숙한 지방세포로부터 핵의 분리, 형광 활성화 선별에 의한 정제, 및 단세포 수준 전사학에 대한 프로토콜을 설명합니다.

단세포 게놈 응용을 위한 지방 조직 핵의 격리

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

이 프로토콜은 스냅 냉동 조직의 염색질 준비에 중점을 두고 있으며 X-ChIP(Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation)에 이어 정량적 PCR 분석(X-ChIP-qPCR) 또는 차세대 시퀀싱 접근법(X-ChIP-seq)에 적합합니다.

염색질 면역침전 분석을 위한 냉동 키메라 간 조직에서 염색질 추출

이 연구는 유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 갈색 지방 세포를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다.

유전자 및 단백질 발현 분석을 위해 쥐 견갑골 갈색 지방 조직에서 갈색 지방 세포 분리

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

여기에서는 쥐 쇄골 상부 갈색 지방 조직의 조직학적 및 유전자 발현 분석을 해부하고 수행하기 위한 실용적인 절차를 제공합니다.

쥐 쇄골 상갈색 지방 조직의 해부, 조직학적 처리 및 유전자 발현 분석

Chromatin 바인딩 단백질의 순차적 소금 추출 큰 단백질 복합물의 바인딩 속성을 결정 하기 위한 유용한 도구입니다. 개별 하위 단위 또는 단백질 복잡 한 대량 chromatin의 전반적인 선호도에 도메인의 역할을 평가 하기 위해이 메서드를 사용할 수 있습니다.

바인딩 속성 수정 복합물 Chromatin의 대량 Chromatin의 분석에 대 한 순차적 소금 기사

배우세요 생쥐 갈색 지방 조직에서 효율적인 염색질 면역침전 시퀀싱(ChIP-seq) 방법을 통해 히스톤 변형 및 비히스톤 단백질의 단백질-DNA 상호작용을 연구하는 기법입니다.

Murine 갈색 지방이 많은 직물의 염색 질 Immunoprecipitation

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