Name: 전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 학습하세요 전체-마운트 면역염색을 활용한 3D 백색 지방 조직 구조 시각화 기법입니다. 이 방법은 지방세포 형태를 보존하고 공복 및 비만 등 대사 조건에서 세포 간 상호작용과 혈관 밀도 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

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이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 캐나다, 조종사 및 타당성 연구 그랜트 밴팅 최고의 당뇨병 센터 (BBDC), H.에 SickKids 시작 기금에서 교부 금에 의해 투자 되었다 미, 의료 연구 센터 프로그램 (2015R1A5A2009124)를 통해 국립 연구 재단의 한국 (NRF) 과학의 부, 정보 통신와 J R.K. 미래 계획

Phenogenomics (TCP) 동물 관리에 캐나다 위원회의 표준 준수에 대 한 모든 실험 동물 프로토콜 센터의 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다. 마우스 명암 주기 12 h에 유지 하 고 물과 음식에 대 한 무료 액세스와 함께 제공 했다. 7 달 오래 된 C57BL/6J 남성 쥐 전체 마운트 착 실험에 사용 되었다.
참고: 섹션 1 ~ 2 시간 순서 대로, 섹션 3 직후에 제 1 단계는 선택적 되 고 있습니다. 제 4 섹션 2 완료 후 체형 크기와 혈관 밀도 분석을 수행할 수 있습니다.
1. 재료 준비와 조직 분리
<ol><li>신선한 1 %paraformaldehyde (PFA) 조직 고정을 위한 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1에 희석을 준비 합니다. 0.3% 비 계면 활성 제 1 x PBS에 희석을 준비 (라 함 PBS-0.3T) 세척 단계 후속 조직에 대 한. 참고: 각 조직에 대 한 준비 1%의 약 1.5 mL PFA 완전 침수를 위해. 고정 볼륨 증가 또는 조직 크기에 따라 감소 될 수 있습니다. 주의:이 단계는 PFA는 부식성과 독성 유해. 착용 개인 보호 장비 (예: 니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 신발, 보안 경) 그리고 증기 두건에서 핸들.</li>
	<li>(예를 들면, 자 궁 경관 탈 구 또는 이산화탄소 질 식) 승인 된 절차에 따라 동물 안락사 지체 없이, 원하는 지방 조직 창 고 (예를 들어, 사 타 구니 백색 지방 조직 또는 perigonadal 백색 지방이 많은 직물)18를 해 부.</li>
	<li>해 부가 위 잘라 조직 100 x 15 m m2 페 트리 접시에 조각 약 0.5-1 ㎝ 크기, 그리고 1% 가득 microcentrifuge 튜브에서 그들을 담가 PFA. 얼음에 계속.</li>
</ol>2. 전체 산 백색 지방이 많은 직물의 얼룩
<ol><li>해 부 완료 되 면 1%에서 조직 샘플을 이동 PFA 얼음에서 룸 온도 (RT) 1 h를 다음 빨리 세척에 대 한 12 또는 24 잘 셀 문화 접시에 조직을 전송.</li>
	<li>PBS 가진 조직 세척-0.3T, 5 분 속도으로 분 당 20-25 젖 힌 채 22 °, 기우 하는 통에 RT에서 각각에 대 한 3 번. 참고: 뿌리의 사용을 포함 하는 모든 후속 단계에 대 한이 기울기 및 속도 사용 합니다. 참고: 다 색 기자 마우스 선 산/mG 및 추가 사용 하는 경우 항 체 염색 법은 필요 하지 않습니다, 조직 현미경 검사 법에 대 한 준비 단계 2.2.</li>
	<li>0.5-1 추가 mL 차단 버퍼 (PBS에 희석 5% 동물 혈 청-0.3T). 셰이 커에 접시를 넣고 실시간 1 시간에 대 한 품 어</li>
	<li>차단 솔루션 발음 및 추가 PBS에 희석 하는 주 항 체-1% 동물 혈 청으로 0.3T.</li>
	<li>장소 접시 4 ° C에서 통에 하룻밤.</li>
	<li>다음 날 씻어 PBS 가진 조직-5에 대 한 3 번 0.3T 실시간에 각 분</li>
	<li>PBS에 희석 적절 한 2 차 항 체를 사용 하 여-0.3T. 0.5-1 추가 mL 이차 항 체 솔루션을 각 영역. 접시 알루미늄 호 일에 포장 하 고 실시간에 1 시간 동안 통에 품 어 참고: photobleaching를 방지 하기 위해 어둠 속에서 이차 항 체 희석.</li>
	<li>이차 항 체 외피 후 PBS로 세척-실시간에서 각각 5 분 동안 두 번 0.3T 이미지 샘플 중립 지질 얼룩이 적절 하지. 지질 작은 물방울의 경우 5 분 두 번, (비 이온 계면 활성 제) 없이 1 x PBS로 세척 얼룩 중립 지질을 사용 하 여 필요.</li>
	<li>세척 단계 후 1:1500 희석 요인이 실시간에서 30 분 1 x PBS에 희석 중립 지질 얼룩으로 품 어 조직은 현미경 검사 법에 대 한 준비가 지금입니다. 미래의 영상에 대 한 조직 4 ° C에이 솔루션에 저장할 수 있습니다. 참고:; 시간이 지남에 감소 품질 이미징 따라서, 이미지에 대 한 최고의 시간 1 또는 2 일 이내입니다.</li>
	<li>집게를 사용 하 여 조직 24 x 60 m m ² 유리 coverslip에 평면을 거꾸로 공초점 레이저 현미경 시스템에서 그것을 배치.</li>
	<li>DAPI와 핵의 얼룩을 원하는 경우 DAPI 완전히 조직 잠수함 건조에서 그것을 방지를 포함 하는 설치 매체의 1-2 방울을 추가 합니다.</li>
	<li>전체-마운트 얼룩진 조직에서 여러 개의 초점 비행기의 이미지를, μ m 4-6 단계-원하는 확대 크기와 깊이에 Z-100-150 μ m의 더미를 수행 합니다.</li>
</ol>3. 조직 개간 및 Immunolabeling를 사용 하 여 iDISCO +
참고:이 프로토콜은 이전에 게시 절차9,,1019에 기반.
<ol><li>고정 및 메탄올 전처리<ol>
<li>4 %PFA 하룻밤 2 mL microcentrifuge 튜브에에서 4 ° C에서 1 x PBS에 희석에 티슈를 품 어. 참고: 영상까지 모든 다음 치료에 대 한 2 mL 튜브에 조직의 떠나.</li>
		<li>다음 날, 1 시간 각 실시간에 셰이 커에 대 한 1 x PBS에 조직 세 번 씻어 참고:이 단계 RT 또는 4 ° C에서 하룻밤 샘플을 두고 일시 중지 지점 수 있습니다.</li>
		<li>그 후, 1 시간에 대 한 20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올, RT에서 조직을 탈수. 1 시간 동안 실시간에 100% 메탄올에서 디하이드레이션 다음 신선한 100% 메탄올을 조직 전송 및 1 h 4 C에서 품 어. 참고: 증류수에 메탄올을 희석. 메탄올 인큐베이션 기간 동안은 조직 샘플 몰입으로 샘플 통에 넣어 필요가 없습니다. 주의:이 단계는 메탄올은 독성 유해. 그것은 오픈 불길에 따라 가연성입니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리. 메탄올 점화 그리고 가연성 안전 캐비닛에 저장 합니다.</li>
		<li>밤새 4 ° c.에 5%의 과산화 수소 (H2O2; 1 볼륨 30% H2O2 100% 메탄올의 5 권에서 희석)와 조직 표 백제 주의: 과산화 수소 30%는 피부와 눈 접촉 시 매우 위험. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리.</li>
		<li>그 후, 1 시간 동안 80%, 60%, 40% 및 20% 메탄올 및 1 x PBS에 RT에서 조직을 rehydrate.</li>
		<li>0.2% 비 계면 활성 제 1 h 각 실시간에 셰이 커에 대 한 두 번, 1 x PBS에 희석으로 씻</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunolabeling 참고: 각 단계에서 immunolabeling 시작, 개간이 완료 될 때까지 조직을 산화를 방지 하는 데 사용 하는 솔루션으로 튜브의 상단에 조직을 포함 하는 2 mL 튜브를 작성.<ol>
<li>2 일 동안 1 x PBS, 0.2% 비 계면 활성 제, 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 및 incubated 탁상 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 0.3 M 글리신의 솔루션에 그들을 배양 하 여 조직 permeabilize. 참고: 37 ° C permeabilization 단계에 대 한 최대 부 화 기간은 2 일입니다.</li>
		<li>2 일에 대 한 PBS, 0.2% 비 계면 활성 제, 10 %DMSO, 5% 당나귀 혈 청, 그리고 1 %Fc 블록 incubated 탁상 궤도 셰이 커에 37 ° C에서 x 1의 해결책에 있는 직물을 차단 합니다. 참고: 블로킹 단계에 대 한 최대 부 화 시간은 2 일 이다.</li>
		<li>1 x PBS, 0.2% 폴 20, 솔루션의 1 차 항 체에 조직 품 어 10 µ g/mL 헤 파 린, 5 %DMSO, 그리고 4 일 동안 incubated 탁상 궤도 통에 37 ° C에서 5% 당나귀 혈 청.</li>
		<li>1 x PBS, 0.2% 폴 20, 10 µ g/mL 덤플링을 RT 5 번, 각각 1 h에서 통에 씻어. 참고:이 단계 실시간에 샘플을 하룻밤 두고 일시 중지 지점 수 있습니다.</li>
		<li>1 x PBS, 0.2% 폴 20의 해결책에 있는 이차 항 체 조직 품 어 10 µ g/mL 헤 파 린, 그리고 4 일 탁상 궤도 통에 37 ° C에서 5% 당나귀 혈 청. 참고: 3.2.5 단계에서 모든 샘플 이차 항 체의 photobleaching를 방지 하기 위해 알루미늄 호 일 포장을 해야 합니다.</li>
		<li>2 h에 대 한 PBS, 0.2% 폴 20, 및 RT에 통에 10 µ g/mL 헤 파 린 x 1의 솔루션에는 조직 5 번을 씻어. 참고:이 단계 샘플 실시간 하룻밤 두고 일시 중지 지점 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>조직 흰색 adipose 조직 및 볼륨 이미지는<ol>
<li>20%, 40%, 60% 및 80% 메탄올에서 그 후, 각 실시간에서 1 시간 동안 배양 하 여 2 mL 튜브에 포함 된 조직 탈수 그런 다음 두 번 실시간에 100% 메탄올에서 샘플을 탈수 참고:이 단계 실시간 하룻밤에 100% 메탄올에 당신의 샘플을 두고 일시 중지 지점 수 있습니다.</li>
		<li>통에 RT에서 3 h에 대 한 메탄올의 1 볼륨을 2 양의 DCM의 혼합 조직 품 어. 참고: DCM은 휘발성 이다. 튜브는 증발을 방지 하기 위해 단단히 밀폐 된 다는 것을 확인 하십시오. 주의:이 단계는 위험. DCM은 흡입 시 독성. 장기간된 노출 화학 화상 발생 수 있습니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 실험실 외 투, 신발, 안전 고글)을 착용. 사용 하 여 증기 두건.</li>
		<li>알을 품고 100 %DCM 조직 두 번, 각 실시간에 통에 15 분</li>
		<li>100%에서 품 어 실시간 영상까지 및 샘플 저장에 DBE. 이미징, 전에 반전 튜브 여러 번 솔루션을 혼합. 참고:은 DBE 지우기 실패 조직 귀 착될 수 있다 산화를 방지 하기 위해 튜브를 완전히 채워. DBE 인큐베이션 기간 동안 튜브를 흔들 하지 마십시오. 주의:이 단계는 위험. DBE 독성이 있다. 그것은 눈과 피부에 자극을 일으킬 수 있습니다. 개인 보호 장비 (예를 들어, 니트 릴 장갑, 랩 코트, 안전 고글)을 착용 하 고 증기 두건에서 처리.</li>
		<li>유기 용 매 DBE의 굴절률과 일치 하는 가벼운 현미경으로 전체 조직 샘플을 이미지. 원하는 확대와 단계-크기는 전체 조직에 대 한 Z 스태킹를 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 전체 산에서 데이터 분석의 예로 스테인드 ImageJ를 사용 하 여 조직 이미지
참고: 다운로드 및 설치 지침을 보려면 https://imageJ.nih.gov/ij/download.html를 참조 하십시오.
<ol><li>혈관 밀도 (보 그림 2)의 정량화<ol>
<li>ImageJ에 혈관 immunostaining와 채널에만 저장 된 이미지를 가져옵니다. 참고: 정량화에 대 한 이미지는 착 절차 및 이미지 수집 상태 일관 되어야 합니다. 동일한 시 약을 사용 해야 합니다. 노출 시간, 강도, 그리고 확대 되어야 이미징 과정20에 해당 합니다.</li>
		<li>혈관 밀도 정량화에 대 한 흑백 이미지 색 변환. 이렇게 하려면, "이미지" 탭에서 "조정" 명령을 다음 "색상 임계값" 옵션을 선택 합니다. "임계값 색" 디스플레이 상자에서 "어두운 배경"20 을 선택 하 고 "" b 조 & 승"" 아래 "임계값" 컬러 ""을선택 합니다.</li>
		<li>배경 혈관 신호의 면적의 비율을 측정, "분석" 탭, "분석 입자" 명령을 다음을 선택 합니다. "분석 입자"의 표시에서 "취소 결과" 및 "요약" 옵션을 선택 합니다. "확인"을클릭 합니다.</li>
		<li>복사 및 분석에 대 한 스프레드시트에 요약 탭 아래 비율 영역의 값을 붙여 넣습니다. 영역 비율 혈관 밀도를 나타냅니다. 각 개별 이미지에 대 한 4.3.1–4.3.4 단계를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>체형 크기21 (보 그림 3)의 정량화<ol>
<li>ImageJ에 adipocytes의 저장 된 이미지를 가져옵니다.</li>
		<li>이미지의 규모를 설정 하려면 직선 선택 도구를 사용 하 여 이미지에 알려진 거리 규모에 선 추적 하 여 픽셀 단위로 규모의 길이 측정 합니다. "분석" 탭에서 "비율 설정" 명령을 선택 합니다. 하기 전에 추적 했다 선의 거리 자동으로 픽셀 단위로 계산 됩니다.</li>
		<li>"설정 규모" 표시 상자에 표시 됩니다. 알려진된 거리 및 길이 단위를 입력 합니다. "Global" 축척 모든 가져온된 이미지에 대 한 설정을 적용 하 고 "확인"을클릭 합니다를 선택 합니다.</li>
		<li>선택 영역 측정, "분석" 탭에서의 방법으로 "측정 설정" 명령을 선택 합니다. 측정을 위한 다양 한 옵션의 목록이 표시 됩니다. "영역" 옵션을 선택 하 고 "확인"을클릭 합니다.</li>
		<li>자유형 선택 도구를 사용 하 여 관심의 각 체형의 경계를 추적 합니다. "분석" 탭에서 "측정 (Ctrl + M)" 명령을 선택 하 고는 체형의 영역 표시 됩니다. 다른 adipocytes 이미지에 대해이 절차를 반복 합니다. 참고: 정확한 측정을 위해, 정량화에 대 한 여러 개의 이미지를 사용 합니다.</li>
		<li>복사 하 고 추가 데이터 분석에 대 한 스프레드시트에 붙여 지역 측정.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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저자는 공개 없다.

조직학 및 cryosection 같은 기존의 기술을 세포내 구조를 관찰에 대 한 혜택을 제공, 지방 조직 연구, 세포의 3 차원 시각화를 가능 하 게 다른 관점을 제공 합니다 전체 마운트 얼룩 최소한 처리 조직의 아키텍처입니다.
성공적으로 전체 마운트 얼룩을 수행 하기 위해 다음 제안 사항은 고려 사항으로 취해야 한다. 다른 지방 조직 창 고 수 결과가 다양 한 immunostaining; 따라서, 지방 조직 창 고 사용의 종류를 먼저 결정 한다. 예를 들어, 갈색 지방이 많은 직물 (박쥐) 때문에 작은, multilocular adipocytes21흰색 adipose 조직 (WAT) 상대 밀도 이다. 박쥐의이 증가 밀도 조직을 통해 침투 항 체에 대 한 어려운 있습니다. 또한, 지방이 많은 직물의 크기는 또한 적절 한 항 체 얼룩이 지기에 대 한 긴급 때문에 너무 큰/두꺼운 조직 부족 한 항 체 침투에 또한 발생할 수 있습니다. 따라서...

지방 조직 에너지 저장에 대 한 필수적인 장기 이며 동적 개장 및 거의 무제한 확장1특징 이다. 에너지 항상성, 지방 조직 또한 담당 한다 필수적인 역할 50 adipokines2전체 신체 신진 대사 기능 조절 하는 호르몬 분 비에. 지방 조직 성숙 adipocytes, 섬유 아 세포, 내 피 세포, 면역 세포, 및 체형 조상 세포3를 포함 하 여 다양 한 세포 유형의 다양 한 아키텍처 구성 하고있다. 최근 연구는 비만 다른 대사 장애 크게 변경할 수 지방 조직 기능 및 그것의 microenvironment, 포함 하지만 adipocytes, 염증 세포의 침투의 확대에 국한 되지 않습니다 (예: 대 식 세포), 및 관 역 기능3.
조직학, cryosectioning 등 기존의 형태학 기법 설명 조직 수축 및 구조 왜곡3로 이어질 수 있는 긴 화학 처리 단계와 같은 많은 생물학을 공부 하 고 몇 가지 제한 4. 또한, 이러한 2D 기술을 얻은 섹션은 전체 조직을3의 작은 지역에 한정 된 다른 세포 유형에 의해 발휘 된 세포 상호 작용을 관찰 충분 하지 않습니다. 기존에 비해 형광 이미징 방법, 전체 마운트 얼룩 단계가 필요 없습니다 추가 침략, 등 포함, 단면, 탈수; 따라서,이 항 체 특이성을 감소의 문제를 방지 합니다. 이와 같이, 체형 형태 및 전반적인 지방 조직 구조5의 더 나은 보존 이미징 지방 조직에 대 한 간단 하 고 효율적인 방법입니다. 따라서, 전체 마운트 얼룩으로 신속 하 고 저렴 한 immunolabeling 기법 지방 조직 3D 아키텍처1,6,,78을 유지 하기 위해 설립 되었다.
그러나, 전체 마운트 얼룩의 사용과 지방이 많은 직물 형태학의 보존에도 불구 하 고이 기술은 조직의 지질 표면 아래 내부 구조 시각화 수 아니다. 몇몇 최근 연구9,10 조직 지방 조직 내에서 포괄적인 3D 시각화 수 있도록 전체 마운트 immunolabeling1,6 와 결합 하는 기법을 삭제를 설립 했다. 특히, 조밀한 신경 및 맥 관 구조 네트워크 최근 연구9,10,,1112 3D 볼륨 영상과 시각화 했다. 실제로, 다른 생리 적인 조건 하에서 지방 조직의 신경 및 혈관 소성을 공부 하 고 그것의 생물학을 공부 필수적 이다. 솔벤트 허가 기관 (iDISCO +) 조직 비운의 3-차원 영상 Immunolabeling 사용은 비운의 유기 화학 시 약 dichloromethane (DCM와 불투명 함 조직 그리고 메탄올 전처리, immunolabeling의 구성 과정 )와 dibenzyl 에테르 (DBE)13,14. 지방 조직을 투명 하 게 함으로써, 혈관과 신경 섬유 등 조직 내의 해부학의 더 정확한 표현9,10얻을 수 있습니다. IDISCO + 장점이 그것은 다양 한 항 체와 형광 기자11,14, 그리고 여러 장기와 심지어 embryoes14에서 성공을 보여주었다. 그러나, 그것의 주요 제한은 있는 18 ~ 20 일 전체 실험을 완료 하는 데 필요한 긴 보육 시간입니다.
전체 산 얼룩의 또 다른 중요 한 응용 프로그램 계보 추적 시스템와 함께에서 셀 운명의 시각화 이다. 계보 추적 모든 딸 세포에 전달 될 수 있다 고15시간 이상 보존 하는 셀에는 특정 유전자/마커 라벨입니다. 따라서, 셀의 자손15의 운명을 결정 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구입니다. 1990 년대 이후, Cre LoxP 재조합 시스템 생활의 혈통 추적에 대 한 강력한 접근 되고있다 유기 체15. Cre, DNA recombinase 효소를 표현 하는 마우스 선을 loxP-정지-loxP 시퀀스에 인접 한 기자를 표현 하는 다른 마우스 라인 넘은, 기자 단백질 표현된15입니다.
전체-마운트 얼룩에 대 한 형광 색 기자 들의 사용은 세포내 활동 체형16의 최소한의 간섭에 대 한 허용 하기 때문에 지방이 많은 직물의 이미징 적합 합니다. 그러나, 전통적인 기자는 일반적으로 제한 된 세포질 콘텐츠17흰색 adipocytes의 계보를 추적 하 고 어려운 세포질, 얼룩. 이 문제를 해결 하려면 막 도약 형광 tdTomato/막 eGFP (mT/mG) 기자 마커를 사용 하 여 이상적인 도구입니다. 막-타겟 tdTomato Cre 음수가 셀18로 표시 됩니다. Cre 절단 시 막 대상 eGFP 식 스위치,이 기자 체형 창시자17,18 (보충 그림 1)의 계보를 추적에 대 한 적당 한 만드는 발생 합니다.
이 문서의 목적은 전체 마운트 얼룩에 대 한 상세한 프로토콜을 제공 하 고 결합 하 수 다른 기술을 개발 및 지방이 많은 직물의 생리학을 공부 하는 방법을 보여 것입니다. 이 프로토콜에서 설명 하는 응용 프로그램의 두 가지 예는 1) 멀티 컬러 기자 마우스 라인 adipocytes 2) 조직 흰색 adipose 조직 (WAT)에 신경 arborization 추가 시각화를 비운의 다양 한 출처를 식별 하는 사용.

<table><tbody><tr><td>LipidTox</td><td>Life Technologies</td><td>H34477</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1 1차 항체</td><td>Millipore</td><td>MAB1398Z(CH)</td><td></td></tr><tr><td>TH(티로신 하이드록실라제) 1차 항체</td><td>Millipore</td><td>AB152, AB1542</td><td></td></tr><tr><td>DAPI 염색</td><td>BD Pharmingen</td><td>564907</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R 컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>초분석기 I</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td>Light sheet 이미지 형광 현미경</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 2차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td></td><td>파장 488, 594 및 647 사용</td></tr><tr><td>정제 쥐 안티 마우스 CD16/CD32</td><td>BioSciences</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>디클로로메탄</td><td>시그마-알드리치</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>디벤질-에테르</td><td>시그마-알드리치</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>메탄올</td><td>피셔 케미컬</td><td>A452-1</td><td></td></tr><tr><td>30% 과산화수소</td><td>BIO BASIC CANADA INC</td><td>HC4060</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>J7126</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>렉틴 키트 I, 플루오레세인 labeled</td><td>VECTOR LABORATORIES</td><td>FLK-2100</td><td></td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA497GA</td><td></td></tr><tr>DAPI <td>Vector Laboratories</td><td>H-1500</td><td></td>파라포름알데히드(PFA)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충액 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>트윈이 있는 하드 세트 장착 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>동물 혈청 (염소, 당나귀)</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3d 백색 지방 조직 구조의 시각화

Visualization of 3D White Adipose Tissue Structure Using Whole-mount Staining

지방이 많은 직물은 높은 소성으로 중요 한 변화 기관 이다 이며 환경 자극 및 영양 상태에 반응. 따라서, 다양 한 기법 형태학 및 지방이 많은 직물의 생물학 연구 개발 되었습니다. 그러나, 기존의 시각화 방법을 공부 전체 기관의 3D 아키텍처를 캡처를 2D의 섹션에서 조직으로 제한 됩니다. 여기에 우리가 전체-마운트 현재 얼룩, 최소한의 처리 단계를 그대로 지방 조직 형태를 유지 하는 immunohistochemistry 메서드. 따라서, adipocytes 및 다른 세포 구성 성분의 구조는 조직의 가장 대표적인 3D 시각화를 달성 하는 왜곡 없이 유지 됩니다. 또한, 전체 마운트 얼룩 세포 운명 결정을 결정 하는 계보 추적 방법 결합할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 지방이 많은 직물의 더 깊은 부분에 관한 정확한 정보를 제공 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 이 한계를 극복 하기 위해 전체 산 얼룩이 지 수 추가와 결합 될 조직 기법 조직의 불투명 함 제거 하 고 빛-시트 형광 현미경을 사용 하 여 전체 지방 조직 해부학의 완전 한 시각화에 대 한 허용을 삭제. 따라서, 더 높은 해상도 지방 조직 구조의 더 정확한 표현을 이러한 기술의 조합으로 캡처할 수 있습니다.

지방이 많은 직물의 취약성 때문 방법 여러 처리 단계를 포함 하 고 단면 지방 조직 형태3 (그림 1A)의 외관을 손상 될 수 있습니다. 그러나, 전체 마운트 얼룩 adipocytes, 결과 (그림 1B)의 정확한 해석을 보장의 형태를 보존할 수 있습니다.
지방 조직의 과잉 고정 정착 액을 이용한 autofluorescence 이끌어 낸다. 그림 2A같이 녹색과 적색 채널 티로신 hydroxylase (TH)와 PECAM-1 신호, 얼룩 각각, 그 autofluorescence PFA에 3 일 이상 고정으로 인해 발생 한 수 있습니다 나타내는 조직의 동일한 지역에 중복. 그림 2B 전체 실장 일 얼룩에 대 한 신호 PECAM-...

현재 연구의 초점은 지방 조직 아키텍처와 세포 구성의 3D 영상에 대 한 이상적인 방법으로 전체-마운트 immunostaining 및 시각화 기법을 설명 하.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

Adipose tissue is an important metabolic organ with high plasticity and is responsive to environmental stimuli and nutrient status. As such, various ...

이 방법은 세포 간 상호 작용과 지방 조직 생리학이 금식과 비만과 같은 다른 신진 대사 조건에 어떻게 변화하는지와 같은 지방 생물학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 원래 지방 3D 구조를 최적으로 보존하고 통상적인 면역 조직 화학에 일반적으로 필요한 긴 처리 단계를 피한다는 것입니다. 이 방법은 지방 조직의 구조에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 뇌를 염색 하는 전체 마운트에 의해 신경계와 같은 다른 장기 시스템에도 적용 될 수 있습니다.일반적으로, 이 방법에 새로운 개인 속성 조직 사이트를 얻기에 어려움 때문에 투쟁 할 것 이다, 적절 한 고정 기간을 찾는, 그리고 최적의 항체 농도. 해부가 완료된 후, 1시간 동안 얼음에서 실온으로 1%파라포름알데히드에 티슈 샘플을 함유한 접시를 옮는다. 그런 다음 조직을 12 또는 24웰 세포 배양 판으로 이송하여 더 빠른 세척을 합니다.전체 마운트 염색 절차는 해부 직후에 시작해야 하며 각 단계 사이에 일시 중지 점이 없다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. PBS-0.3T로 티슈를 22도기울어실온에서 분당 20~25°C의 속도로 5분간 세척합니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.그 후, 5%의 동물 혈청을 포함하는 블로킹 버퍼의 약 0.5~1밀리리터를 추가합니다. 이전 조건을 사용하여 셰이커에 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 차단 용액을 흡습하고 PBS-0.3T에서 희석된 1차 항체의 밀리리터를 각각 1%의 동물 혈청으로 첨가한다.22도의 기울기와 분당 20 ~25 기울기의 속도로 4 섭씨에서 셰이커에 밤새 접시를 배양. 다음 날 PBS-0.3T를 사용하여 실온에서 5 분 동안 조직을 씻으실 수 있습니다. 이 세척을 두 번 더 반복합니다.그런 다음, 각각의 우물에 적절하고 희석된 이차 항체 솔루션의 0.5 와 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 감싸고 실온에서 셰이커에 1시간 동안 배양합니다. 그 후 실온에서 PBS-0.3T로 플레이트를 2회 세척하여 세척당 5분간 세척합니다.중성 지질 얼룩 중에 액체 방울의 시각화가 필요한 경우, 5 분 동안 지속 각 세척1x PBS로 두 번 세척하십시오. PBS에서 희석된 중성 지질 얼룩을 추가하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 이미징을 시작하려면 집게를 사용하여 조직을 24 x 60mm 유리 커버 슬립에 평평하게 놓습니다.DAPI로 염색하는 핵이 바람직한 경우, 조직을 완전히 침수하고 건조를 방지하기 위해 DAPI를 포함하는 마운팅 매체의 1 ~ 2 방울을 추가합니다. 그런 다음 슬라이드를 반전된 공초점 레이저 현미경 시스템에 배치합니다. 여러 초점 평면에서 전체 마운트 스테인드 조직의 이미지를 얻으려면 원하는 배율에서 4 ~ 6 마이크로 미터의 단계 크기로 깊이 100 내지 150 마이크로미터의 Z 스택을 수행하십시오.이 연구에서는, 전체 탈염 염색은 지방 조직 아키텍처를 보존하기 위하여 이용됩니다. 다중 처리 단계와 단면화를 수반하는 방법과 달리, 이는 지방 조직 형태의 손상으로 이어질 수 있으며, 전체 마운트 염색 방법은 결과를 해석할 때 정확성을 보장하면서 지방 세포의 형태를 보존할 수 있습니다. 지방 조직의 과고착은 고정 유도 형광으로 이어지며, 이는 여기에서 볼 수 있는 티로신 하이드록실라제 및 PECAM-1 신호와 같은 동일한 영역을 겹쳐서 표시될 수 있다.제대로 고정, 전체 마운트 얼룩 샘플, 그러나, 별도의 별개의 신호를 표시, 이러한 신호가 자가 형광이 아니라는 것을 나타내는. 이미징 전체 마운트 스테인드 지방 조직은 다른 실험 조건하에서 형태학적 변화의 정량화를 허용합니다. 특히, 지방 조직은 에너지 레벨의 급격한 변화에 따라 대사 의 항상성을 중재하는 데 중요한 혈관이 높게 조직된다.예를 들어, 24시간의 금식을 겪는 C57 블랙 6J 마우스는 lipolysis를 나타내는 상당히 작은 홍포세포 크기를 표시하고, 지속적으로 공급되는 마우스와 비교할 때 혈관 밀도가 상승하는 추세를 나타낸다. iDISCO+로 지방 조직을 지우면 지방 조직이 광학적으로 투명해질 수 있습니다. 조직 정리를 통해 간 지방 조직의 면역 라벨링은 동일한 배율에서 조직 클리어링없이 전체 마운트 염색에서 관찰된 것에 비해 훨씬 조밀한 신경 절기를 나타낸다.이 절차를 시도하는 동안 PFA의 실온에서 1 시간 이상 샘플을 과대화하지 않는 것이 중요합니다. 그러나 샘플이 섭씨 4도로 고정되면 이 고정 기간이 연장될 수 있습니다. 이 절차에 따라 ImageJ를 이용한 정량화와 같은 다른 방법은 형포 부위 및 혈관 밀도와 같은 세포 구조가 다양한 생리적 조건에 대한 응답으로 변화하는 방법과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행 될 수 있습니다.

visualization-3d-white-adipose-tissue-structure-using-whole-mount

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

큰 조직 내에서 형광 표지된 세포의 고해상도 이미지를 얻으려면 이상적으로는 생물학적 샘플을 절편 없이 이미지화해야 합니다. 3DISCO는 유기 용매를 사용한 순차적 배양을 기반으로 하는 간단한 조직 세척 절차입니다. 투명화되면 장기가 투명해져 표본의 종단 간 레이저 스캔이 가능합니다.

영상은 3DISCO에 의해 세포 수준에서 본래대로 생물학적 시스템을 해제

이 프로토콜은 MRI와 전체 심장 심근 조직의 3 차원 비교를위한 새로운 방법을 설명합니다. 이는 심근 경색의 만성 돼지 모델의 경색 경계 영역에서 심근 내 주입의 정확한 평가를 위해 설계되었습니다.

3D 전체 심장 심근 조직 분석

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

높은 지질 콘텐츠로 인해 지방 조직 전통적인 조직학 방법을 사용 하 여 시각화를 도전 하고있다. Adipo 분명 강력한 라벨 및 지방이 많은 직물의 고해상도 체적 형광 이미징 기술을 삭제 하는 조직 이다. 여기, 샘플 준비, 전처리, 얼룩, 지우기, 및 이미징에 대 한 설치 방법을 설명 합니다.

Adipo-지우기: 조직 지방 조직의 3 차원 이미징 방법 삭제

새로운 혈관 형성 및 동 정적인 신경 분포 개장 하는 지방 조직에서 중추적인 역할을 재생합니다. 그러나, 시각화 및 양적 측정 지방 조직에 기술적인 문제가 남아 있다. 여기 우리는 성공적으로 레이블 및 양적 혈관과 다른 adipose 조직에 신경 섬유의 밀도 비교 하는 프로토콜을 제시.

혈관과 신경 섬유 지방 조직에서 공동 얼룩

여기서, 우리는 형광 화상 진찰에 의하여 혈관, 핵, 면역 세포, 뉴런 및 지질 물방울 외투 단백질을 시각화하기 위하여 마커의 조합을 사용하여 마우스와 인간 백색 지방 조직의 3D 구조를 해결하는 간단하고 저렴하고 빠른 청산 방법을 기술합니다.

메틸살리실레이트 클리어링 및 3D 이미징에 의한 지방 조직 구조 탐구

마이크로 PET/MR 이미징 기반 접근법을 사용하여 마우스에서 열원성 지방 창고의 기능적 이미징 및 정량화.

[18F]FDG 마이크로 PET/MR 이미징을 사용한 마우스의 갈색 및 베이지 지방 조직의 시각화 및 정량화

건강한 근육 조직을 근육 내 지방으로 대체하는 것은 인간의 질병과 상태의 두드러진 특징입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방을 시각화, 이미지 및 정량화하는 방법을 간략하게 설명하여 근육 내 지방 형성의 기초가되는 메커니즘에 대한 엄격한 연구를 가능하게합니다.

근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

학습하세요 전체-마운트 면역염색을 활용한 3D 백색 지방 조직 구조 시각화 기법입니다. 이 방법은 지방세포 형태를 보존하고 공복 및 비만 등 대사 조건에서 세포 간 상호작용과 혈관 밀도 변화를 연구하는 데 활용됩니다.

전체-마운트 얼룩을 사용 하 여 3D 백색 지방 조직 구조의 시각화

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