Name: 인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 배우세요 인간 기본 섬유아세포를 RNA 기반 방법으로 유도 만능 줄기세포로 재프로그래밍하는 고효율 기술을. pH 조절과 microRNA를 활용하여 통합 유전자 없이 고품질 iPSC를 생성하는 방법을 익히세요.

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우리는 건강의 국가 학회 (T32AR007411-33)와 콜로라도 대학 피부 질병 연구 핵심 센터 (P30AR057212)에서 지원 자금에 대 한 감사. 우리는 또한 선 피 (EB) 연구 협력, EB 의료 연구 재단, 치료 EB 자선, Dystrophic 선 피 연구 협회 (데 브라) 국제, 킹 보두앵의 Vlinderkindje 기금, 재단과 게이츠 감사 프론티어 기금입니다.

<ol><li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Mouse+Embryonic+and+Adult+Fibroblast+Cultures+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li>
<li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2015).</li>
<li>Hacein-Bey-Abina, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LMO2-Associated+Clonal+T+Cell+Proliferation+in+Two+Patients+after+Gene+Therapy+for+SCID-X1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1.</a> Science. 302 (5644), 415-419 (2003).</li>
<li>Warren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).</li>
<li>Judson, R. L., Babiarz, J. E., Venere, M., Blelloch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-specific+microRNAs+promote+induced+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-specific microRNAs promote induced pluripotency.</a> Nature Biotechnology. 27 (5), 459-461 (2009).</li>
<li>Anokye-Danso, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+miRNA-mediated+reprogramming+of+mouse+and+human+somatic+cells+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient miRNA-mediated reprogramming of mouse and human somatic cells to pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 8 (4), 376-388 (2011).</li>
<li>Kogut, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+RNA-based+reprogramming+of+human+primary+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-efficiency RNA-based reprogramming of human primary fibroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hirai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radical+acceleration+of+nuclear+reprogramming+by+chromatin+remodeling+with+the+transactivation+domain+of+MyoD%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Radical acceleration of nuclear reprogramming by chromatin remodeling with the transactivation domain of MyoD.</a> Stem Cells. 29 (9), 1349-1361 (2011).</li>
<li>Mandal, P. K., Rossi, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+human+fibroblasts+to+pluripotency+using+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Reprogramming human fibroblasts to pluripotency using modified mRNA.</a> Nature Protocols. 8 (3), 568-582 (2013).</li>
<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).</li>
</ol>

I.K.와 G.B.는 공동 발명가 "방법 및 구성에 대 한 프로그래밍 세포", PCT 출원 번호를 받을 수 있는 특허 출원에 PCT/US2016/063258입니다.

이 프로토콜 Ipsc는 매우 높은 효율로 일반 및 질병 관련 인간의 섬유 아 세포 라인의 프로그래밍에 대 한 수 임상 관련, 비 통합, RNA 기반 방법을 설명 합니다. 날짜 하려면, 모든 인간의 섬유 아 세포 선 우리 설명 프로토콜 프로그램을 시도 했습니다 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 높은-품질 Ipsc의 만족 수를 굴복 했다. 결과 Ipsc 즉시 전송 하 고 지류 무료 문화 조건에 확장 수 있습니다.
프로그래밍에 대 한 섬유 아 세포의 품질:
프로그래밍 성공 하는 것은 시작 하는 섬유 아 세포의 품질에 크게 의존입니다. 이상적으로, 프로그래밍 최고의 효율을 달성 하기 위해 사용할 수 있는 가장 낮은 통행 fibroblasts와 함께 시작 되어야 합니다. 효율을 프로그래밍 하는 것은 통로 2-4의 섬유 아 세포와 가장 좋습니다. 프로그래밍 사용할 수 있습니다 여전히 높은 통로 (통로 5-8), 심지어 노화 섬유 아 세포, 효율을 감소와 함께 쓰 신. 때로는 낮은 통로 섬유 아 세포는 사용할 수 없습니다 또는 환자 샘플 건강 한 성장을 방지 하는 유전 돌연변이. 이 경우에, 초기 도금 밀도의 최적화가 필요할 수 있습니다. 손상 된 섬유 아 세포 라인의 프로그래밍 하는 것은 일반적으로 RNA transfections 동안 증가 세포 죽음 연관 된다. 그 결과, 잘 프로그래밍에 셀 프로그래밍 10-14 일 스파스 될 나타납니다. 또한 대형 acellular 지역에는 잘 표시 되지 것입니다. 이 경우 재활 프로토콜 수 섬유 아 세포의 더 높은 초기 시작 번호를 다시 시작 해야 합니다. 형식 6-잘 접시의 당 3000 입력된 셀 도금 가장 성인 섬유 아 세포 라인에 대 한 일관 되 게 작동 합니다. 그러나, 5000-10000 (노화 라인에 대 한 50000) 도금 수 우리의 이전 게시8에서 보고 된 질병 관련 된 샘플의 프로그래밍을 개선 하기 위해 도움이 됩니다. 반대로, 세포 confluency를 너무 일찍 도달 프로그래밍에 저항력이 될 수 있습니다. 경우 셀 RNAs를 프로그래밍으로 transfections를 받고 너무 급속 하 게 확산 (로 때때로 주 신생아 섬유 아 세포의 경우), 형식 6-잘 접시8의 당 500 fibroblasts와 프로그래밍 시작.
Transfection 버퍼의 처리:
Transfection 버퍼 (8.2의 pH를 조정 하는 감소-혈 청 매체)의 pH 프로토콜 프로그래밍이 필요한 최적의 transfection 효율을 달성 하는 최고 이다. 이러한 이유로, transfection 버퍼의 처리에 관한 몇 가지 예방 조치는 것이 좋습니다. 우리는 대기 공기에도 짧은 노출 transfection 버퍼의 버퍼의 pH에 영향을 발견 했다. 따라서, transfection 버퍼 (우리는 5 또는 15 mL 나사 모자 원뿔 관 사용) 최소한의 공기 공간 스크류 캡 용기에 aliquoted 이어야 한다. 추가 공기 노출 최소화, 2 개의 transfections의 최대 각 transfection 버퍼 aliquot을 사용 합니다. 마지막으로, 온도 영향 pH, 이후 transfection 버퍼 transfection 단지의 어셈블리에 대 한 rt equilibrated은 중요 하다. 37 ° c transfection 버퍼 따뜻한 하지 하는 것이 좋습니다.
Ipsc의 뿌리고.
많은 이전 프로토콜 추천 개별 iPSC 식민지 프로그래밍의 끝을 따기에 출판, 그러나이 프로그래밍의 효율성은 매우 높은 또는 식민지 클러스터 함께 있는 경우로 하는 경우를 달성 하기 어려울 수 있습니다 우리의 프로토콜입니다. 따라서, iPSC 식민지 서로 가까이에 있다면, 먼저 뿌리고 셀 수동으로 식민지를 따기 전에 재설정된 Ipsc 밖으로 확산 하는 것이 좋습니다. 이 이른 통행 단계를 수행 하는 것 몇 가지 이점이 있다. 식민지에 밖으로 퍼지는 그들이 제공 성장, 더 많은 공간에 원래 잘 달성 될 수 있었다 그렇지 않으면 보다 따기에 대 한 훨씬 더 큰 식민지를 양보 합니다. 이 크게 고른된 클론에서 iPSC 라인에서 성공률을 향상 시킵니다. 우리는 또한 섬유 아 세포와 함께 추가 문화 시간 희석된 비율에도 불구 하 고 나타나는 고른된 iPSC 식민지의 평균 품질을 개선 하기 위해 찾으십시오. 불완전 하 게 재설정된 fibroblasts 지원 paracrine 요소는 Ipsc를 설정 하 고 셀 피더-무료 문화 조건으로 직접 전환을 쉽게 도움을 계속 제공할 수 있습니다. 섬유 아 세포는 우연히 Ipsc mTeSR1에서 경작 하는 경우에 비해 선택적 성장 단점이 있다. 따라서, 오염 fibroblast 세포 인구는 3-4 구절 내에서 무시할 수 수량을 신속 하 게 희석 된다.
Y-27632 등 록 억제제 인간의 Ipsc의 일상적인 문화에 자주 사용 됩니다. 우리는 자주 또는 확장 문화 Y-27632와 일부 iPSC 라인의 전반적인 품질에 해로운 효력이 있을 수 있다을 발견 했다. 덩어리 뿌리고 메서드를 사용 하 여 같은 EDTA와 Y-27632 않습니다 분한 후 iPSC 생존 능력을 유지 하는 데 필요한. 우리 완전히 모든 iPSC 격리, 확장, 또는 일상적인 문화에 대 한 Y-27632와 보충 미디어를 제거 했습니다.
프로토콜 제한 사항:
설명된 RNA 기반 재활 접근 한 제한은 초기 비용과 복잡성 재활 시 약의 준비와 관련 된입니다. 시 약은 모든 루틴 및 이전 되었습니다 mRNA를 생성 하는 준비 절차 설명 (PCR, 녹음 방송 생체 외에서 DNase 치료, 상한, dephosphorylation, 정화), 누적 mRNA 시 약의 생산은 상대적으로 길고 특수 과정입니다. 이 프로토콜을 다른 주요 도전 transfect 세포 마다 48 h, 재활 프로토콜의 노동 강도 증가 하는 필요 이다. 이러한 고려 사항 몇 환자 샘플의 프로그래밍은 원하는 경우 금지 있을 수 있습니다. 그러나, 1 차 배려 임상 관련 Ipsc 또는 매우 높은 재활 효율 달성의 세대 이면 설명된 RNA 기반 재활 접근 이상적입니다.
요약, 설명된 고효율 RNA 기반 재활 방법 우리의 이전 게시8에 설명 된 대로 재설정 체세포 형식의 최적화 transfection 효율에 경첩. 이 연구에서 제시 하는 RNA transfection 프로토콜 인간의 기본 fibroblasts에 대 한 높은 조정 하지만 잠재적으로 다양 한 체세포의 재활 효율 향상을 위해 다른 셀 형식에 맞게 수 있습니다.

유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)로 체세포를 재프로그래밍 pluripotency1,2를 유지 하는 중요 한 녹음 방송 요인의 핵심 집합의 확장된 식이 필요 합니다. Ipsc 임상 응용 프로그램에 대 한 생산 때 처리 하는 동안 입력된 셀에 mutational 부담 최소화 및 iPSC 생성의 효율성은 환자 샘플에서 상대적으로 높은 수준에서 유지에 필수적 이다. 그러나, 프로그래밍 통합 무료 프로토콜을 포함 하 여 방법의 대부분은 매우 낮은 재활 효율성, 이러한 제한 임상 유용성 있는 접근3에서 겪고 있다. 낮은 재활 효율 또한 기존 돌연변이, 결과 Ipsc mutational 부담 증가 운반 하는 세포의 선택적 프로그래밍 홍보 수 있습니다. 또한, 모든 DNA 기반 재활, 같은 방법을 lentivirus 및 episomal 기반 접근, DNA 수 있습니다 무작위로 게놈으로 통합 하 고 유해한 insertional mutagenesis와 원치 않는 (에 대 한 기회를 만드는 안전 관심사에서 고통 다운스트림 조직 파생 상품4pluripotency 유전자의 잠재적으로 종양) 식입니다.
유망한 접근 pluripotency 체세포에서의 효율적인 유도 달성 하 고 결과 Ipsc mutational 부담을 줄이기 위해 합성 출장된 메신저 RNAs를 사용 하는 nucleobases (수정 된 mRNAs)5프로그래밍에 대 한 수정 포함. 수정 된 mRNA 기반 재활 접근의 효율성은 배아 줄기 세포 (ESC)를 추가 하 여 더 강화 될 수 있다-특정 microRNAs (miRNAs)-367/302s3체세포와 함께 프로그램을 표시 되었습니다 증가 효율6 ,7. 그러나, miRNAs-367/302s의 추가 함께 수정된 mRNA 기반 재활 접근은 종종 갓 격리 환자 세포3응용 프로그램 중 실패합니다. 이 수정 된 mRNA 기반 방식의 주소 불일치, 하 우리는 최근 보고 pluripotency 높은 성공률과 함께 인간의 기본 fibroblasts에 유도 하 고 인코딩 두 수정 된 mRNAs를 활용 하는 최적화 된, 통합 무료 전략 프로그래밍 요소와 성숙한 미르-367/3028을모방 합니다. 우리의 방법에 칵테일 재활 수정된 mRNA OCT4 MyoD transactivation 도메인 (M3O 라는)9 와 다른 5 개 재활 요인 (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, 및 NANOG) 융합의 수정된 된 버전을 포함 합니다. 미르와 pluripotency 요인 인코딩 수정된 mRNA 결합 모방 프로그래밍이 프로토콜의 효율성에 시너지 효과가 나타났다. RNA transfection 처방의 추가 최적화 셀 시드, 그리고 자란 조건 했다 또한 초고 레벨8에 접근의 재활 효율성을 증가 하는 데 필요한.
다른 많은 프로토콜 달리 재활 접근에만 몇 천 입력된 fibroblasts를 일반적으로 필요합니다. 또한, 많은 일반적인 비 통합 전략 episomal 플라스 미드를 사용 하 여, 센다이 바이러스, 또는 각자 복제 RNA 포함 광범위 한 재활 벡터 생성된 Ipsc에 희석을 뿌리고. 반대로, 수정 된 mRNA와 성숙한 미르 모방 짧은 반감기를가지고 빠르게 셀에서 제거 됩니다. 함께 찍은 환자 샘플 및 사용 가능한 Ipsc의 세대 수집 사이 누적 셀 문화 시간이이 접근, 효과적으로 결과 Ipsc 돌연변이 축적을 제한 하 고 비용 효율성 개선에서 최소 이다.
여기, 우리는 Ipsc 우리의 조합 수정된 mRNA/miRNA 기반 접근8를 사용 하 여에 성인 인간 섬유 아 세포의 재프로그래밍 하는 높은 효율을 달성 하기 위해 자세한 단계별 프로토콜을 제시. 이 RNA 기반 재활 프로토콜 연구와 잠재적인 임상 응용 프로그램에 대 한 통합 무료 Ipsc를 생성 하기 위한 비용 효율적인, 간단 하 고 강력한 방법을 제공 한다. 또한, 그것은 세, 그리고 노화 섬유 아 세포 등 어려운-하-재, 질병 관련 된 섬유 아 세포 라인의 다양 한의 프로그래밍에 적용 됩니다. 인간 섬유 아 세포를 재 프로그램에 대 한 프로토콜의 회로도 그림 1에 표시 됩니다. 프로토콜은 특별히 인간 성인 기본 섬유 아 세포 형식 6-잘 접시에서의 3 개의 우물을 프로그래밍 하는 방법을 설명 합니다. 두 웰 스는 일반적으로 높은-품질 iPSC 식민지의 충분 한 수 양보. 많은 경우에, 단 하나 잘 필요한 이며 세 번째 잘 프로그래밍 효율 분석에 사용할 수 있습니다. 필요한 경우에 우물의 수 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Plasmid templates for PCR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_KLF4</td><td>Addgene</td><td>26815</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_SOX2</td><td>Addgene</td><td>26817</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_c-MYC</td><td>Addgene</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_LIN28A</td><td>Addgene</td><td>26819</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hM3O</td><td>Addgene</td><td>112638</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hNANOG</td><td>Addgene</td><td>112639</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_mWasabi</td><td>Addgene</td><td>112640</td><td></td></tr><tr><td>Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG</td><td></td></tr><tr><td>Reverse Primer (울트라머, 4nmol 스케일로 주문)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA</td><td></td></tr><tr><td>(ARCA Cap) 3&acute;-0-Me-m7G(5')ppp(5')G&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>Pfu Ultra II 핫스타트 2x 마스터 믹스</td><td>애질런트</td><td>600850-51</td><td></td></tr><tr><td>5-메틸시티딘-5'-트리포스페이</td>트 <td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1014</td><td></td></tr><tr><td>남극 포스파타제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7 전사 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Pseudouridine-5'-Triphosphate</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>Riboguard RNase 억제제</td><td>Lucigen</td><td>RG90910K</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & 농축기</td><td>ZymoResearch</td><td>R1019</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000684</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000715</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000717</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000718</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-367-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000719</td><td></td></tr><tr><td>Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)</td><td>Fisher</td><td>AM9937</td><td>변형된 mRNA와 miRNA를 희석하는 데 사용</td></tr><tr><td>Fibroblast culture and reprogramming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1% 젤라틴 H2O</td><td>StemCell 기술</td><td>#07903</td><td></td></tr><tr><td>Stericup-GV 멸균 진공 여과 시스템</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGVU05RE</td> DPBS 2-Mercaptoethanol ThermoFisher Scientific 21985023 6-well plates(조직 배양 처리)<td>에서 트랜스펙션 완충액 및 0.5mM EDTA를 멸균하는 데 사용</td></tr> <tr><td></td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Fetal Bovine <td></td></tr><tr><td> Serum</td><td>Fisher</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>FGF Basic</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>phg0263</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>매체 준비에 사용되는 글루타민 보충제</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Gibco Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut 혈청 교체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX 트랜스펙션 시약</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778500</td><td>이 프로토콜은 Lipofectamine RNAiMax 트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11095080</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td>에 최적화되어 있습니다.<td></td><td>31985070 Reduced serum medium, pH를 8.2, 500 mL</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985062</td><td>Reduced serum medium으로 조정하여 transfection buffer를 만드는 데 사용, pH를 8.2, 100 mL</td></tr><tr><td>10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td>로 조정하여 transfection buffer를 만드는 데 사용 <td>뉴클레아제가 없는 물에 희석하여 1 M 용액을 만들고 pH 조정</td></tr><tr><td>에 사용물 (뉴클레아제 없음, DEPC 처리되지 않음)</td><td>Fisher</td><td>AM9932&nbsp;</td><td>NaOH를 희석하고 pH 측정기를 세척하는 데 사용합니다.</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Fungizone</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>100 &micro의 농도로 공급; g/mL, 재프로그래밍 절차를 위한 매트릭스로 사용</td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>2520056</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Virus B18R (CF)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34-8185-86</td><td></td></tr><tr><td>iPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>코닝 마트리겔 hESC 인증 매트릭스</td><td>코닝</td><td>354277</td><td>iPSC 배양을 위한 ECM(Extracellular matrix</td></tr><tr><td>) EDTA, 0.5 M 원액</td><td>K& D 메디컬&nbsp;</td><td>RGF-3130</td>은 <td>DPBS에서 0.5mM로 희석하고 필터 살균 및 iPSC 계면 살균</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>만능 줄기 세포(PSC) 배지에 사용, 섬유아세포에 비해 iPSC에 성장 이점을 제공합니다</td></tr><tr><td>항체 및 검출</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti Mouse (HRP conjugated)</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-60 (마우스 anti 인간)</td><td>스템젠</td>트 <td>09-0010</td><td></td></tr><tr><td>과산화수소 (30%)</td><td>LabChem</td><td>LC154301</td> PBS 소 혈청 알부민 (BSA)<td>으로 3%로 희석</td></tr><tr><td></td><td>Fisher</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 살린 (PBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.02</td><td>10x로 제공, 1x</td></tr><tr><td>VECTOR NovaRED Peroxidase Substrate Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>Special Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Description</td><td></td><td></td><td>Notes</td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 가습 조직 배양 인큐베이터</td><td></td><td></td><td>디지털 미터, fyrite 또는 이와 동등한 것을 사용하여 CO2 를 보정합니다. 인큐베이터를 5% CO2, 37 &deg;C로 평형 조정합니다.</td></tr><tr><td>Tri-gas moistified tissue culture incubator</td><td></td><td></td><td>디지털 미터, fyrite 또는 이와 동등한 것을 사용하여 CO2 를 보정합니다. 인큐베이터를 5% CO2, 5% O2, 37 &deg;C. 리프로그래밍 절차에 사용합니다.</td></tr><tr><td>pH 측정기는</td><td></td><td></td><td>소수점 이하 두 자리까지의 분해능을 가져야 합니다. 가능하면 RNA 작업을 지정하십시오.</td></tr><tr><td>도립 현미경(Inverted microscope</td><td></td><td></td>) <td>transfection 효율을 모니터링하기 위해 EGFP를 시각화하도록 구성된 현미경.</td></tr></tbody></table>

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 rna 기반

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)는 인간 개발과 질병을 공부 하는 유용한 도구가 될을 입증 했다. Ipsc를 재생으로 치료를 진행 하 고 더 안전 하 고, 강력한, 및 편법 재활 프로토콜 필요 합니다. 여기, 선물이 Ipsc 비 통합 방식을 사용 하 여에 인간 피부 섬유 아 세포의 매우 높은 효율 프로그래밍에 대 한 임상 관련, 단계별 프로토콜. 프로토콜의 핵심 표현 pluripotency 요인의 구성 (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4 MyoD 퓨전) 생체 외에서 베낀된 메신저 RNAs를 합성에서 뉴클레오티드 (수정 된 mRNAs) 수정. 재활 수정된 mRNAs는 2 주 동안 기본 fibroblasts 성숙한 배아 줄기 세포 관련 예측에 관한-367/302 모방 함께 모든 48 h에 페. 결과 iPSC 식민지 수 있습니다 다음 격리 되며 직접 급지대 무료 조건에서 확장. 섬유 샘플을 효율성과 우리의 재활 프로토콜의 일관성을 최대화 하려면 우리 RNA transfection 처방을 포함 한 다양 한 매개 변수를 최적화 transfections, 문화 조건 및 시드 밀도의 타이밍. 중요 한 것은, 우리의 메서드는 원본의 대부분 섬유, 어려운 재 병, 세, 또는 노화 샘플을 포함 하 여 높은-품질 Ipsc를 생성 합니다.

그것은 일반적으로 섬유 Ipsc (그림 1)의 첫 번째 튜브의 동결을 프로그래밍의 개시에서 약 5-6 주 걸립니다. 재활 프로토콜은 일반적으로 두 단계로 분류할 수 있습니다. 단계 1 구와 문화를 포함 하 고 7 transfections, 칵테일 재활 RNA와 모든 48 h. 단계 2 수행 포함 절연, 확장, 및 iPSC 식민지의.
프로토콜을 시작 하기 전에 좋은 품질의 재설정을 섬유 아 세포는 보장 되어야 합니다. 스핀 들-모양, 바이 폴라, 건강 fibroblasts 나타납니다 그리고 대략 24 h의 2 배 시간 refractile. 하루 0, 하루-2에 10 cm 그릇에 도금 하는 250000 셀 40-60 %confluency (그림 1, 0)에 성장 하 고 약 6-10 105 셀 x 항복 한다. 느린 속도로 증식 하는 세포-2 당일 및 하루 0 프로그래밍에 더 높은 밀도에서 도금에 의해 보상 될 수 있습니다.
섬유 아 세포의 프로그래밍에 대 한 6-잘 형식 요리에 매우 스파스 다음 도금 나타납니다 (그림 2, 1 일). 24 시간 첫 번째 transfection fibroblasts 스핀 들 모양을 잃게 되며 프로그래밍의 나머지를 통해 유지 되는 더 둥근된 형태 (그림 2, 주 2)을 채택. MWasabi에서 녹색 형광 mRNA 최소한 하루에 2 관찰할 수 고 꾸준히 하루에 4에 의해 명확 하 게 표시 되도록 밝기 증가 해야 합니다. MWasabi 형광을 감지 하는 능력 범위 민감도 설정에 달려 있습니다. 셀 밀도 점차적으로 그리고 지속적으로 증가 (일 1-6), 처음 세 개의 transfections에 걸쳐 확산 일 7과 8 사이 발생에 명백한 버스트와 함께. 셀 (그림 2, 10 일째) 10 일에 의해 크게 confluent 나타납니다. 첫 번째 iPSC 식민지 하루 11 (그림 2, 하루 11); 일찍 나타날 수 있습니다. 그러나, 식민지 하루 18 늦게까지 관찰을 않을 수 있습니다. 일반적으로, 15-18 일 있을 것입니다 명확 하 게 다른 주변, 불완전 하 게 재설정된 섬유 아 세포는 크고 분명 iPSC 식민지 (하루 15,그림 2, 그림 3, 17 일). Pluripotency 마커 TRA-1-60에 대 한 Immunostaining (그림 3, 하루 17, TRA-1-60) 재활 효율성을 평가 하기 위해 수행할 수 있습니다. 우리의 경험에서는, 대부분의 섬유 라인은 잘 재설정 수백 당 식민지 항복 (그림 3, 삽입 B).
차선의 도금 밀도 우리의 프로토콜 프로그래밍의 감소 효율성에 대 한 가장 일반적인 이유 이며, 질병, 노화, 및 높은 통과 하는 섬유 아 세포와 자주 관련입니다. 밀도 도금 하는 것이 너무 낮은 경우 큰 acellular 불모의 패치 (그림 4C), 프로그래밍의 끝에 있을 것입니다 그리고 iPSC 식민지 (그림 4D)를 형성 하지 않을 수 있습니다. 하루 14 매우 confluent 재설정된 셀 해야 한다 ( 그림 4A 와 4B 그림 2, 비교 주 14). 마찬가지로, 세포는 밀도가 너무 도금 또는 너무 빨리 증식, 프로그래밍 효율은 극적으로 감소.
환자 파생 Ipsc의 동질성을 유지 하려면 그것은 하나의 식민지에서 셀 라인을 확장 하는 것이 중요입니다. 효율을 프로그래밍 하는 것이 우리의 프로토콜에 매우 높은 때문에 가까운 근접에서 형성 하 고 각 다른 (그림 3, 15-17 일)으로 성장 수 있습니다 이웃 iPSC 식민지. 이 때로는 어렵게 기계적으로 클론 확장에 대 한 단일 식민지를 분리 합니다. 우리는 그것이 첫 번째 통로 재설정 잘 및 더 큰 문화의 영역에 걸쳐 희석 하는 데 도움이 나타났습니다. 좋은 통행 비율 전체 6 잘 플레이트에서 잘 재설정된 6 잘 포맷 접시를 균등 하 게 분할 이루어져 있다.
희석 통로 따라 Ipsc 식민지로 성장 하 고 섬유 아 세포 (그림 5, 하루 18)에서 쉽게 구별할 수 있습니다. 처음, iPSC 식민지는 느슨하게 포장 될 수 있습니다, 그리고 개별 세포는 비교적 큰 세포질 영역. 4-7 일 동안는 Ipsc 격 증 하 고 정의 된 가장자리와 특성 단단히 포장 식민지를 형성 한다. 식민지 내에서 개별 셀 (그림 5, 하루 22) 저명한 nucleoli는 큰 핵 부분이 있다. 많은 식민지에 각 잘 형성 해야 하 고 고전적인 iPSC 형태 들만 확장에 대 한 선택 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig1.jpg"> 그림 1 : 프로그래밍으로 인간의 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc). 인간 섬유 아 세포의 프로그래밍에 대 한 도식 프로토콜 제공 됩니다. 섬유 아 세포는 먼저 7 transfections 48 h 간격으로 수행 하 여 다음 형식 6-잘 접시의 우물에 낮은 밀도에서 passaged. 보통은 각 transfection 후 대체 16-20 h. 재설정된 Ipsc는 약 하루에 18, 그리고 클론 식민지에 passaged 처음 하루 26에 의해 선택 됩니다. 일반적으로, 섬유 아 세포 파생 iPSC 라인 장기 보관을 위해 하루 38 동결 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig2.jpg"> 그림 2 : 프로그래밍의 각 하루 동안 대표 매일 이미지. 섬유 아 세포는 프로그래밍을 시작 하는 통행의 때에 약 40-60% 합칠 이어야 한다 (0, 세포는 10 cm 접시에 도금). 하루에 1, 첫 번째 transfection (T1) 발생 하 고 셀이 시점에서 매우 희박 나타납니다. 다음 날 (2 일), 더 둥근된 형태는 명백한 될 것입니다. 셀 빠르면 하루 11 (빨간색에서 동그라미)에 표시 하기 시작 하는 iPSC 클러스터와 프로토콜을 통해 밀도 증가 나갈 것입니다. 하루 15, iPSC 식민지 신중 경계와 큰 있을 것입니다. 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig3.jpg"> 그림 3 : 식민지 형성 프로그래밍으로 transfections를 다음 수정 mRNAs와 미르 모방. 낮은 확대 이미지 대표 일 15-17에 프로그래밍의 촬영 했다. 최종 transfection 다음 재설정된 Ipsc는 크기에서 확장 하 고 불완전 하 게 재설정된 주변 fibroblasts에 명확 하 게 구별 될 응축 하는 정의 된 경계와 명확한 식민지를 형성할 것 이다. Pluripotency 마커 TRA-1-60에 대 한 Immunostaining Ipsc (인세트 A)의 존재를 표시 하 고 단일 잘 (녹색에서 동그라미 수 식민지의 인세트 B, 예) 내 모든 식민지를 계산 하 여 효율성을 프로그래밍의 계산에 사용할 수 있습니다. 눈금 막대 = 1 m m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig4.jpg"> 그림 4 : 프로그래밍에 대 한 최적의 도금 밀도의 대표 이미지. (A, B) 프로그래밍의 14 일까 너무 스파스는 섬유 아 세포의 예 ( 그림 2, 비교 주 14). (C) 낮은 확대 이미지 큰, 불모의 패치 프로그래밍의 하루 17에 빨간색으로 동그라미. (D) 같은 잘 고정 되었고 TRA-1-60 전반적인 가난한 것인지에 대 한 스테인드 프로그래밍 효율 낮은 세포 밀도 때문. 스케일 바 = 200 µ m (A, B), 그리고 1 m m (C, D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig5.jpg"> 그림 5 : 초기 통과 후 Ipsc의 대표 이미지. 프로그래밍 수정된 mRNAs와 미르 모방, 재설정된 세포와 transfections를 완료 한 후 17-20 일에 의해 passaged 있습니다. Ipsc는 PSC 매체에 성장 이점이 있고 불완전 하 게 재설정 했다 어떤 섬유 아 세포를 빠르게 추월. 처음, Ipsc는 가난 하 게 정의 된 경계와 느슨한 나타날 수 있는 식민지를 형성할 것 이다. 몇 일 이내 셀 빠르게 증식 하 고 높은 핵-세포질 비율, 단단히 가지 테두리와 식민지로 클러스터링 단단히 포장된 셀의 특성 형태에 걸릴. 눈금 막대 = 200 µ m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기 우리 재활 요인 인코딩 수정된 mRNAs를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포로 인간의 기본 섬유 아 세포를 재 설 정할 임상 관련, 높은 효율, 피더 무료 메서드를 설명 하 고 성숙한 예측에 관한-367/302 모방. 또한는 재활 효율성을 평가 하는 방법 클론 iPSC 식민지 확장 및 pluripotency 마커 TRA-1-60의 식을 확인 있습니다.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

높은 효율로 인해, 이 방법은 인간 질병을 연구하고 새로운 줄기 세포 치료를 개발하기위한 도구로 유도 된 만능 줄기 세포 또는 IPSC를 더 발전 시킬 수 있습니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 재프로그래밍하기 어려운 질병, 관련 질병, 노인 및 노화 섬유아세포를 포함하여 1 차적인 인간 섬유아세포로부터 고품질 통합 무료 IPSC를 생성하는 기능입니다. 이 방법의 성공은 섬유 아세포의 최적의 RNA 형질 효율에 달려 있습니다.그리고 형질 전환 버퍼의 pH를 조정하는 것은 이를 달성하기 위한 핵심 절차이다. 시작하려면 500 밀리리터와 100 밀리리터 실온을 사용하여 신선한 감소 혈청 매체의 병을 사용하여 트랜스페션 버퍼를 준비하십시오. pH 미터의 유리 전극을 완충제에 삽입하여 500 밀리리터 병에서 배지의 기본 pH를 측정하고 pH를 읽기 전에 최대 1분 정도 기다립니다.pH를 조정하려면 수산화 나트륨 1개 중 3~4밀리리터를 500밀리리터 병에 넣습니다. 병을 닫고 잘 섞습니다. 5분 간 기다린 후 병을 열고 pH 미터의 전극을 버퍼에 삽입합니다.pH 미터의 판독값이 안정될 때까지 기다립니다. pH가 8.15에서 8.17에 도달할 때까지 소량의 수산화 나트륨을 계속 추가하여 공정 중에 pH 미터를 여러 번 보정합니다. 0.22 마이크로미터 진공 여과 시스템을 사용하여 전환 버퍼를 필터링합니다.최소한의 공기 공간을 가진 5개의 밀리리터 튜브에 멸균 된 버퍼를 알리쿼트합니다. 다시 프로그래밍할 섬유아세포가 40%에서 60%의 인플루엔자에 있는지 확인합니다. DPBS의 4밀리리터를 15밀리리터 원뿔튜브로 옮기고, 재조합 인간 라미닌 521의 마이크로리터 100을 추가합니다.위아래로 파이프를 통해 완전히 섞으세요. 희석 된 재조합 인간 라미닌 521의 우물 당 1 밀리리터를 6 개의 우물의 세 개의 우물에 넣습니다. 이 코팅 된 접시를 섭씨 37도에서 2 시간 동안 배양하십시오.이 잠복기 동안, 섬유 아세포 팽창 매체의 따뜻한 6 밀리리터와 37섭씨에 중간 도금 매체의 4 밀리리터. 밀리리터당 200 나노그램의 최종 농도에서 밀리리터당 100 나노그램과 B18R의 최종 농도에서 기본 FGF로 도금 매체를 보완하십시오. 조심스럽게 40 %에서 60 %의 합류에있는 섬유 아세포에서 소비 된 매체를 흡인.DPBS의 5 밀리리터로 세포를 헹구는 다. 트립신 EDTA의 3 밀리 리터를 추가하고 부드럽게 트립신 EDTA로 세포를 커버하기 위해 접시를 흔들어. 과잉 액체를 흡인시키고, 트립신의 약 500 마이크로리터를 남기고, 섭씨 37도에서 3분 동안 섬유아세포에 배양한다.인큐베이터에서 플레이트를 제거한 후, 단단히 그러나 조심스럽게 접시의 측면을 눌러 세포를 빼낸다. 현미경의 밑에 세포를 보기 위하여 그(것)들이 분리되었는지 확인합니다. 트립신 EDTA를 중화시키기 위해 분리 된 세포에 섬유 아세포 팽창 매체의 5 밀리리터를 추가합니다.15 밀리리터 원모 관에서 세포를 수집하고 잘 섞는다. 혈종계를 사용하여 세포를 계산한 다음 파이펫 12, 000 세포를 이전에 준비된 사전 데운 도금 매체의 4밀리리터로 계산합니다. 인큐베이터에서 코팅 된 플레이트를 제거 한 후 우물에서 라미닌 521을 흡인하여 우물 표면이 건조하지 않도록합니다.도금 매체에 있는 세포를 부드럽게 재일시 중단하고 잘 코팅된 각 에 세포 현탁액의 1 밀리리터를 추가합니다. 도금 된 세포를 낮은 산소 또는 산소가 5 %로 설정된 삼가스 조직 배양 인큐베이터에 넣고 위로, 왼쪽 오른쪽 운동 사이를 번갈아 가며 세포를 부드럽게 분산시키고 두 번 더 움직임을 반복하여 플레이트를 소용돌이지 않도록합니다. 하룻밤 동안 세포를 배양합니다.한편, 15 밀리리터 원모형 튜브에 리프로그래밍 매체 4밀리리터를 추가하고, 하룻밤 동안 평형화하기 위해 풀린 캡을 가진 낮은 O 2 인큐베이터에 넣습니다. 형질 전환 하기 전에 적어도 한 시간 전에, 낮은 O 2 인큐베이터에서 평형 리프로그래밍 매체를 제거. 밀리리터당 100 나노그램의 최종 농도에 bFGF를 추가하고, B18R을 밀리리터당 200 나노그램의 최종 농도에 추가하고 잘 섞는다.한 번에 잘 작동하면 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 소비된 매체를 제거합니다. 그리고 bFGF와 B18R로 보충 된 재프로그래밍 매체의 1 밀리리터로 대체하십시오. 세포를 가진 접시를 낮은 산소 인큐베이터로 다시 이동합니다.섬유아세포 전형을 시작하려면 먼저 실온에서 약 1시간 동안 경질 완충제의 알리쿼트를 상위화한다. 수정된 MRNA의 33마이크로리터 알리쿼트와 MIRNA의 14마이크로리터 알리쿼트(aliquots)를 음수 섭씨 80도에서 제거하고 해동될 때까지 약 3~5분 동안 실온으로 데워집니다. 마이크로퍼지에서 잠시 아래로 회전합니다.약 3~5분 동안 실온으로 트랜스페트 시약을 데우기. 튜브를 2~3회 반전하여 시약을 혼합하고 미세 분리기에서 간단히 아래로 회전시하십시오. 실온 트랜스퍼션 버퍼 279마이크로리터를 RNA 무료 마이크로센트심분리기 튜브로 옮기고, 31마이크로리터의 트랜스페션 시약을 추가한다.파이펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분간 배양합니다. 실온 트랜스퍼션 버퍼 132마이크로리터를 수정된 MRNA의 33마이크로리터 알리쿼트에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞습니다. 실온 트랜스퍼션 버퍼102.6 마이크로리터를 MIRNA 모방의 14 마이크로리터 알리쿼트에 넣고 부드럽게 파이펫을 섞어 넣습니다.수정된 MRNA의 전환 혼합을 준비하려면 310 마이크로리터 경질 버퍼의 165마이크로리터를 트랜스페션 버퍼의 165마이크로리터에 추가하여 수정된 MRNA 믹스를 수정했습니다. 파이펫을 섞어. MIRNA 모방의 전환 혼합을 준비하려면 310 마이크로리터 경질 버퍼의 116.6 마이크로리터를 116.6 마이크로리터 트랜스페션 버퍼에 추가하여 116.6 마이크로리터 트랜스페션 버퍼에 KRNA 모방믹스를 추가합니다.잘 섞고 실온에서 15분 동안 배양하여 수정된 MRNA 및 MIRNA 모방으로 트랜스펙트 버퍼가 복잡해질 수 있도록 합니다. 낮은 산소 인큐베이터에서 세포로 플레이트를 제거합니다. 각 우물에 현명하게 떨어뜨리고, 복잡하고 수정된 MRNA를 포함하는 트랜스페션 믹스의 웰당 100 마이크로리터를 추가합니다.접시를 위로 위로 가볍게 교반한 다음 오른쪽 왼쪽 움직임을 통해 트랜스페션 컴플렉스를 분산시합니다. 복잡한 MIRNA 모방을 포함하는 형질 믹스의 웰 당 66.7 마이크로 리터를 추가 각 우물에 걸쳐 현명하게 드롭. 접시를 위로 위로 가볍게 교반한 다음 오른쪽 왼쪽 움직임을 통해 트랜스페션 컴플렉스를 분산시합니다.전자 감염 된 세포와 플레이트를 낮은 산소와 트라이 가스 인큐베이터에 배치합니다. 투명하게 접시를 위아래로 교반한 다음 오른쪽 왼쪽으로 움직여 트랜스펙트 복합체를 분산시합니다. 다음 날 배지를 변경하기 전에 인큐베이터에서 16~20시간 동안 감염된 세포를 배양한다.15 밀리리터 원모형 튜브에 리프로그래밍 배지 4밀리리터를 추가하고, 하룻밤 동안 평형화하기 위해 풀린 캡이 있는 낮은 O 2 인큐베이터에 넣습니다. 다음 날 아침, 배지를 함유하는 형질전환을 bFGF 및 B18R로 보충한 신선한 미리 평형된 배지로 대체하고 프로토콜에 설명된 바와 같이 경질 요법을 계속한다. 재프로그래밍을 위한 6가지 웰 포맷 접시의 우물로 성공적으로 도금한 후 섬유아세포는 매우 희소해 보였습니다.첫 번째 성공적인 회전 후 24 시간, 섬유 아세포는 그들의 스핀들 모양을 분실하고 더 둥근 형태를 채택했습니다. 처음 3개의 transfections를 통해, 세포 밀도는 7 일과 8 일 사이에서 일어나는 명백한 파열로 점차적으로 일관되게 증가했습니다. 10일째가 되면 세포는 대체로 혼잡해 보였다.첫 번째 IPSC 식민지는 11 일 초에 나타났다. 일 15 받는 날 17, IPSC 식민지 크고 분명 하 고 명확 하 게 주변 및 완전히 다시 프로그래밍 된 섬유 아 세포에서 구별 되었다. 자공성 마커 TRA-1-60에 대한 면역 염색은 높은 리프로그래밍 효율을 확인하였다.최적이 아닌 도금 밀도는 이 프로토콜에서 재프로그래밍의 효율성을 저하시키는 가장 일반적인 이유입니다. 도금 밀도가 너무 낮으면 큰 세포 남작 패치가 나타나고 IPSC 식민지가 형성되지 않았습니다. 다시 프로그래밍 된 세포의 희석 통과 에 따라, IPSC는 단일 식민지로 성장하고 쉽게 섬유 아세포에서 구별했다.그(것)들은 느슨하게 포장되고 개별적인 세포는 상대적으로 큰 세포질 영역이 있었습니다. 4~7일 동안 IPSC는 확산되어 정의된 가장자리가 있는 특징적인 밀집 식민지를 형성했습니다. 식민지 내의 개별 세포는 눈에 띄는 핵을 가진 큰 핵 분획을 보여주었습니다.환자 섬유아세포를 재프로그래밍한 후, 결과 IPSCs는 메커니즘을 유발하는 질병을 해명하거나 새로운 재생 세포 기반 치료법을 개발하기 위해 다양한 체세포로 분화될 수 있다.

rna-based-reprogramming-human-primary-fibroblasts-into-induced

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

우리는 인간의 요인 Oct4, Sox2, Nanog, 그리고 Lin28의 lentivirus - 중재 전송을 사용하여 인간의 체세포에서 유도된 pluripotent 줄기 세포의 생성에 대한 프로토콜을 보여줍니다. Pluripotency는 형태학 및 배아 줄기 (ES) 세포 특정 마커의 존재에 의해 확인되었다.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

우리는 함께 retroviral Oct3 / 4, Sox2, Klf4과 c-myc (OSKM)를 인코딩 벡터, 라이브 염색법에 의해 정확하게 다시 프로그램 hiPSC의 신분을 이용하여 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (hiPSC) Tra-로 인간의 체세포의 효율적인 언어학 재활을위한 프로토콜을 제시 1-81 항체.

인간 유도 Pluripotent 줄기 세포의 선택 및 분리 식민지는 성인 섬유아 세포에서 다시 프로그램

OCT4의 레트로 바이러스 - 매개 자궁외 표현을 통해 인간의 유도된 pluripotent 줄기 세포 (iPSCs) 생성하는 방법은, SOX2, KLF4 및 MYC가 설명되어 있습니다. GFP 발현을 바탕으로 인간 iPSC 식민지를 식별하기위한 실용적인 방법도 설명되어 있습니다.

GFP와 Retroviral 벡터를 사용하여 유도 Pluripotent 줄기 세포 (iPSCs)로 인간 체세포를 프로그래밍

여기, 우리는 일관된 결과 및 향상된 효율성을 보여줍니다 센다이 바이러스와 유전자가없는 인간 유도 만능에 인간의 체세포를 재 프로그램하는 우리의 설립 방법을 제시한다.

센다이 바이러스와 인간의 체세포의 효율적인 생성 인간 유도 만능 줄기 세포

유도 만능 줄기 세포의 생성은자가 이식의 유도에 대한 매혹적인 전망을 제공합니다. 그러나, 만능 상태와 힘든 다시 차별화를 통해 진행은 여전히​​ 임상 번역을 방해한다. 여기에서 우리는 성인 인간 섬유 아세포의 유도와 유도 된 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환과 신경 계통에 후속 차별화를 설명합니다.

성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 - 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

인간 유래 다 능성 줄기 (hiPS) 세포의 강력한 유도는 피부 섬유 아세포의 비 통합 적 센다이 바이러스 (SeV) 벡터 매개 재 프로그램 화를 사용하여 달성되었다. 재조합 인간 라미닌 521 (LN-521) 매트릭스 및 필수 E8 (E8) 배지를 사용하여 제노 프리 및 화학적으로 한정된 배양 조건을 사용하여 hiPS 세포 유지 및 클론 확장을 수행 하였다.

Laminin 521 매트릭스를 이용한 인간 유래 다 능성 줄기 세포의 통합 된 자유 유도

직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.

성인 인간 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경의 고수익 문화의 간단한 세대

세포 재프로그래밍은 다능성 세포 상태를 조절하고 유지하는 주요 유전자의 도입을 요구합니다. 기술된 프로토콜은 바이러스/통합 방법 없이 인간 진피 섬유아세포로부터 유도된 만능 줄기 세포(iPSCs) 콜로니의 형성을 가능하게 하지만, 세포 방어 메커니즘을 감소시키는 면역 회피 인자와 결합된 비변형 RNA(NM-RNAs)를 사용한다.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

배우세요 인간 기본 섬유아세포를 RNA 기반 방법으로 유도 만능 줄기세포로 재프로그래밍하는 고효율 기술을. pH 조절과 microRNA를 활용하여 통합 유전자 없이 고품질 iPSC를 생성하는 방법을 익히세요.

인간의 기본 섬유 아 세포의 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍 RNA 기반

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