Name: 세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 C1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 배우세요 보체 단백질 C1q와 히알루론산의 상호 작용이 세포 부착을 촉진하는 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역 반응과 세포 외 기질 연구에 활용됩니다.

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우리는 HA, 레오나르도 아마디오, 가브리엘라 지토 (IRCCS "Burlo Garofolo", 트리에스테, 이탈리아의 부인과)와 안드레아 로마노 (해부학 및 병리학 조직학의 수술 임상 단위, 카티나라 병원, 트리에스테, 이탈리아의 제공에 대한 이반 도나티에게 감사드립니다. )을 조직 샘플 수집용으로 하였다. 우리는 비디오 준비와 알렉스 코폴라, 목소리의 도움 니콜로 모로시니도 감사합니다. 이 작품은 산모와 아동 건강 연구소에서 보조금에 의해 지원되었다, IRCCS "Burlo Garofolo", 트리에스테, 이탈리아 (RC20/16) 및 폰다지오네 카사 디 리스파르미오 트리에스테 R.Bulla.

환자로부터의 조직 샘플은 이탈리아 트리에스테 대학 병원의 기관 위원회의 윤리적 고려 사항의 승인 후 통보 된 동의 후 수집되었다.
1. 종양 세포 격리 및 배양 (1 일째)
<ol><li>MPM 고체 표본으로부터 인간 중피종 세포를 분리합니다. 0.5 mM Ca2+/ Mg2+, 0.5 % 트립신 및 50 μg / mL로 보충 된 행크스의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS)으로 구성된 소화 용액 5 mL에서 약 2-3mm2의 조각을 얻기 위해 커터로 조직을 미세하게 다진다. DNase I, 4 °C에서 하룻밤.</li>
	<li>종양 세포 분리 및 배양 (2일째)<ol>
<li>하룻밤 배양 후, 소화된 조직을 37°C 인큐베이터에 부드럽게 흔들어 놓고 30분 동안 놓는다.</li>
		<li>원심분리 시 소화 용액 (250 x g)을 중간 크기 199의 5 mL에 용해 된 3 mg / mL 콜라게 나아제 유형 1로 HBSS로 교체하고 37 °C에서 30 분 동안 더 배양하십시오.</li>
		<li>10% 열 불활성화 태아 소 혈청 (FBS)를 추가 하 여 효소 반응을 차단 합니다. 세포의 대부분이 조직에서 방출되도록 하기 위해 5 mL 파이펫으로 세포를 매우 신중하게 다시 중단하십시오. 이어서, 100 μm 기공 필터를 통해 세포 현탁액을 걸러내다.</li>
		<li>세포를 12.5 cm2 플라스크에서 종자하고 인간 내피 세포혈청이 없는 배지(HESF)를 사용하여 37°C에서 배양하고, 10% FBS로, EGF(10 ng/mL), 기본 FGF(20 ng/mL), 및 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충하였다. 참고: 2-3일마다 신선한 매체로 교체하세요.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HA 코팅 (1 일차)
<ol><li>1 mg / mL6의농도에서 이중 증류수에서 고분자 HA (1.5 kDa)를 다시 일시 중단하십시오.</li>
	<li>부드러운 파이펫팅으로 탄산염/중탄산염 완충액(0.1M, pH 9.6)에서 HA 스톡 용액을 50 μg/mL로 희석합니다.</li>
	<li>96-웰 플레이트를 4°C에서 하룻밤 동안 100 μL의 희석 HA 스톡 용액으로 코팅합니다. 참고 : 히알루 론산은 트리에스테대학 생명과학학과 이반 도나티 교수의 친절한 선물이었다 7 .</li>
</ol>3. C1q 코팅 (2일차)
<ol><li>하룻밤 배양 후, 진공 처리 된 우물을 흡인하고 잘 당 덜베코의 PBS (dPBS)의 100 μL로 96 웰 플레이트를 세척합니다.</li>
	<li>C1q (25 μg / mL 또는 투여 반응 실험을위한 다른 농도) 또는 BSA (음성 대조군)가 dPBS + 0.5 % BSA 및 0.7 mM Ca + 0.7m Ca + 0.7 mM + 0.7 mMCa+0.7 μS의 농도에서 25 μg / mL의 농도로 이러한 단백질을 배양하여 플라스틱 고정 HA에 결합하도록 허용하십시오. . 그런 다음 4 °C에서 밤새 배양합니다.</li>
	<li>우물을 진공 흡인하고 dPBS의 100 μL / 웰로 96 웰 플레이트를 세척하십시오.</li>
</ol>4. FAST DiI로 셀 라벨링
<ol><li>형광염 FAST DiI의 10 μg/mL를 함유하는 dPBS 의 500 μL에서 1 x 105 종양 세포를 재중단한다. 라벨링을 위해 5% v/v CO2 인큐베이터에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이팅하고, 5분 간격 후에 수동으로 혼합한다.<ol>
<li>여분의 FAST DiI를 제거하려면, dPBS 10 mL을 추가하고, 부드럽게 위아래로 피펫을 추가하고, 7 분 동안 250 x g에서 원심 분리기를. 0.1 % BSA (HESF + 0.1 % BSA)를 포함하는 인간 내피 혈청 무료 배지의 1 mL에서 세포 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HA/C1q 행렬에 대한 세포 접착 (1일차)
<ol><li>진공 은 상이한 매트릭스로 코팅된 웰을 흡인한다(웰은 3.2단계에서 코팅되었다).</li>
	<li>표지된 셀 현탁액의 100 μL을 코팅된 웰에 분배하고 5% v/vCO2 인큐베이터에서 37°C에서 35분 동안 플레이트를 배양한다.</li>
	<li>상급체를 흡입하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다. 0.5% BSA, 0.7 mM Ca2+ 및 0.7 mM Mg2+를포함하는 dPBS로 한 번 씻으십시오.
</li>
	<li>10 mM Tris-HCl, pH 7.4 + 0.1 % v /v SDS의 200 μL / well을 추가하여 부착 세포를 용해시키고 형광 판독기 (544 nm, 방출 590 nm)로 96 웰 플레이트를 즉시 판독하여 라벨 수가 증가하는 것을 통해 생성된 교정 곡선을 사용하여 부착 된 라벨수를 통해 발생했습니다. 셀.</li>
</ol>

<ol><li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation%3A+Chemistry%2C+processing+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346(2016).</li>
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<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling%3A+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).</li>
<li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li>
<li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).</li>
<li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li>
<li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li>
<li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li>
</ol>

저자는 연구가 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 인 관계가없는 상태에서 수행되었다고 선언합니다.

우리는 히알루론산과 상호 작용하는 보체 성분 C1q가 어떻게 인간 종양 조직으로부터 분리된 1차 세포의 거동을 조절할 수 있는지 를 조사하는 쉬운 방법을 설명합니다. HA와 C1q는 모두 생리적 및 병리학적 조건 하에서 조직 미세 환경에 풍부하게 존재하며, 여러 세포 생물학적 과정에 참여한다. 예를 들어, C1q는 태반 8 동안 모계 데시두아의 엑스트라풀루스 트로포블라스트 침공을 선호하는 태반의미세환경 내에 존재하는 것으로 나타났다. C1q는 또한 조직 재생 및 수리 에 필요한 혈관 유전 적 과정을 육성 상처 치유 피부에 증착10. 마지막으로, C1q는 몇몇 다른 종양조직에서 확인되었습니다 4. 고분자량 HA는 혈관신생 및 증식에 대한 자연적인 장벽이며, 최근의 증거에 따르면 C1q는 보체 활성화에 있어 고전적인 역할 외에 ECM 분자로서 작용할 수 있으며 세포 이동을 선호합니다.
<p clas...

종양 미세 환경 (TME)은 세포 생존, 성장 및 침략에 대한 허용 틈새 시장을 제공 할 수 있기 때문에 암 발달 및 진행에 영향을 미칩니다. TME에 있는 새로운 중요한 선수의 확인은 표적 치료를 위한 새로운 분자 공구의 발견을 위해 유용할 지도 모릅니다. TME는 내피 세포, 섬유아세포 및 면역 계통의 세포와 같은 비악성 세포의 복잡하고 동적인 네트워크를 포함하며, 콜라겐, 라미닌, 섬유넥틴을 포함하는 주변 세포외 매트릭스(ECM) 성분에 내장되어 있으며, 프로테오글리칸과 히알루로난을 종양 및 비종양 세포는 사이토카인, 케모카인, 성장 인자 및 TME의 물리적, 화학적 및 신호 특성을 전체적으로 변경하는 염증 및 매트릭스 리모델링 효소와 함께 ECM 구성 요소를 합성하고 분비합니다. 이러한 성분 중, 히알루 론산 (HA) 종양 생물학에 중요 한 역할을 발휘 하기 위해 등장 했다. 그것의 간단한 화학 성분에도 불구하고, HA는, 그것의 HA 결합 분자 (hyaladherins)와 더불어, 크기 및 농도 의존적인 방식으로 혈관신생, 면역 계통 반응성 및 ECM 리모델링을 조절할 수 있다 1.
보체 (C) 시스템은 또한 최근 증가하고있는 로컬 TME의 일부입니다. C 시스템은 비 자기 세포, 원치 않는 숙주 요소 및 병원체에 대한 방어의 첫 번째 라인에 관여하는 수용성 및 막 결합 단백질의 세트를 포함합니다. 기능적으로, C는 선천적이고 적응적인 시스템의 2-이펙터 암을 연결하여 염증 반응의 직접적인 세포 살상 또는 장착을 촉진한다2. C 활성화는 암세포를 파괴하거나 그들의 성장을 억제해서 종양 성장을 억제할 수 있습니다, 그러나 만성 염증을 유지해서 종양 승진시키는 활동을 소유할 수 있다는 것을 점점 더 명확해지고 있습니다, 의 설치를 승진시키는 면역억제군, 혈관신생 유도, 암 관련 신호경로 활성화3. 이러한 맥락에서, C1q, C 시스템의 고전적인 경로의 제1 인식 분자는 C 활성화 4와 독립적으로종양 미세 환경에서 중요한 기능을 발휘하는 것으로 나타났다. C1q는 혈관신생 및 전이 외에 암세포 부착, 이동 및 증식을 선호할 수 있는 다양한 인간 악성 종양에 의해 국소적으로 발현되는 것으로 나타났다5. 흥미롭게도 C1q는 HA와 같은 ECM의 주요 구성 요소와 상호 작용합니다.
우리는 종양 질량에서 1 차적인 암세포를 격리하는 기술을 개발했습니다. 또한, 우리는 종양 미세 환경, 특히 C1q와 높은 분자량 히알루 론산 사이의 상호 작용을 자극 할 수있는 매트릭스를 만들었습니다. HA에 결합된 C1q는 종양 세포의 부착을 유도할 수 있었다.

<table><tbody><tr><td>100&thinsp; &마이크로; m 기공 필터</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B 용액 (fungizone)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>basic FGF</td><td>Immunological Sciences</td><td>GRF-15595</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 유형 I</td><td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td><td>MX1D12644</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>Roche</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Immunological Sciences</td><td>GRF-10544</td><td></td></tr><tr><td>FAST DiI</td><td>분자 프로브, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>D7756</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 혈청</td><td>Gibco,&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr> 세포 배양을 위한 <tr><td>Fibronectin</td><td>Roche</td><td>11051407001</td><td></td></tr><tr><td>플라스크</td><td>Corning</td><td>430639</td><td>멸균, 통풍</td></tr><tr><td>겐타마이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>행크 s 균형 잡힌 소금 용액 (HBBS)&nbsp;</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>H6648</td><td>EDTA, 포도당, 페니실린-스트렙타미신, 겐타마이신 및 곰팡이존</td></tr><tr><td>고분자량 히알루론산</td><td>이반 도나티</td><td></td><td></td>교수에 의한 친절한 선물</tr><tr><td>인간 내피 혈청 무료 매체</td><td>기브코,&nbsp; Thermo Fisher Scientific</td><td>11111-044</td><td>EGF (5&thinsp; ng/mL), 염기성 FGF(10&thinsp; ng/mL), 및&nbsp; 1% 페니실린&ndash; 스트렙토 마이신 (시그마 - 알드리치)</td></tr> <tr><td>마그네슘 클로라이드</td><td>카를로 에르바</td><td>13446-18-9</td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199 행크 포함 s 소금</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>시그마-알드리치&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>타임랩스 현미경&nbsp;</td><td>니콘&nbsp;</td><td>이미징 시스템 BioStation IM-Q</td><td></td></tr><tr><td>Titertek Multiskan ELISA Reader</td><td>Flow Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4674</td><td></td></tr></tbody></table>

세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 c1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

종양 미세 환경이 신생물 성장 및 전이에 적극적인 역할을 한다는 것이 점점 입증되고 있다. 다른 통로를 통해, 종양 세포는 자극 인자, 케모카인 및 사이토카인을 분비하여 기질, 면역 및 내피 세포를 효율적으로 모집 할 수 있습니다. 차례로, 이 세포는 높은 증식 및 전이성 능력을 유지하기 위하여 성장 촉진 신호, 대사 산물 및 세포외 매트릭스 분대를 풀어 놓음으로써 미세 환경의 신호 특성을 바꿀 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 우리는 인간 악성 종양의 범위에 의해 국소적으로 고도로 발현되는 보체 성분 C1q가 세포외 기질 히알루론산과 상호 작용할 때 인간 종양으로부터 분리된 1차 세포의 거동에 강하게 영향을 미친다는 것을 확인합니다. 표본. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산(HA)에 결합하여 종양 세포 부착에 어떻게 영향을 미치는지 테스트하는 방법을 설명하며, 이는 세포외 기질의 주요 성분의 생물학적 특성(이 경우 HA)이 종양을 향한 생리활성 신호에 의해 형성될 수 있다는 사실을 뒷받침하는 것입니다. 진행.

HA는 음전하고분자다당류이며, 이는 반복(β,1-4)-D-글루쿠론산-(β,1-3)-N-아세틸-D-글루코사민 난당류 단위(도1B)로구성된다. 96웰 플레이트상에서 HA의 결합의 발생뿐만 아니라 그 고정화의 효율은 생체화 HA(bio-HA)를 이용하여 시험하였다. 10 μg/mL에서 1 mg/mL에 이르는 다양한 Bio-HA 농도를 100 mM 탄산염/중탄산염 버퍼 pH 9.6에서 다시 중단하고 4°C에서 밤새 배양하였다.
광범위한 세차 후, 96웰 플레이트에 결합된 바이오-HA는 알칼리성 인산염에 컨쥬게이션된 스트렙타비딘을 사용하여 검출되었고, 스트렙타비딘의 존재는 pNPP(1 mg/mL)를 기판으로 사용하여 정량화되었다. 판독은 ELISA 리더를 사용하여 405 nm의...

보체 성분 C1q는 세포외 기질과 상호 작용할 수 있는 조직 미세환경에서 고도로 발현되는 염증성 분자이다. 여기서, 우리는 C1q가 히알루론산에 결합하여 세포 부착에 미치는 영향을 시험하는 방법을 설명한다.

세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 C1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

세포 접착을 촉진하는 보완 단백질 C1q와 히알루론산 간의 상호 작용을 평가하는 포괄적인 절차. 우리는 최근에 선천적인 면역 계통의 보충 성분 C1q가 종양 과 태반 미세 환경에서 높게 발현되고 세포외 매트릭스의 성분과 상호 작용할 수 있다는 것을 정의했습니다. 이 경우 히알루론산.우리는 음경 환경 전반에 걸쳐 단백질의 생물학적 기능을 연구하는 방법을 제안합니다. 세포 외 매트릭스 인자의 세포 분열 특성을 형성하는 이러한 분자의 능력을 조사하기 위해. 이러한 상호작용이 환경의 조직에 존재하는 세포에 의해 어떻게 감지될 수 있는지 연구하기 위해, 인간 조직에서 유래한 이진 세포가 세포외 매트릭스에 결합된 C1q에 부착할 수 있는 이 쉬운 방법을 설정하여 히알루론산이다.코팅 절차의 경우 첫 번째 단계는 96 잘 조직 코팅 마이크로 플레이트에 높은 분자량 히알루론산의 결합이다. 코팅의 경우, 히알루론산은 밀리리터당 15마이크로그램의 농도로 0.1 두더지 탄소 완충제 PH 9.6으로 희석된다. 그리고 부드럽게 파이프는 균일 한 솔루션을 달성하기 위해 재기재된다.100 마이크로리터의 용액이 우물을 코팅하는 데 사용됩니다. 그런 다음 플레이트는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 옮겨지도록 합니다. 다음날 진공 청소기는 처리된 우물을 흡인시합니다.dPBS로 한 번 씻으시면 됩니다. 해당 우물에 C1q 또는 BSA를 추가합니다. C1q는 요즘 밀리 리터 당 1 밀리 그램의 농도에서 상업적으로 사용할 수 있으며 밀리 리터 당 25 마이크로 그램의 농도로 희석됩니다.그리고 dPBS는 0.5%BSA 및 0.7 밀리몰드 칼슘과 마그네슘 및 이가지 양온을 함유하고 있습니다. BSA LPS 무료0.5%의 농도와 날짜 PBF에서 사용됩니다. 플레이트는 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 옮겨져 있습니다.C1q 투여량은 면역SA와 연결된 효소에 의해 결정된다. 빠른 DiI로 라벨링하는 셀. 지방 혈 성 추적자 빠른 DiI관심의 세포를 레이블하는 데 사용됩니다. dPBS에서 재중단된 세포는 밀리리터당 백만 개의 세포의 농도에서 사용됩니다.빠른 DiI는 세포 현탁액으로 직접 1~100을 희석한다. 셀 서스펜션은 수동으로 혼합되어 섭씨 37도에서 15분 동안 이송됩니다. 5분 간 배양 후 셀 서스펜션을 혼합하고 이 수술을 두 번 더 반복합니다.빠른 DiI의 과잉을 제거하려면 dPBS의 10 밀리리터를 추가합니다. 7분간 250g에서 부드럽게 위아래로 위아래로 피벗합니다. 0.1%BSA의 존재에 인간 내성 혈청 무료 배지의 1 밀리리터에서 세포 펠릿을 다시 중단.히알루론산 C1q 행렬에 대한 세포 접착. 코팅 된 우물에서 dPBS를 흡입 진공. 코팅 된 우물에 라벨 이 부착 된 세포 현탁액의 100 마이크로 리터를 배포합니다.표지된 세포의 200마이크로리터는 표준 곡선 생성에 사용되는 임시 튜브에서 분해됩니다. 섭씨 37도에서 35분 동안 접시를 배양합니다. 인큐베이터에서 접시를 꺼내.불균형한 세포를 부드럽게 흡인합니다. 0.5%BSA와 0.7 밀리몰드 칼슘과 마그네슘을 함유한 dPBS로 한 번 세척하십시오. 용해 버퍼의 200 마이크로 리터를 추가하여 부착 된 세포를 lyss.동시에 리시스 버퍼에서 표지된 셀의 1~2개의 직렬 희석시 표준 곡선을 준비합니다. 544 나노미터를 발산 파장으로 사용하고 590 나노미터를 방출 파장으로 사용하여 무한 F 200 T-can 계측기에서 플로레시프 신호의 판독을 수행한다. 대표적인 결과.대표적인 결과에 의해 나타난 바와 같이, 히알루론산에 세포 접착은 HA 단독으로 또는 HA 바운드 BSA와 비교하여 강하게 강화된 C1q를 발견한 것이 분명하다. 각 매트릭스의 부착 셀의 백분율은 표준 곡선을 기준으로 계산됩니다. 결론. 우리의 실험에서 먼저 우리는 아리살 금속을 사용하여이 경우 히알루론산에서 세포외 매트릭스를 결합하는 보완 성분 C12의 능력을 평가했다.둘째, 우리는 결합된 히알루론산을 추구하기 위하여 형광염으로 염색된 인간 1차 세포의 기능을 분석했습니다. 우리가 이 연구에서 제안한 모형은 자극의 조합에 이 세포 반응에 대한 평가를 위한 세포외 매트릭스 비계의 3D 모형에 대안에 있는 더 쉽고 싼 방법입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

외인성 hyaluronic의 산성 (HA)과 암 세포의 상호 작용의 고해상도 분석이 가능합니다 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 패턴의 표면은 carbodiimide 화학 및 microcontact 인쇄 결합하여 가공하고 있습니다.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

두 분자가 상호 작용하는 세포의 표면에 고정하는 경우 수용체 - 리간드 상호 작용 속도론을 측정하는 접착 주파수 분석이 설명되어 있습니다. 이 기계 기반의 분석은 수용체와 리간드를 상호 작용으로 micropipette - 압력 인간의 붉은 부착 센서와 같은 혈액 세포와 인테 αLβ2과 세포 유착 분자 - 1을 사용하여 exemplified입니다.

에 대한 접착 주파수 분석 현장에서</em셀 - 셀 인터페이스에서 교차 Junctional 분자의 상호 작용> 속도론 해석

정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

여기에서는 추정 세포 접착 분자의 고유 접착 특성을 특성화하기 위한 간단하고 빠른 방법을 제시합니다.  세포 접착 분자의 분비된 에피토프 태그가 붙은 엑토도메인(ectodomain)은 작고 균일한 기능화된 비드의 배양 배지에서 캡처됩니다.  그런 다음 이러한 beads를 간단한 bead aggregation assay에 즉시 사용할 수 있습니다.

상상 속의 세포 부착 분자의 특성에 대한 비드 집계 분석 실험

이 플로우 접착 분석은 T 세포 상피 세포 상호 작용의 간단한 고 충격 모델을 제공한다. 주사기 펌프는 전단 응력을 생성하기 위해 사용하고, 공 초점 현미경 정량 이미지를 캡처한다. 이 연구의 목적은 효과적으로 유동 조건을 이용하여 T 세포 유착을 정량화하는 것이다.

T 림프구 - 접착 분자 상호 작용의 연구에 대한 접착에서 전단 응력의 분석

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기에서는 여러 가지 용도, 특히 알츠하이머 질환 (Alzheimer 's disease, AD)과 같은 질병에 대한 감수성 평가에 사용하기 위해 보체 수용체 1 (CR1) 길이 다형성을 결정하는 혁신적인 방법에 대해 설명합니다. 이 방법은 AD의 병인에 CR1 isoforms의 역할을 더 잘 이해하는 데 유용 할 수 있습니다.

보체 수용체 1 길이 다형성 유전자 타이핑을위한 고해상도 Melting PCR : 알츠하이머 병 유전자 감수성 평가를위한 혁신적인 도구

혈관 벽에 면역 세포의 동적 접착 용기 추적에 대 한 전제 조건입니다. 여기, 우리 addressin 코팅 모 세관을 사용 하 여 인간 세포의 동적 세포 접착에 안티 integrin 항 체, 발산 또는 다른 요인의 영향 분석에 대 한 기능 생체 외에서 시험에 대 한 프로토콜을 제시.

선 동적인 장 질병에 방지 접착 치료의 기능 분석에 대 한 동적 접착 시험

이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

체외 히알루로난이 풍부한 세포외 기질이 신경 능선 세포 이동에 미치는 영향에 대한 조사

효과적으로 정화가 자주 필요한 면역 세포 집단의 기능을 연구합니다. 보완 고갈은 고순도와 면역 세포 인구의 격리를위한 신속하고 저렴한 방법입니다.

보완 고갈에 의해 특정 세포 집단의 고갈

배우세요 보체 단백질 C1q와 히알루론산의 상호 작용이 세포 부착을 촉진하는 메커니즘을 평가하는 방법을. 이 기법은 면역 반응과 세포 외 기질 연구에 활용됩니다.

세포 부착 촉진에 있는 보체 단백질 C1q와 히알루론산 사이 상호 작용의 평가

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