Name: 코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 학습하세요 돼지 전혀에서 코딩 및 비코딩 RNA를 동시에 분석하는 최적화된 RNA-seq 프로토콜. 글로빈 감소와 RNase H 소화를 활용하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적인 고품질 RNA 라이브러리를 준비하는 방법을 익히세요.

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이 작품에 의해 주로 지원 되었다에 의해 미국 농 무부 NIFA AFRI 2013-67015-21236, 그리고 일부 USDA NIFA AFRI 2015-67015-23216 여. 이 연구는 농업 연구 서비스 연구 참여 프로그램은 미국 에너지 부 (사이 부처간 합의 통해 과학 교육 (ORISE)에 대 한 오크 리 지 연구소에 의해 관리 하는 약속에 의해 부분적으로 지원 되었다 미상)와 미국 농 무부. ORISE는 관리 오크 리 지 연관 된 대학에 의해 DOE 계약에서 더. 드-AC05-06OR2310입니다.
우리는 HP PRRSV 전염 성 클론, 박사 수잔 Brockmeier에 대 한 그녀의 동물 실험에 관련 된 도움말 및 비서 지원 원고 준비에 대 한 고소 Ohlendorf 닥터 케이 Faaberg 감사 하 고 싶습니다.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.
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만든 최적화 된 프로토콜의 첫 번째 중요 한 단계 추가 globin 고갈 단계, 전체 혈액 샘플에서 품질 읽기를 가능 하 게 포함 되어 있습니다. 전 혈을 사용 하 여 시퀀싱 연구에서에 가장 큰 한계 중 하나는 globin 분자에 지도 하 고 관심18의 다른 분자에 매핑할 수 있는 읽기를 줄이기 위해 샘플에서 읽기의 높은 숫자입니다. 따라서, 우리의 샘플 유형에 대 한 프로토콜을 최적화, 우리는 가장 높은 가능한 mRNA 및 비 코딩 RNA 시퀀싱을 통해 캡처 되도록 globin 고갈 단계를 통합 하 필요 합니다. 모든 샘플 globin globin 성적 돼지 특정 헤모글로빈 A와 B (HBA 및 HBB) oligonucleotides 최 외., 201414에서 절차에 따라 사용 하 여 높은 수준에 대 한 계정에 고갈 했다. 또 다른 중요 한 단계는 능력 polyadenylated 비 코딩 및 바이러스 성 RNA 분자 내에서 실...

다음 차세대 시퀀싱 (NGS) 생물학 유 기체의 게놈 수준에서 발생 하는 변경의 수사를 위한 강력한 도구로 떠오르고 있다. NGS 메서드에 대 한 샘플 준비 유기 체, 조직 유형에 따라 변화 될 수 있습니다 그리고 더 중요 한 것은 질문 연구원은 촉각을 곤두세우고 있다 주소. 많은 연구 결과 건강 하 고 아픈 개인1,2,,34같은 국가 사이 유전자 발현의 차이 공부 하는 수단으로 NGS를 아닙니다. 시퀀싱 걸릴 전체 게놈으로 놓고, 대부분 캡처 연구원 수 없다면, 한 번에 특정 유전자 표식에 대 한 게놈 정보의 포인트.
관찰 하는 식의 가장 일반적인 표시는 메신저 RNAs (mRNAs). RNA-seq에 대 한 준비 라이브러리에 대 한 가장 많이 사용 된 절차 purifications, fragmentations, 및 ligations5,6의 시리즈를 통해 mRNA 분자의 복구를 위해 최적화 되어 있다. 그러나, 수행 하는 프로토콜은 어떻게에 결정 샘플 유형과 말했다 샘플에 대해 제기 되는 질문에 무 겁 게 의존 합니다. 대부분의 경우에서 총 RNA 추출; 그러나, 관심의 모든 RNA 분자는 고 mRNA 식 연구 같은 경우에 리보솜 RNAs (rRNA) 같은 지나치게 풍부한 RNA 종 감지 성적표는 mRNAs와 관련 된의 수를 늘리기 위해 제거 될 필요가 있다. 풍부한 rRNA 분자를 제거 하기 위한 가장 대중적이 고 널리 사용 방법은 polyadenylated RNA 사본 polyA 고갈7로의 감소 이다. 이 접근은 mRNA 발현의 분석으로 mRNA 사본에는 영향을 주지 않습니다. 그러나, 비 코딩 또는 바이러스 성 RNAs에 관심이 있는 연구에 polyA 고갈이이 분자도 제거 합니다.
많은 연구는 RNA 순서 라이브러리 준비 검사 (코딩) mRNA 식 이거나 또는 작은 또는 큰 비 코딩 RNA의 특정 클래스에 초점을 선택 합니다. 듀얼 샘플 준비에 대 한 허용 하는 우리 같은 다른 절차8 있지만, 많은 연구 가능한 경우 별도 연구에 대 한 별도 샘플에서 라이브러리를 준비 합니다. 우리 같은 연구에 대 한이 일반적으로 여러 개의 혈액 샘플, 소모품, 시간과 동물 스트레스 증가 요구할 것입니다. 우리의 연구의 목표를 사용 하 여 전체 혈액 동물에서 식별 하 고 두 mRNA의 다른 클래스를 계량 수 되었고 건강 하 고 높은 병원 성 돼지 재생산과 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV HP) 사이 비 코딩 RNA 표현 도 불구 하 고만 하나의 전체 혈액 샘플 (2.5 mL) 각 돼지에서 돼지9,10 도전. 이 위해서 우리 일반적인 추출 및 mRNA 및 비 코딩 RNA (ncRNA) 식11 단일 샘플에서의 분석에 대 한 있도록 적절 한 데이터를 생성 하기 위해 라이브러리 생성 프로토콜을 최적화 하기 위해 필요 합니다.
이 때문에 RNA 추출 및 라이브러리 생성을 위한 방법과 사용할 수 있는 표준 키트 mRNA를 위해 주로 예정 되었다 폴 리 A 고갈 단계12를 사용 하 여 mRNA 및 비 코딩 RNA 분석에 대 한 허용 하는 프로토콜에 대 한 필요 라는 메시지가 나타납니다. 이 단계 만들었을 것입니다 그것은 비 코딩 RNA 바이러스 증명서 샘플에서 복구 불가능. 따라서, 최적화 방법 필요 했다 샘플 polyA 고갈 없이 총 RNA 추출에 대 한 허용. 이 원고에 표시 메서드에 mRNA를 소형 및 대형 크기의 ncRNAs 시퀀싱 라이브러리를 빌드를 샘플 형식으로 전체 혈액의 사용 하 고 최적화 되었습니다. 메서드는 모든 감지 비 코딩 RNAs의 분석에 대 한 허용 하 고 이후 수사13에 대 한 바이러스 성 RNAs를 유지 최적화 되었습니다. 모두 있음, 우리의 최적화 된 라이브러리 준비 프로토콜 단일 전체 혈액 샘플에서 여러 개의 RNA 분자의 조사에 대 한 수 있습니다.
이 메서드를 사용 하 여 뒤에 전반적인 목표는 전체 혈액의 1 개의 샘플에서 비 코딩 RNA와 mRNA의 컬렉션에 대 한 허용 하는 프로세스를 개발 했다. 우리의 연구는 단일 샘플9에서 공급에 mRNA, ncRNA, 및 각 동물에 대 한 바이러스 성 RNA를가지고 수 있습니다. 이, 궁극적으로, 동물 추가 비용 없이 더 많은 과학적 발견에 대 한 허용 하 고 각 개별 샘플의 식의 더 완전 한 그림을 제공 합니다. 설명 된 메서드를 모두 비교 하는 상호 학문의 완료에 대 한 허용 뿐만 아니라 유전자 발현의 레 귤 레이 터의 시험에 대 한 수 있습니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 단일 전체 혈액 샘플을 사용 하 여. 우리의 연구는 유전자 발현에 변화를 검사 하이 프로토콜을 사용 하 고 가능한 후 레 귤 레이 터는 9 주 된 남성 상업 돼지에 virally 감염 된.

<table><tbody><tr><td>PAXgene Tubes</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>분자 생물학 등급 물</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA 분리 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute 클린업 키트</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 얇은 벽 튜브</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL RNase/DNase - free 튜브</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well Thermocycler</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>글로빈 환원 올리고 (&alpha; 1)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td>서열 GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>글로빈 환원 올리고 (&alpha; 2</td><td>)모든 공급업체</td><td></td><td>서열 TCA ACG ATC AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>글로빈 환원 올리고(&beta; 1)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td>서열 AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>글로빈 환원 올리고(&beta; 2)</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td>서열 GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X 올리고 혼성화 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>-트리스-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>밀리포어 시그마</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H 버퍼</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-분자 생물학 등급 물</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Rnase 억제제</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기</td><td>모든 공급업체</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 전기영동 바이오분석기 기기</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 나노 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 고감도 DNA&nbsp; 키트</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>mRNA 키트; 인간/마우스/쥐 세트 A&nbsp; (48 개 샘플, 12 개 색인)</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td><td>Illumina</td><td></td><td>온라인</td></tr><tr><td>RNAClean XP 비드</td><td>사용 가능 BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP 비드</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube strip</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0.2 ml 얇은 벽 튜브</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube 스트립 캡</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - free reagent reservoirs</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 역전사효소</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96웰 플레이트</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>필요에 따라 .3mL 플레이트 대신 사용됨</td></tr><tr><td>MicroAmp 광학 접착 필름</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>Illumina&reg를 위한 NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set; (세트 1)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>소형 RNA 키트</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex 소형 RNA 라이브러리 준비 세트, Illumina&reg; (세트 2)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E75805</td><td>소형 RNA 키트</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR 정제 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S 슈퍼 마그넷 플레이트</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

코딩 및 비 코딩 rna 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

점점 더 강력 하 고 혁신적인 다음 세대 시퀀싱 기술의 출현 관심의 생물학 프로세스에 관련 된 기본 유전자 발현 검사 하는 기능으로 새로운 길을 열었습니다. 이러한 혁신 뿐만 아니라 그 효과 세포 기능, 유전자에 대 한 코드는 mRNA 시퀀스에서 관찰 하는 연구원을 허용 하지만 또한 비 코딩 RNA (ncRNA) 분자 번역, 하지만 여전히 남아 있는 규정 하는 기능. 연구자는 mRNA와 ncRNA 식 관찰 하는 능력, 그것은 하나 또는 다른에 집중 하는 연구에 대 한 관습 되었습니다. 그러나, 연구는 mRNA와 ncRNA 식으로 관심이 있다, 여러 번 사용 별도 샘플 검사 코딩 또는 비 코딩 RNAs 라이브러리 준비에 차이 때문에. 이 시간, 소모품 및 동물 스트레스를 증가 시킬 수 있는 더 많은 샘플에 대 한 필요 발생할 수 있습니다. 또한, 그것은 하나의 분석, 일반적으로 mRNA, 조사 될 수 있는 생물 학적 질문의 수를 제한에 대 한 샘플을 준비 하기로 하는 연구자를 발생할 수 있습니다. 그러나, ncRNAs 효과 mRNA 식 규제 역할을 가진 여러 클래스를 스팬. 중요 하기 때문에 ncRNA 기본적인 생물 학적 프로세스와 이러한 프로세스에서의 장애를 감염 하는 동안, 그들은 따라서, 치료제에 대 한 매력적인 목표를 만들 수 있습니다. 이 원고는 세대에 대 한 수정된 프로토콜을 보여줍니다 mRNA 및 비 코딩 RNA 식 라이브러리, 전 혈의 단일 샘플에서 바이러스 성 RNA를 포함 하 여. 이 프로토콜의 최적화 RNA의 순도 향상, 갠 RNAs의 복구용 결 찰을 증가 하 고 더 많은 RNA의 캡처 수 있도록 크기 선택, 생략.

우리의 연구에서 대표 샘플 globin ribo 고갈 전체 혈액 샘플은. 7 (그림 1을)와 260/280 nm 농도 비율 2 (그림 1b와 1 c) 이상에 RNA 무결성 번호 (린)와 globin 고갈된 라이브러리 샘플 프로토콜의 대표적인 결과 의하여 이루어져 있다. 유효성 검사 샘플 결과의 각 도서관의 최종 농도 주고 분 광 광도 계를 사용 하 여 수행한 및 칩 기반 그래프 표시 (mRNA 또는 ncRNA)는 분자 캡처된 봉우리의 린 번호를 주고 전기 이동 법에 따라 풀링 및 시퀀싱 전에 라이브러리 샘플 크기를 삽입 합니다. 현재 연구에 대 한 초점 mRNA와 작은 ncRNAs만 배치 했다. MRNA 라이브러리에 대 한 대표적인 결과 ~ 280에서 electropherogram 피크는 bp (<stro...

여기, 우리가 코딩 (mRNA)의 처리를 위해 최적화 된 프로토콜을 제시 하 고 비 코딩 (ncRNA) globin 단일 전체 혈액 샘플에서 RNA-seq 라이브러리를 감소.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

이 방법은 숙주 아미노 반응에 관여하는 코딩, 비코딩 및 바이러스 RNA 발현뿐만 아니라 병원체가 숙주의 생물학적 기능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 검사함으로써 숙주 병원체 상호 작용연구에서 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 단일 전혈 샘플에서 글로빈 감소 된 RNAeq 라이브러리에서 mRNA 및 비 코딩 RNA의 처리에 최적화 된 프로토콜을 제시한다. 이 기술을 시연하는 것은 제 실험실의 기술자인 사라 앤더슨(Sarah Anderson)이 될 것입니다.실온에서 10분 동안 50 20회 G에서 혈액튜브를 원심분리하는 것으로 시작합니다. 생물학적 안전 캐비닛에서 작업한 후 상퍼를 제거한 후 8밀리리터의 RNase 없는 물을 펠릿에 추가합니다. 튜브를 닫고 펠릿이 눈에 띄게 용해될 때까지 펠릿을 소용돌이게 한 다음 실온에서 10 분 동안 50 20 회 G에서 튜브를 원심 분리하여 펠릿을 복구합니다.생물학적 안전 캐비닛에서 작업, 상체를 폐기하고 펠릿을 저장합니다. 총 RNA를 분리하려면, 펠릿에 리시스 결합 버퍼의 300 마이크로 리터를 파이펫팅으로 시작합니다. 소용돌이 후, 새로운 라벨1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 각 튜브에서 혼합물을 전송.miRNA 격리 키트에서 30 마이크로리터의 균질 첨가제를 추가합니다. 튜브를 소용돌이치며 얼음 위에 10분 간 놓습니다. 연기 후드에서 작업, 얼음에서 튜브를 제거하고 키트와 소용돌이에서 산 페놀 클로로폼 시약의 300 마이크로 리터를 추가하여 혼합합니다.실온에서 5분 동안 10, 000회 G에서 원심분리한 후, 새로운 튜브에 수상으로 조심스럽게 제거합니다. 이전 단계에서 수성 회복의 양을 기준으로, 혼합각 튜브 및 파이펫의 수성 파지에 100%에탄올의 1.25 배의 부피를 추가합니다. 각 샘플에 대해 필터 카트리지가 포함된 신선한 수집 튜브를 준비합니다.파이펫 약 675 마이크로리터의 용액-에탄올 혼합물을 필터 카트리지에. 원심분리기는 10, 000회 G에서 간단히 원심분리기를 사용하여 필터를 통해 액체를 전달합니다. 흐름을 삭제합니다.용액 에탄올 혼합물을 필터와 원심분리에 추가하여 완전히 사용될 때까지 반복합니다. 키트에서 필터 카트리지에 700 마이크로리터의 워시 솔루션을 추가합니다. 원심분리기는 필터를 통해 솔루션을 간단히 가져옵니다.흐름을 버리고 동일한 필터 카트리지와 수집 튜브를 유지합니다. 각 필터 카트리지에 500 마이크로리터의 워시 솔루션 2-3을 추가합니다. 원심분리 후 흐름을 버리고 세척 단계를 반복합니다.필터 카트리지에서 잔류 액체를 제거하려면 60초 더 회전합니다. 카트리지를 신선한 수집 튜브로 옮기습니다. 각 필터 카트리지의 중앙에 95도 예열된 뉴클레아제 없는 물의 100마이크로리터를 추가합니다.최대 속도로 탁상 원심분리기에서 약 20~30초 동안 카트리지를 원심분리합니다. 글로빈 환원 올리고스를 사용하여 혼성화를 발효시키기 위해, 먼저 추출된 각 샘플을 0.2 밀리리터 얇은 벽핵반응튜브에 첨가하여 RNA를 분해한다. 튜브를 열 사이클러에 70°C의 70도에서 2분간 배치합니다.그 후, 즉시 최적의 RNA 품질을 얻기 위해 얼음에 튜브를 배치합니다. 튜브가 냉각되는 동안, 2 밀리리터 튜브에 10X 글로빈 감소 올리고 믹스와 10X 올리고 혼성화 버퍼의 400 마이크로리터를 준비합니다. 혼성화 믹스를 만들기 위해, RNA 샘플 6 마이크로그램, 10X 글로빈 환원 올리고 믹스의 마이크로리터 2개, 10X 올리고 혼성화 완충제의 1마이크로리터, 뉴클레아제 프리 워터를 각각 0.2 밀리리터 박벽, 뉴클레아스 프리 반응 튜브에 10 마이크로리터의 최종 부피에 추가한다.튜브를 열 사이클러에 70°C의 섭씨 70도에 2분간 놓습니다. 그 후, 즉시 얼음에 튜브를 배치합니다. RNase H 소화를 수행하려면 먼저 10X RNase H를 하나의 X RNase H 버퍼로 1개의 X RNase H로 희석합니다.10X RNase 버퍼의 마이크로리터 2개, RNase 억제제 1편, X RNase H 1개 소리터 2개, 뉴클레아제 없는 물의 5마이크로리터를 총 10마이크로리터에 결합하여 RNase H 반응 혼합을 준비한다. RNase H 반응 믹스의 10 마이크로리터를 글로빈 감소 혼성화 샘플에 추가하고 철저히 혼합합니다. 이 반응을 섭씨 37도에서 10분간 소화한 다음 섭씨 4도까지 식힙니다.튜브에 0.5 개의 어금니 EDTA의 마이크로 리터 1개를 추가하여 소화를 멈추고 튜브의 전체 함량을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 그 직후, RNase 가 없는 물 80마이크로리터, 350마이크로리터의 용해 완충제, 각 튜브에 100% 에탄올 250마이크로리터를 넣고 파이펫팅으로 잘 섞습니다. 각 700 마이크로리터 샘플을 2밀리리터 수집 튜브에 배치된 별도의 용출 필터 카트리지로 전송하여 유동을 수집합니다.원심분리기는 8, 000배 이상에서 15초 동안 원심분리기를 한 다음 흐름을 폐기합니다. 동일한 용출 필터 카트리지를 새로운 2밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지 멤브레인을 세척하려면 필터 카트리지와 원심분리기 500마이크로리터를 8, 000배 이상에서 15초 간 추가합니다.흐름을 삭제합니다. 그런 다음 동일한 수집 튜브를 사용하여 필터 카트리지에 80%에탄올의 500 마이크로리터를 추가합니다. 8, 000 배 G에서 2 분 동안 원심 분리기 및 더 큰.흐름 통과 및 수집 튜브를 모두 폐기하고 용출 스핀 컬럼을 저장합니다. 각 용출 스핀 컬럼을 새로운 2밀리리터 컬렉션 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지의 열린 뚜껑을 통해 5분간 전속력의 원심분리기는 스핀 컬럼 멤브레인을 건조시키고 에탄올 이월을 방지합니다.수집 튜브를 폐기한 후 말린 필터 카트리지를 1.5밀리리터 수집 튜브에 넣습니다. 필터 카트리지 멤브레인의 중앙에 직접 RNase가 없는 물 14마이크로리터를 추가합니다. RNA를 elute하기 위하여는, 최고 속도로 60 초 동안 관을 원심분리하고 추가 RNA 평가 및 준비로 계속합니다.글로빈 고갈된 시료는 이제 분할되어 작은 비코딩 RNA 라이브러리뿐만 아니라 리보 고갈된 mRNA 및 길고 비코딩 RNA 라이브러리를 준비하는 데 사용될 수 있다. 이 프로토콜을 사용하여 글로빈 고갈 및 리보 고갈된 전혈 샘플의 발현 라이브러리를 준비한 후, 전기 포근 파일 실행 요약은 6.3에서 9.2까지 범위의 RNA 무결성 번호를 가진 글로빈 고갈 된 라이브러리 샘플을 보여 주었다. 이것은 글로빈 고갈 방법을 사용하고 단지 6에 가까운 RIN 숫자를 달성할 수 있었다 그밖 연구 결과에 비해 개선된 것으로 판명되었습니다.단일 돼지 전혈 샘플의 사전 글로빈 감소 및 글로빈 후 감소는 260 에서 280 나노미터 농도 비율이 2 개 이상임을 보여주었다. 이 프로토콜을 사용하여, 풀링 및 시퀀싱 전에 글로빈 및 리보 고갈된 전혈 mRNA 라이브러리 샘플의 칩 기반 전기페로그램이 얻어졌다. mRNA 라이브러리의 경우, 대표적인 전기 페로그램은 약 280개의 베이스 쌍에서 피크를 갖는다.작은 ncRNA 대표 칩 기반 전기 페로그램은 약 100에서 400 베이스 쌍까지 의 피크의 범위를 포함한다. 약 143개의 베이스 쌍의 피크는 miRNAs에 해당하며, 약 153개의 베이스 쌍의 피크는 piRNAs에 해당합니다. 이 절차를 시도하는 동안, 지적 된 즉시 얼음 튜브를 기억하는 것이 중요합니다.이 절차에 따라, 다음 세대 염기서열 분석과 같은 그밖 방법은 차동 표현, 후성 유전학 변경 및 생물학 통로 및 프로세스에 그 효력과 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행되어야 합니다. 페놀 클로로폼 시약으로 작업하는 것은 매우 위험하며 연기 후드에서 작업하는 것과 같은 예방 조치를 취해야한다는 것을 잊지 마십시오. 또한, 전혈 또는 전염성 유기체를 취급할 때, 전염하는 유기체의 활성화의 앞에 생물학적 안전 캐비닛에서 작동을 수행해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

RNA 시퀀싱과 생물 정보학 분석은 마우스 EMLcells의 린-CD34 + 린-CD34- 부분 집단에서 유의 및 발현 된 전사 인자를 식별하는 데 사용되었다. 이들 전사 인자는 자기 갱신 린-CD34 +를 부분적으로 분화 된 린 - CD34- 세포 사이의 스위치를 결정하는데 중요한 역할을 할 수도있다.

RNA 시퀀싱 분석하여 EML 조혈 전구체 세포의자가 재생 (self-renewal)과 분화를 조절하는 중요한 요소의 식별

스트레스에 적응하는 세포의 능력은 세포의 생존에 매우 중요합니다. mRNA 번역의 조절은 그러한 적응 전략 중 하나로, 단백질체의 빠른 조절을 제공합니다. 여기에서는 스트레스 조건에서 선택적으로 번역되는 특정 mRNA를 식별하기 위해 표준화된 폴리솜 프로파일링 프로토콜을 제공합니다.

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후 성적인 요소는 유전자 발현을 조절 하 고 B 세포 기능을 조절 하는 유전자 프로그램으로 작용할 수 있습니다. 결합 하 여 체 외에서 B 세포 자극, qRT-PCR, 및 높은 처리량 예측에 관한 시퀀스 및 mRNA 순서 접근, 우리 B 세포에서 miRNA 및 유전자 표현의 epigenetic 변조를 분석할 수 있습니다.

MicroRNAs 받 클래스 스위치 DNA 재조합 및 플라즈마 세포 차별화에 B 세포 유도에서 mRNAs의 게놈 넓은 분석의 HDAC 억제제 중재 변조

여기, 우리는 Arabidopsis thaliana 엽초 엽 원형체에 적용된 상호 작용 캡처 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 생체 내 UV 가교 결합에 비판적으로 의존하며 생리 환경으로부터 식물 mRNA 결합 단백질의 분리 및 동정을 허용합니다.

식물 원형질에서 mRNA Interactome 캡처

나노 기 공 시퀀싱은 원격 지에서 비용 효과적인 시퀀싱을 허용 하는 새로운 기술 이며 리소스 부족 설정입니다. 여기서, 우리는 이러한 조건과 호환 되는 전 혈에서 mRNAs의 시퀀싱을 위한 프로토콜을 제시 한다.

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여기서, 우리는 리보태그 시스템을 사용하여 성인 남성 마우스 생식세포의 선택집단으로부터 리보솜 및 관련 RNA의 면역침전을 기술한다. 전략적 번식과 신중한 면역 침전은 세균 세포 트랜스라토메에 알리고 돌연변이 표현형의 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 깨끗하고 재현 가능한 결과를 초래합니다.

남성 마우스의 생식 세포에서 리보태그 면역 강하

이 프로토콜은 자동화된 그래디언트 메이커 또는 그래디언트 분별 시스템을 사용하지 않고 폴리솜 프로파일을 생성하는 방법을 설명합니다.

그래디언트 메이커 또는 분획 시스템이 없는 폴리솜 프로파일링

공동 번역 상호 작용은 초기 체인 수정, 타겟팅, 폴딩 및 조립 경로에서 중요한 역할을합니다. 여기에서, 우리는 선택적 리보솜 프로파일링, 생체 내에서, 모델 진핵생물 사카로마이세스 세레비시아에서 이러한 상호작용의 직접적인 분석을 위한 방법을 설명한다.

선택적 리보솜 프로파일링을 통한 공동 번역 상호 작용 네트워크의 글로벌 식별

리보솜을 번역하면 코돈 당 세 개의 뉴클레오티드를 펩티드로 해독합니다. 리보솜 프로파일링에 의해 포착된 mRNA를 따른 그들의 움직임은 특징적인 삼중항 주기성을 나타내는 발자국을 생성한다. 이 프로토콜은 RiboCode를 사용하여 리보솜 프로파일링 데이터에서 이 두드러진 기능을 해독하여 전체 전사체 수준에서 활발하게 번역된 열린 판독 프레임을 식별하는 방법을 설명합니다.

데 노보 리보솜 프로파일링 데이터를 사용하여 능동적으로 번역된 오픈 리딩 프레임 식별

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

학습하세요 돼지 전혀에서 코딩 및 비코딩 RNA를 동시에 분석하는 최적화된 RNA-seq 프로토콜. 글로빈 감소와 RNase H 소화를 활용하여 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적인 고품질 RNA 라이브러리를 준비하는 방법을 익히세요.

코딩 및 비 코딩 RNA 클래스의 식별 표시 돼지에서 전 혈

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