Name: 단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 배우세요 수동 정렬을 이용한 마우스 뉴런 단일 세포 RNA 시퀀싱 방법입니다. 형광 표지된 GABAergic 뉴런을 분리하여 고품질 전사체 데이터를 획득하고 뉴런 하위집단의 유전자 발현 패턴을 분석할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 NIH (5R01MH094705-04와 Z.J.H.에 R01MH109665-01)에서 교부 금에 의해, CSHL 로버트 슨 신경 과학 기금 (Z.J.H.)에 의해 고 NARSAD 장래가 화목 (되)에 의해 지원 되었다.

<ol><li>Macosko, E. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+Parallel+Genome-wide+Expression+Profiling+of+Individual+Cells+Using+Nanoliter+Droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells Using Nanoliter Droplets.</a> Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).</li>
<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
<li>Xin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+Fluidigm+C1+platform+for+RNA+sequencing+of+single+mouse+pancreatic+islet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Use of the Fluidigm C1 platform for RNA sequencing of single mouse pancreatic islet cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3293-3298 (2016).</li>
<li>Gao, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanogrid+single-nucleus+RNA+sequencing+reveals+phenotypic+diversity+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nanogrid single-nucleus RNA sequencing reveals phenotypic diversity in breast cancer.</a> Nature Communications. 8 (1), 228(2017).</li>
<li>Yuan, J., Sims, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Automated+Microwell+Platform+for+Large-Scale+Single+Cell+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">An Automated Microwell Platform for Large-Scale Single Cell RNA-Seq.</a> Scientific Reports. 6, 33883(2016).</li>
<li>Eberwine, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+gene+expression+in+single+live+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Analysis of gene expression in single live neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (7), 3010-3014 (1992).</li>
<li>Hashimshony, T., Wagner, F., Sher, N., Yanai, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEL-Seq%3A+Single-Cell+RNA-Seq+by+Multiplexed+Linear+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">CEL-Seq: Single-Cell RNA-Seq by Multiplexed Linear Amplification.</a> Cell Reports. 2 (3), 666-673 (2012).</li>
<li>Paul, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+Architecture+of+Synaptic+Communication+Delineates+GABAergic+Neuron+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transcriptional Architecture of Synaptic Communication Delineates GABAergic Neuron Identity.</a> Cell. 171 (3), 522-539 (2017).</li>
<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사 다는 것을 선언 합니다.

프로토콜을 정렬 매뉴얼은 인구 밀도 쥐 두뇌에서 표시 또는 현재 높은 처리량 셀을 사용 하 여 공부 가능 하지 않은 희소 한 세포 인구를 대표 하는 신경의 감독된 RNA 시퀀싱에 적합 정렬 및 증폭 방법입니다. FACS를 보통 복종 셀 노즐 크기에 따라 ~ 9-14 psi의 범위에서 칼 집 및 샘플 라인 압력을 받 다 고 원하는 이벤트 요금. 또한, 노즐에서 배출 되 고, 시 셀 수 토지 하드 컬렉션 튜브 또는 우물 영향 스트레스를 일으키는 샘플 버퍼 코팅의 표면에. 수동 정렬 하는 동안 같은 높은 압력 적 적용 됩니다, 셀 모 세관 작용에 의해 피펫으로 빨려 고 부드럽게 밖으로 그들을 부과 단순히 유리 펫의 팁에 의해 퇴 학. 디바-Seq 프로토콜은 작은 세포 볼륨 세포에서 RNA 증폭에 유용 (< 8 µ L) 시작 물자 및 일관 되 게 수익률 많은 감지 유전자 (8-10 K)의 낮은, 깊은 시퀀싱과 결합 하면 세부에 대 한 세포질 기능 기본 셀 정체성8,...

단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq) transcriptomic 연구 변신 했다. 대규모 단일 셀 RNAseq 다양 한 방울1,2, 마이크로3, nanogrids4, microwells5와 같은 기술 사용 하 여 수행할 수 있지만 대부분 메서드 정의 된 셀을 정렬할 수 없습니다. 그 유전자 인코딩된 fluorophores를 표현 한다. 선택 세포 인구를 격리 하려면 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 단일 셀 모드에서 레이블이 지정 된 셀을 정렬 하려면 종종 사용 됩니다. 그러나, FACS 몇 가지 제한 사항이 있으며 세심 한 샘플 처리 단계가 필요 합니다. 첫째, 입력된 셀의 많은 수는 일반적으로 상당한 분수 (종종 몇 백만 셀 mL 당), 필요 (> 15-20%) 레이블이 지정 된 인구를 포함 하. 둘째, 셀 준비 조밀도 기온 변화도 원심 분리 단계 폐해 분수, 파편, 및 그렇지 않으면 노즐 또는 흐름 셀을 방해할 수 있습니다 세포 덩어리를 제거 하의 여러 라운드를 필요할 수 있습니다. 셋째, FACS 일반적으로 얼룩이 지 고 라이브/죽은 (예를 들어, 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), propidium 요오드 화물 (PI), 및 Cytotracker 염료) 얼룩, 추가 시간을 소요 하기 위한 단계를 destaining을 사용 합니다. 넷째, 엄지손가락의 규칙 2-색상 정렬 (예: DAPI 및 그린/레드 형광 단백질 (GFP/RFP)), 일반적으로 두 개의 예제 및 컨트롤은 필요에 따라 원하는 마우스 긴장 뿐만 아니라 처리 됩니다 레이블된 샘플을 요구. 다섯째, 필터링은 종종 수행 하기 전에 여러 번 샘플 FACS 기계에 막힌된 샘플 라인을 사전 방지 하기 위해 정렬 하는 동안. 여섯째, 가장 일반적으로 사용 되 FACS 설정을 초기화 하 고 유체 흐름을 안정화 고 방울 캘리브레이션을 수행에 시간을 할당 해야 합니다. 예제는 일반적으로 보상 행렬, 더블 릿 거부 설정, 중 문, 등 사용자 설정 단계 6과 7 스스로 미리 또는 필요에 대 한 실제 샘플 컬렉션 이전 순서 대로 실행 하는 7, 제어는 동시에 기술자의 지원입니다. 마지막으로, 포스트-FACS, 종종 하나의 분류에 셀에 각 잘; 있는지 확인 하는 단계는 예를 들어 빠른 판 영상 등이 콘텐츠 심사 설치에 샘플 검사 여.
위에서 설명한 단계를 우회 하 여 붙일 레이블이 단일 뉴런의 작은 인구의 시퀀싱을 대상으로 비교적 빠른 촉진 수동 절차 뒤에 매우 민감한 체 외 의 2 라운드 정렬 설명 증폭 프로토콜, 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 두 번 시험관 전사 라는. RNA 증폭 및 cDNA 라이브러리 생성은 Eberwine 그 외 여러분 에서 적응 6 와 Hashimshony 외. 7, 작은 세포 볼륨; 있는 마우스 수에 맞게 특정 수정 또한, 우리는 또한 흥분 성의 피라미드 뉴런에 대 한 동등 하 게 유용 하다 발견.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA 스파이크인 제어 믹스</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>RNA 단편화 완충액</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>남극 포스파타제</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>폴리 뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligase2, 잘린</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp 자석&nbsp; 비즈</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect 크기 선택 마그네틱 비즈</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat# 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat# 1078</td><td></td></tr><tr><td>Protease from Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# P5147</td><td></td></tr><tr><td>Message Amp II kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA 키트</td><td>Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>바이오분석기 RNA Pico 칩</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>바이오분석기 고감도 DNA 칩</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>바이오분석기 2100</td><td>애질런트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIC 광학 장치를 사용한 형광 및 명시야 조명을 사용한 해부 현미경.&nbsp; (라이카 모델 MZ-16F).</td><td>라이카</td><td>모델 MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>유리 미세 모세관: 붕규산 모세관 500/pk. OD= 1mm, ID=0.58mm, 벽= 0.21mm, 길이= 150mm.</td><td>Warner Instruments</td><td>모델 GC100-15, 주문# 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>모세관 피펫 풀러</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 조직 냉각 장치</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 셀 rna 시퀀싱 시퀀싱 (디바-seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

단일 셀 RNA 시퀀싱 (RNA-seq)은 지금 유전자 발현 시 금 한 널리 구현 된 도구 이다. 상업적으로 사용 가능한 단일 셀 RNA 시퀀싱 플랫폼 무차별 모든 입력된 셀 처리합니다. 때때로, 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 관심의 구체적으로 레이블이 지정 된 인구를 분리 하 상류 사용 됩니다. FACS의 한계는 수집 하 고 쥐의 뇌에서 드문 또는 띄엄띄엄 레이블이 신경 인구를 프로 파일링에 대 한 실용적인 크게 레이블이 분수 입력된 셀의 높은 숫자에 대 한 필요는. 여기, 우리는 수동으로 수집 스파스 붙일 갓에서 단일 뉴런을 표시 해리 마우스 뇌 조직에 대 한 메서드를 설명 합니다. 이 프로세스는 높은 순도와 생체 외에서 전사 기반 증폭 프로토콜 생 성적 비율을 유지 하는 후속 통합 단일 레이블 뉴런을 캡처에 대 한 수 있습니다. 개별 mRNA 카운트를 생성 하기 위해 독특한 분자 식별자 (Umi)를 사용 하는 이중 선형 증폭 방법을 설명 합니다. 증폭 결과 단일 셀 당 유전자 검출의 높은 학위에서의 2 라운드.

위에서 설명한 프로토콜을 사용 하 여, GABAergic 신경 했다 수동으로 정렬 (그림 1) 고 RNA는 증폭, cDNA 라이브러리 (그림 2)로 그리고 높은 깊이8시퀀스. 증폭된 RNA (aRNA) 제품 500 위에 약간 피크 분포와 크기에서 200-4000 bp 사이 원거리 bp (그림 3A). 비드 정화 cDNA 라이브러리 추가 구슬 200 보다 작은 파편 제거를 사용 하 여 정화의 두 번째 라운드에 의해 크기 제한 했다 bp (그림 3B 와 3c)와 ~ 350에서 피크와 혈압. 데 짧은 조각 이어질 것입니다 빈 읽기 (아니 mRNA 삽입, 유일한 어댑터 및 뇌관 시퀀스), 반면 ...

이 프로토콜 수동을 정렬 mRNA 증폭 높은 깊이 단일 셀 RNA 시퀀싱 전사 기반 생체 외에서 다음 단일 붙일 레이블된 신경 세포를 분리 하는 절차에 설명 합니다.

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

이 방법은 단일 뉴런 격리 및 시퀀싱 분야의 주요 장애물을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다. 특정 인구 또는 사용자 정의 뇌 영역에서 형광으로 표지 된 뉴런의 하위 집단을 수집하는 것과 같은. 이 기술의 주요 장점은 관심의 단일 뉴런이 파편을 오염하지 않고 포획되도록 한다는 것입니다.그것은 또한 상대적으로 부드러운, 기존의 FACS 정렬의 유체 압력을 실시 하는 경우 신속 하 게 죽는 깨지기 쉬운 신경 유형에 대 한 중요 한. 모세관 풀러를 사용하여 10 내지 15 미크로네 출구 직경을 가진 당겨진 유리 미세 모세 혈관을 준비하여 시작합니다. 미세 한 가위를 사용하여 모세관의 끝을 잘라 원하는 보드 직경을 가져옵니다.그런 다음 튜브 커넥터를 사용하여 0.2 마이크론 PVDF 멤브레인 주사기 필터와 양방향 튜브 밸브에 0.8 밀리미터 내부 직경의 유연한 실리콘 튜브의 120 ~ 150센티미터 길이를 부착합니다. 차가운 인공 뇌 척수액 또는 ACSF의 500 밀리리터를 준비하고 15 분 동안 에어스톤을 통해 또는 용액이 완전히 지울 때까지 5 %의 이산화탄소 균형 산소를 버블링하여 산소를 공급하십시오. ACSF 100 밀리리터를 포함하는 150밀리리터 비커 3개를 준비합니다.하나에, 활동 차단제의 칵테일을 추가합니다. 다른 하나에, 밀리 리터 당 1 밀리 그램의 최종 농도에 프로테아제대 연쇄상 구균 분획을 추가합니다. 최종 비커에 FBS를 1%의 최종 농도에 추가하고 에어스톤을 통해 이산화탄소 균형 산소를 5%로 산소화합니다.마지막으로, 출구 직경이 줄어 있는 세 개의 긴 파스퇴르 파이펫을 화염 위로 굴려 서 십시오. 작은 가위로 두개골을 열고 피질을 손상시키지 않고 미세 포셉을 사용하여 신선한 뇌를 추출하여 안락사 마우스에서 뇌를 해부하십시오. 절제 기간 동안 5%의 이산화탄소 균형 산소에 부착된 에어스톤을 남기고, 차갑고 산소가 공급되는 ACSF에 뇌를 배치합니다.뇌를 진동 척에 배치하고 관상 또는 처진 부분을 300 미칸 두께로 자른다. 최소 10~50개의 라벨이 부착된 셀을 얻기 위해 필요에 따라 많은 섹션을 수집합니다. 비커 안에 놓인 면 메쉬 슬라이스 홀더에 슬라이스를 넣어 산소가 공급되는 ACSF로 목욕합니다.액티비티 블로커를 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하고 에어스톤을 사용하여 산소를 부각시키면서 실온에서 15~20분 동안 차단합니다. 프로테제스 용액을 사용하여 ACSF가 포함된 비커로 슬라이스를 이동하여 실온에서 가벼운 소화를 수행합니다. 소화후 실온에서 액티비티 블로커 용액을 사용하여 ACSF를 함유한 비커로 슬라이스를 다시 이동하여 프로테아제를 씻어내라.거품 산소를 유지합니다. 다음으로 실온에서 1%의 FBS가 포함된 ACSF가 포함된 100mm 페트리 접시를 준비하고 개별 섹션을 마이크로절을 위해 디스크로 이동합니다. 형광 해부 범위하에서, 마이크로 해부 영역 및 최소 10 ~ 50 세포를 갖는 관심층에 미세 집게 쌍을 사용합니다.파스퇴르 파이펫을 사용하여 ACSF 솔루션에서 약 0.8 밀리리터를 포함하는 2밀리리터 미세 원심 분리기 튜브로 마이크로 해부 된 조각을 이동합니다. 실온에서 마이크로 퍼지 튜브에 해부 된 조직을 적시. 가장 크고 가장 작은 출구 직경으로 끝나는 각 화염 파스퇴기 파이펫으로 약 10 스트로크를 수행합니다.해리된 세포를 산소ACSF를 함유한 100mm 페트리 접시에 분배하고 세포가 점진적으로 정착할 때까지 5~7분 정도 기다립니다. 해부 현미경하에서 GFP 및 RFP 신호를 관찰한다. 밝은 필드 조명 아래에서 형태를 검사하여 이물질을 식별합니다.이물질이 거의 없는 세포의 영역이 확인되면 모세관을 사용하여 튜브에 부착하여 튜브 밸브의 끝을 혀로 차단하여 세포를 선택하십시오. 그런 다음 모세관을 세포에 가깝게 배치합니다. 모세관의 블록을 방출하고 모세관 작용을 사용하여 세포를 캡처하기 위해 다시 신속하게 차단합니다.모세관을 신선한 산소 ACSF로 100mm 페트리 접시로 옮기고 형광 광학 에서 모세관 팁을 관찰하면서 튜브로 부드럽게 날려 세포를 접시에 분배합니다. 100~150개의 세포가 수집될 때까지 수집 절차를 반복하여 이물질과 같은 오염물질이 밝은 필드 차동 간섭 대조 광학에서 최소화되도록 합니다. 마지막으로, 매번 신선한 마이크로 모세관 파이펫을 사용하여 단일 셀을 선택하고 0.5 마이크로리터를 0.5 마이크로리터로 추방하여 프라이머를 함유한 샘플 수집 버퍼 1마이크로리터를 포함하는 0.2 마이크로리터 마이크로 퍼지 튜브로 추방합니다.마이크로 퍼지 튜브의 파이펫 팁을 깨고 셀이 수집 버퍼에 머물수 있도록 합니다. 마른 얼음에 튜브를 넣어 세포를 동결. RNA 증폭을 위한 처리될 때까지 영하 80도 냉동고에 보관하십시오.GABAergic 뉴런은 마우스 뇌의 cingulet 피질에서 분리되었다. 수동으로 정렬된 뉴런으로부터 증폭된 RNA는 500개의 베이스 쌍 보다 약간 높은 피크 분포를 가진 크기가 200에서 4, 000의 베이스 쌍 사이를 배회했다. 비드 정화 후, cDNA 라이브러리는 200개 미만의 베이스 쌍과 약 350개의 베이스 쌍에서 피크를 제거하기 위해 구슬을 이용한 2차 정화에 의해 더욱 제한된다.시퀀싱은 셀당 4.8배 10배, 5위 중앙값6.9배 10회 10회, 셀당 5일 평균 매핑판독을 보였다. UMIs를 사용하여 RNA를 중복한 후, 각 단일 세포는 5번째 중앙값으로 1.0배 또는 1.4배 10배, 세포당 5번째 평균 고유 판독을 가졌다. 각 단세포 외부 RNA 대조컨소시엄에서, RNA의 스파이크는 시료에 첨가된 절대 분자수를 계산하기 위해 내부 대조군으로 사용되었다.0.92의 경사와 0.94의 조정 된 R 사각형으로 관찰 된 카운트에 입력의 선형 관계가 있었다. 단일 뉴런 당 약 10, 000 유전자의 평균6, 000 개 이상의 유전자를 검출 하는 단일 세포의 95% 이상이 절차를 사용 하 여 검출 되었다. 개발 후, 이 기술은 분자 생물학자가 뚜렷한 잘 특징적인 마우스 피질 인터뉴런의 전사체를 탐구할 수 있는 길을 열어주었으며, 세포 정체성에 대한 코딩을 담당하는 엄선된 유전자 범주를 확인했습니다.

single-cell-rna-sequencing-fluorescently-labeled-mouse-neurons-using

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런을 분리하는 방법을 보여줍니다.

쥐의 뇌에서 형광 표지된 뉴런 분리

고품질 총 RNA는 70% 에탄올에 Azure B로 척수 섹션을 염색한 후 레이저 포획 마이크로디스트섹션에 의해 마우스 척수 모터 뉴런의 세포체로부터 제조되었다. 충분한 RNA(~40-60 ng)는 RNA-seq 및 qRT-PCR에 의한 하류 RNA 분석을 허용하기 위해 3,000-4,000개의 모터 뉴런으로부터 회수된다.

레이저 포획 미세 절에 의해 마우스 척수 모터 신경 세포 체에서 전사 분석을위한 RNA의 생산

우리는 성체 쥐 뇌의 뇌실하부(SVZ)에서 신경줄기세포(NSC)와 그 자손을 분리하기 위한 FACS(Fluorescent Activated Cell Sorting) 기반 방법을 보고합니다. FUCCI(Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator) 형질전환 마우스에 적용되어 라이브 이미징을 통한 세포 주기 진행을 연구할 수 있습니다.

셀 성인 마우스 뇌실 영역에서 신경 줄기 및 전구 세포의 정렬과 세포주기 역학의 라이브 이미징

파킨슨 병 (PD)에서 Substantia 그라 (SNC) 도파민 신경 세포는 운동 기능 장애로 이어지는, 퇴화. 여기에서 우리는 티로신 하이드 록 (TH) 프로모터 서열에 의해 구동 eGFP는 표현 마우스에서 복부 중뇌 신경 세포를 배양하는 문화에서 개별 형광 신경 세포를 수확하고, RNA-서열을 사용하여 사체를 측정하기위한 프로토콜을보고합니다.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

우리는 초기 마우스 배아에 있는 microRNAs를 프로파일링하기 위한 기술을 기술합니다. 이 프로토콜은 낮은 세포 입력 및 작은 RNA 농축의 도전을 극복합니다. 이 분석은 초기 마우스 배아의 상이한 세포 계보에서 시간이 지남에 따라 miRNA 발현의 변화를 분석하기 위하여 이용될 수 있다.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

여기에 제시된 것은 형광 활성화 핵 (FAN) 분류를 통해 대부분의 뉴런을 배제하는 마우스 치아 이랑에서 분리 된 단일 핵을 서열화하는 방법입니다. 이 접근법은 고품질 발현 프로필을 생성하고 신경 줄기 세포와 같은 희소 한 집단을 포함하여 틈새 시장에서 대표되는 대부분의 다른 세포 유형에 대한 연구를 용이하게합니다.

해마 신경인성 틈새를 연구하기 위해 단일 핵 RNA 시퀀싱과 결합된 뉴런의 형광 활성화 핵 음성 분류

이 논문은 단일 세포 및 핵의 염기서열 분석을 위한 gastrulating mouse embryos의 고품질 single-cell 및 nuclei suspensions를 위한 파이프라인을 설정합니다.

돌연변이 전체 마우스 배아의 단일 세포 RNA 염기서열 분석: epiblast에서 gastrulation 말기까지

이 프로토콜은 유세포 분석과 단일 세포 RNA 시퀀싱을 결합하여 출생 후 초기 마우스 뇌의 소뇌에서 미세아교세포 상태를 분리하고 특성화합니다. 효소 해리, Percoll 원심분리 및 면역염색을 사용하여 미세아교세포의 이질성을 밝히고 소뇌 발달 및 질병에서의 역할에 대한 이해를 향상시킵니다.

출생 후 초기 마우스 뇌 발달에서 미세아교세포 활성화를 특성화하기 위한 유세포 분석 및 단일 세포 분석

배우세요 수동 정렬을 이용한 마우스 뉴런 단일 세포 RNA 시퀀싱 방법입니다. 형광 표지된 GABAergic 뉴런을 분리하여 고품질 전사체 데이터를 획득하고 뉴런 하위집단의 유전자 발현 패턴을 분석할 수 있습니다.

단일 셀 RNA 시퀀싱 시퀀싱 (디바-Seq) 절대 수 수동 정렬 및 두 배 전사 생체 외에서 를 사용 하 여 붙일 레이블이 마우스 뉴런의

더 많은 동영상 탐색