Name: 기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: 배우세요 Zika 바이러스 항체 의존 향상 정량화 방법을 인간 면역 세포와 환자 혈청을 이용하여. 실시간 PCR로 감염 수준을 측정하여 백신 개발에 필요한 면역 반응 메커니즘을 연구합니다.

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이 작품 (T.M.C.)에 1R21AI129881-01, 국가 신흥 전염 성 질환 연구소, 그리고 보스턴 대학 학부에서 시작 자금 아낌없이 지원 했다.

이 연구에 사용 된 혈 청 샘플은 콜롬비아에서 코 호트의 인간 참가자에서 얻은 했다. 샘플 컬렉션 대학 데 팜 플로 나 (콜롬비아, 남 아메리카)와 로스 Potios 병원8내부 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인 되었다. 샘플 제공 익명으로 하 고 조사 했다 환자 정보에 액세스할 수 없습니다. 혈 청 샘플 DENV serotype 확인 했다. 샘플 추가 DENV 감염을 중화 확인 되었다 생체 외에서. 컨트롤에 대 한 미국에서 건강 한 개인 (HC)에서 혈 청 샘플 사용 되었다.
참고: 이 프로토콜은 Fcγ 수용 체를 표현 하는 모든 인간 세포 종류에 에이드의 ZIKV 복제 검사를 사용할 수 있습니다. 프로토콜의 구성 부품 (그림 1).
1. 셀 시드 및 감염 설치
참고: 이 특별 한 연구, 인간의 기본 세포 또는 U937 myelomonocytic 셀 라인 (ATCC-CRL-1593.2)에 대 한 사용 되었다. 셀 5% 이산화탄소 (CO2)와 함께 37 ° C 배양 기에서 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 보충 RPMI 성장 매체에 유지 되었다. 단계는 biosafety에 실시 했다 모든 멸 균 조건에서 2 (BSL-2) biosafety 내각 수준.
<ol><li>시드 3 x 104 셀 당 매체의 100 µ L 함께 메 마른 플랫 바닥 96 잘 접시에 고 5% CO2와 37 ° C 배양 기에 넣어.</li>
	<li>셀을 뿌리기, 후 혈 청 샘플 실 온에서 해 동 하 고 10 직렬 희석 (즉, 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000) 혈 청 자유로운 매체에 샘플을 혼합 하 여. Aliquot 살 균 96 잘 접시로 희석. 혈 청 하지 않고 바이러스를 사용 하 여 추가 제어로.</li>
	<li>ZIKV 재고 1-2 분 동안 물 목욕에서 37 ° C에서 녹여 하 고 신속 하 게 나중을 위해 얼음에 그들을 전송.</li>
	<li>혈 청 aliquots를 ZIKV 변형 MR766의 감염 (MOI) 상응 하는 금액의 0.1 다양성을 추가 합니다. 참고: 희석 비율 일정 하 게 유지 하 고 총 볼륨은 ~ 200 µ L; 다는 것을 확인합니다 그건 각 치료의 triplicates에 대 한 충분입니다. 다운스트림 분석에 대 한 부정적인 제어로 사용 하는 감염 되지 않은 3 개의 우물을 유지.</li>
	<li>양식 단지 Zika virions (편의 위해,이 "면역성이 있는 복합물" 라고 합니다)와 함께 DENV 항 체를 허용 하기 위하여 5% CO2 1 h 37 ° C 배양 기에서 추가 된 바이러스 혈 청 희석을 품 어.</li>
	<li>평면-바닥 96 잘 접시에 시드 된 셀에서 미디어 발음 워시 살 균 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (1 x PBS) x 셀.</li>
	<li>각 잘 하는 면역성이 있는 복합물의 50 µ L을 추가 하 고 2 시간에 대 한 5% CO2 37 ° C 배양 기에서 그들을 품 어.</li>
	<li>외피의 2 h 발음 세포에서 면역 단지를 포함 하는 미디어, 후는 멀티 채널을 사용 하 여 플라스틱, 그리고 세척 셀 2 x 1 x PBS 완전히 면역 단지와 연결 되지 않은 모든 virions를 제거.</li>
	<li>10 %FBS 각각을 잘 품 어 48 h에 대 한 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 세포 보충 하는 신선한 완전 한 미디어의 100 µ L를 추가 합니다.</li>
</ol>2. RNA 추출
<ol><li>인큐베이터에서 96 잘 접시를 제거 하 고 캐비닛 biosafety에 그것을 전송.</li>
	<li>미디어 발음, 세척 셀 2 x 1 x PBS, RNA 추출을 진행. 참고: RNA는 어떤 방법의 선택에 의해 추출 될 수 있다 ( 테이블의 자료를 참조).</li>
	<li>잘 당 10% β-mercaptoethanol 세포 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L를 추가 합니다. 피 펫 팁 속도 세포 절차를 가진 세포를 긁 적와 함께 적어도 5 배 아래로 버퍼 플라스틱</li>
	<li>새로운, 레이블, 살 균 1.5 mL 튜브에 세포 lysates 전송.</li>
	<li>70% 에탄올 (250 µ L)의 동일한 금액을 추가 합니다. 때까지 혼합물은 분명 4 배-5 배 아래로 플라스틱.</li>
	<li>2 mL 컬렉션 튜브에 실리 카 기반 열 표시를 혼합물 (~ 500 µ L)를 전송 및 통해 흐름 30 s. 폐기를 위해 15000 x g 에서 원심 및 동일한 컬렉션 튜브에 열을 유지.</li>
	<li>각 열에 워시 버퍼 1의 700 µ L을 추가 하 고 통해 흐름 30 s. 폐기를 위해 15000 x g 에서 원심 동일한 컬렉션 튜브에 열을 유지.</li>
	<li>30 미 삭제는 상쾌한 15000 x g 에서 각 열을 원심 분리기 세척 버퍼 2의 500 µ L를 추가 합니다. 2 x이이 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>워시 버퍼 2에서에서 새로운 2 mL 컬렉션 튜브 및 15000 x g 에서 원심 분리기 2 분 확인 실리 카 기반 열 얻을 완전히 건조 그리고 아무 에탄올에 대 한 열 왼쪽으로 이동.</li>
	<li>2 mL 튜브를 삭제 하 고 장소에 열 새로운, 살 균, 분류, 1.5 mL 복구 튜브.</li>
	<li>각 열과 1 분 15000 x g 에서 원심 분리기의 센터에서 RNase 무료 물 prewarmed (42 ° C) 30 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>복구 eluted RNA와 260 nm 파장에는 분 광 광도 계를 사용 하 여 샘플을 계량 합니다. 참고: 이상적으로, 260에서 흡 광도 값 사이의 비율을 계산 하 여 RNA의 순도 결정 nm 및 280 nm. 순화 된 RNA의 260/280 비율이 1.8-2.0 사이 이상적으로 이다.</li>
</ol>3. 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응
참고: 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응 (qRT-PCR) 보통 SYBR 녹색 나 염색, Taq DNA 중 합 효소, deoxynucleotide 된 (dNTPs), 및 수동 염료의 구성 되는 어떤 SYBR 녹색 믹스를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 모든 정량 Pcr 기계 SYBR 녹색의 검출 능력이 반응을 수행 하 고 데이터를 얻기 위해 사용할 수 있습니다. 이 실험에 대 한 1 단계 RT-PCR 키트 SYBR 녹색의 칵테일을 했다 사용 된 내가 이용한 염료, Taq DNA 중 합 효소, dNTPs, 역전사의 추가 혼합물 ( 테이블의 자료를 참조). 봉투 영역에 대 한 설계 및 ZIKV 게놈 수준의 척도를이 연구에 사용 된 뇌관 ZIKV-qF에 대 한 CCGCTGCCCAACACAAG 및 CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT ZIKV-qR에 대 한 있습니다. 컨트롤, 인간의 β-2-microglobulin (B2M) 측정 하 고 ZIKV (내부 관리 유전자)의 표현을 표준화 하는 데 사용 했다. B2M 유전자 발현이이 연구에 사용 된 척도를 뇌관 순서는 B2M qF에 대 한 CTCCGTGGCCTTAGCTGTG 및 TTTGGAGTACGCTGGATAGCCT B2M qR에 대 한 이다. 모두는 ZIKV와 B2M 유전자에 대 한 각 샘플에 대 한 3 개의 기술 복제를 넣어 확인 하십시오. RT-PCR의 설치는 아래 간략하게 설명 되어 있습니다.
<ol><li>
RT-PCR 설치
	<ol>
<li>샘플 당 RNA의 사용 100 ng</li>
		<li>각 반응에 대 한 특정 유전자의 앞으로 역 뇌관의 10 µ M 주식에서 1 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>샘플 당 역전사 믹스의 0.25 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>각 개별 반응 SYBR 녹색 믹스의 12.5 µ L를 추가 합니다.</li>
		<li>최대 25 µ L의 물 추가 합니다. 마스터 그것은 96-잘 PCR 접시에서 RNA, aliquot를 제외한 모든 위에서 언급 한 시 약의 혼합 및 마지막 RNA를 추가 확인 합니다.</li>
		<li>투명 접착 테이프를 가진 접시를 봉인.</li>
		<li>1000 x g 는 시 약을 섞어 1 분 동안에 격판덮개 원심</li>
		<li>정량 Pcr 기계에 접시를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RT-PCR 프로필 참고: 표 1에 표시 된 RT-PCR 프로필을 사용 합니다.
	<ol>
<li>보완 DNA (cDNA)의 합성을 위해 10 분 동안 50 ° C에서 샘플을 품 어.</li>
		<li>CDNA 합성 후 5 분 동안 95 ° C에서 Taq DNA 중 합 효소를 활성화 합니다.</li>
		<li>10 s 뇌관 어 닐 링 및 확장 30 60 ° C에서 95 ° C에서 변성의 40 주기를 수행 s.</li>
		<li>결국에서 추가 용융 곡선 단계 (65 ° C)를 넣어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
데이터 분석
	<ol>
<li>이상적으로, 단일 피크 1.6 이상의 경우 하나만 amplicon와 증폭 값의 존재를 확인 하는 특정 유전자에 대 한 모든 샘플에서 보여줍니다 정량 Pcr 기계는 algori를 실행 하는 데 사용 하는 프로그램에서 용융 곡선 탭을 클릭 하 여 용융 곡선을 모니터링 thm (증폭 값 정량 Pcr 기계에 의해 사용 되는 알고리즘에 따라 다름) 100% 증폭 값으로 2를 고려 합니다. 단계 사이의 최소 10 시간을 잡고 0.5 ° C 온도 단위로 사용 해야 최적의 결과 대 한 용융 곡선 프로토콜에 s.</li>
		<li>거기 다는 것을 확인 한 후 단일 amplicon 및 좋은 증폭 값을 먼저 클릭 각 샘플의 양적 주기 (Ct/Cq 값)을 Microsoft Excel로 내보내기 정량화 데이터 탭에서.</li>
		<li>스프레드시트를 사용 하 여, Ct 값을 사용 하 여 각 샘플의 평균을 계산 합니다. 다음, 수식을 클릭 하 고 평균을 선택 합니다. 각 샘플 (복제)의 평균 CT 값 추가 분석을 위해 사용 됩니다.</li>
		<li>다음, 계산 하는 수식 ΔCt을 사용 하 여 ΔCt = 평균 대상 유전자의 Ct-코네티컷 제어 유전자의 평균 (이 경우, ΔCt = 평균 ZIKV 유전자의 Ct-코네티컷 B2M 유전자의 평균).</li>
		<li>계산 하는 데이터를 정규화 하는 ΔΔCt (이 경우, ΔΔCt = ΔCt ZIKV 샘플-B2M 샘플).</li>
		<li>배 모든 정규화 단일 ΔΔCt 값에 대 한 수식 2^-(ΔΔCt)를 입력 하 여 유전자 발현을 증가 계산 합니다. 이전 연구9,10에 설명 된 대로 통계 테스트 배 증가의 결과 얻을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hayes, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+outside+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus outside Africa.</a> Emerging Infectious Diseases. 15, 1347-1350 (2009).</li>
<li>Grard, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+virus+in+Gabon+%28Central+Africa%29+-+2007%3A+a+new+threat+from+Aedes+albopictus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Zika virus in Gabon (Central Africa) - 2007: a new threat from Aedes albopictus.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 8 (2), 2681(2014).</li>
<li>Fauci, A. S., Morens, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus+in+the+Americas--Yet+Another+Arbovirus+Threat%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Zika Virus in the Americas--Yet Another Arbovirus Threat.</a> New England Journal of Medicine. 374 (7), 601-604 (2016).</li>
<li>Hawkes, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+Infectivity+of+Arboviruses+by+Specific+Antisera+Produced+in+Domestic+Fowls%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Journal+of+Experimental+Biology+and+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the Infectivity of Arboviruses by Specific Antisera Produced in Domestic Fowls.</a> Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science. 42, 465-482 (1964).</li>
<li>Musso, D., Gubler, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Zika Virus.</a> Clinical Microbiology Reviews. 29 (3), 487-524 (2016).</li>
<li>Vaughn, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+viremia+titer%2C+antibody+response+pattern%2C+and+virus+serotype+correlate+with+disease+severity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Dengue viremia titer, antibody response pattern, and virus serotype correlate with disease severity.</a> The Journal of Infectious Diseases. 181 (1), 2-9 (2000).</li>
<li>Khandia, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Dengue%2FZika+Virus+Pathogenicity+by+Antibody-Dependent+Enhancement+and+Strategies+to+Protect+Against+Enhancement+in+Zika+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Modulation of Dengue/Zika Virus Pathogenicity by Antibody-Dependent Enhancement and Strategies to Protect Against Enhancement in Zika Virus Infection.</a> Frontiers of Immunology. 9, 597(2018).</li>
<li>Londono-Renteria, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relevant+in+vitro+human+model+for+the+study+of+Zika+virus+antibody-dependent+enhancement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A relevant in vitro human model for the study of Zika virus antibody-dependent enhancement.</a> Journal of General Virology. 98 (7), 1702-1712 (2017).</li>
<li>Ganger, M. T., Dietz, G. D., Ewing, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+common+base+method+for+analysis+of+qPCR+data+and+the+application+of+simple+blocking+in+qPCR+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A common base method for analysis of qPCR data and the application of simple blocking in qPCR experiments.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 534(2017).</li>
<li>Renn, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+quantitative+real-time+RT-PCR+assay+for+determining+expression+profiles+of+types+I+and+III+interferon+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High-throughput quantitative real-time RT-PCR assay for determining expression profiles of types I and III interferon subtypes.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), e52650(2015).</li>
<li>McArthur, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+vaccines%3A+recent+developments%2C+ongoing+challenges+and+current+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Vaccines%22%5BJournal%5D)">Dengue vaccines: recent developments, ongoing challenges and current candidates.</a> Expert Review of Vaccines. 12 (8), 933-953 (2013).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humoral+cross-reactivity+between+Zika+and+dengue+viruses%3A+implications+for+protection+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Microbes+and+Infections%22%5BJournal%5D)">Humoral cross-reactivity between Zika and dengue viruses: implications for protection and pathology.</a> Emerging Microbes and Infections. 6 (5), 33(2017).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+antibody-mediated+neutralization+and+protection+against+flavivirus%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of antibody-mediated neutralization and protection against flavivirus.</a> IUBMB Life. 68 (10), 783-791 (2016).</li>
<li>Dai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+Zika+Virus+Envelope+Protein+and+Its+Complex+with+a+Flavivirus+Broadly+Protective+Antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Structures of the Zika Virus Envelope Protein and Its Complex with a Flavivirus Broadly Protective Antibody.</a> Cell Host & Microbe. 19 (5), 696-704 (2016).</li>
<li>Sirohi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3.8+A+resolution+cryo-EM+structure+of+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The 3.8 A resolution cryo-EM structure of Zika virus.</a> Science. 352 (6284), 467-470 (2016).</li>
<li>George, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prior+Exposure+to+Zika+Virus+Significantly+Enhances+Peak+Dengue-2+Viremia+in+Rhesus+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Prior Exposure to Zika Virus Significantly Enhances Peak Dengue-2 Viremia in Rhesus Macaques.</a> Scientific Reports. 7 (1), 10498(2017).</li>
<li>Morens, D. M., Halstead, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antibody-dependent+infection+enhancement+of+four+dengue+virus+serotypes+by+monoclonal+and+polyclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies.</a> Journal of General Virology. 71, Pt 12 2909-2914 (1990).</li>
<li>Dejnirattisai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-reacting+antibodies+enhance+dengue+virus+infection+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans.</a> Science. 328 (5979), 745-748 (2010).</li>
<li>Priyamvada, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+antibody+responses+after+dengue+virus+infection+are+highly+cross-reactive+to+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (28), 7852-7857 (2016).</li>
<li>Charles, A. S., Christofferson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+a+Dengue-Derived+Monoclonal+Antibody+to+Enhance+Zika+Infection+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Currents%22%5BJournal%5D)">Utility of a Dengue-Derived Monoclonal Antibody to Enhance Zika Infection In Vitro.</a> PLoS Currents. 8, (2016).</li>
<li>Swanstrom, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dengue+Virus+Envelope+Dimer+Epitope+Monoclonal+Antibodies+Isolated+from+Dengue+Patients+Are+Protective+against+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Dengue Virus Envelope Dimer Epitope Monoclonal Antibodies Isolated from Dengue Patients Are Protective against Zika Virus.</a> MBio. 7 (4), (2016).</li>
</ol>

저자는 선언할 수 없다.

다른 DENV serotypes 에이드로 이어지는 DENV 항 체의 분11효과적인 백신 개발을 방해 했다. ZIKV 같은 가족 Flaviviridae에 속해 있으며 다른 flaviviruses, 특히 DENV12와 상당한 상 동. ZIKV와 DENV에 대 한 항 체를 중화의 주요 목표 두 바이러스13,,1415사이 매우 높은 구조 및 제 사기 순서 상 동을 공유 하는 봉투 단백질 이다. 그것은 DENV 또는 ZIKV를 사전 면제 다른 바이러스8,16의 감염을 향상 시킬 수 입증 되었습니다.
상 패 분석 실험<sup class=...

모기 품 어진 바이러스 성 질병 가운데 Zika 감염1가장 임상적으로 중요 한 중 하나입니다. 감염은 flavivirus ZIKV는, 대부분의 경우에는 기본 벡터1,2 Aedes aegypti 사용에 의해 발생 합니다. 그러나, 일부 ZIKV 발생3주 벡터로 Aedes albopictus 보고 연구 있다. 많은 경우에서 무 증상 감염 이지만, 가장 일반적인 증상은 발열, 두통, 근육 통증2. 아무 치료 또는 백신 ZIKV 감염에 사용할 수 있는 이며 사용 가능한 치료는 주로 지원. 남아메리카에 있는 ZIKV의 최근 발발 microcephaly2라는 태아에 neurodevelopmental 장애에 약 20-fold 증가 질병의 심한 경우에 지도 했다. 남미 지역 여러 arboviruses DENV 및 웨스트 나 일 바이러스에 발병으로 조사 여부 다른 flavivirus(es)에 이전 면역 역할 ZIKV 감염 및 질병의 심각도에 결정적 이다.
연령대에 걸쳐 바이러스는 호스트 셀 기계를 정복 하 고 항 바이러스 반응 억제 infectivity의 그들의 기회를 증가 하는 다른 전략을 진화 했다. 모두의 가장 매혹적인 중 현상 에이드4그들의 복제를 향상 시키기 위해 바이러스에 의해 호스트 미리 면역 항 체의 사용 이다. DENV의 모든 4 개의 serotypes에 걸쳐 ADE 잘 공부 하 고 바이러스 titers 및 질병 결과5,,67증가 입증 되었습니다. 이전 체 외 연구에서 우리는 기존의 기본 인간의 면역 세포8DENV 면제 때문에 ZIKV 복제의 향상을 나타났습니다. 우리는 또한 관련 생체 외에서 메서드 기본 셀에 ZIKV 복제 향상 DENV 기존의 항 체의 기능을 정량화를 시연 했다.
우리가 개발한 프로토콜 DENV 중화 TCID 50에 대 한 테스트는 인간의 혈 청 샘플 사용 또는 플 라크 감소 중립화 시험 (PRNT) 분석 실험, 생물학으로 관련 된 셀 또는 셀 ZIKV 감염 시킬 수 있는 조직에서 파생 된 ZIKV 함께.

<table><tbody><tr><td>소 태아 혈청&nbsp;</td><td>제미니</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>아이사이클러&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>785BR02188</td><td>모델 번호 CFX96 광학 모듈</td></tr><tr><td>마이크로퓨지 18 원심분리기</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>367160</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop-1000</td><td>열과학&nbsp;</td><td>1072</td><td></td></tr><tr><td>Quantifast SYBR-One step RT-PCR 키트&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>204154</td><td>1단계 RT-qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy RNA 분리 키트에 사용됩니다&nbsp;</td><td>키아겐&nbsp;</td><td>74106</td><td>RNA 추출에 사용</td></tr><tr><td>RPMI-medium&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr></tbody></table>

기본 인간 세포에서 zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells

Flavivirus Zika Guillain-바레 증후군 등 유아, microcephaly 신경 합병증의 최근 출현은 심각한 공공 안전 문제를 가져왔다. 위험 요인 중 항 체 의존 향상 (ADE) 포즈 가장 중요 한 위협을 Zika 바이러스 (ZIKV)의 최근 재 출현은 주로 지역 인구는 다른 밀접 하 게 관련을 사전 면제의 상태 flaviviruses, 특히 뎅기열 바이러스 (DENV) 여기, 우리 ZIKV 감염 기본 인간 세포 또는 세포에 DENV에 대 한 인간의 혈 청 항 체의 효과 측정에 대 한 프로토콜을 설명 합니다.

그림 1, 에이드 프로토콜 수행에 관련 된 모든 단계의 단계별 도표 그림이 이다. 그것은 DENV에 기존의 면역 인 에이드의 ZIKV의 전체 절차를 보여주는 회로도입니다. 그림 2 는 어떻게 인간의 혈 청 샘플 세 가지 그룹으로 분류 되었다: DENV 감염 확인 샘플 이라고 DENV에 감염 된 그룹, DENV 항 체 확인 샘플은 DENV 노출 그룹으로 하 고 건강 한 DENV 중화 항 체 또는 RNA 개인 세라 건강 한 제어 (HC) 그룹을 이라고 합니다. (그림 2)입니다.
모든 혈 청 샘플 ZIKV와 단지를 만들기 위해 허용 되었다 고 대 식 세포 세포를 감염 하는 데 사용 했다. 48 h 바람직합니다...

우리는, 사용 하 여 인간의 혈 청 기본 인간 세포 감염 부 량 정량 실시간 중 합 효소 연쇄 반응에 의해 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대 한 기존의 면역의 효과 평가 하는 방법을 설명 합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

The recent emergence of the flavivirus Zika and neurological complications, such as Guillain-Barr&#233; syndrome and microcephaly in infants, has brought ...

이 방법은 실제 인간 환자 혈청 및 1 차적인 인간 면역 세포를 사용하여 Zika 바이러스 감염에 뎅기열 바이러스에 대하여 기존 면제의 효력을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 실제 인간 환자 혈청 샘플과 인간 1 차 세포의 사용은 사전 면역 세라 및 항체에 의한 Zika 바이러스의 항체 의존성 향상에 대한 심층적인 통찰력을 제공합니다. 이 방법은 다른 인간 세포에 있는 바이러스 감염을 강화하기 위하여 환자의 혈액 내의 항체의 기능에 통찰력을 제공합니다.바이러스 감염 수준이 검출을 위해 충분히 높지 만 세포를 압도하거나 데이터 해석을 방해하지 않을 만큼 충분히 낮다는 것을 확인하는 것이 중요합니다. 멸균, 평평한 바닥 96-웰 플레이트에서 잘 세포 배양 배지의 100 마이크로리터에서 제4 세포에 세 번 10번 을 파종하여 시작한다. 모든 세포가 도금되었을 때, 플레이트를 섭씨 37도 및 이산화탄소 인큐베이터 5%에 놓고 해동된 인간 혈청 시료를 혈청 프리 배지에 10배 연속 희석합니다.바이러스 솔루션 및 세포에 희석제를 추가하기 전에 모든 면역 세럼에 대한 혈청 희석 및 희석 계수를 일정하게 유지해야 합니다. 다음으로, Zika 바이러스는 신속하게 얼음에 주식을 전송하기 전에 1 ~ 2 분 동안 섭씨 37도 수조에 재고 솔루션을 균주. 혈청 알리쿼트에 Zika 바이러스의 감염 동등한 부피의 0.1 복합성을 추가하고 뎅기열 바이러스 항체가 Zika virions와 복합체를 형성할 수 있도록 1 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 우물당 100마이크로리터의 PBS로 세포를 세척하고 각 웰에 50마이크로리터의 면역 복합체를 추가합니다. 2 시간 인큐베이션 후, 배지를 제거하고 우물당 100 마이크로리터의 PBS로 우물을 두 번 씻아 면역 복합체및 부착되지 않은 비리온을 완전히 제거합니다. 그런 다음 10%의 태아 소 혈청으로 보충된 세포 배양 배지의 웰당 100 마이크로리터로 세포를 공급한다.그런 다음 세포를 세포 배양 인큐베이터로 48시간 동안 되돌려 보입니다. 감염 이틀 후, 각 웰에 10%의 베타 머카토에탄올이 있는 세포 리시스 버퍼 250 마이크로리터를 첨가하기 전에 잘 100마이크로리터의 멸균 PBS로 세포를 두 번 세척한다. 파이펫은 리스시 공정속도를 높이고 세포 리스를 1.5 밀리리터 튜브로 살균하기 위해 긁힘으로 적어도 5번 위아래로 감았다.각 튜브에 70%에탄올의 동일한 볼륨을 추가하고 용액을 4~5회 위아래로 피펫합니다. lysate 서스펜션이 명확하면 각 솔루션을 원심 분리를 위해 2밀리리터 수집 튜브에 레이블이 부착된 실리카 기반 컬럼으로 전송합니다. 동일한 수집 튜브에 컬럼을 유지하는 흐름을 버리고 두 번째 원심 분리를 위해 각 열에 700 마이크로리터의 Wash 버퍼 1을 추가합니다.흐름을 폐기한 후, 세척당 500 마이크로리터의 세차 버퍼 2개로 컬럼을 두 번 더 헹구십시오. 두 번째 세척 후 컬럼을 새로운 2밀리리터 수집 튜브로 옮겨 다른 원심분리를 합니다. 원심분리를 위해 각 컬럼의 중앙에 42도 의 30 마이크로리터를 추가하고 용출된 RNA를 복구합니다.정량적 실시간 폴리머라제 연쇄 반응 또는 QRTPCR 분석을 위해 반응당 역전사 믹스의 0.25 마이크로리터와 함께 10개의 마이크로몰라 주식으로부터 유전자 특이적 전방 및 역프라이머1개의 마이크로리터를 첨가한다. Zika 바이러스 유전 물질을 인식하는 프라이머는 바이러스 유전자를 검출하고 감염 정량화를 허용할 것입니다. 다음으로, SYBR 그린 믹스의 12.5 마이크로리터를 추가하고 각 반응에 25 마이크로리터의 물을 추가하여 96웰 QPCR 플레이트의 각 웰에 마스터 믹스 15 마이크로리터를 추가합니다.마스터 믹스를 사용하는 경우, 혼합에 RNA 샘플의 100 나노그램을 추가하고 마스터 믹스를 QRTPCR 플레이트의 개별 우물에 파이펫한다. 샘플은 동일한 QRTPCR 플레이트에서 트리플리케이트로 실행되어야 합니다. 그런 다음 테이블에 설명된 매개 변수에 따라 정량적 PCR 컴퓨터에서 샘플을 실행합니다.시스템 소프트웨어의 용융 곡선 탭을 클릭하여 용융 곡선을 모니터링합니다. 용융 곡선은 하나의 앰플리콘의 존재를 확인하기 위해 특정 유전자에 대한 모든 샘플에서 단일 피크를 보여줍니다. 최적의 결과를 얻으려면 용융 곡선 프로토콜에서 단계 와 최소 보유 시간 사이에 섭씨 0.5도의 온도 증분을 사용합니다.그런 다음 정량화 데이터 탭을 클릭하여 각 샘플에 대한 정량적 주기를 얻고 데이터를 스프레드시트로 내보내 추가 정량화 분석을 합니다. 인간 혈청 샘플은 세 가지 다른 그룹으로 분류될 수 있다: 뎅기열 바이러스 감염 확인 샘플, 뎅기열 바이러스 항체 확인 샘플, 그리고 뎅기열 바이러스가 항체 또는 RNA를 중화하지 않는 건강한 세라. 감염 48 시간 후, QRTPCR 분석은 뎅기열 바이러스 혈청형을 포함하는 대부분의 혈청이 다른 수준에서 Zika 바이러스 복제를 향상시킬 수 있음을 보여줍니다.Zika 바이러스 titres에서 가장 높은 증가는 체증을 함유하는 뎅기열 바이러스 혈청형으로 처리된 대식세포에서 발견되며, 이는 체형 1및 3에 비해 Zika 바이러스의 상대적으로 낮은 유도를 보여준다. 멸균 환경을 유지하고, 적절한 개인 보호 장비를 착용하고, 항상 해동된 바이러스 혈청 샘플과 QPCR 시약을 얼음에 보관하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 쉽게 환자 혈청의 패널을 사용하여 황열병 바이러스, 뎅기열 바이러스 또는 웨스트 나일 바이러스와 같은 다른 flavivirus의 항체 의존적 향상을 연구하기 위해 수정될 수 있다.이 기술은 arbovirus 또는 바이러스학 필드에 있는 미래 항체 의존적인 향상 연구 결과를 수행하는 데 매우 유용할 것입니다. 적절한 생체 안전 수준 2 개의 개인 보호 장비는 항상 사용되어야하며 모든 바이러스 성 폐기물은 폐기 하기 전에 30 분 동안 10 %의 표백제에서 오염제거해야합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Source: Asad, S., et al. Quantification of Antibody-dependent Enhancement of the Zika Virus in Primary Human Cells. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates antibody-dependent enhancement of Zika virus infection in human primary macrophages, using dengue antibody–virus complexes to model how cross-reactive antibodies facilitate Fcγ receptor–mediated viral entry and replication for studying infection mechanisms and immune interactions.

Antibody-Dependent Enhancement of Zika Virus by Dengue Antibodies in Human Primary Macrophages

이 비디오는 지카 바이러스 회복기 혈청을 사용하여 뎅기열 바이러스 감염의 항체 의존성 향상(ADE)을 측정하는 분석을 보여줍니다. 이 분석은 녹색 형광 단백질을 인코딩하는 뎅기열 리포터 바이러스 입자(RVP)를 사용합니다. 지카 바이러스에 대한 혈청 항체는 RVP와 교차 반응하여 복합체를 형성합니다. 결합된 항체는 Fc 수용체를 발현하는 세포의 RVP 흡수를 향상시키며, 이는 유세포 분석을 사용하여 검출됩니다.

바이러스 감염의 항체 의존성 증진을 조사하기 위한 In vitro assay

이 비디오는 인간 병원체인 지카 바이러스에 대한 항바이러스 활성이 있는 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. 숙주 세포 내에서 지카 바이러스는 내재화 시 증식을 거쳐 주변 세포를 감염시키고 뚜렷한 영역 또는 바이러스 플라크를 생성합니다. 항바이러스제 역할을 하는 I형 인터페론은 바이러스 증식을 방해하여 숙주 세포 단층에서 바이러스 플라크의 형성을 방지합니다.

지카 바이러스 성장의 강력한 억제제로서 인터페론을 스크리닝하기 위한 체외 분석

이 비디오는 인간 태아의 신경 줄기 세포를 지카 바이러스에 감염시키는 절차를 보여줍니다. 감염된 세포는 추가 연구에 사용할 수 있습니다.

태아 신경 줄기 세포의 지카 바이러스 감염

지카 바이러스(ZIKV)는 신종 병원체로, 태아 발달 이상 및 소두증과 관련이 있습니다. 효과적인 감염성 세포 배양 시스템의 구축은 ZIKV 복제 연구와 백신 및 약물 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 ZIKV와 관련된 다양한 바이러스 분석을 설명하고 논의합니다.

Zika 바이러스 감염 세포 배양 시스템과<em&gt; 체외</em인터페론의&gt; 예방 효과

이 프로토콜은 두 개의 플라스미드 감염성 cDNA 클론으로부터 감염성 Zika 바이러스의 회수를 설명합니다.

새로운 세계 Zika 바이러스 전염성 클론으로부터 재조합 바이러스의 구조 및 특성 규명

우리는 Zika 바이러스 미리 혈 청 뎅기열 바이러스 기자 바이러스 성 입자를 사용 하 여 감염의 항 체 의존 향상을 측정 하기 위한 간단 하 고 쉬운 프로토콜을 설명 합니다.

간단한 Cytometry 결정 체 외에서 항 체 의존의 향상 뎅기열 바이러스 Zika 바이러스 미리 혈 청을 사용 하 여 분석 결과 기반으로

Zika 바이러스 (ZIKV) 감염에 대 한 Ifnar1-/- murine 모델의 immunoprivileged 장기에 항 원 특정 T 세포 응답을 평가 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 메서드는 보호의 셀룰러 메커니즘 및 immunopathogenesis ZIKV 백신의 조사에 대 한 중추적인 이며 또한 그들의 효능 평가 위한 귀중 한.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

프로토콜의 목표는 감염 다음 마우스에 있는 다중 기관에서 Zika 바이러스를 격리하고 정량화하여 바이러스성 질병을 조사하기 위하여 이용된 기술을 설명하는 것입니다.

마우스의 여러 장기에서 Zika 바이러스의 격리 및 정량화

본 프로토콜은 베로 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포에서 지카 바이러스(ZIKV)의 증식과 24웰 및 96웰(고처리량) 형식의 세포 기반 비색 면역검출 방법을 사용한 ZIKV의 정량화에 대해 설명합니다.

바이러스 전파 및 세포 기반 비색 정량화

여기에서는 인간 세포에서 지카 바이러스 감염 및 복제를 실시간으로 연구하는 매우 쉽고 간단한 방법으로 세포 기반 전기 임피던스(CEI)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 또한, CEI 분석은 항 바이러스 화합물의 평가에 유용합니다.

지카 바이러스 억제제를 실시간으로 평가하기 위한 세포 기반 전기 임피던스 플랫폼

배우세요 Zika 바이러스 항체 의존 향상 정량화 방법을 인간 면역 세포와 환자 혈청을 이용하여. 실시간 PCR로 감염 수준을 측정하여 백신 개발에 필요한 면역 반응 메커니즘을 연구합니다.

기본 인간 세포에서 Zika 바이러스의 항 체 의존 향상의 정량화

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