Name: 크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 배우세요 Cryptococcus neoformans와 아메바의 공배양 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 투과전자현미경을 활용한 식세포작용 연구 방법입니다. 이 기술은 병원체-숙주 상호작용 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작품은 남아프리카 공화국의 국립 연구 재단 (보조금 번호 : UID 87903)과 자유 국가의 대학에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 또한 우리의 현미경 연구 기간 동안 피터 반 와이크와 핸리 그로블러가 제공하는 서비스와 지원에 감사드립니다.

크립토코커스 네오포르만 및 일부 아칸타모에바 카스텔라니 균주는 생체 안전성 수준-2(BSL-2) 병원체로 간주된다; 따라서, 연구원은 이 유기체로 일할 때 적당한 예방 조치를 취해야 합니다. 예를 들어, 실험실 직원은 실험실 코트, 장갑 및 눈 보호와 같은 특정 교육 및 개인 보호 장비 (PPE)가 있어야합니다. 생물학적 안전 캐비닛(레벨 2)은 감염을 일으킬 수 있는 절차에 사용되어야합니다(레벨 2).14.
1. 곰팡이 세포의 재배 및 표준화 (Madu 등에서 수정 15)
<ol><li>효모-펩톤-덱스트로스(YPD) 한천 플레이트에서 스톡 배양물(9개월 이상 없음)에서 시험 곰팡이 균주(즉, C. neoformans UOFS Y-1378 및 C. neoformans LMPE 046)를 줄무늬. YPD 한천의 성분에 대한 정보는 표1에서 찾을 수 있습니다. 참고: C. neoformans UOFS Y-1378은 3-하이드록시 지방산을 생산하는 것으로 나타났으며, C. neoformans LMPE 046은 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않습니다. 이러한 분자의 존재가 결정되는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일 1을 참조하십시오.</li>
	<li>30 °C에서 48 시간 동안 한천 판을 배양합니다. 참고: 플레이트는 4°C에서 최대 2개월 동안 보관할 수 있으며 폐기하거나 스톡배양(16)을 만드는 데 사용할 수 있다.</li>
	<li>48h-old plate에서 크립토코칼 세포(C.neoformans UOFS Y-1378 또는 C. neoformans LMPE 046)를 긁어내고 화학적으로 정의된 YNB 국물(6.7 g/L)의 100mL를 함유한 250 mL 원추형 플라스크로 접종합니다(6.7 g/L). w /v) 포도당. YNB 국물 재료에 대한 정보는 표2에서 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>플라스크를 30°C에서 24시간 동안 배양하고 회전식 셰이커에서 160 rpm에서 교반합니다.</li>
	<li>24 시간 배양 후, 혈세포계를 사용하여 곰팡이 세포를 계산하고 pH 7.4에서 PBS로 세포 수를 1 x 106 세포 / mL로 조정합니다. 참고: 준비된 C. neoformans UOFS Y-1378 접종은 단계 3.1 및 3.2에서 사용되었고, C. neoformans LMPE 046 접종은 3.2 단계에서만 사용되었습니다.</li>
</ol>2. 아메바 세포의 재배 및 표준화 (Madu 등에서 수정 15)
<ol><li>아칸타모에바 카스텔라니의 주식 문화를 해동하고 실온 (RT)에 가져. 참고: 아메바는 악셀슨-올슨 외8 및 슈스터17의수정된 프로토콜에 기초하여 제조되었다.</li>
	<li>해동 배양액의 피펫 1 mL을 ATCC 배지(712)의 15 mL를 함유하는 50 mL 원심분리기 튜브로 접종하였다. ATCC 배지 712의 성분에 대한 정보는 표3에서 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>400 x g 및 30 °C에서 5 분 동안 원심 분리기를 부드럽게 즉시 흔들어 줍니다.</li>
	<li>상급자 흡인.</li>
	<li>ATCC 배지 712의 15 mL에서 세포를 재중단하고 14일 동안 30°C에서 튜브를 배양한다. 참고 : 주기적으로 간단한 빛 현미경을 사용하여 세포를 확인하여 트로포 조이트 상태에 있는지 확인하십시오. 일단 그들이 trophozoite 상태에, 신선한 문화를 시작.</li>
	<li>피펫 1 mL은 트로포조이트 상태에서 세포를 나타내고 이를 사용하여 신선하고 멸균된 ATCC 배지 712의 15 mL를 함유하는 멸균 50 mL 원심분리튜브를 접종하는데 사용한다.</li>
	<li>회전 쉐이커에서 160 rpm에서 교반하면서 1 주일 동안 30 °C에서 튜브를 배양합니다.</li>
	<li>1주일 후, 혈세포계를 사용하여 아메바 세포를 계산하고 신선하고 멸균된 ATCC 배지 712로 세포 수를 1 x 107 세포/mL로 조정합니다.</li>
	<li>스트로버18에의해 상세한 대로 트라이팬 블루 얼룩을 사용하여 생존 분석을 수행합니다. 적어도 80% 생존가능성을 보여주는 문화권으로 더 나아가보라고 한다.</li>
</ol>3. 식균증을 연구하는 세포의 형광 염색 (Madu 등에서 수정 15)
<ol><li>형광 현미경을 사용하여 정성적 데이터 수집 참고 : 아칸타모에바 카스텔라니와 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378이 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>표준화된 아메바(ATCC 배지 712에서 1 x 107 셀/mL)의 200 μL 현탁액을 부착 슬라이드의 챔버 웰에 분배하고 30°C에서 2시간 동안 배양하여 세포가 표면에 부착하도록 합니다.</li>
		<li>아메바 세포가 부착하기 위해 침전되는 동안, 1 x 106 세포 /mL (PBS의 999 μL)으로 조정 된 표준화 된 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 1.5 mL 플라스틱 튜브에서 1 μL의 플루오레세이세이토시오시아네이트로 얼룩지게합니다. 참고: 아세톤 1 mL에 1 mg의 플루오레세인 이소티오냐네이트를 용해시켜 얼룩을 준비합니다.</li>
		<li>Rt와 어둠 속에서 2 시간 동안 50 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 부드럽게 교반하십시오.</li>
		<li>2시간 후, 960 x g에서 원심분리기를 30°C에서 5분 동안 펠렛세포에.</li>
		<li>상급체를 흡인하여 얼룩으로 PBS를 제거한다.</li>
		<li>셀 펠릿을 세척하기 위해 튜브에 PBS 1 mL을 추가합니다. 부드럽게 파이펫팅하여 세포를 씻으십시오.</li>
		<li>30°C에서 5분 동안 960 x g에서 세포를 원심분리한다. 상급제는 버리십시오. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>세척된 세포를 PBS의 1 mL에서 다시 중단합니다.</li>
		<li>염색된 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 세포의 200 μL 현탁액을 얼룩지지 않은 아메바 세포를 함유하는 챔버 웰에 분배한다.</li>
		<li>제조된 공동 배양액을 30°C에서 추가로 2시간 동안 배양한다. 참고: 공동 배양은 실험의 목적에 맞게 서로 다른 시간 지점에 대해 배양될 수 있다.</li>
		<li>공동 잠복기가 끝나면 우물의 내용을 흡인합니다.</li>
		<li>300 μL의 PBS를 웰에 추가하여 챔버 웰을 세척하고 결합되지 않은 공동 배양 세포를 제거합니다. 부드러운 파이펫팅으로 이 작업을 수행합니다. 우물의 내용을 흡인합니다. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>97 mL의 증류수에 3 mL의 글루타랄데히드를 추가하여 3% 글루타랄데히드 용액을 준비합니다.</li>
		<li>챔버 웰에 250 μL의 3% 용액을 추가하고 1 시간 동안 배양하여 공동 배양 된 세포를 고정시.</li>
		<li>3.1.13 단계에서 자세히 설명된 바와 같이 고정제를 흡인하고 챔버 웰을 세척한다.</li>
		<li>챔버 슬라이드와 함께 제공된 도구를 사용하여 챔버 웰을 해체합니다.</li>
		<li>안티페이드 화합물, 1,4-디아자비시클로-[2.2.2]-옥탄을 슬라이드에 추가하여 자동 표백을 방지합니다. 커버슬립으로 덮고 증발을 방지하기 위해 매니큐어로 측면을 밀봉합니다.</li>
		<li>공초점 레이저 스캐닝 현미경의 100x 대물렌즈(오일 포함)를 사용하여 공동 배양된 세포를 봅니다. 참고 : 아메바와 크립토 코카인 세포 사이의 상호 작용을 보기 위해 밝은 필드와 형광으로 사진을 찍는 것이 중요합니다. 가능한 경우 형광을 밝은 필드 이미지에 슈퍼 부과할 수 있습니다. 아메바 세포는 전형적으로 크기가 더 크며(즉, 45-60 μm), 트로포조이트 세포는 불규칙한 형상을 갖는다. 크립토코카인 세포는 직경이 5-10 μm이고 난형 형상에 글로보스를 갖는다. 레이저에 노출되면 얼룩이 없는 아메바 세포가 자동 형광을 방출할 수 있습니다. 자동 형광을 줄이는 방법은 비스커와 돌베레19, 클랜시와 콜러20을 참조하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>형광 플레이트 리더를 사용하여 정량적 데이터 수집 참고 : 아칸타모에바 카스텔라니와 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 또는 C. 네오포르만스 LMPE 046으로 이 분석작업을 수행합니다.<ol>
<li>표준화된 아메바(ATCC 배지 712에서 1 x 107 셀/mL로 조정)의 100 μL 현탁액을 검정부착형 96웰 마이크로티터 플레이트에 분배합니다.</li>
		<li>아메바 세포가 표면에 부착 할 수 있도록 30 °C에서 2 시간 동안 플레이트를 배양.</li>
		<li>아메바 세포가 부착하기 위해 침전되는 동안, 표준화된 C. neoformans UOFS Y-1378 세포를 1 x 106 세포/mL(PBS 의 999 μL)으로 1 μL의 pHrodo Green Zymosan A BioParticles 1.5 mL 마이크로 센트리 퓨저 튜브에 장착했습니다. 스테인 C. 네오포만LMPE 046 세포뿐만 아니라 별도의 튜브. 참고 : 염료는 FITC와 달리 식세포21,22의산성 환경 내에 갇혀있는 세포를 선택적으로 얼룩지게합니다. 이 기술의 경우, 중성 pH(ATCC medium 712)를 가진 배지에서 중성 pH(PBS) 및 아메바를 가진 배지에서 크립토코카인 세포를 유지하는 것이 중요하다. 산성 환경을 가진 매체는 상대 형광 단위의 거짓 양성 판독을 초래할 것이며, 이는 더 많은 수의 크립토코커스가 내면화되었음을 암시합니다.</li>
		<li>RT와 어둠 속에서 2 시간 동안 50 rpm으로 설정된 궤도 셰이커에서 크립토 코칼 세포를 부드럽게 교반하십시오.</li>
		<li>2시간 후, 960 x g에서 미세원심분리튜브를 30°C에서 5분 동안 펠렛세포로 하였다. 상급체를 흡인하여 얼룩으로 PBS를 제거합니다.</li>
		<li>튜브에 1 mL의 PBS를 추가하여 펠릿 세포를 세척합니다. 부드러운 파이펫팅으로 세포를 씻으하십시오.</li>
		<li>30°C에서 5분 동안 960 x g에서 세포를 원심분리한다. 상급제는 버리십시오. 세탁 단계를 한 번 더 반복하십시오.</li>
		<li>PBS의 1 mL에 세척 된 세포의 펠릿을 다시 중단.</li>
		<li>염색되지 않은 아메바 세포를 함유하는 우물에 염색된 크립토코카인 세포의 100 μL 현탁액을 분배합니다.</li>
		<li>제조된 공동 배양액을 30°C에서 추가로 2시간 동안 배양한다. 참고: 실험 목적에 맞게 서로 다른 타임포인트에 대해 공동 배양양을 배양할 수 있습니다.</li>
		<li>공동 배양 기간이 끝나면 마이크로 플레이트 리더에서 형광을 측정합니다. 로그신호를 상대형광 단위로 변환합니다. 참고 : 염료의 흥분은 492 nm이며 방출은 538 nm입니다. 자가형광을 줄이는 방법은 비스커와 돌베레19, 클랜시와 콜러20에 문의하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 식균증을 연구하기 위해 투과 전자 현미경 검사법의 사용 (반 와이크와 윙 필드 23에서 수정)
<ol><li>아메바의 5 mL 현탁액(ATCC 배지 712에서 1 x 107 세포/mL로 조정)을 15 mL 원심분리기 튜브에 넣고 30°C에서 30분 동안 정착할 수 있도록 합니다.</li>
	<li>표준화된 아메바 세포 5 mL을 포함하는 동일한 원심분리관에 C. neoformans UOFS Y-1378 셀(PBS에서 1 x 106 세포/mL로 조정)의 5 mL 현탁액을 추가합니다.</li>
	<li>튜브 스탠드를 30°C에서 2시간 동안 두십시오.</li>
	<li>튜브를 640 x g에서 30°C에서 3분 동안 탄환을 공동 배양된 세포를 펠렛한다. 상급자 흡인. 공동 배양 된 세포를 세척하지 마십시오.</li>
	<li>3.0 M (pH = 7.0) 나트륨 인산염 완충제 3% 글루타랄데히드 3 시간 동안 펠렛을 3 mL로 재중단시킴으로써 공동 배양 된 세포를 고정시.</li>
	<li>튜브를 1,120 x g에서 30°C에서 5분 동안 탄환을 펠렛하여 공동 배양된 세포를 펠렛한다. 상급자 흡인.</li>
	<li>원심분리기 튜브에 인산나트륨 완충제 5 mL를 추가하여 펠릿 세포를 세척합니다. 튜브의 내용물20s를 부드럽게 파이펫팅하여 세척합니다.</li>
	<li>튜브를 1,120 x g에서 30°C에서 5분 동안 탄환을 펠렛하여 공동 배양된 세포를 펠렛한다.</li>
	<li>4.8-4.10 단계를 반복합니다. 상급자 흡인.</li>
	<li>1.5 시간 동안 1%의 오스뮴 테트옥사이드를 1%로 완충한 인산나트륨 1.0 m(pH= 7.0)의 3 mL에서 펠릿을 다시 중단하여 공동 배양 된 세포를 다시 고정시.</li>
	<li>3% 글루타랄데히드를 제거하는 유사한 방식으로 공동 배양 된 세포를 세척하여 고정제 (오스뮴 테트옥사이드)를 제거하십시오.</li>
	<li>각각 30%, 50%, 70%, 95%, 100%의 2가지 변화(공동 배양 세포라고도 함)에서 TEM 물질(공동 배양 세포라고도 함)을 탈수한다. 이렇게 하려면, 아세톤 용액 3 mL를 펠릿 된 세포에 넣고 15 분 동안 방치하십시오. 그런 다음 RT에서 10 분 동안 200 x g의 원심 분리기를 폐기하고 아세톤 용액의 높은 비율을 추가하십시오.</li>
	<li>Spur24에의한 프로토콜에 따라 정상 일관성의 에폭시를 준비합니다. 참고 : 에폭시 수지는 단면화에 사용됩니다.</li>
	<li>갓 제조된 에폭시 수지에 TEM 물질을 내장한다. 이렇게 하려면 아래 단계를 따르십시오.<ol>
<li>아세톤의 100% 용액의 3 mL에 재중단된 TEM 물질을 포함하는 튜브에 갓 제조된 에폭시의 3 mL를 추가한다. 튜브가 1시간 동안 방치합니다.</li>
		<li>30°C에서 10분 동안 200 x g에서 튜브를 원심분리한다. 에폭시-아세톤 용액을 흡인한다.</li>
		<li>갓 준비한 에폭시 6 mL을 튜브의 펠릿에 넣습니다. 튜브가 1시간 동안 방치합니다.</li>
		<li>200 x g에서 30 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 모든 에폭시-아세톤 용액을 흡인합니다.</li>
		<li>갓 준비한 에폭시 3 mL을 튜브에 넣습니다. 튜브가 8시간 동안 방치합니다.</li>
		<li>200 x g에서 30 °C에서 10 분 동안 원심 분리기. 모든 에폭시 용액 흡입</li>
		<li>갓 준비한 에폭시 3 mL을 튜브에 넣습니다. TEM 물질을 진공 건조기에서 하룻밤 동안 에폭시 용액에 보관하십시오. 주의: 에폭시 수지는 방사성 물질이다. PPE를 사용하여 에폭시 수지 처리합니다. 에폭시 수지도 연기 후드에서 처리해야합니다. 연구원은 각 국가25에의해 지정된 것과 같은 물질을 폐기하기위한 안전 규정을 따라야한다.</li>
	</ol></li>
	<li>70 °C에서 8 시간 동안 TEM 물질을 중합.</li>
	<li>울트라 마이크로톤에서는 에폭시 내장 소재에서 약 0.1mm x 0.1mm 및 60nm 두께의 작은 부분을 장착된 유리 나이프로 다듬습니다. 그리드에서 단면을 조립하고 얼룩을 지키기 전에 TEM 샘플 홀더 상자에 그리드를 놓습니다.</li>
	<li>어둠 속에서 10 분 동안 6 % 우라일 아세테이트의 방울로 섹션을 얼룩. 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.| 참고: 증류수 100 mL에서 얼룩(6g)을 재구성합니다. 주의: 우라벨 아세테이트는 방사성 물질입니다. PPE를 사용하여 우라릴 아세테이트를 처리하십시오. 우라날 아세테이트는 또한 연기 후드에 처리해야합니다. 연구원은 각 국가25에의해 지정된 것과 같은 물질을 폐기하기위한 안전 규정을 따라야한다.</li>
	<li>100 mL의 증류수를 함유한 비커에 5번 찍어 섹션을 헹굽니다. 참고 : 증류수는 우라벨 아세테이트의 흔적이 포함되어 있으므로 그에 따라 폐기해야합니다.</li>
	<li>어둠 속에서 10 분 동안 납 구연산염 한 방울로 섹션을 얼룩지게하십시오. 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다. 참고 : 납 구연산염은 레이놀드26에의해 프로토콜에 따라 준비되어야한다.</li>
	<li>100 mL의 증류수를 함유한 비커에 5번 찍어 섹션을 헹굽니다.</li>
	<li>TEM 샘플 홀더 박스에 스테인드 섹션으로 그리드를 개별적으로 조립합니다.</li>
	<li>전송 전자 현미경으로 섹션을 볼 수 있습니다.</li>
</ol>

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저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

논문에서, 아메바가 크립토 코카인 세포와 상호 작용할 때 발생할 수있는 가능한 결과를 밝히기 위해 다른 기술이 성공적으로 사용되었습니다. 또한, 우리는 Cryptococcus-amoeba 상호 작용의 결과에 3-하이드록시 지방산의 효과를 보여주기 위해 관심이 있었습니다.
사용된 첫번째 기술은 정지 심상을 렌더링하는 공초점 현미경 검사법이었습니다. 이 기술의 주요 단점은 특정 시간대에 만 제한된 정보를 제공했다는 것입니다. 결과에 기초하여 그려질 수 있는 모든 결론은 유도적 추론에 빌려주며, 여기서 관찰 세트(32)에 기초하여 결론에 도달할 수있다. 그러나 패턴이 존재하는 몇 가지 상황을 관찰한다고 해서 해당 패턴이 모든 상황에서 사실임을 의미하지는 않습니다. 따라서, 연구에서, 그것은 표시 하 고 아마도 어떻게 이러한 제한 된 정보 근거 없는 결론으로 이어질 수 있습니다 주의. 요점, 모순 또는 지원의...

미생물은 토양과 물의 열린 물리적 경계와 같은 다른 생태 틈새 에서 점유하고 번창하기 위해 시간이 지남에 따라 진화, 다른 사람의 사이에서1. 이러한 틈새 시장에서, 미생물은 종종 제한된 자원에 대한 직접 경쟁에 종사; 중요한 것은, 그들은 증가 인구를 수용 할 필요가 자신의 성장이나 공간을 지원하기위해 사용하는 영양소에 대한 2,3. 어떤 경우에, 아메바와 같은 일부 홀로주체 유기체는 심지어 그들의 바이오 매스에서 영양분을 추출하는방법으로 크립토 코카인 세포에 선행 할 수있다 4,5. 차례로, 이것은 그 먹이의 인구 수를 제어하여 영토 지배를 확립 할 수 있습니다. 이러한 약탈적 압력 때문에, 일부 먹이는 압력의 부정적인 영향을 조정하기 위해크립토코칼 캡슐 6과 같은 미생물 인자를 생성하도록 선택될 수 있다. 그러나, 이 압력의 의도하지 않은 결과로, 몇몇 세균은 종 장벽을 교차하고 영양분이 풍부하고이상적인 인체의 밀폐된 공간 같이 7를 식민지화하는 새로운 틈새 시장을 찾아내는 것을 허용하는 요인을 얻습니다 조건. 후자는 크립토 코커스 (C.) 같은지상파 미생물을 설명 할 수있다. 네오포만은 병원성으로 변할 수 있습니다.
이를 위해, 크립토 코카인 세포가 아메바와 가질 수있는 초기 접촉을 연구하는 것이 중요하고이 병원성이 될 그들을 선택할 수있는 방법. 더 구체적으로, 이것은 감염 도중 대식세포에 의해 행동할 때 cryptococcal 세포가 어떻게 행동하는지에 단서를 줄 수 있습니다. 이러한 이유로 아메바는 상대적으로 저렴하고 실험실에서 아메바의 문화를 유지하기 쉽기 때문에 여기에 대식세포의 모델로 선택되었습니다8. 관심의 또한 크립토 코카인 이차 대사 산물 을 조사하는 것이었습니다. 3-하이드록시 지방산9,10 아메바 및 크립토 코카인 세포 사이의 상호 작용에 영향을 미치는.
아메바와 육안으로의 먹이 사이의 상호 작용을 인식하는 간단한 방법은 한천 접시의 표면에 먹이를 사용하여 잔디를 만들고 아메바를 발견하는 것입니다. 한천 판에 플라크 또는 클리어 영역의 시각화는 아메바가 먹이를 먹였을 수 있는 영역을 묘사합니다. 그러나이 매크로 수준에서는 프로세스의 결과만 지적되며 식세포증의 과정은 기계화 될 수 없습니다. 따라서, 세포 대 세포 에 기초하여 과정을 이해하기 위해,11,12를사용할 수 있는 몇 가지 현미경 방법이 있다. 예를 들어, 인큐베이션 챔버를 가진 거꾸로 된 현미경은 식세포와 그 표적13사이의 사건의 시간 경과를 비디오로 기록하는데 사용될 수 있다. 불행히도, 시간 경과 기능을 가진 현미경의 비용으로 인해 실험실이 특히 자원 불량 설정에서 이러한 현미경을 구입하는 것이 항상 가능한 것은 아닙니다.
위의 한계를 피하기 위해, 이 연구는 C. 네오포르만스 비즈 C. 네오포르만스 UOFS Y-1378 및 C. 네오포르만스 LMPE 046아칸타모에바 카스텔라니의 상호작용을 평가하는 순차적 탐구 설계를 제시한다. . 첫째, 정량적 방법 앞에 정성적 방법이 사용됩니다. 정지 심상은 반전된 형광 현미경, 뿐만 아니라 아메바-Cryptococcus 상호 작용을 묘사하는 전송 전자 현미경을 사용하여 캡처됩니다. 이어서 플레이트 리더를 사용하여 형광을 정량화하여 아메바의 효율을 추정하여 크립토코카인 세포를 내화시켰다. 데이터 해석 단계에서 이러한 방법의 결과를 조정할 때 식세포증 시간 경과 비디오를 정독하는 것만큼 중요한 정보를 똑같이 드러낼 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1,4-Diazabicyclo-[2.2.2]-옥탄</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D27802-1.5-mL</td><td></td></tr> <tr><td>플라스틱 튜브&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69715-15-mL</td><td></td></tr> <tr><td>원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>7252018-50-mL 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>1132017-8</td></tr><tr><td>-웰 챔버 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>1109650-</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>머크</td><td>SAAR1022040LC</td><td>-</td></tr><tr><td>아메바 균주</td><td>ATCC&Ograve; </td><td>30234TM</td><td>-</td></tr><tr><td>ATCC 매체 712</td><td>ATCC&Ograve; </td><td>712TM</td><td>Amoeba medium</td></tr><tr><td>Black 96웰 마이크로타이터 플레이트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>152089-Centrifuge</td><td>Hermle</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>-클로로포름</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>-</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon</td><td>Nikon TE 2000</td><td>-</td></tr><tr><td>에폭시 수지:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] NSA</td><td>[1] ALS</td><td>[1] R1054</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] DER 736</td><td>[2] ALS</td><td>[2] R1073</td><td>-</td></tr><tr><td>[3] ERL Y221 수지</td><td>[3] ALS</td><td>[3] R1047R</td><td>-</td></tr><tr><td>[4] S1 (2-디메틸아미노에탄올)</td><td>[4] ALS&nbsp;</td><td>[4] R1067</td><td>-</td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이</td>트<td>, 시그마-알드리치,</td><td>F4274</td><td>-</td></tr><tr><td>포름산</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>, 489441</td><td>-</td></tr><tr><td>플루오로스칸 어센트, FL</td>, <td>써모피셔 사이언티픽</td>, <td>374-91038C</td>, <td>마이크로플레이트 리더</td></tr><tr><td>, 글루코스</td><td>시그마-알드리치,</td><td>G8270</td><td>-</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>, ALS</td><td>R1009</td><td>-</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>Boeco</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Lead citrate</td><td>ALS</td><td>R1209-Liquid</td><td></td></tr> <tr><td>Chromatography Mass Spectrometer</td><td>Thermo Fisher</td> <td>Scientific-Methanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R 34,860-Orbital</td><td></td></tr> <tr><td>shaker</td><td>Lasec&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>오스뮴 테트록사이드</td><td>ALS</td><td>R1015-pHrodo</td><td></td></tr> <tr><td>Green Zymosan A BioParticles</td><td>Life Technologies</td><td>P35365</td><td>이것은 pH-sensitive 염료</td></tr><tr><td>생리학적 완충 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-50TAB-Rotary</td><td></td></tr> <tr><td>shaker</td><td>Labcon-</td><td></td><td>-</td></tr><tr><td>Sodium phosphate buffer입니다:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1] 디소듐 수소 오르토포스페이트 디하이드레이트&nbsp;</td><td>[1] Merck</td><td>[1] 106580</td><td>-</td></tr><tr><td>[2] 나트륨 이수소 오르토인산염 이수화물</td><td>[2] Merck&nbsp;</td><td>[2] 106345</td><td></td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Philips</td><td>Philips EM 100&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>트리판 블루&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td>-</td></tr><tr><td>초소형 Leica</td><td></td><td>EM UC7-Uranyl</td><td></td></tr> <tr><td>acetate</td><td>ALS</td><td>R1260A</td><td>-</td></tr><tr><td>진공 건조기</td><td>Lasec&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>바이알</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29651-U-YNB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Lasec&nbsp;</td><td>239210-YPD</td><td></td></tr> <tr><td>한천</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>Y - 1500</td><td>-</td></tr></tbody></table>

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

Cryptococcus 감염을 시뮬레이션하기 위해 환경에서 크립토 코카인 세포의 자연 포식자인 아메바를 대식세포의 모델로 사용할 수 있습니다. 대식세포와 유사한 이 육식 유기체는 식세포증을 사용하여 내면화된 세포를 죽입니다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경의 도움으로 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 대화형 순간을 묘사하는 이미지가 캡처됩니다. 전자 현미경의 분해력은 또한 아메바 식품 액포내부에 갇혀있을 때 크립토 코카인 세포의 초구조적 세부 사항을 밝히는 데 도움이됩니다. 식세포증은 지속적인 과정이기 때문에 정량적 데이터가 분석에 통합되어 이미지가 캡처될 때 시점에서 어떤 일이 발생하는지 설명합니다. 구체적으로, 상대 형광 단위는 크립토 코카인 세포를 내화에 아메바의 효율을 정량화하기 위해 판독된다. 이를 위해 크립토코카인 세포는 염료로 염색되어 식품 액포의 산성 환경 내에 한 번 형광이 가해집니다. 함께 사용 하는 경우, 이러한 기술을 통해 수집 된 정보는 아메바에 의해 내면화 될 때 세포의 행동과 운명에 결론을 도출 하는 데 도움이 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다., 아마도, 다른 식세포 세포에 의해.

미생물은 육안으로 인식할 수 없는 현미경 유기체입니다. 그러나, 그들의 충격은 피부 감염과 같은 관찰 가능한 임상으로 명백한 질병 귀착될 수 있습니다. 미생물의 특정 측면을 공부 할 때, 자신의 형태에 이르기까지, 부산물, 상호 작용, 회화 및 비디오 증거를 제공 할 수있는 것은 가장 중요하다.
우리는 먼저 크립토 코카인 세포와 아메바 사이의 상호 작용을 시각화하기 위해 노력했습니다. 이를 위해, 2시간 공동 배양 세포를 나타낸 밝은 필드 이미지를 먼저 연구하였다. 한 이미지는 아메바에 가까운 곳에 있던 크립토 코카인 세포를 공개했습니다. 아메바 세포 중 하나는 크립토코카인 세포를 포획하기 위해 확장된 의사포디아로 보였다(도1A). 다음으로, 참조를 위해 형광에 상응하는 이미지를 ...

이 논문에서는 스틸, 형광 이미지 및 고해상도 투과 전자 현미경 이미지를 사용하여 연구되는 크립토코카인 세포 및 아메바의 공동 배양을 준비하기 위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 여기에 예시된 것은 정량적 데이터가 이러한 정성적 정보를 보완하는 방법입니다.

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

이 절차의 전반적인 목적은 환경 포식자 아메바에 의해 병원성 곰팡이 종 Cryptococcus neoformans의 phagocytosis를 연구하는 도구로 현미경 을 사용하는 것입니다. 이 비디오는 공초점 레이저 스캐닝 현미경 및 전송 전자 현미경 검사를 사용하여 연구할 크립토 코칼 세포 및 아메배의 공동 배양을 준비하기위한 프로토콜을 자세히 설명합니다. 이러한 기술을 사용하여 얻은 정보는 감염 중에 내면화 될 때 암호 세포의 행동에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.YPD 천 접시에 테스트 곰팡이 균주를 줄입니다. 섭씨 30도에서 48시간 동안 접시를 배양합니다. 48 시간 된 접시에서 세포의 루프를 긁어 4 %의 포도당으로 보충되는 YNB 국물의 100 밀리리터를 포함하는 250 밀리리터 원추형 플라스크로 접종하십시오.플라스크를 섭씨 30도에서 24시간 동안 로터리 셰이커로 배양합니다. 24시간 잠복기 후, 혈류계를 사용하여 곰팡이 세포를 계산하고 생리적 완충액을 사용하여 밀리리터당 100만 개의 세포로 세포 수를 조절한다. 펩톤 효모 추출물 포도당 국물에 아메바 세포를 재배하여 섭씨 30도에서 일주일 동안 재배합니다.혈전계를 사용하여 아메바 세포를 계산하고 신선한 멸균 ATCC 배지 712로 밀리리터당 세포 수를 1,000만 세포로 조절한다. 이에 따라 트라이판 블루 얼룩을 사용하여 생존 가능성 분석기를 수행합니다. 적어도 80%의 생존력을 보이는 세포와 함께 일하는 것이 좋습니다.표준화된 아메바 세포의 200마이크로리터 서스펜션을 부착 슬라이드의 챔버로 분배합니다. 세포가 섭씨 30도에서 표면에 부착되도록 2시간 동안 지나갑니다. 아메바 세포가 정착하는 동안, 형광균 이소티오야네이트와 표준화 된 크립토 코칼 세포를 얼룩.실온과 어둠 속에서 2 시간 동안 곰팡이 세포를 부드럽게 교반하십시오. 이미 아메바 세포를 포함하는 적절한 챔버에 세척 한 후 스테인드 크립토 코칼 세포의 200 마이크로 리터 현탁액을 분배합니다. 준비된 공동 문화를 섭씨 30도에서 추가로 2시간 동안 배양합니다.코인큐베이션 기간이 끝나면 PBS로 챔버를 두 번 세척하여 비내화 된 크립토 코칼 세포를 포함한 모든 무바운드 아메바 세포를 제거하십시오. 세포를 고치는 데 사용된 글루타랄데히드를 흡인하고 PBS로 챔버를 두 번 세척합니다. 챔버 슬라이드를 분해합니다.공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 공동 배양 된 세포를 볼 수 있습니다. 상기 분석서를 보완하기 위해, 식품 바쿠올 내부에 갇힌 세포의 판독을 선택적으로 허용하는 pHrodo 염료로 크립토코칼 세포를 얼룩지게 한다. 이미 종자 아메바 세포를 포함하는 검은 부착 마이크로티터 플레이트의 우물에 이 스테인드 세포를 분배합니다.로그산스믹 신호를 상대형광 단위로 변환할 수 있는 마이크로 플레이트 판독기에서 형광을 측정합니다. 표준화된 아메바 세포의 5밀리리터를 이미 포함하는 동일한 원심분리기 튜브에 표준화된 크립토코칼 세포의 5밀리리터를 추가합니다. 튜브가 섭씨 30도에서 2시간 동안 방치되도록 허용하십시오.원심 분리 후 상퍼를 흡인. pH 7에서 3시간 동안 3%글루타랄데히드에서 3%글루타랄데히드화나트륨의 1개의 어금니로 공동 배양된 세포를 나타내는 펠릿을 수정한다. 인산나트륨 완충제로 공동 배양 된 세포를 한 번 씻으라.마찬가지로 버퍼링 된 1 % 오스뮴 테트란화물에 1 1 1/2 시간 동안 다시 수정한 다음 세척합니다. 30%50%70%95%와 100%의 등급아톤 계열에서 공동 배양된 세포라고도 하는 TEM 물질을 각각 15분 동안 탈수한다. 여기서 두 가지 변경 사항에서 최종 탈수 단계를 반복합니다.정상 일관성의 에폭시를 계량하여 에폭시 수지를 준비합니다. 에폭시 수지에 물질을 포함. TEM 물질을 섭씨 70도에서 8시간 동안 중합합니다.울트라톤에 유리 나이프가 장착된 16나노미터 섹션을 잘라냅니다. 어둠 속에서 10 분 동안 우라젤 아세테이트로 섹션을 얼룩지게하고 어둠 속에서도 10 분 동안 구연산염을 납으로 얼룩지게합니다. 전송 전자 현미경으로 섹션을 봅니다.예시적인 목적을 위해, 비디오에서, 2개의 격리가 검토되고, 하나는 3-하이드록시 지방산을 생성하고 그렇지 않은 다른 하나. 3-하이드록시 지방산은 크립토코칼 세포의 성장에 역할을 하지 않는 이차 대사산물이다. 다음은 크립토코커스와 아메배 사이의 대화형 순간을 보여주는 스냅샷입니다.점에, 내면화 전후의 크립토 코칼 셀을 관찰할 수 있다. 식세포증을 연구할 때, 라이브 이미징을 사용하는 것이 이상적입니다. 그러나, 연구원이 지속적으로 phagocytosis의 과정을 따르기 위하여 그 같은 현미경에 접근하는 것이 항상 가능하지는 않습니다.이러한 한계를 보완하기 위한 가능한 해결책은 상대형광 단위의 판독을 통해 정량적 데이터로 이미지를 보완하는 것일 수 있다. 막대 그래프는 이미지를 보완하는 데 사용한 데이터의 예입니다. 중요한 것은 이미지 형태의 정성적 데이터와 정량적 데이터는 시간이 지남에 따라 서로 다른 시점에서 취할 수 있다는 것입니다.모든 정보를 피킹함으로써, 하나는 phagocytosis의 과정에서 무슨 일이 일어나는지의 더 큰 이미지를 구성하기 시작할 수 있습니다. 정량적 데이터에서, 3-하이드록시 지방산을 가진 세포가 3-하이드록시 지방산을 생성하지 않는 세포에 비해 아메바 작용에 덜 민감하다는 것을 보는 것은 분명하다. TEM은 고해상도 전력으로 인해 음식 바쿠올의 루멘에 조류의 눈을 볼 수 있기 때문에 특히 강력한 도구이며, 이것은 라이브 이미징뿐만 아니라 스틸 이미지를 검사 할 때 종종 놓친 세부 사항의 종류입니다.이 특정 TEM 현미경 에서, 크립토 코칼 세포의 표면에 protuberances 명확하게 볼 수 있습니다. 이전에는 이러한 세포 표면 구조가 3-하이드록시 지방산이 주변 환경으로 방출되는 채널이라는 이론이 있었습니다. 요점에, 이러한 채널은 내부 조건을 변경하기 위해 아메배의 식품 바쿠올의 루멘에 3 하이드록시 지방산을 전달하는 데 도움이 될 수 있으며, 따라서 세포 생존의 촉진.pHrodo 또는 FITC 같이 음식 vacuole 안쪽같이 낮은 pH에서 단지 형광으로 사용하기 위하여 훨씬 더 나은 얼룩일 지도 모릅니다. 구체적으로 볼 때, pHrodo는 연구원이 내화된 세포에 관한 데이터를 얻을 수 있도록 허용합니다. 이를 위해, 세포는 염색하기 전에 인산염 완충액에서 중단되고 아메바 매체가 중성 pH인 것이 중요합니다.전송 전자 현미경 연산자는 종종 결과가 왜곡되고 전자 폭격에 의해 손상된 현미경 그래프가 있는 지점이기 때문에 제대로 단면에 훈련되어야 합니다. 그것은 연구원이 제시된 프로토콜에서 충분한 정보를 취하고 그들의 자신의 연구 결과에서 그(것)들을 최적화할 수 있을 것이라는 점을 상상됩니다. 더욱이, 연구원은 또한 표적으로 한 대사산물에 대하여 항체를 개발하고 TEM 시험 도중 면역금표지를 포함하여 그들의 면역 형광 현미경 연구 결과 도중 그(것)들을 적용할 수 있습니다.

complementary-use-microscopic-techniques-fluorescence-reading

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

형광 현미경을 사용하여 Nematodes에 박테리아를 머릿속으로

우리는 고속 3D 라이브 세포 형광 현미경과 고해상도 cryo - 전자 단층 촬영을 결합하여 상호 현미경 방법을 설명합니다. 우리는 이미지 동적 호스트 헬라 세포와 상호 작용하는 작은 HIV-1 입자에 의해 상호 방식의 기능을 보여줍니다.

동적 상호 작용의 3 차원 구조 분석을위한 상호 현미경

양자점(QD) 나노입자를 에폭시 포매 인간 병리학 조직의 상관 면역세포화학적 연구에 사용할 수 있는 방법을 설명합니다. 당사는 광시야 형광 현미경 및 투과 전자 현미경으로 시각화되는 상용 항체 단편 접합 QD를 사용합니다.

양자점 나노 입자를 사용하여 상호 빛 - 및 전자 현미경

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

이 문서는 단백질 세포 외 지역화 역학을 조사하고 바실러스 subtilis 및 황색 포도상 구균에 있는 고분해능 형광 현미경 검사법을 사용하여 형태학적 인 변화를 감시하기 위하여 단계별 가이드를 제공합니다.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

세균성 세포의 화상 진찰은 큰 거대 분자 기계의 기능을 지시하는 정적 및 동적 프로세스를 정의에 초점을 맞춘 신흥 시스템 생물학 접근입니다. 여기서, 정량적 라이브 세포 영상 및 극저온 단층 촬영의 통합은 레지오넬라 뉴모필라 형 IV 분비 시스템 아키텍처 및 기능을 연구하는 데 사용된다.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

배우세요 Cryptococcus neoformans와 아메바의 공배양 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경과 투과전자현미경을 활용한 식세포작용 연구 방법입니다. 이 기술은 병원체-숙주 상호작용 메커니즘을 이해하는 데 중요한 통찰을 제공합니다.

크립토코커스-아메바 상호 작용 을 연구할 때 현미경 기술과 형광 읽기의 상호 보완적 사용

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