Name: 이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 학습하세요 망막색소변성증 치료를 위한 고내용 이미징 분석법으로 로돕신 변이체의 세포 표면 및 세포 내 전송을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 약물 효능 평가와 다른 막 단백질 연구에도 적용 가능합니다.

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피츠버그 대학 신약 연구소이 콘텐츠 영상 및 초기 교육을 제공 하 고 우리 박사 마크 E. Schurdak를 감사 합니다. 아낌없이 박사 크 Palczewski (케이스 서쪽 예비 대학) 공유 하는 1D 4 및 B630 안티 rhodopsin 항 체. 마우스 rhodopsin 금성 건설의 cDNA를 포함 하는 플라스 미드는 박사 네 빈 램버트 (오 거 스타 대학)에 의해 공유 되었다. 이 작품은 피츠버그 대학 비전 연구 코어 보조금에서 YC를 P30EY008098 건강 그랜트 EY024992의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.

참고: rhodopsin 전송 시험.
1. 준비 및 세포의 문화
<ol><li>부활 cryo 보존 U2OS 안정 세포는 야생 타입 (WT) 또는 돌연변이 마우스 rhodopsin 금성 융해 단백질을 표현. 만 작은 얼음 결정은 유리병에 남아 때까지 37 ° C에서 세포를 녹여. 참고: U2OS 셀 사용 됩니다이 프로토콜에 있기 때문에 포토 리셉터 셀 라인 생체 외에서 연구에 사용할 수 있는 미리 속눈썹 생 합성 rhodopsin의 포유류 세포에 있는 유사한 분자 메커니즘에 의해 규제 됩니다. 또한, U2OS 셀 접시의 바닥에 단단히 부착 있고 큰 세포 기관, 그래서 그들은 rhodopsin 전송 분석 결과 대 한 이상적입니다. 7 U2OS 안정 세포 표현 WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N 및 P267L rhodopsin 돌연변이 사용 품질 및 신뢰성 분석 결과의 표시 예를 들어 여기. 분석 결과의 목표에 따라 볼 수 있듯이 다른 rhodopsin 돌연변이 또는 다른 막 단백질을 표현 하는 안정 된 세포를 사용할 수 있습니다. 안정적인 세포 인간의 rhodopsin 표현 가능한 경우이 분석 결과에 사용할 수 있습니다. 때문에 95% 상 동을 공유 하는 마우스 및 인간의 rhodopsin 단백질 화합물이 분석이 결과 의해 확인 된 것 이며 테스트 비보에 rhodopsin P23H 돌연변이8을 들고 마우스 adRP 모델을 사용 하 여 마우스 rhodopsin는 여기 사용 되었다. 안정적인 셀19위에서 설명한 대로 생성 되었다. WT 및 돌연변이 rhodopsin 성적 질문-PCR에 의해 계량 했다 그리고 WT과 돌연변이 rhodopsin 녹취 록의 표현 하는 안정적인 세포의 클론이 분석이 결과 대 한 선정 됐다. Rhodopsin 단백질의 표현은 immunoblot와 immunostaining에 의해 확인 되었다. 이 분석 결과에서 사용 하는 셀의 통로 20 보다 낮은 되어야 합니다.</li>
	<li>(높은 포도 당 Dulbecco의 수정이 글의 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 매체 (DMEM)과 5 µ g/mL Plasmocin) 성장 매체의 10 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브로 셀의 각 줄을 전송 합니다.</li>
	<li>원심 200 x g 5 분 삭제에 튜브는 상쾌한 고 각 셀 라인에 대 한 세포 성장 매체의 5 mL와 함께 셀 펠 릿 resuspend. 60 m m 조직 문화 접시에 셀 서 스 펜 션의 각 줄을 전송 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>하위 조직 문화 접시로 90%의 합류를 도달할 때 셀 참조12에 설명 된.</li>
</ol>2. 시드 잘 당 5000 셀에 셀
참고: 조직 문화 후드에서 다음 절차를 수행 합니다.
<ol><li>폴 리-리와 플레이트를 취급 합니다.<ol>
<li>셀을 뿌리기 전에 1 일 치료 블랙 벽 고 20 µ L/잘 30 분 폴 리 리 신 솔루션의 바닥판 384-잘 취소 합니다.</li>
		<li>액체를 발음 하 고 모든 우물 1 h. 넣어 다시 접시 뚜껑에 대 한 건조 허용 4 ° C에서 하룻밤 셀 시드 접시를 저장.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 현 탁 액을 준비 합니다.<ol>
<li>90% 합류까지 100mm 조직 배양 접시에 성장 매체에서 각 셀 라인 문화.</li>
		<li>버퍼링 하는 인산 염 (PBS)와 각 접시를 세척 하 고 0.05%의 1 mL로 세포 분리 37 ° c.에 트립 신</li>
		<li>분석 결과 매체 (10 %FBS, 100 단위/mL 페니실린 및 100 μ g/mL 스 높은 포도 당 DMEM) 10 mL에 셀의 각 라인 resuspend</li>
		<li>셀을 계산 하 고 분석 결과 매체와 105 셀/mL x 1.25 셀의 각 줄을 희석.</li>
	</ol>
</li>
	<li>씨 셀입니다.<ol>
<li>전자 멀티 채널 피 펫 또는 자동화 된 시 약 디스펜서를 사용 하 여 셀 선 및 채우기 열 1-21 (그림 2) 384-잘 접시의 당 세 개의 열에 세포 현 탁 액의 40 µ L/잘 분배 하.</li>
		<li>U2OS의 40 µ L/잘 추가 (P23H-Rhodopsin-금성) 열 22-23을 U2OS의 40 µ L/잘 (Rhodopsin-금성) 열 컨트롤로 24.</li>
		<li>300 x g 30에서 격판덮개 원심 384-잘 접시의 바닥에 모든 셀을 내리게 하기 위해 s. 참고: 셀 시드 후 접시에 물리적 충격을 피하십시오. 그렇지 않으면, 셀의 각, 한 모서리에 짓 눌린 것입니다 하 고 접시가 콘텐츠 이미징에 대 한 적합 하지 않을 것 이다.</li>
		<li>5% CO2 접시의 하단에 연결할 셀 3 h 37 ° C에서 384-잘 접시를 품 어.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 치료 화합물과 셀
<ol><li>그림 2와 같이 치료 조건 판 지도 생성 합니다.</li>
	<li>작업 솔루션 96 잘 접시에 최대 15 화합물의 x 5의 300 µ L를 준비 합니다.<ol>
<li>5 번 96-우물의 우물 A1 g 2에 있는 그들의 마지막 농도의 접시 (그림 2A)을 분석 결과 매체와 cps 1 ~ 15을 희석. 잘 h 2에서 분석 결과 매체의 300 µ L를 추가 합니다. 참고: 각 화합물의 최종 농도 사용 됩니다 가장 효과적인 농도에 P23H rhodopsin의 전송 구조 HTS12,13.</li>
		<li>2% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 당 100 µ L를 추가 25 µ m 9-시스-망막 열 11, 12, 분석 결과 중간에 각각 희석 하는. 추가 9-cis-희미 한 빛에 망막.</li>
	</ol>
</li>
	<li>384 잘 플레이트 세포 (그림 2B)와 교양에 대 한 솔루션을 작동 하는 x 5의 당 10 µ L를 추가 합니다.<ol>
<li>전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 열 1 ~ 21 (그림 2)에서 화합물 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15 행 A, C, E, G, I, K, M, 및 O를 추가. 화합물을 추가 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 및 열 1 ~ 21에서에서 행 B, D, F, H, J, L, N 및 P M.</li>
		<li>열 22 및 24 2 %DMSO 당 10 µ L를 추가 합니다. 9-25 µ M의 당 10 µ L 추가시스-망막 열 23. 참고: DMSO는 사용 차량 제어로 모든 화합물 처음 주식으로 DMSO에 용 해 하기 때문에. 22 DMSO 치료 세포를 포함 하는 P23H 표현 rhodopsin 사용 됩니다 0% 제어 하는 열입니다. 9-시스-망막 치료 세포 P23H rhodopsin 표현 100% 컨트롤으로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 24 시간 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.</li>
</ol>4. 세포 표면에 Rhodopsin 단백질 얼룩 막 Permeabilization 없이 Immunostaining.
참고: 어떤 세제를를 지키고 세포 막 전체 immunostaining 과정에서 피하십시오.
<ol><li>16%를 diluting 하 여 4 %paraformaldehyde (PFA) 준비 PFA 화학 증기 두건에서 1:4 볼륨 비율에 PBS 가진. 전송 4 %PFA 시 저수지에서.</li>
	<li>희미 한 붉은 빛으로 어두운 방에 384-잘 접시를 꺼내. 진공 수집 병에 연결 하는 8 채널 흡 인기를 사용 하 여 매체를 부드럽게 발음. 갓된 4%의 당 20 µ L을 추가 하는 전자 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 전체 384-잘 접시에는 PFA 및 실 온에서 20 분 동안 품 어. 세포 분리를 방지 하려면 항상 포인트는 흡 인기의 끝 각의 같은 쪽에 열망 하는 동안. 각의 중앙 하단 영역을 만지지 마십시오. 이미지를 복용 했을 때 지역에 흡 인기에 의해 감동 하지 않으려면 필드를 선택 합니다. 10 분 이상 외피, 384-잘 접시 증발을 방지 하는 뚜껑으로 커버. 참고: 셀을 100% 제어의 결과 영향을 미칠 것입니다 재생된 isorhodopsin의 photobleaching을 피하기 위해 어두운 방에 고정 됩니다. 고정, 후 정상적인 빛에서 384-잘 접시 밖으로 촬영 수 있습니다.</li>
	<li>각 잘에서 PFA 발음 전자 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 PBS의 당 50 μ를 추가 하는 8 채널 흡 인기를 사용 합니다. PBS 가진 3 개의 세척을 수행을 두 번 더 반복 합니다. 주의: 폐기물 액체 포함 PFA 출장된 병에 수집 하 고 실험 후 유해 화학 낭비로 처분 될 것 이다.</li>
	<li>전체 384-잘 접시에 5% 염소 혈 청의 당 20 µ L을 추가 하 여 셀을 차단 하 고 30 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>5% 염소 혈 청을 발음 하 고 추가 15 µ L 당 20 µ g mL-1 b 6-30 안티 rhodopsin 항 체의 1% 염소 혈 청에서 2 차 항 체 전용 컨트롤 그룹에 대 한 행 P 1% 염소 혈 청의 잘 당 오 추가 15 µ L A 행.</li>
	<li>90 분 동안 실내 온도에 또는 4 ° C에서 384-잘 접시를 밤새 품 어. 커버 알루미늄 호 일을 피하기 위해 photobleaching는 fluorophores의 384-잘 접시.</li>
	<li>PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어.</li>
	<li>PBS를 발음 하 고 5 µ g mL-1 Cy3 활용 된 염소 반대로 마우스 IgG 항 체의 당 15 µ L를 추가 합니다. 알루미늄 호 일 384-잘 접시를 커버 하 고 1 시간을 위한 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>PBS의 당 50 µ L로 3 회 접시를 씻어. 1 µ g mL-1 15 분 동안 실 온에서 핵 얼룩 Hoechst 33342 포함 된 PBS의 당 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>이미징 하기 전에 투명 한 필름으로 384-잘 접시를 봉인. 커버 알루미늄 호 일로 384-잘 접시와 이미지 즉시 이동 하는 경우 1 주까지 4 ° C에서 저장 합니다.</li>
</ol>5입니다. 영상입니다.
참고:이 콘텐츠 이미징 절차는 자료의 테이블에에서 나열 된 이미징 시스템에 적응. 절차는 다른 높은 콘텐츠 이미징 시스템을 사용 하는 경우 달라질 수 있습니다.
<ol><li>뚜껑을 제거 하 고 a 1 접시의 왼쪽된 상단 모서리에 배치와 함께 콘텐츠 영상에 384-잘 접시를 넣어.</li>
	<li>이미지 수집에 대 한 매개 변수를 설정 하는 이미지 수집 소프트웨어를 엽니다.<ol>
<li>새로운 설정 판 수집 설정 창을 열고 만들거나 기존 설치 파일을 로드 합니다.</li>
		<li>20 x 목표를 선택 하 고 픽셀 보정된 픽셀 크기는 0.80 x 0.80 그래서 2로 binning 설정 µ m.을 설정 스캔 라인 2000와 이미지 크기 (W x H) 사이트 당 1000 x 1000 픽셀 (800.00 µ m x 800.00).</li>
		<li>몇 군데 수 접시 유형을 선택 합니다. 384 잘 플레이트의 제조업체에서 제공 하는 정보를 사용 하 여 접시 크기에 맞게.</li>
		<li>웰 스는 384-잘 접시에 대 한 이미지를 선택 합니다.</li>
		<li>잘 당 이미지를 4 개의 사이트를 선택 합니다. 잘 감동 포부 팁의 측면을 하지 마십시오.</li>
		<li>405, 여기 레이저 선택 및 561 488 nm. DAPI, FITC, 텍사스 레드 채널에 대 한 배출 필터를 선택 합니다. 레이저 파워를 최적화 하 고 긍정적인 통제 우물에서 촬영 한 이미지의 밝기를 보장 하기 위해 각 채널의 이득을 채도 임계값 보다는.</li>
		<li>자동 초점에 대 한 잘-투-잘 초점을 선택 합니다. 첫 번째 잘 잘 샘플을 찾기 위한 초기도 인수를 선택 합니다. 모든 사이트에 사이트 자동 초점을 설정 합니다.</li>
		<li>각 채널에 대 한 줄당 4 개의 평균을 선택 합니다. 각 채널에 대 한 Z-오프셋 값을 최적화 합니다.</li>
		<li>되도록 이미지 384 잘 플레이트의 대각선 모서리에 2-3 웰 스는 초점에 모든 테스트 웰 스, 잘 당 모든 사이트에서 이미지는 셀 이상의 40% 합류, 그리고 모든 채널의 형광 강도 약 절반 포화 100% 테스트 웰 스를 제어 합니다.</li>
		<li>이미지 수집 방법을 저장 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>전체 접시를 실행 합니다. 시계는 영상 캡처 이미지는 영상 떠나기 전에 이미지 품질을 확인 하는 접시의 첫 번째 열에서 완료 될 때까지. 384-잘 접시를 꺼내 고 나중에 사용할 4 ° C에서 저장 합니다. 참고: 잘 찍은 채널 당 선택 하는 사이트의 수에 따라 걸립니다 40 분 한 384-잘 접시 이미징 완료 3 h.</li>
</ol>6. 이미지 분석입니다.
<ol><li>이 콘텐츠 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 이미지 데이터를 당겨. 매개 변수를 설정 하려면 100% 제어 웰 스 (23 열) 중 하나를 선택 합니다.</li>
	<li>분석 방법으로 다중 파장 셀 점수 를 선택 하 고 시작 설정 구성.<ol>
<li>DAPI 채널에서 이미지를 사용 하 여 핵을 정의 합니다. 선택 된 정의 핵 모양 잘 핵 이미지와 잘 맞는 다는 것을 확인 하는 미리 보기.</li>
		<li>FITC 채널 rhodopsin 금성 몇 군데에서 셀의 모양을 정의 합니다.</li>
		<li>텍사스 레드 채널에 rhodopsin 셀 표면 얼룩 영역을 정의 합니다.</li>
		<li>설정을 최적화 된 경우 확인 하려면 5 우물에 현재 알고리즘을 테스트 합니다. 설정을 저장 하 고 구성 창을 닫습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>최적화 된 분석 방법으로 모든 웰 스를 실행 합니다.</li>
	<li>그대로 휴대폰 번호로 개체 수 를 내보냅니다. FITC 채널의 평균 강도 Rhodopsin 금성 강도 (Rhodopsin 금성 INT)로 내보냅니다. 세포 표면 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin 강도로 텍사스 Red 채널의 평균 강도 내보냅니다.</li>
	<li>스프레드시트 소프트웨어에서 내보낸된 데이터를 엽니다. MEM-총 비율으로 세포 표면에 rhodopsin 강도를 rhodopsin 금성 INT에 의해 나눕니다. Z를 계산 '-분석 결과 품질을 평가 하는 각 매개 변수에 대 한 요소. Z′ = 1−3X (STD+을100% 제어표준0% 제어) / | 100% 제어−Mean0% 제어의미 |. 참고: Z'-요소 0 나타냅니다이 콘텐츠 스크린과 Z에 대 한 충분 한 중간 분석 결과 보다 높은 ' 비율이 0.5와 1 사이 높은 처리량 화면20,21에 필요한 뛰어난 분석 결과 나왔다.</li>
	<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 각 매개 변수에 대해 두 색 열 맵을 생성 하. 셀 라인 x 축과 y 축에 화합물의 이름을 정렬 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기, 우리는 콘텐츠 이미징 분석 결과 조회 수는 HTS.에서 확인 대상이 사용 보였다 이러한 프로토콜에 관련 된 유일한 자동화 높은 콘텐츠 영상입니다. Immunostaining와 형광 이미징 rhodopsin의 rhodopsin5,14,,1516의 지역화 특성을 일반적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 전통적인 이미징 방법으로 촬영 한 이미지의 정량화는 충분 한 셀 이미지 조건, 실험, 당 이미지의 낮은 용량 및 품질 제어 매개 변수의 부족의 부족에 의해 제한 됩니다. 우리 384-잘 형식 전통적인 immunostaining 프로토콜을 적응 하 고이 콘텐츠 이미징 전통적인 영상 교체. 이 높은 콘텐츠 이미징 프로토콜을 사용 하 여, 우리가 성공적으로 선택 하 고 구분 HTS<sup class="xr...

단백질 misfolding은 근이 영양 증, 신경 유년으로 망막 화 (RP)1를 포함 하 여 눈부신 질병에 관여. RP 상속 및 진보적인 망막 변성 기능과 항상성 막대 대뇌 또는 망막 안료 epitheliums (RPEs)2,3에 영향을 미치는 60 개 이상의 유전자에 돌연변이와 관련 된입니다. 효과적인 치료는 현재 RP에 대 한 합니다. Rhodopsin 돌연변이 RP의 경우 상 염색체 지배 (광고)의 약 25-30%를 위한 계정. 150 이상 rhodopsin 돌연변이4 (인간의 유전자 돌연변이 데이터베이스, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), 중 클래스 II 돌연변이 로드 포토 리셉터 죽음에 기여 rhodopsin 단백질의 구조적 불안정의 원인이 고 시력 손실5,6,,78. P23H 이다 북아메리카에 있는 가장 빈번한 rhodopsin 돌연변이 또한 클래스 II rhodopsin 돌연변이9,10의 전형적인 예. 그것의 고유한 구조 불안정으로 인해 misfolded rhodopsin는 야생 타입 rhodopsin 원형질 막5에 위치 하 고 있습니다 반면 포유류 세포에서 바인딩과 그물 (ER)에 축적 됩니다. Misfolded rhodopsin P23H 돌연변이 전시 지배적인 부정적인 세포 독성 haploinsufficiency, 때문만 아니다 하지만 응급실의 활성화로 관련 단백질 강 직 통로 중단된 막대 외부 세그먼트 조직 관련. 로드 포토 리셉터 세포 스트레스 완화, 한 전략 약리 보호자를 사용 하 여 돌연변이 rhodopsin의 네이티브 접는 안정화 하는.
이 위해 우리는 높은 처리량 화면 셀 기반 (HTSs)11,12,13 P23H rhodopsin 돌연변이 플라즈마에 이송 계량 하는 β-galactosidase 조각 보완성 분석 결과 사용 하 여 수행 막입니다. 이 HTS 분석 결과의 강력 하 고 간단한 프로토콜 우리 각 화면에 대 한 정도 79000 작은 분자의 활동을 탐구를 활성화. 그러나,이 HTS 분석 결과 발광 신호 읽기, 때문에 가양성 β-gal 억제제를 포함 하 여 색 또는 세포 독성 화합물 포함 되며 2 차 분석 결과 의해 식별 대기 히트 목록에.
전통적인 immunostaining 및 형광 이미징 방법 포유류 세포5,14,,1516의 rhodopsin 교통 공부를 몇 년 동안 사용 되었습니다. 그러나, 이러한 기존의 방법 신뢰할 수 있는 이미징 분석은 높게 일관 된 조건 하에서 촬영 한 이미지의 많은 수를 요구 하기 때문에 rhodopsin 전송으로 10 개 이상 화합물의 약리 효과 척도를 사용할 수 없습니다. 기존의 이미징 방법으로 하지 amendable. 여기, 우리 misfolded rhodopsin 돌연변이11,,1317의 셀 표면 수송 척도를 2 차 분석 결과 기반으로 하는 immunostaining이 콘텐츠 이미징 프로토콜 개발. 원형질 막에 rhodopsin 레이블을, 우리 생략 세포 막 permeabilization와 immunostained의 단계 rhodopsin 돌연변이 단일 클로 널 (b 6-30) 안티 rhodopsin 셀의 extracellular 측에 rhodopsin의 N 맨끝 epitope를 인식 하 여 막18. 전체 셀에 돌연변이 rhodopsin를 시각화 하려면 우리 rhodopsin 금성 형광 단백질을 융합. 다른 형광 채널에 형광 강렬의 정량화, 총 rhodopsin 강도 포함 하 여 전체 셀, 셀 표면에의 비율에에서 1 개의 단 하나 실험에서 여러 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 세포 표면에는 전체 셀에서의 rhodopsin 형광 안정적인 6 misfolded rhodopsin 뮤턴트의 총을 표현 하는 세포에이 방법을 적용, 우리이 뮤턴트 쪽으로 여러 개의 작은 분자 보호자의 약리 프로 파일을 생성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서 모든 셀 immunostained 384-잘 접시에 있으며 매우 일관 된 이미징 조건 하에서 자동된 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데. 이미지 분석은 600 개 이상의 셀을 셀 모양 및 단백질 표정 수준 변화와 셀의는 인해 변화를 줄이기 위해의 이미지가 포함 된 각 잘 수행 됩니다. 이 프로토콜의 워크플로 그림 1에 요약 됩니다. 이 방법의 장점은 우리 이미지 기반 분석에서 고해상도 이미지 뿐만 아니라 다중 매개 변수 quantifications를 얻을입니다. 일반적으로,이 프로토콜 수정 하 고 계량 관심사의 어떤 misfolded 막 단백질의 수송에 적용 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>U2OS(로돕신-금성) 세포</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS(T4R-로돕신-금성) 세포</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS(P23H-로돕신-금성) 세포</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS(P53R-로돕신-금성) 세포</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정된 세포 NA U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) 세포</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) 세포</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정 세포</td></tr><tr><td>U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) 세포</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS 세포에서 생성된 안정된 세포</td></tr><tr><td>DMEM 고포도당</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-500</td><td>L-글루타민, 나트륨 함유 피루브산</td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>Heat 불활성화</td></tr><tr><td>플라스모신</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>마이코플라즈마 제거 시약</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(100X)</td>세포 <td>배양의 박테리아 오염을 방지하기 위한 Gibco 15140122 100X 농축 항생제 솔루션</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>칼슘 및 마그네슘이 없는 HBSS의 0.25%, 1mM EDTA</td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, 멸균 여과, BioReagent, 세포 배양에 적합</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384웰 조직 culutre treated microplates, 검은색 웰 벽과 고함량 분석에서 세포 이미징을 위한 광학적으로 투명한 고리형 올레핀 바닥이 있는 마이크로플레이트</td></tr><tr><td>Sterile 96-well plate</td><td>Eppendorf</td><td>30730119</td><td>뚜껑이 평평한 바닥으로 처리된 조직 배양물, sterile, 검출 가능한 발열원, Rnase, DNase 및 DNA가 없습니다. Non-cytotoxic</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Sailine (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x PBS Buffer, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, 세포 배양 테스트</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>화합물 테스트</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized</td><td>NA</td><td>Compounds purchased from 다른 공급 업체 또는 맞춤형 합성</td></tr><tr><td>B6-30 항 로돕신 항체</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td><td>Krzysztof Palczewski 박사의 선물</td></tr><tr><td>Cy3 결합 염소 항 마우스 2 차 항체</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16 % 파라 포름 알데히드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28908</td><td>메탄올 프리</td></tr><tr><td>10 % 일반 염소 혈</td>청 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50062Z</td><td>차단 버퍼</td></tr><tr><td>Hoechst 33342, Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>핵 염색 용액</td></tr><tr><td>High-content imager</td><td>Molecular Devices</td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg; 마이크로 컨포칼 High-Content 이미징 시스템</td></tr><tr><td>MetaXpress High-Content 이미지 획득 및 분석 소프트웨어</td><td>Molecular Devices</td><td>MetaXpress</td><td>High-Content 이미지 획득 및 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫(0.5-10 &micro; L)</td><td>Rainin</td><td>17013802</td><td>수동 8채널 피펫, 0.5-10 &마이크로; L</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫 (0.5-10c</td><td>Rainin</td><td>17013805</td><td>수동 8채널 피펫, 20-200 &마이크로; L</td></tr><tr><td>전자 멀티채널 피펫(10-200 &mu; L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>96웰 및 384웰 마이크로플레이트 피펫팅 작업용 전자 멀티채널 피펫</td></tr><tr><td>50ml 시약 저장소</td><td>Genesee Scientific</td><td>28-125</td><td>멀티채널 피펫 분주용 시약</td></tr> 예비형 <tr><td>8채널 아스피레이터</td><td>ABC Scientific</td><td>EV503</td><td>96웰 또는 384웰 플레이트에서 액체 흡인용 8채널 스테인리스강 어댑터</td></tr><tr><td>Excel 스프레드 시트 소프트웨어</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>데이터 분석 및 히트 맵 생성을위한 스프레드 시트 소프트웨어</td></tr><tr><td>Origin2018 과학 데이터 분석 및 그래프 작성 소프트웨어</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>용량 반응 곡선을 생성하기위한 데이터 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

이 콘텐츠 이미징 분석 rhodopsin 전송 분석 결과

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

Rhodopsin misfolding 돌연변이 상 염색체 지배적인 망막 화 (RP), 효과적인 치료 부족 질병 눈부신 진보로 각 성 하는 로드 포토 리셉터 죽음으로 이어질. 우리가 가설을 misfolded rhodopsin 돌연변이의 세포 독성 약리학 돌연변이 rhodopsin 단백질 안정화에 의해 완화 될 수 있다. P23H 돌연변이 다른 클래스 II rhodopsin 변이 중 인코딩합니다 구조적으로 불안정 rhodopsin 돌연변이 단백질을 바인딩과 그물 (ER)에 누적 된 반면 야생 타입 rhodopsin 포유류에 플라즈마 막에 수송 된다 셀입니다. 우리는 이전 발광 기반 높은 처리량 화면 (HTS)을 수행 하 고 응급실에서 원형질 막의 P23H rhodopsin의 전송 구조 약리 보호자의 그룹을 식별. 돌연변이 rhodopsin 단백질 금액과 전체 세포에서 원형질 막에는 여기, 정량이 콘텐츠 이미징 분석 다음 immunostaining 메서드를 사용 하 여, 우리. 이 메서드는 유익 하 고 가양성 HTS. 다음에서 진정한 안타를 식별 하는 효과적인 또한,이 콘텐츠 이미지 분석 계량 각 화합물의 약리 속성을 평가 하는 하나의 실험에서 여러 매개 변수를 사용할 수 있습니다. 이 분석 결과 사용 하 여, 우리 6 RP 관련 rhodopsin 돌연변이, 이러한 rhodopsin 돌연변이의 구조적 안정성에 대 한 양적 및 질적 이해에 대 한 2 차원 약리 프로필을 얻는 쪽으로 11 다른 화합물의 효과 분석 그리고 이러한 돌연변이 향해 다른 화합물의 효능입니다.

우리는 매개 변수가 세 rhodopsin 전송 특징: 전체 (Rhodopsin 금성 INT) 원형질 막 (세포 표면에 Rhodopsin INT)에 rhodopsin의 immunostaining 강도 및 셀의 비율의 rhodopsin 금성 강도 전체 셀 (MEM-총 비율)에 있는 rhodopsin 금성 강도를 세포 표면에 rhodopsin 얼룩. Rhodopsin 전송 분석 결과의 대표적인 결과 그림 3 과 그림 4에 표시 됩니다. DMSO와 9-를 사용 하 여cis-망막 치료 세포 각각 0과 100% 컨트롤 P23H rhodopsin 비너스를 표현 Z'-이 세 개의 매개 변수는 0 0.5, 그 분석 결과 적당 한 품질, 제안 사이의 범위에 대 한 요인 이 콘텐츠 이미징21에 대 한 충분 한. 도 최적화 된 ...

여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.

이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

Rhodopsin 잘못 접는 것은 망막 색소증에게 불린 진보적인 망막 변성을 일으키는 원인이 됩니다. 전통적인 이미징 방법은 rhodopsin 수송을 정량화하는 능력이 제한되어 있지만, 새로 개발된 이미지 기반 분석법은 높은 처리량 스크리닝을 허용하여 거짓 긍정을 제거합니다. 이 기술은 약물 약역학의 빠른 평가를 허용합니다.질병을 일으키는 rhodopsin의 접이식을 구출하는 눈에서, 따라서 조용히 치료할 수 없는 눈부신 질병, 망막색 색소증에 대한 처리를 위한 잠재력을 가속화합니다. 막 단백질의 세포 지역화는 그 기능에 매우 중요합니다. 이 방법은 관심있는 다른 멤브레인 단백질의 수송을 정량화하기 위해 쉽게 변형되고 적용 될 수 있습니다.플레이트 맵을 준비하고 각 플레이트웰에서 액체를 부드럽게 추가하고 흡인하여 세포 수와 세포 간의 일관된 면역 상태 조건을 유지해야 합니다. 이렇게 하면 Z 계수가 높고 신뢰할 수 있는 결과가 생성됩니다. 시작하려면, 씨앗 5000 세포는 검은 벽으로 잘 당 5000 세포, 명확한 바닥, 폴리 리신 처리 384 잘 플레이트.37°C의 플레이트를 37°C의 큐베이션으로 5% CO2로 3시간 동안 배양하여 세포가 플레이트 바닥에 부착합니다. 다음으로, 여기에 표시된 것과 같이 미리 결정된 플레이트 맵에 따라 멀티채널 파이펫을 사용하여 5배 작업 솔루션의 웰당 10마이크로리터를 추가합니다. 이제 22및 24개의 열에 2%DMSO의 웰당 10개의 마이크로리터를 추가합니다.또한, 희미한 빨간 빛 아래 어두운 방에 25 마이크로 몰러 9 시스 망막의 우물 당 10 마이크로 리터를 추가합니다. 다양한 테스트 화합물을 모두 적재하면 알루미늄 호일로 플레이트를 덮고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다. 어두운 방에서 384개의 잘 접시를 꺼내어두운 붉은 빛이 켜집니다.여기서, 진공 수집 병에 연결된 8 채널 아스피라기를 사용하여 접시의 우물에서 매체를 부드럽게 흡인시합니다. 다음으로, 멀티채널 파이펫을 사용하여 새로 준비된 4%파라포름알데히드의 웰당 20마이크로리터를 전체 384웰 플레이트에 추가하고 실온에서 20분 동안 셀을 수정합니다. 고정 후 접시를 일반 빛에 놓습니다.8채널 아스피러를 사용하여 각 우물에서 파라포름알데히드를 흡인하고 멀티채널 파이펫을 사용하여 PBS 웰당 50마이크로리터를 추가합니다. PBS를 총 3회 세척 주기로 대체합니다. 그런 다음 각 우물에 5%의 염소 세럼의 우물 당 20 마이크로리터를 추가하고 30 분 동안 실온에서 플레이트를 배양합니다.인큐베이션에 따라, 우물을 흡인하고, 밀리리터 B630 항로도프신 항체당 20 마이크로리터 15마이크로리터를 O.Next행의 우물에 1%염소 세럼을 추가하고, 이차 항체 전용 대조군을 위해 P행에 15마이크로리터를 추가한다. 플레이트를 실온에서 90분 또는 밤에섭씨 4도에 배양합니다. 그런 다음, 형광의 광표백을 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 덮는다.다음으로 PBS 웰당 50 마이크로리터로 플레이트를 세 번 씻으시다. 마지막 세척에 이어, PBS를 흡인하고, Cy3-conjugated 염소 안티 마우스 IgG 항체의 밀리리터 당 5 마이크로그램의 웰 당 15 마이크로 리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 접시를 덮고 실온에서 샘플을 1 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션에 이어 접시를 세 번 씻으시다. 그런 다음 PBS 웰당 50 마이크로리터를 추가하여 실온에서 Hoechst 얼룩의 밀리리터 당 1 마이크로그램을 15 분 동안 포함시합니다. 마지막으로, 투명 필름으로 웰 플레이트를 밀봉하고 알루미늄 호일로 덮고 최대 1 주일 동안 섭씨 4도에 보관하십시오.호일을 제거하고 샘플 플레이트를 고함량 이미저에 넣고 A1은 플레이트왼쪽 상단에 배치합니다. 그런 다음 이미지 수집 소프트웨어를 열어 이미지 수집을 위한 매개 변수를 설정합니다. 플레이트 획득 설정 창을 열고 새 설정을 만들거나 기존 설정 파일을 로드합니다.20X 목표를 선택하고 픽셀 비닝을 2개로 설정하므로 보정된 픽셀 크기는 0.80 x 0.80 미크론입니다. 그런 다음 스캔 선을 2000으로 설정하고 이미지 크기를 사이트당 1000x 1000픽셀로 설정합니다. 다음으로, 이미지할 플레이트 유형을 선택합니다.제조업체에서 제공한 정보를 사용하여 플레이트 치수를 채웁니다. 이제 이미지할 우물을 4개의 사이트와 함께 선택하여 잘 이미지할 수 있습니다. 포부 팁에 의해 감동 우물의 측면을 피하십시오.이미징의 경우 405, 488 및 461 나노미터로 여기 레이저를 선택합니다. 그런 다음 DAPI, FITC 및 텍사스 레드 채널의 배출 필터를 선택합니다. 레이저 전력과 각 채널의 이득을 최적화하여 긍정적인 제어 우물이 포화되지 않도록 합니다.자동 초점에 초점을 잘 잘 선택합니다. 그런 다음 획득할 초기 웰을 선택하고 모든 사이트에 대해 사이트 자동 포커스를 설정합니다. 또한 각 채널에 대해 회당 평균 4개를 선택하고 각 채널에 대한 Z 오프셋 값을 최적화합니다.테스트된 모든 우물에 이미지가 초점을 맞추고 있는지 확인하기 위해 플레이트 모서리에 2~3개의 우물을 먼저 테스트하여 모든 것이 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 잘 당 모든 사이트에서 그 이미지는 40 % 이상의 합류와 세포를 가지고 있는지 확인합니다. 마지막으로, 모든 채널의 형광 강도가 모두 100% 제어 우물에서 약 절반포화상태임을 확인합니다.그런 다음 이미지 수집 방법을 저장하고 전체 플레이트를 실행합니다. 이미저를 떠나기 전에 플레이트의 첫 번째 열에서 이미지 캡처가 끝날 때까지 이미저를 보고 이미지 품질을 다시 확인합니다. 완료되면 접시를 제거하고 나중에 사용하기 위해 섭씨 4도에 보관하십시오.고함량 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지 데이터를 가져옵니다. 열 23에서 100% 제어 우물 중 하나를 선택하여 매개 변수를 설정합니다. 먼저 다중 파장 셀 채점을 분석 방법으로 선택하고 추가 설정을 구성합니다.DAPI 채널의 이미지를 사용하여 핵을 정의합니다. 미리 보기, 선택된 핵 의 정의된 핵 형상이 핵 이미지와 잘 잘 맞는지 확인한다. 다음으로, 로도신 비너스가 이미지되는 FITC 채널에서 셀 모양을 정의합니다.이를 위해 각 셀의 최소 및 최대 직경, 배경 위의 최소 형광 강도 및 각 셀의 최소 영역을 설정합니다. 이제 텍사스 레드 채널의 진도 세포 표면 얼룩 영역을 정의하여, 세포 모양의 최소 및 최대 직경, 배경 위의 미늄 형광 강도, 각 스테인드 셀의 최소 영역을 설정하여. 현재 알고리즘을 5개의 우물에서 테스트하여 설정이 최적화되었는지 확인합니다.그런 다음 설정을 저장하고 구성 창을 닫습니다. 최적화된 분석 방법으로 모든 웰을 실행합니다. 완료되면 개체 번호를 그대로 셀 번호로 내보냅니다.FITC 채널의 평균 강도를 Rhodopsin 금성 강도로 내보내고 텍사스 레드 채널의 평균 강도를 세포 표면에 로도신 강도로 내보냅니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 각 매개 변수에 대해 2색 열 맵을 생성합니다. x축에 셀라인의 이름과 y축의 화합물을 정렬합니다.여기서, P23H rhodopsin 금성의 우리의 심상은 녹색에 있는 금성 형광을 표현하고, 세포 표면 면역 염색을 적색으로 표현하는 U2OS 세포를 취급했습니다. 세포는 DMSO 또는 5개의 마이크로몰러 9-시스 망막으로 처리되었습니다. rhodopsin 전송 분석, 다양 한 조건 하에서 전체 세포에 진 통 양을 비교, P23H 돌연변이 세포주에서 상당한 회복을 보여줍니다., 9 시스 망막으로 처리 하는 경우.또한, 세포 표면의 진도 강도, 및 전체 세포에서 진도상가금강도에 세포 표면에 진통 얼룩의 비율은, DMSO로 처리된 야생형 rhodopsin에 비해 P23H 돌연변이에 대해 현저히 낮지 않다. 히트 맵은 여러 돌연변이체에서 셀당 평균 진도 양과 지역화를 비교하는 효율적인 방법입니다. 여기서, 야생형 대조군 및 6개의 진통 돌연변이는 수평으로 나열되고, 화합물 처리의 효력은 수직으로 비교됩니다.이전 연구에 동의하여, 세포 표면의 진도 강도및 세포 표면에 진통 얼룩얼룩의 비율은 Rhodopsin 금성 강도에 DMSO로 처리된 야생형에 비해 6개의 돌연변이체에 대해 더 낮습니다. 화합물 1, 2, 6 및 9크게 T4R, P23H, D190N 및 P267L 진도 선 돌연변이체에서 진도 핀 금성 강도 세포 표면에 진통 얼룩의 비율을 증가, 이러한 화합물은 플라즈마 막에 이러한 진도 돌연변이의 수송을 구출 제안. 이 이미지 분석에 중요 하기 때문에, 그 세포는 고정 하기 전에 50 그리고 70%의 컨할 필요가 있습니다.또한, 우리는 전체 접시에 걸쳐 우물의 이미지를 보여 주었다. 초점이 맞추어진 이미지와 종료되지 않는 형광에 모든 채널에 대한 모든 임계값이 있는지 확인합니다. 선택 화합물까지, 그 구조 잘못 주름 진 rhodopsin 수송, 우리는 과정을 검증 할 수 있습니다, 다음 진도 P23H 돌연변이를 표현하는 마우스 모델을 사용하여, 생체 내에서 이러한 화합물의 효능을 전달.이 방법을 통해 멤브레인 단백질 량과 현지화를 정량화할 수 있습니다. 따라서, 그것은 보조 저장 및 저하 당 막 단백질에서 시작 된 마이크로 실수에 대 한 좋은 도구. 파라포름알데히드는 이 실험에서와 마찬가지로 이 시약처리를 포함하는 절차를 가지고 있습니다.그것은 후드에서 수행됩니다. 이 시약을 포함한 폐기물은 유해 화학물질로 적절히 폐기해야 합니다.

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

우리는 높은 처리량 방식으로, 여러 세포 프로세스와 구조를 시각화하고 수치 높은 콘텐츠를 이미지로 자동 셀 culturing를 결합 방법을 설명합니다. 이러한 방법은 genomes의 추가 기능 주석의 도움뿐만 아니라 질병 유전자 네트워크 및 잠재적 약물 표적을 식별할 수 있습니다.

Neurodegenerative 질병 높은 콘텐츠 심사

우리는 마우스 망막의 생체 외 슬라이스 준비를 사용하여 콘 광 수용체의 축삭 터미널에서 칼슘 역학을 모니터링하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 중요한 포유 동물 모델 시스템에서 콘 칼슘 신호의 포괄적 인 연구, 마우스를 할 수 있습니다.

이미징 CA<sup&gt; 2 +</sup마우스 망막의 광 수용체 콘 축삭 터미널에서&gt; 역학

진핵 세포 발현을 위해 디자인 된 카르복시 말단에 GFP 태그 컨스 부호화 TMEM184A는 혈관 세포에서 헤파린 수용체로서 TMEM184A의 식별을 확인하기위한 분석에 사용 하였다.

GFP - 태그 TMEM184A를 사용하면 헤파린 수용체 신원 확인을 위해 구축

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

이 논문은 세포 내 ROS 수준과 미토콘드리아 막 전위와 형태학을 동시에 정량화하기위한 고 - 내용 현미경 검사 워크 플로우를 제시한다. 세포 투과성 형광 리포터 분자 5- (and- 6) - 클로로 메틸 -2 ', 7'- 디클로로 디 히드로 플루 오렌 시스 디 아세테이트, 아세틸 에스테르 (CM-H 2 DCFDA) 및 테트라 메틸 로다 민 메틸 에스테르 (TMRM)...

고감도 현미경을 이용한 세포 산화 환원 프로파일 링

신경 흥분의 엔도-동적 과정 및 exocytosis 흥분 성의 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체의 통해 변조 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 표면 및 내부 수용 체 인구 풀 측정에 대 한 접근, 하이 콘텐츠 분석 결과가입니다.

AMPA 모니터링을 위한 하이 콘텐츠 분석 결과 수용 체 매매

이 보고서는 시각적 GPCR, 로도프신 및 mini-Go와그 복합체를 준비하기위한 다른 세제의 선별을 설명합니다. 정제 동안 다른 단계에서 복합체의 품질을 특성화하는 생화학적 방법이 입증되었습니다. 이 프로토콜은 그들의 미래 구조 연구를 위해 다른 막 단백질 복합체로 일반화될 수 있다.

성공적인 결정화를 위한 시각적 GPCR-mini-G 단백질 신호 복합체의 전략적 스크리닝 및 특성화

여기에서, 광수용체 막 단백질의 국소화 및 eGFP 형광을 이용한 초파리 화합물 안구에서의 망막 변성의 평가를 위한 비침습적 방법이 기재되어 있다.

eGFP 태그 단백질을 사용하여 초파리 광수용체 세포에서 막 단백질 밀매를 연구하기

이 작업에서는 재조합 G 단백질 결합 수용체(GPCR)에서 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 384웰 플레이트에 대한 고처리량 세포 내 칼슘 형광 분석에 대해 설명합니다. 표적, 소열 진드기, Rhipicephalus microplus 의 키닌 수용체는 CHO-K1 세포에서 발현됩니다. 이 분석은 하나의 "이중 첨가" 분석에서 동일한 세포를 사용하여 작용제와 길항제를 식별합니다.

재조합 G 단백질 결합 수용체의 고처리량 스크리닝을 위한 "이중 첨가" 칼슘 형광 분석

이 프로토콜은 고도로 분화되고 편광된 인간 망막 색소 상피(RPE) 배양에서 리포푸신 축적 모델과 RPE의 총 OS 소비/분해 용량을 검출하기 위한 개선된 외부 세그먼트(OS) 식균 작용 분석을 설명합니다. 이러한 방법은 이전 리포푸신 모델과 고전적인 펄스 추적 외부 세그먼트 식균 작용 분석의 한계를 극복합니다.

Improved Lipofuscin Models and Quantification of Outer Segment Phagocytosis Capacity in Highly Polarized Human Retinal Pigment Epithelial Cultures

여기에서는 비타민 A 막 수용체와 광 수용체 옵신과 각각의 생리학적 리간드와 단백질-리간드 상호 작용을 연구하기 위한 두 가지 정량적 방법을 설명합니다.

레티닐리덴 단백질 생성에서 비타민 A 막 수용체 및 옵신 단백질과 리간드의 상호 작용을 연구하기 위한 방법론

학습하세요 망막색소변성증 치료를 위한 고내용 이미징 분석법으로 로돕신 변이체의 세포 표면 및 세포 내 전송을 정량화하는 방법입니다. 이 기술은 약물 효능 평가와 다른 막 단백질 연구에도 적용 가능합니다.

이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과

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