Name: 백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 생체 내 백혈구 탈출구 정량화 방법을 Kaede 형질전환 마우스를 이용하여 피부 종양에서 면역 세포 동역학을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 질병 진행 과정에서 면역 반응을 이해하는 데 도움을 줍니다.

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저자 박사 마커 스 Bosenberg YUMM 1.1 및 YUMM 1.7 murine 흑색 라인 및 박사 데보라 J. Fowell b 6를 제공 하기 위한 제공 하는 것을 감사 하 고 싶습니다. RIKEN BRC 통해 국가 바이오-리소스 문 부 과학성, 일본의와 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr 쥐.

모든 동물 프로토콜 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 오 레 곤 건강 & 과학 대학에 의해 승인 되었습니다가지고.
1. 염증 및 마우스 Pinna의 FITC 그림의 유도
<ol><li>층 류 흐름 후드에서 C57Bl/6 마우스 증발된 isofluorane를 사용 하 여 anesthetize (3-5 %isofluorane 유발 하 고 1-3 %isofluorane;에서 0.5-1.0에서 산소 유량 L/분). 페달 반사의 손실 모니터링 하 여 적절 한 anesthetization를 위해 무의식적인 움직임과 감소 호흡 속도.</li>
	<li>귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 5 %FITC 솔루션의 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: 틸 프 탈 레이트 (DBP)에 녹아. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.</li>
	<li>FITC 신청 후 24 시간 이산화탄소 노출 뒤에 자 궁 경부 전위를 통해 마우스를 안락사. 가 위를 사용 하 여 머리에서 귀를 구분 하 여 PBS에 귀 pinnae를 수집 합니다. 자 궁 경부 dLNs와 사 타 구니 비 배수 LNs는 LNs 주위 조직에서 분리를 핀셋을 사용 하 여 PBS에 수집 합니다. 사 타 구니 비 배수 LNs FITC+/Kaede 빨간+ 백혈구의 존재에 대 한 부정적인 컨트롤 될 것입니다. 기관 프로토콜 당 시체의 처분. 참고: 분석을 위한 최적의 시간 게시물 photoconversion 세포 유형 및 알려진된 철새 동작에 따라 달라 집니다. 수지상 세포, 예를 들어 6 h 게시물 DBP 응용 프로그램으로 이른 dLNs에서 검색할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 염증 및 마우스 Pinna의 Photoconversion의 유도
<ol><li>층 류 두건에서 80 mg/kg 케 타 민 및 염 분에 녹아 10 mg/kg xylazine의 복 주사가-Tg 마우스 (C57Bl/6 배경) anesthetize. 1.1 단계에에서 설명 된 대로 적절 한 anesthetization를 확인 합니다.</li>
	<li>귀 위쪽으로 향하게 하는 복 부 측으로 편평 하다. 피펫으로 20 µ L 귀 pinna의 복 부 측에 1:1 아세톤: DBP의. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.</li>
	<li>DBP 신청 후 알루미늄 호 일의 조각에 슬릿을 절단 하 고 보라색 광원에 귀를 노출 하는 슬릿을 통해 귀를 당겨. 등 쪽 면이 위쪽으로 양면 테이프를 사용 하 여 호 일에 귀를 보호 귀를 평평 하다.</li>
	<li>3 분 100 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 직접 광원, photoconvert 아래 귀 위치.</li>
	<li>photoconversion, 후 24 h가-Tg 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확. 참고: 1.3 단계에서에서 언급 한 고려 사항 외에도 확산의 속도 결정 분석의 타이밍으로 급속 하 게 세포 분할에서 단풍나무 레드의 손실이 발생 합니다.</li>
</ol>3. vaccinia 감염 마우스 Pinna의 FITC 응용 프로그램
<ol><li>1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 C57Bl/6 마우스를 anesthetize.</li>
	<li>이의 복 부 측 평평 하다. 피펫으로 5 x 106 플 라크 형성 단위 (PFU) 귀 pinna에 PBS의 10 µ L에 희석 vaccinia 바이러스 (VacV)의. 29 게이지 바늘을 사용 하 여, pinna 25 번40구멍.</li>
	<li>감염 된 후 24 h, 단계 1.1 그리고 피펫으로 20 µ L 5% 귀 pinna의 복 부 측에 아세톤에 녹아 있는 FITC에서에서 설명한 isofluorane와 VacV에 감염 된 쥐를 anesthetize. 몇 초 동안 말리에 귀를 하실 수 있습니다.</li>
	<li>FITC 신청 후 24 시간에서 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs 및 사 타 구니 LNs를 수집 합니다. 참고: FITC DC 다양 한 24 시간 간격으로 매매를 결정 하기 위해 시간 포인트 게시물 감염에 적용할 수 있습니다. 우리는 이전 dLNs에 DC 마이그레이션 하루 1 ~ 3 게시물 감염41에서 비슷한 수준에서 유지 됩니다 보고.</li>
</ol>4. vaccinia 감염 마우스 Pinna Photoconversion
<ol><li>1.1 단계에에서 설명 된 대로 증발된 isofluorane와 단풍나무-Tg 마우스를 anesthetize.</li>
	<li>3.2 단계에에서 설명 된 대로 VacV와 귀 pinna 감염.</li>
	<li>감염 된 후 24 h, anesthetize가 VacV에 감염 된 쥐 단계 2.1에 설명 된 대로 고 2.3-2.4 단계에서 설명한 대로 photoconversion를 수행 합니다.</li>
	<li>photoconversion, 후 24 h는 마우스를 안락사 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 귀 pinnae, 자 궁 경부 LNs, 사 타 구니 LNs를 수확. 참고: 단계 3.4에서 위에서 언급 한, photoconversion 시간 포인트 게시물 감염에서 관리 수 있습니다.</li>
</ol>5. 귀 및 림프 노드 Cytometry에 대 한 처리
<ol><li>단일 셀 정지 귀 pinnae의 만들기: 껍질 떨어져 귀를 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase에서 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에 아래로 향하게의 내부는 두 쌍의 족집게와 장소를 사용 하 여 귀 pinna의 복 부와 등 쪽 면 행 크의 버퍼링 식 염 수 솔루션 (HBSS) (캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +포함). 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 30 분 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>LNs에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물에서 LNs 장소. 애타게 오픈 림프 노드 두 29 게이지 바늘을 사용 하 여 캡슐을 30 분 동안 37 ° C에서 림프절을 품 어 70 µ m 나일론 셀 스 트레이너를 통해 소화 조직을 누릅니다.</li>
</ol>6. 피부 흑색 종 종양 이식 및 Photoconversion입니다.
<ol><li>전기 면도기를 사용 하 여 장난-Tg 마우스 뒷면의 센터에서 모피를 면도.</li>
	<li>왼쪽 및 오른쪽 상단 견 사이 뒤쪽의 센터에서 29 게이지 바늘을 놓고 intradermally가-Tg 마우스의 피부에 주입 5 x 105 종양 세포 (식 염 수의 50 µ L에 희석). 종양 (즉, 왼쪽 및 오른쪽 상 완 LNs 종양에 대 한 상단 뒷면 중앙 배치) 지정 된 림프절 림프 배수 되도록 신중 하 게 배치 해야 합니다. DLN 위에 종양이 피부/종양 통해 LNs의 직접 photoconversion에서 발생할 수 있습니다 배치 하지 마십시오.</li>
	<li>원하는 크기 (100-650 m m3) 종양을 허용 합니다.</li>
	<li>2.1에 설명 된 대로 조직 컬렉션 이전 1 일 장난-Tg 마우스 anesthetize 하 고 종양 주변의 모든 새로 regrown 모피를 면도.</li>
	<li>알루미늄 호 일에 원형 구멍을 삭감 하 고 광원을 종양을 노출 하는 종양을 이겨낼. 다시 구멍을 통해 떨어지는에서 종양을 방지 하기 위해 종양 보다 약간 작은 구멍을 삭감 하 고 인접, 비 종양 피부의 변환 최소화 합니다.</li>
	<li>광원 및 5 분 200 mW 전력에서 405 nm 광원을 사용 하 여 photoconvert 바로 아래 종양 위치.</li>
	<li>1.3 단계에서에서 설명한 대로 photoconversion, 후 24 h 쥐 안락사. PBS에는 종양, 상 완 dLNs, 및 사 타 구니 비 배수 LNs를 수집 합니다. 가 위를 사용 하 여 주변 피부에서 종양을 잘라 고 1.3 단계에서에서 설명한 대로 LNs를 제거 합니다.</li>
</ol>7. 종양 및 림프절 Cytometry에 대 한 처리
<ol><li>종양에서 단일 셀 정지를 만들기: 1 mg/mL 콜라 D 80 U/mL DNase HBSS에 희석을 포함 하는 24-잘 접시의 우물으로가 위 종양을 말하다. 70 µ m 나일론 여과기를 통해 1 h. 보도 소화 조직에 대 한 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>5.2 단계에에서 설명 된 대로 림프절의 단일 세포 현 탁 액을 만듭니다.</li>
</ol>8입니다. 항 체 Cytometry에 대 한 얼룩
<ol><li>단일 셀 정지에 조직을 소화, 후 관심의 표식이 있는 셀을 표준 흐름 cytometry 얼룩 기법을 수행 합니다. 간단히, 96 잘 접시에 피펫으로 2 x 106 셀. Fc 블록 (1 µ g/mL) 얼음; 20 분에 대 한 샘플을 품 어 FACs 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 PBS에) 두 번 씻어. 라이브/죽은 얼룩 (PBS에 희석) 샘플에 추가 하 고 얼음;에 15 분 동안 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어. 1 차 항 체 (테이블의 재료) 얼음; 30 분 FACs 버퍼에 희석 된 품 어 FACs 버퍼 두 번 씻어. 참고: 녹색가 고 빨간 형광 FITC와 PE fluorophores;와 겹치는 데 따라서, FITC와 PE 활용 된 항 체는 데 단백질을 함께 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>얼룩, 후 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 또는 2% 셀 수정 PFA.</li>
</ol>9. 교류 Cytometry 분석
<ol><li>FITC (가 그린)와 PE (빨강 단풍나무) 채널을 70-80%의 전체 범위에 PMT 전압 설정 (약 10에서 인구 센터4)가 그린 비보 전 또는 빨간 단색 splenocytes 또는 혈액을 사용 하 여. 참고:이 큰 신호 확산에서 발생 장난 (FITC) 녹색과 빨강 단풍나무 (PE) 채널에 대 한 보상 하지 마십시오.<ol>
<li>단색이 컨트롤을 만들려면 장난-Tg 마우스에서 비장 또는 혈액을 수집 합니다. ACK 버퍼, 붉은 혈액 세포를 lyse 다음 셀 두 그룹으로 나누어:가 녹색 및 변환가 빨간색 없이.</li>
		<li>단일 색상가 빨간색 컨트롤 중단 1 mL의 PBS에 셀과 100의 힘에는 405 nm 광원을 사용 하 여 5 분에 대 한 24-잘 접시에 photoconvert mW. 이러한 세포를 사용 하 여 설정 하는 데 녹색 (FITC)와 빨간 PMT 전압 교류 cytometer (단계 9.1)에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>가 단백질에 대 한 전압을 설정 되 면 단일 fluorophore 보상 구슬 제조 업체의 지시 당 분류를 사용 하 여 다른 모든 기본 항 체 얼룩에 대 한 보상.</li>
	<li>데이터를 수집 하는 교류 cytometer에서 샘플을 실행 합니다. 참고: 데 단백질 세포에 의해 생산 되 고 지속적으로. 즉 그 24 h photoconversion, 후 변환 된 셀이 녹색에 대 한 두 배 긍정적인 되며 새로 합성된 장난 (녹색)으로 붉은 단풍나무 단백질 셀에 축적 했다.</li>
	<li>FlowJo 소프트웨어 또는 비슷한 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다.</li>
</ol>

저자는 공개 충돌이 있다.

주변, 비 림프 조직에서 백혈구 탈출구는 개시 및 면역 반응의 해결에 대 한 중요 한, 탈출구를 제어 하는 분자 메커니즘 이해 가난 하 게 된다. 지식에이 격차는 주로 정량화 비보에 대 한 도구의 준비 가용성 예정 이다. 여기, 우리 photoconvertible 마우스 (단풍나무-Tg) 피부와 종양에서 내 생 백혈구 탈출구를 계량 하 고 염증에 FITC 페인트로 직접 머리 비교를 제공 하 고 감염 모델의 사용을 설명 합니다. 두 모델 모두 생 DC 인구를 추적 하는 동안 FITC와 비 phagocytic 세포에 의해 빈약한 통풍 관의 무료 배수 제한 FITC 골수성과 림프 출구 주변, 비 림프 조직 등에서 광범위 한 분석에 대 한 페인트의 유틸리티 설명 종양입니다. 또한, 우리를 나타내는 종양에서 출구 확률적 결과 제시한 Torcellan 그 외 여러분 확인 보다는 선택적 데이터 제시 39. 종양에서 백혈구 출구 제어 메커니즘의 추가 조사 종양 관련 된...

주변 조직 면역 반응 염증의 사이트에 백혈구 신규 모집에 의해 뿐만 아니라 그들의 후속 보존 규제 메커니즘에 의해 형성 된다. 따라서, 보호 면역 체류 시간, 또는 오히려 림프 혈관을 통해 말 초 조직에서 마이그레이션합니다는 백혈구 입력 여부를 결정 하는 누적 세포 및 분자 메커니즘에 의해 결정 됩니다. 중요 한 것은, 백혈구 림프 혈관 (탈출구 되 나)을 통해 조직의 종료에 대 한 성향은 그들의 특수 기능에 연결 된다. 수지상 세포 (DC) 취득 성숙 신호 항 전송 및 배출 림프절 (dLN), 적응 면역1에 필요한 프로세스에서 프레 젠 테이 션에 대 한 응답에서 철새 행동. 청소 골수성 세포, 대 식 세포와 호 중구, 식 균 작용을 통해 apoptotic 파편을 취소를 제공 합니다. 세균 감염 시 호 중구 탈출구 조직 및 궁극적으로 apoptosis와 DSS 유도 colitis의 모델 dLNs2 에서 받게, 데이터 지원 macrophage 탈출구는 지역의 염증3를 해결 하는 데 필요한 가설. 그러나 Neutrophil 및 대 식 세포 출구 모든 염증 상황에서 발생 하는 여부, 불명 하다. 정상 상태4,5,,67,8감염된 및 염증된4,,910, 에서 T 림프 구 출구에 대 한 증거 11,12 주변, 비 림프 조직은 T 세포는 활발히 recirculate, 조직 기반 신호 운전이 출구를 제대로 이해 남아 있지만 나타냅니다. 여러 연구 결과 확인 21 (CCL21)와 그것의 수용 체 CCR74,11, chemokine (C C 모티브) 리간드를 포함 하 여 신호 배출 림프 모 세관 쪽으로 방향 마이그레이션에 필요한 후속 탈출구 13, 12 (CXCL12) chemokine (C X C 모티브) ligand 수용 체 CXCR42,14및 sphingosine 1 인산 염 (S1P)10,,1516. 그러나, 이러한 메커니즘은 모든 컨텍스트에서 활성 그리고 미결 문제에 남아 있다 여부 그들은 모든 종류의 세포 출구 결정. 중요 한 것은, 더 출구와 질병에서 기능적인 관련성을 제어 하는 메커니즘에 대 한 통찰력 필요 양적 vivo에서 분석의 방법을 합니다.
여러 가지 방법은 출구 여러 동물 모델에 vivo에 직접 cannulation 림프 혈관의 입양 전송 ex vivo 라는 백혈구, 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램을 포함 하 여 계량 하는 데 사용 되었습니다. 레이블이 지정 된 입자, 그리고 photoconversion17,18 vivo에서 주입 구심 마우스 림프 혈관의 직접 cannulation 어렵고 작은 동물에서 수집 될 수 있는 액체의 양에 의해 제한 이다. 따라서, cannulation 크게 큰 동물에서 수행 되었습니다 (예., 양) 수술 조작 등은 실용적. 이러한 연구는 림프10,,1920에 림프 및 골수성 세포의 존재에 대 한 직접 증거를 제공합니다. 또한, 양 모델 공개는 급성 및 만성 염증 림프에 림프 구 존재 거의 10010,21증가.
중요 한 것은 분류 하 고 유전자 조작 세포의 입양 전송 공개 하 고 CCR7는 CD4의 탈출구 필요 심하게 염증이 피부5,11, 림프 톨의 전처리 하는 동안+ T 세포 작은 분자 S1P 수용 체 길 항 제, FTY720, 부분적 으로만 그들의 출구10를 억제. 흥미롭게도, 만성 염증이 피부에서 전송 된 림프 톨의 출구 CCR7 독립적인10, 이지만 부분적으로 CXCR49필요할 수 있습니다. 그러나 입양 전송 실험,, 제공 비 생리 적인 수 전 비보 의 활성화 및 레이블이 세포 주입, 조직 및 높은 중간 유체 압력의 biomechanical 환경 변경 통해 조직으로 그 초기 림프 모 세관 열고22그들의 전송 속성 변경 합니다. Fluorescein isothiocyanate (FITC) 피부 irritants의 유무에 한 대안, 경 피 응용 프로그램으로 (예., 틸 프 탈 레이트, DBP) 또는 감염23,24 의 추적에 대 한 수 추적 프로그램을 축적 하 고 dLNs를 마이그레이션할 phagocytic 세포. 마찬가지로, 붙일 레이블된 종양 종양 소재25잠겼습니다 있다 phagocytic 세포를 추적 하는 수단을 제공 합니다. 이러한 메서드는 DC 출구13,14,17,,2627 지배 하지만 비 phagocytic 추적할 수 있습니다 메커니즘에 대 한 중요 한 통찰력을 제공 림프 톨 그리고, 해석 성 FITC 따라서 철새, 라벨 LN 거주 Dc의 무료 림프 배수 하 여 복잡 한 수 있습니다.
또는, intravital 현미경 실시간으로,2829순수 관련 백혈구 인구의 비보에 추적을 허용 하는 강력한 도구입니다. 함께 사용 기자 마우스 및 생체 내에서 항 체 기반 immunofluorescent이 라벨, intravital 현미경 복잡 한 공간을 계시 했다 및 면역의 일시적인 역동성 셀 밀매, 포함 중간 마이그레이션30 , 림프 endothelium, 림프 루멘 및 마이그레이션 LN 항목28,31시 내 통로 환생. Intravital 이미징 기술의 광범위 한 채택 비용, 설정, 위해 필요한 전문 기술에 의해 제한 하 고 여러 세포 유형 측정 처리량 제한. 아직도, 인구 역학을 분석 하는 양적 방법 커플링 intravital 이미징 조직 것입니다 통찰력을 제공 추가 하 고 중요 한 기계 운동 성 및 마이그레이션 그리고 림프 모 세관 내에서 메커니즘에 관하여 18 , 31 , 32.
따라서, vivo에서 photoconversion 나왔다 제자리에 라벨, 허용 하는 방법으로 생리 적 백혈구 출구 (함께 사용할 경우 cytometry)의 정량화 및 phagocytic 활동의 독립은 부재 또는 도전의 존재입니다. 단풍나무-Tg 마우스 constitutively 후 레스터 변환 빨간색 형광 (빨강 단풍나무)33보라색 빛에 노출 될 때까지 녹색 형광 (가 그린)를 전시 하는 돌 산호에서 고립 된 단백질을 표현 한다. 그들은 주변 조직 사이트에서 탈출구로 Photoconverted 세포를 추적할 수 있습니다 dLNs에 축적. 이것 및 다른 유사한 photoconvertible 마우스 모델34,35 피부36에서 규정 하는 T 세포의 제정 탈출구, Peyer의 패치37에서에서 CXCR4 종속 B 세포 출구를 포함 하 여 중요 한 생물학을 계시 했다 , 펩 티 드 다시 도전38, 그리고 종양 microenvironments39에서 광범위 한 백혈구 송신 시 상주 메모리 T 세포의 동원. 여기, 우리는 피부 염증 및 photoconvertible 메서드를 사용 하면 기존 데이터의 직접적인 비교에 대 한 있도록 감염의 맥락에서 경 피 FITC 응용 프로그램 photoconversion의 머리 비교를 수행 합니다. 또한, 우리 이식된 종양에서 photoconversion를 설명 하 고 변환 효율 및 종양 microenvironments에서 선택적 탈출구를 기술 한다. 따라서, 우리는 더 이러한 방법의 응용 프로그램 필요 백혈구 출구 intratumoral 백혈구 복잡성, 항 종양 면역, 해석에 대 한 중요 한 영향을 미칠 것 이다, 종양에서의 중요 한 생물학을 명료 하 주장 하 고 치료에 응답입니다.

<table><tbody><tr><td>Collagenase D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 및 콜림터가 있는 Silver-LED-405B 광원</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>플루오레세인 이소티오시아네이트 이성질체 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>디부틸 프탈레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29 게이지 주사기</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70 um 셀 스트레이너</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Caisson</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정성 아쿠아 데드 셀 스테인 키트</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>정제 안티 마우스 CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (클론 N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (클론 M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (클론 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (클론 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (클론 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (클론 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (클론 HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (클론 BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (클론 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (클론 M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (클론 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (클론 RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 (Fraction V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Rat 및 Anti-Hamster Igk / 음성 제어 보상 입자 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessa 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 소프트웨어</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

백혈구 탈출구 murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

고갈 림프절 주변 조직에서 백혈구 탈출구만 면역 감시 및 시작에 대 한 중요 하지 않습니다 하지만 또한 주변 조직 응답의 해상도에 기여. 다양 한 방법은 비 림프, 주변 조직에서 백혈구 탈출구를 계량 하는 데 사용 됩니다, 세포질이 고 분자 메커니즘을 맞는 탈출구를 제어 하는 불완전 하 게 이해 남아 있다. 여기, 우리는 murine 피부와 종양에서 백혈구 탈출구의 정량 분석에 대 한 현장에서 photoconversion 사용 하 여를 설명합니다. Photoconversion는 직접 라벨 백혈구의 피부 조직 내에서 거주 할 수 있습니다. 보라색 빛에 피부 노출 유도 로컬 하지만 선 동적인 응답 특징 백혈구 침투와 혈관 시키는 형광 추적기의 경 피 응용 프로그램 머리 비교에서 photoconversion 특히 철새 수지상 세포 인구를 분류 하 고 동시에 피부 microenvironments 및 종양에서 골수성과 림프 탈출구의 정량화를 사용. 백혈구 탈출구의 메커니즘 intratumoral 백혈구 복잡성에 대 한 우리의 이해에 누락 된 구성 요소를 유지 고 따라서 여기에 설명 된 도구 응용 프로그램 제공할 것 이다 종양의 역학에 대 한 독특한 통찰력 모두 면역 microenvironments 안정 된 상태와 치료에 대 한 응답에서

우리는 먼저 photoconversion 결과 효율성을 평가 하 고 결정 마우스 피부에 관련 된 염증에 문학에 발표 된 복제 하고자 했다. 귀 pinna 100 mW 보라색 빛에 노출 되었다 (405 nm) 이전33을 설명 하는 3 분. 단일 셀 정지 모든 CD45의 78% 변환 효율을 공개 노출 다음 즉시 귀 피부 또는 자 궁 경부 dLNs에서 생성 된+ dLNs (그림 1A)에서 변환 된 셀으로 피부에 백혈구 관찰. Photoconversion와 관련 된 염증 반응 평가, 하 우리 계량 CD45 침투의 숫자+ 변환된 귀 0에 24 h 백혈구 변환 (그림 1B) 및 급성 변화에에서 게시 혈관 침투성 측정 의해 마일의 분석 결과42 (<str...

여기, 우리는 순 진, 염증된에서 백혈구 탈출구의 정량화 vivo에서 악성 murine 피부에 대 한 방법을 보여 줍니다. 두 모델의 머리 비교를 수행 하는 우리: 경 피 FITC 응용과 현장에서 photoconversion. 또한, 피부 종양에서 백혈구 탈출구를 추적 하기 위한 photoconversion 유틸리티를 설명 합니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

광변환은 병들게 된 상태의 여러 조직 부위로부터 백혈구 거주 및 출구 역학에 대한 기계론적 통찰력을 위해 백혈구 이그레의 정량적 분석을 위한 추적 가능한 생체 내 방법을 제공한다. 음, 여기에서 우리는 백과 종양에서 백혈구 추적의 유용성을 보여줍니다. 이 분석법의 적용은 다른 조직 및 질병에 대한 적용은 빛을 투여할 수 있는 능력에 의해서만 제한됩니다.이 기술의 주요 장점은 생체 내 에서 염증 조직으로부터 의한 송신으로 면역 세포 집단을 전송하는 대신 내인성의 정량화를 허용한다는 것입니다. 염증을 유도하기 위해 발가락 핀치에 대한 반응의 부족을 확인한 후, 마이크로 파이펫을 사용하여 20 마이크로리터의 디부틸 프탈레이트 또는 DBP를 투여하고 마취케드 트랜스제닉 마우스의 귀 좌측에 투여한다. DBP가 건조할 수 있도록 허용한 후 알루미늄 호일 조각의 슬릿을 통해 귀를 당기고 양면 테이프를 사용하여 등쪽을 위쪽으로 향하는 호일에 귀를 평평하게 고정시십시오.그런 다음 405 나노미터 광원 바로 아래에 있고 100 밀리와트의 전력으로 3 분 동안 포토 컨버터를 배치하십시오. 박시니아 감염의 경우, 미적화된 Kaede 트랜스제닉 마우스의 귀 정점에 PBS의 10 마이크로리터에서 5배 10~6개의 플라크 형성 유닛을 투여하고 피나 25번 찌르도록 마이크로피펫을 사용한다. 24 시간 후, 포토 컨버터블 피나 그냥 입증.적절한 실험 시점에서, 피나와 자궁 경부 및 잉게인 림프절을 수확하고 각 피나의 복부와 등쪽을 떼어내는 핀셋 의 두 쌍을 사용합니다. 그런 다음 림프절과 피나 조각을 귀 안쪽을 내려다 보는 24웰 플레이트의 개별 우물에 콜라게나제 D의 밀리리터 당 1밀리그램, 칼슘과 마그네슘을 함유한 HBSS에서 희석된 DNA의 밀리리터 당 80단위를 포함하는 개별 우물에 넣습니다. 29 게이지 바늘 2개를 사용하여 각 림프절 캡슐을 열고 30 분 동안 37 °C의 플레이트를 놓습니다.인큐베이션의 끝에서, 각 조직의 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 별도의 70 마이크론 나일론 세포 스트레이너를 통해 소화 된 피나 및 림프절 조직을 누릅니다. 종양이 적절한 실험 크기로 성장하면 종양 부위 주위에 새로 자란 털을 면도하고 알루미늄 호일 조각에 절단 된 원형 구멍을 통해 종양을 당깁니다. 종양을 405 나노미터 광원 바로 아래에 배치하고 200 밀리와트의 전력으로 5 분 동안 광변환을 합니다.광전 후 24시간 후, 각 동물로부터 종양과 상반부 및 잉구인 림프절을 수확하고 HBSS에서 콜라게나아제 D와 DNase를 함유하는 24웰 플레이트의 개별 우물 내에서 종양을 다진 가위를 사용합니다. 림프절을 별도의 우물에 넣고 방금 설명한 대로 캡슐을 열어 놓습니다. 37°C에서 1시간 동안 종양과 림프절을 반시간 동안 배양한 후, 별도의 70 마이크론 스트레이너를 통해 소화된 조직을 눌러 각 조직의 단일 세포 현탁액을 얻습니다.혈동 세포측정에 의한 단일 세포 현탁액을 분석하기 위해 먼저 Kaede 형질전환 마우스에서 비장 또는 혈액을 수집하고 염화 칼륨 완충액으로 적혈구를 분해한다. 세포를 변환되지 않은 Kaede FITC 로 분할하고 Kaede PE 인구를 변환한 다음 24웰 플레이트의 한 웰에서 PBS의 1 밀리리터에서 단일 색상 Kaede PE 세포를 다시 중단한 다음 100밀리와트의 전력에서 405 나노미터 광원 하에서 5 분 동안 세포를 광변환합니다. 다음으로 광변환된 Kaede PE 셀과 변환되지 않은 Kaede FITC 세포를 사용하여 각 형광 채널의 총 범위의 70~80%까지 광증 전압을 설정합니다.Kaede 단백질에 대한 전압이 설정되면 제조업체의 지침에 따라 단일 불소 표지 보상 구슬을 사용하여 다른 모든 1 차 항체 얼룩을 보상하십시오. 그런 다음 표준 유량 세포 분석 프로토콜에 따라 유동 사이토미터에서 샘플을 실행합니다. 광변환 노출 직후 귀 피부 또는 자궁 경부 배수 림프절에서 생성된 단일 세포 현탁액은 배수 림프절에서 관찰된 변환 된 세포없이 피부에있는 모든 CD45 양성 백혈구의 78 %의 변환 효율을 나타낸다.광변환 된 귀 0 및 24 시간 변환에서 CD45 양성 백혈구에 침투하는 수의 정량화는 보라색 빛 노출이 백혈구 침투의 통계적으로 유의한 증가를 일으킨다는 것을 보여줍니다. CD45 양성 백혈구 침투의 이러한 증가는 암시니아 바이러스와 같은 강력한 염증 자극에 의해 유도된 침투에 비해 작다. 광변환은 또한 마일리지 분석으로 측정된 귀 피네의 혈관 투과성을 증가시켜, 함께 배용량, 노출 시간 및 데이터 해석을 최적화할 때 조직 염증에 대한 보라색 빛의 효과를 고려해야 한다는 것을 나타냅니다.광변환 된 동물로부터 해리 된 종양 세포의 흐름 세포 측정 분석은 카에데 FITC 양성에서 Kaede PE 양성으로 종양 내 CD45 양성 세포의 상당한 변환을 밝혀, 림프절 세포를 배수하는 동안 변환되지 않은 상태로 유지. CD45 양성 백혈구의 광변환 효율은 종양 유형과 크기 사이에서 크게 변화했으며, CD45 양성 백혈구는 작은 흑색종 종양 내에서 가장 효율적인 광변환을 보여줍니다. 종양 부피가 증가함에 따라, 변환 효율은 특히 약 50%로 감소하며, 멜라닌 생성 종양 내에서 관찰된 CD45 양성 세포의 최대 광변환으로 광변환 효율에 눈에 띄는 영향을 미치며, 종양 부피가 400입방밀리미터에 접근함에 따라 10%로 떨어집니다.광변환 후 24시간 동안 종양 배수 림프절을 검사하면 다양한 표현형의 Kaede 적양성 면역 세포의 존재를 드러내므로 광변환 된 종양으로부터 백혈구 이온을 입증합니다. 개발 후, 이 기술은 면역학 분야의 연구원들이 말초 조직에서 꾸준한 상태와 염증성 백혈구 회전율의 운동학을 발견할 수 있는 길을 열었습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 관심의 조직만 광변환되어 주변 조직의 부주의한 광변환이 결과를 손상시키기 때문에 하는 것이 중요합니다.이 방법에 새로운 개인그들의 조직의 변환에 대 한 노출 시간을 최적화 해야, 조직 수집 관심의 백혈구의 역학에 따라 발생 하기 전에 시간의 기간 뿐만 아니라.

quantifying-leukocyte-egress-via-lymphatic-vessels-from-murine-skin

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

가까운 적외선 형광 (NIRF)를 사용하여 최근 개발 된 이미징 기술은 림프 시스템의 암 전이에서 활약 역할, 면역 반응, 상처 수리 및 기타 림프 - 관련 질병을 명료하게하다하는 데 도움이 될 수 있습니다.

마우스의 림프 Vasculature의 비 침습적 광학 이미징

이 비디오는 마우스에서 Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG에 발판 감염 후 수지상 세포 이동을 모니터링하기 위한 분석을 보여줍니다. 세균 감염 시 활성화된 피부 DC 세포는 세포 투과성 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙시니미딜 에스테르(CFSE) 염료로 표지됩니다. 슬와골 배출 림프절로의 DC 이동을 위한 적절한 간격 후, 노드 세포를 분리하고 DC 특이적 표면 마커에 대한 면역 염색을 실시합니다. 마이그레이션된 DC의 식별은 유세포 분석을 사용하여 수행됩니다.

감염된 마우스에서 배출 림프절로의 피부 수지상 세포 이동을 모니터링하기 위한 CFSE 기반 분석

이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

피부에서 배출 림프절로의 세포 이동을 추적하기 위한 마우스의 분석법이 설명되어 Bacille Calmette-Guérin에 발바닥 패드 감염 후 림프절로 동원된 피부 수지상 세포의 특성을 분석할 수 있습니다.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

림프 구 chemotaxis 및 마이그레이션에 대 한 양적 평가 대 한 프로토콜은 면역학 연구를 위한 중요 한 도구입니다. 여기, 생체 외에서 프로토콜 허용 실시간, 다중화 세포 이동의 평가 뿐만 아니라 상호 보완적인 vivo에서 기술 활성화 추적 기본 셀의 비장에 설명 되어 있습니다.

인간 Monocyte Chemotaxis에서 생체 외에서 그리고 Vivo에서 인신 매매 Murine 림프 구 측정

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

여기에서, 우리는 마우스 cremaster 근육의 포스트 모세관 정맥에 intravital 현미경 검사법을 수행하는 방법을 보여줍니다. 일반적으로 염증과 패혈증의 다른 모델, 특히 케모카인과 사이토 카인에 의해 유도 된 모델에 적용, 우리는 과장 된 근육 백혈구 침투를 포함하는 muscolopathies의 연구에서 그 관련성을 강조.

Intravital 현미경 검사법에 의해 평가된 마우스에 있는 Cremaster 근육의 백혈구 침투

여기서는 흉부 덕트 림프구를 수집하고 시간 경과 사진을 사용하여 3 시간 동안 쥐 페이어의 패치에서 장 열대 림프구의 이동을 관찰하는 정확한 방법을 설명합니다. 이 기술은 림프구의 역학이 염증 성 조건하에서 어떻게 영향을 받는지 명확히 할 수 있습니다.

쥐 페이어의 패치에서 림프구 역학의 현미경 관찰

흑색 종은 다른 장기로 빠르게 퍼지는 매우 공격적인 질병입니다. 이 프로토콜은 전이성 흑색종의 Braf/Pten 마우스 모델에서 사타구니 림프절의 부피를 모니터링하기 위해 3D 렌더링과 결합된 초고주파 초음파 이미징의 적용을 설명합니다.

흑색종의 Braf/Pten 유전자 조작 마우스 모델에서 초고주파 초음파 이미징에 의한 림프절 부피 분석

이 논문은 진피 림프 모세혈관에서 쥐 내피 세포의 자기 비드 기반 분리 방법을 설명합니다. 분리된 림프 내피 세포는 다운스트림 in vitro 실험 및 단백질 발현 분석에 사용할 수 있습니다.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation(Murine 피부 림프 내피 세포 분리)

배우세요 생체 내 백혈구 탈출구 정량화 방법을 Kaede 형질전환 마우스를 이용하여 피부 종양에서 면역 세포 동역학을 연구하는 기술입니다. 이 방법은 질병 진행 과정에서 면역 반응을 이해하는 데 도움을 줍니다.

백혈구 탈출구 Murine 피부 및 종양 림프 혈관을 통해 측정

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