Name: Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 학습하세요 레트로바이러스 감염을 이용한 안정적 DR3 과발현 세포주 구축 방법을. 이 기술은 항유사분열제 유도 세포사멸 메커니즘 연구와 DR3 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 작품은 (김소)에 53110000117 및 043222019 (X.W.)에 칭화 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다.

여기에 설명 된 모든 마우스 실험 승인 되었고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 칭화 대학에서 수행 note 하시기 바랍니다.
1입니다. 세대 DR3 Overexpression 셀 라인의
<ol><li>3 전장 DR3 cDNA를 삽입 하 여 DR3 식 (pMXs-IRES-DR3-깃발)에 대 한 플라스 미드를 생성 플래그 retroviral 벡터 pMXs-IRES-Blasticidin BamHI/XhoI의 제한 사이트에 C-말단에 x.</li>
	<li>Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM)의 4 mL와 60mm 요리에서 같은 A 세포 성장. 셀 합류 80%-90%에 도달 하면, 다음 날 transfect 플라스 미드 pMXs-IRES-DR3-플래그의 2 μ g으로 셀 transfection 시 약을 사용 하 여 ( 재료의 표참조)에 따라 제조 업체의 수동20.</li>
	<li>후 72 h는 상쾌한 수집, 0.45 μ m 살 균 필터를 사용 하 여 미디어를 여과 하 고 어둠 속에서 4 ° c.에 바이러스 성 현 탁 액을 유지</li>
	<li>HT29 셀 DMEM 60 mm 접시에 성장 하 고 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>셀 30%-50% 합류에 도달 하면, 다음 날, 바이러스 성 현 탁 액의 밀리 리터 당 1, 5-디 메 틸-1, 5-diazaundecamethylene polymethobromide의 8 μ g의 존재 바이러스 서 스 펜 션의 2 mL로 세포 감염. 후 37 ° C에 외피의 4-6 h, 바이러스 성 현 탁 액을 발음 하 고 신선한 DMEM의 4 mL를 추가 하 고 인큐베이터에 접시를 반환.</li>
	<li>요리 24 h 바람직합니다에서 미디어를 삭제 하 고 신중 하 게 prewarmed PBS의 2 mL로 세포를 씻어. 트립 신-EDTA의 1 mL에 있는 셀에 추가 하 고 3 분 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>대부분 세포의 분리 된 10 배 확대에 현미경으로 관찰 후 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 포함 하는 완전 한 DMEM의 2 mL와 trypsinization을 중지 합니다. 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 실 온 (RT)에서 5 분 동안 200 x g 에서 세포를 원심.</li>
	<li>상쾌한을 제거 하 고 10 ml DMEM의 셀 펠 릿 resuspend. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 30, 100, 및 300의 요인에 의해 셀을 희석. 시드 1 µ g/mL blasticidin 포함 된 DMEM의 20 mL와 함께 150 mm 접시에 셀입니다. 1 ~ 2 주 동안 5% CO2 와 37 ° C 배양 기에서 품 어.</li>
	<li>이 기간 동안 관찰 식민지 매일 10 배 확대에 거꾸로 현미경으로. 때 식민지 직경은 약 1-2 m m 접시의 바닥에 잘 격리 된 식민지를 표시 합니다.</li>
	<li>매체를 발음 하 고 미리 데워 공영 3 mL로 세포를 씻어. 60 mm 접시에 트립 신-EDTA의 2 밀리 리터를 추가 합니다. 소독 집게를 사용 하 여 데리 압력가 마로 소독 살 균 복제 실린더, 그리고 60 mm 접시에 그들을 배치. 트립 신-EDTA를 포함 하는 실린더를 선택 하 고 부드럽게 표시 식민지 그들을 배치. 있는지 확인 모든 복제 실린더만 포함 한 식민지 근처 식민지와 오염을 방지 합니다.</li>
	<li>3 분 동안 인큐베이터에 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>3 분 후 10 배 확대 여부 그들은 분리 되는 보고에서 현미경 아래에 있는 셀을 확인 합니다. 셀 들어 올렸다 때 비활성화 된 트립 신을 각 실린더를 문화 매체의 70 μ를 추가 합니다. 부드럽게 믹스 200 μ 피펫으로 세포 현 탁 액. 이 과정은 실린더를 이동 되었는지 확인 합니다.</li>
	<li>각 식민지에서 잘 당 DMEM 1 mL를 포함 하는 2 개의 24-잘 격판덮개 세포 현 탁 액을 전송. 잘 당 세포 현 탁 액의 30 μ 플레이트 A에에서 추가 하 고 해당 70 μ 접시 B. 라벨에에서 제대로 판 우물 및 인큐베이터에 다시 넣어.</li>
</ol>2. 확인 DR3 Overexpression 셀 라인의
<ol><li>플레이트 B 셀 90% 합류에 때, 미디어를 제거 하 고 신중 하 게 씻어 1 mL의 PBS로 세포. 완전히 PBS를 제거 하 고 SDS 페이지 로딩 버퍼 x 1의 50 μ를 가진 세포를 lyse. 원심 분리기 튜브 1.5 mL를 24-잘 접시에서 세포 lysates 전송 및 100 ° c.에서 10 분에 대 한 샘플을 끓여</li>
	<li>15 분 동안 80 V의 정 전압에서 그리고, 1 시간에 120 V에서 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 젤에는 샘플을 실행 합니다.</li>
	<li>400의 정 전류에 젖은 전송에 의해 polyvinylidene 불 소 (PVDF) 막 단백질을 전송 2 h mA.</li>
	<li>반대로 깃발 항 체, 부정적인 컨트롤 (그림 1)으로 서 야생-타입 HT29 셀을 사용 하 여 다른 클론에 DR3 식을 테스트 합니다. TBST에 녹아 5000에서 5% 탈지 우유의 요인에 의해 1 차적인 항 체 희석 (Tris 버퍼 염 0.1%를 포함 트윈-20). 4 ° C에서 플래그 항 체로 막 밤새 품 어.</li>
	<li>TBST 가진 막 TBST 세척 시간 15 분의 총에 대 일 분 마다 실시간 새로 고침에서 200 rpm decoloring 셰이 커에 흔들어 씻어.</li>
	<li>5-6 h 4 ° C에서 10, 000에 5% 탈지 우유의 요인에 의해 희석 방지 마우스 2 차 항 체로 막 품 어.</li>
	<li>2.5 단계에 설명 된 대로 다시 막 씻으십시오.</li>
	<li>부 향상 된 화학 (ECL) 기판을 사용 하 여 플래그 식 감지 하 고 젤 문서 시스템 막 이미지 ( 재료의 표참조). 긍정적인 복제품으로 DR3를 표현 하는 클론을 식별 합니다.</li>
	<li>6 잘 플레이트에 플레이트 B에에서 긍정적인 클론에 해당 하며 10 cm 요리에서 그들을 성장 때까지 세포를 증폭 하는 플레이트 A에에서 클론을 전송 합니다. 긍정적인 복제품에서 성장 하는 세포의 냉동된 주식을 확인 하 고 나중에 사용-80 ° C에서 저장.</li>
</ol>3. 셀의 Antimitotic 에이전트에 Apoptotic 반응의 평가
참고: Diazonamide는 다른 tubulin 불안정 에이전트21거울 암 세포 성장 억제에 놀라운 활동이 해양 자연 제품의 새로운 클래스입니다. 그러나, 행동의 모드 불분명 남아 있습니다. Antimitotic 에이전트에 셀의 세포질 응답을 테스트 하려면 paclitaxel와 diazonamide 야생-타입 HT29 세포와 HT29 DR3 세포 치료에 사용 되었다. 마약 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 10 밀리미터 주식을에 해산 되었고, 다음, 더 다양 한 농도 희석: 30 nM, 100 nM, 300 nM, 1000 nM, 3000 nM, 그리고 10000 DMSO에 nM.
<ol><li>HT29 및 HT29 DR3 셀 trypsinization에 의해 수집 합니다. 자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 밀도 측정 합니다. 그런 다음, 잘 당 3 x 104 의 세포의 밀도에 DMEM에서 12-잘 접시에 셀 씨. 다음 날, 10 nM diazonamide를 추가 하 고 부정적인 제어로 1 %DMSO 사용. 치료의 48 h 후 10 배 확대 (그림 2)에서 현미경으로 세포를 이미지.</li>
	<li>씨 HT29와 HT29 DR3 잘 당 3 x 103 셀의 밀도에서 96 잘 접시 DMEM에서 세포 고 37 ° c.에 하룻밤 성장 하도록 허용 그런 다음 복용량 고조 diazonamide 농도 0.3 추가 nM, 1 nM, 3 nM, 10 nM, 30, 및 100 nM 부정적인 제어로 1 %DMSO 사용 하 여 각 잘.</li>
	<li>치료의 48 h 후 제조업체의 설명서에 따라 발광 기반 세포 생존 능력 분석 결과 키트를 사용 하 여 세포 생존 능력을 측정 합니다.<ol>
<li>인큐베이터에서 96 잘 접시를 꺼내와 그것은 실시간에 약 30 분 동안 서 보자. 다음, 각 음을 분석 실험 시 약의 50 µ L lyse 세포를 2 분 동안 RT에 접시를 흔들 그리고 microplate 리더 (그림 3)를 사용 하 여 각의 또 다른 10 분 확인 오일안에 대 한 실시간에 접시를 품 어 추가 합니다. 참고: 셀 생존 나타냅니다 각각의 상대적 발광 강도 잘 컨트롤의 잘 1 %DMSO 치료.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6 주 된 여성 BALB/c 누드 마우스를 사용 하 여는 vivo에서 연구14. 참고: 쥐 특정 병원 체 자유로운 조건에서 유지 되었다.<ol>
<li>HT29 및 HT29 DR3 셀 trypsinize 하 고, 다음, trypsinization DMEM 37 ° c.에 prewarmed를 사용 하 여 중지 50 mL 튜브에 세포 현 탁 액을 수집 하 고 1000 rpm에서 실시간 삭제는 상쾌한 10 분에 대 한 세포를 원심 FBS 없이 DMEM 매체에서 셀 펠 릿 resuspend. 셀을 다시 원심 고 PBS에 셀 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>자동 셀 카운터를 사용 하 여 셀 및 셀 2.5 x 10의 농도를 희석7 셀/mL PBS를 사용 하 여. 각 마우스 (5 x 106 셀/마우스)22의 맞은 측면에 HT29 또는 HT29 DR3 셀 서 스 펜 션의 200 μ의 피하 주사를 통해 종양을 생성 합니다.</li>
		<li>캘리퍼스 마다 2 d를 사용 하 여 이식 후 종양 볼륨 (TV)를 측정 합니다. 계산 하는 다음 수식을 사용 하 여 TV: TV = 1/2 L x 폭 x 폭 (여기서, w: 종양 폭, l: 종양 길이). 평균 종양 볼륨 약 100 m m3에 도달 하면 컨트롤 또는 치료 그룹으로 쥐를 무작위 (n = 그룹 당 6) 치료를 시작 하 고.</li>
		<li>다음과 같이 paclitaxel 솔루션을 준비 합니다. 첫째, paclitaxel의 총 볼륨 5% 에탄올에 완전히 녹이 고, 다음, 추가 5% polyoxyl 35의 최종 볼륨의 수소 아주까리 기름. 마지막으로, D5W로 볼륨의 나머지 90%를 확인 (물, pH 7.4에에서 5% 포도 당).</li>
		<li>3 20 mg/kg의 복용량에 정 맥으로 paclitaxel을 주사 2 주 동안 주당 x. 종양 볼륨 및 몸 무게 3 주14x를 측정 합니다. 실험을 종료 하 고 체중 20% 감소 또는 종양 볼륨 약 2000 m m3에 도달 하는 경우는 동물을 안락사.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 선언할 수 없다.

이 원고에서 우리 HT29 DR3 안정적인 셀 라인을 생성 하는 방법을 설명 합니다. HT29-DR3 셀 DR3 antimitotic 에이전트에 의해 유도 된 apoptosis에 기여 하는 분자 메커니즘을 공부에 대 한 모델을 제공 합니다. 이 방식은 다양 하 고 반복 합니다. 절차의 성공, 프로토콜의 4 개의 중요 한 단계 해야 간주 합니다. 첫째, 높은 생성 하기 위하여 충분 한 바이러스 titer 그것 것이 좋습니다 같은 A 셀에 80%-90% 합류 때 DNA transfection를 수행. 둘째, 바이러스 성 정지 2 주 보다는 더 이상 빛에서 커버에 4 ° C에서 저장 되어야 한다. 셋째, 150 mm 접시에 감염 된 세포를 분리 하는 경우 그것 감염 효율 변화 다른 세포로 잘 분리 된 식민지를 직렬 희석 하 고 좋습니다. 마지막으로, 단일 식민지를 따기 때 거기 해서는 안됩니다 주변 식민지에 대 한 어떤 오염 든 지.
이 프로토콜 대부분 셀 라인에서 잘 작동 하지만 단...

분리 유전자 발현은 관심사의 유전자의 기능 연구를 종종 고용 된다. 두 가지 방법, 과도 및 안정 되어 있는 transfection, 세포 및 분자 생물학에 prevalently 호스트 셀1,2에 DNA 또는 RNA의 세그먼트를 삽입 하 되. 뚜렷이 transfected DNA 또는 RNA 전달할 수 없습니다 딸 세포에 유전 변경만 시간의 짧은 기간 동안 보존 될 수 있도록. 다른 한편으로, 안정적 transfected 세포, 세 유전자 셀 라인에의 식을 유지 호스트 세포 게놈으로 통합 됩니다. 따라서, 안정 되어 있는 transfection 장기 유전 규칙에 대 한 연구에 대 한 일반적으로 소유 되는 방법입니다. 안정적인 셀 라인 비보에 대 한 마우스 모델에 xenografts 공부3에 이식 수 있습니다. 안정 되어 있는 transfection는 두 가지 범주로 나눌 수 있습니다: 바이러스 및 nonviral. Nonviral transfection에 비해 바이러스 감염 다양 한 높은 효율4,5,,67인간 세포로 유전자를 전송할 수 있습니다. 또한, 하나의 클론에서 안정적인 셀 라인 동질성과 클론 순도의 이점을 제공합니다.
과 통제 세포 성장 암의 가장 구별 특징은. 임상 설정에서 antimitotic 에이전트는 다양 한 유형의 종양8주 치료. 그러나, antimitotic 에이전트의 몇 가지 중요 한 제한이 무시할 수 없습니다. 첫째, 이러한 chemotherapies 또한 원치 않는 암 세포와 정상 세포를 죽 일 수 있다 그리고, 따라서, 심각한 부작용8발생할 수 있습니다. 두 번째, antitubulin 약물 tubulin의 유비 쿼터 스 식 cytoskeletal 단백질9,10다양 다른 조직에에서도 불구 하 고 종양의 모든 종류에 대해 유효 하지 않습니다. 그것은 명확 하지 않습니다 antitubulin 에이전트에 대 한 유망한 효능 보여 난소, 폐, 그리고 신장, 콜론, 또는 췌 장 암11에 임상 치료, 혈액 암. 마지막으로, 심지어 동일한 유형의 종양 환자에 응답할 수 있는 antimitotics 다르게 예측할 수 없는 방식으로. Antimitotic 에이전트, 임상 치료12에서 본 다양 한 결과 결과로 다른 환자의 민감도 영향을 미치는 주요 효과 기 분자를 있을 수 있습니다. 따라서, antimitotic 치료에 환자의 잠재적인 차동 감도 해야 될 고려 치료 개입13를 최적화 하기 위해.
높은 처리량 전체 게놈 siRNA 도서관 화면 DR3 최저 민감한 세포 antimitotic 약물, 화학요법 유도 된 apoptosis14역할 DR3 위한 연루에 저항을 렌더링 수 설명 했다. 종양 괴 사 인자 수용 체 (TNFR) superfamily의 일 원으로, DR3 다양 한 시스템15,16,,1718세포 apoptosis 중재에 보고 되었습니다. 따라서, 우리는 antimitotic 마약 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘 연구 DR3 overexpressing 안정 셀 라인 구축에 착수. 인간 결 장 암 세포 선 DR3 결핍 발견 했다 HT29 DR3 overexpression 공부에 대 한 적절 한 셀 모델을 제공할 수 있습니다. 또한, 클리닉, 결 장 암 않습니다 민감한 antimitotic 약19.
이 문서에서는, 우리는 retroviral 감염을 통해 HT29 DR3 안정적인 셀 라인의 생성을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 DR3 식 부 럽을 사용 하 여 이러한 셀에서의 유효성을 검사 하는 방법과 세포 생존 능력 분석 실험 및 형태학 적 관찰을 사용 하 여 antimitotic 에이전트에 감도 평가 하는 방법을 보여줍니다. 셀 단일 클론에서 증폭 하 고, 따라서, 균질 유전 배경의 이점이 있다. 또한, DR3에 플래그 태그 허용 셀룰러 DR3의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 및 유전자 표현과 단백질 상호 작용의 분석에 의해 생 화 확 적인 접근. 또한, 셀 추가 종양 진행 antimitotics vivo에서14에 대 한 응답을 분석 하는 쥐에 xenografted 수 있습니다.
여기에 제시 된 HT29 DR3 셀 시스템 antimitotics 암 세포14를 죽 일 방법의 분자 메커니즘을 공부를 위한 효과적인 도구를 제공 합니다. Overexpression 및 최저의 세포 유전자 기능 연구에 대 한 일반적인 도구 때문에,이 프로토콜 수 관심 또는 다른 셀 라인의 다른 유전자에 쉽게 적응 되며, 따라서, 광범위 하 게 사용 된 접근 방식을 바 뀌.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>C11965500BT</td><td>10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신</td></tr><tr><td>발광 세포 생존도 분석</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Selleck</td><td>S1150</td><td></td></tr><tr><td>pMXs-IRES-Blasicidin</td><td>Cell Biolabs</td><td>RTV-016</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>C14190500BT</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>1,5-Dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 형질주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2311</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 2차 항체</td><td>Jackson ImmumoResearch</td><td>115-035-166</td><td></td></tr><tr><td>안티 플래그 항체</td><td>Sigma</td><td>F-3165</td><td></td></tr><tr><td>HT29 세포주</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>plat-A 세포주</td><td>Cell Biolabs</td><td>RV-102</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Immobilon-P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>클로닝 실린더</td><td>Sigma</td><td>C1059</td><td></td></tr><tr><td>세포 이미징 다중 모드 리더</td><td>Biotek</td><td>BTCYT3MV</td><td></td></tr><tr><td>CKX53 도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>CKX53</td><td></td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td><td>Nest</td><td>712001</td><td></td></tr><tr><td>60mm 세포 배양 플레이트</td><td>Nest</td><td>705001</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>Nest</td><td></td><td></td>601052</tr><tr><td>0.22 & m 멸균 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf</td><td>5810000327</td><td></td></tr><tr><td>96 웰 화이트 폴리스티렌 마이크로플레이트&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3903</td><td></td></tr><tr><td>Western ECL Substrate</td><td>BIO-RAD</td><td>1705060</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000</td><td>GE 헬스케어</td><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>디컬러링 셰이커&nbsp;</td><td>HINOTECH</td><td>TS-2000A</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-bl-1</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>BIO-RAD</td><td>TC 20</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I 환원 혈청 매체</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985070</td><td></td></tr></tbody></table>

apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 dr3 overexpressing 셀 라인 구축

Establishing Cell Lines Overexpressing DR3 to Assess the Apoptotic Response to Anti-mitotic Therapeutics

관심사의 유전자의 기능을 공부 하는 것은 감소 하는 최저의 셀 라인의 식을 overexpression 셀 라인의 식을 증가 등 식의 그것의 수준을 조작 하 여 얻을 수 있습니다. 과도 하 고 안정적인 transfection 외 인 진 식에 자주 사용 되는 두 가지 방법이 있습니다. 과도 transfection는 안정 되어 있는 transfection 있습니다 호스트 세포 게놈으로 통합 외 인 유전자 그것은 지속적으로 표현 될 것입니다 어디에 단기 식에 유용 합니다. 그 결과, 안정 되어 있는 transfection는 보통 채택 연구에 대 한 장기 유전 규칙에. 여기 우리는 overexpressing 태그 죽음 수용 체 3 (DR3) DR3 함수를 탐구 하는 안정적인 셀 라인을 생성 하는 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리는 동질성과 안정적인 셀 라인의 순수성을 유지 하기 위해 retroviral 감염 후 단일 클론을 선택. 이 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 안정적인 셀 라인 따라서 재구성 HT29 셀에 apoptotic 응답 antimitotic 약물에 민감한 DR3 불충분 한 HT29 셀을 렌더링 합니다. 또한, DR3에 플래그 태그 좋은 DR3 항 체의 불가능에 대 한 보상 하 고는 antimitotic 에이전트 apoptosis를 유도 하는 분자 메커니즘의 생 화 확 적인 연구를 용이 하 게.

안정적으로 DR3 표현 하는 HT29 세포의 특성은 그림 1에 표시 됩니다. 클론 익스프레스 DR3, 다양 한 수준의 동안 부정적인 제어 역할 야생-타입 셀 exogenous 유전자 발현을 표시 하지 않습니다. 여기 우리 5 복제품, 표시는 1 복제 하 고 5 표현할 DR3의 최고 수준. 클론 1 및 5 다음과 같은 실험에 대 한 선택 했습니다.
Diazonamide의 관리 후 HT29와 HT29 DR3 세포의 형태는 그림 2에 10 배 확대에는 거꾸로 한 현미경으로 관찰 되었다. 10 nM diazonamide 48 h 치료, 후 HT29 DR3 깨진된 세포 막과 세포 파편 (하단 패널) 명백한 apoptosis를 보여주었다. 그러나, HT29만 라운드-최...

Overexpressing 유전자 기능 연구 관심사의 유전자 안정적인 셀 라인 구축 그들에 transfecting 통해 retroviral 감염 후 안정 되어 있는 transfection 따기 단일 클론에 의해 할 수 있습니다. 여기 우리가 HT29 DR3 셀 라인 이런 방식으로 생성 된 메커니즘 수용 체 3 (DR3) antimitotics-유도 된 apoptosis에 기여 하는 어떤 죽음에 의해 명료 하 게 보여줍니다.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

Studying the function of a gene of interest can be achieved by manipulating its level of expression, such as decreasing its expression with knockdown cell ...

세포에 있는 과발현 유전자는 유전자 기능을 공부하는 중요한 쪽입니다. 레트로바이러스를 가진 안정적인 트랜스페션은 내인성 유전자가 숙주 게놈에 통합되고 지속적으로 발현될 수 있게 한다. 우리는 레트로 바이러스 감염의 단일 식민지를 집어 들고 플래그 태그 DR3를 과발현 안정적인 세포주를 생성했다.세포주 좋은 DR3 항체의 가용성을 보상 하 고 시험관 내 및 생체 내 DR3 기능 연구 게시물에 대 한 우수한 도구를 제공. 우리는 레트로 바이러스 감염의 단일 식민지를 집어 들어 DR3 과발현 세포주를 생성했습니다. 단일 식민지에서 세포선은 균일성과 순도를 유지할 수 있었다.또한 프로토콜은 취급이 쉽고 간단합니다. 이 절차를 시작하려면 DMEM의 4 밀리리터와 함께 60밀리미터 요리에서 하룻밤 동안 plat-A 세포를 성장시다. 세포가 80~90%에 도달하면 트랜스페트 시약을 사용하여 제조업체 매뉴얼에 설명된 대로 생성된 플라스미드의 2마이크로그램으로 트랜스펙트합니다.72 시간 후, 상체를 수집합니다. 0.45 마이크로미터 멸균 필터를 사용하여 미디어를 필터링하고 바이러스 현탁액을 섭씨 4도에서 어둠 속에서 유지합니다. 다음으로, DMEM을 가진 60 밀리미터 접시에 있는 HT29 세포를 밤새 성장시키고, 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.세포가 30~50%의 합류에 도달하면 바이러스 현탁액의 밀리리터 당 8 마이크로그램의 폴리브레인이 있는 경우 바이러스 현탁액의 2밀리리터로 감염시킵니다. 감염된 세포를 섭씨 37도에서 4~6시간 동안 배양합니다. 그런 다음 바이러스 성 서스펜션을 흡인합니다.신선한 DMEM 의 4 밀리리터를 추가하고 인큐베이터에 요리를 반환합니다. 감염 후 24시간 동안, 접시에서 미디어를 제거하고 미리 따뜻하게 된 PBS의 2 밀리리터로 세포를 조심스럽게 씻으시다. 트립신 EDTA의 1 밀리리터를 추가하고 3 분 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.10 배율의 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 대부분의 세포가 분리되었는지 확인하십시오. 그 후, 트립시니화를 중지하기 위해 10%FBS를 포함하는 DMEM의 2밀리리터를 추가하고, 15 밀리리터 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다. 원심분리기는 실온에서 5분 동안 200배 g의 원심분리기를 제거하고 상체를 제거합니다.DMEM의 10 밀리리터에서 셀 펠릿을 다시 중단하고 부드럽게 위아래로 파이펫을 섞습니다. 다음으로, 세포를 30, 100 및 300의 요인에 의해 희석시 희석시. 종자 세포는 각각 밀리리터 당 하나의 마이크로 그램의 농도에 블라스티딘을 포함하는 DMEM의 20 밀리리터를 포함하는 150 밀리미터 요리입니다.섭씨 37도에서 약 1~2주 동안 이산화탄소 5%를 배양합니다. 이 기간 동안, 매일 식민지를 관찰하기 위해 10 배율에서 반전 된 현미경을 사용합니다. 식민지의 직경이 약 1 ~ 2 밀리미터 일 때 접시의 바닥에 잘 고립 된 식민지를 표시하십시오.잠복기가 완료되면 배지를 흡인하고 미리 따뜻해진 PBS의 3밀리리터로 세포를 씻으세요. 60mm 접시에 트립신 EDTA 2밀리리터를 넣습니다. 멸균 집게를 사용하여 자동 멸균 복제 실린더를 집어 요리에 넣습니다.그런 다음, 이제 각각 트립신 EDTA의 약 30 마이크로 리터를 포함하는 실린더를 선택하고, 부드럽게 표시된 식민지 위에 배치합니다. 접시를 인큐베이터에 3분간 반품합니다. 이 후, 현미경의 밑에 세포를 확인해서 그(것)들이 분리되었는지 확인하십시오.세포가 들어 올릴 때, 트립신을 비활성화하기 위해 각 실린더에 배양 배지의 70 마이크로 리터에서. 200 마이크로리터 파이펫을 사용하여 셀 서스펜션을 부드럽게 혼합하여 믹싱 하는 동안 실린더를 움직이지 않도록 하십시오. 24웰 플레이트 2개를 설정하고 접시 A와 플레이트 B.각 웰에 DMEM 1밀리리터를 추가합니다.플레이트 A의 각 웰에 30 마이크로리터의 셀 서스펜션을 추가하고, 플레이트 B.의 해당 우물에 70 마이크로리터를 추가하여 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 플레이트 B의 세포가 90%의 합류에 있을 때, 미디어를 제거하고 PBS의 1밀리리터로 세포를 조심스럽게 씻으시다. PBS를 완전히 제거하고 1X SDS-PAGE 로딩 버퍼50마이크로리터를 추가하여 셀을 lyse합니다.5분 후, 24웰 플레이트에서 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 셀 리세이트를 전달합니다. 샘플을 섭씨 100도에서 10분간 끓입니다. 10% SDS 젤에서 15분 동안 80볼트의 일정한 전압으로 샘플을 실행한 다음 1시간 동안 120볼트로 샘플을 실행합니다.그런 다음 2시간 동안 400밀리암페어의 일정한 전류로 젖은 이송에 의해 폴리 비닐리덴 불소 막으로 단백질을 전달한다. TBST에 용해되는 5% 무지방 우유에서 1차 항체를 5, 000의 인요인으로 희석한다. 막에 플래그 항체를 추가하고 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 배양합니다.200 RPM으로 설정된 탈색 셰이커를 사용하여 TBST로 멤브레인을 15분 간 세척하여 5분마다 TBST를 새로 고침합니다. 이어서, 5%의 무지방 우유에 10, 000의 계수에 의해 항마우스 이차 항체를 희석한다. 5 ~6 시간 동안 4 섭씨에서 희석 된 이차 항체로 멤브레인을 배양하십시오.앞서 설명한 대로 탈색 셰이커의 멤브레인을 다시 씻으십시오. 그 후, 서양 강화 된 화학 발광 및 젤 문서 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지화하고 FLAG 표현을 감지하십시오. 먼저, 트립시화에 의한 HT29 및 HT29-DR3 세포를 모두 수집하고, 자동 세포 카운터를 사용하여 세포 밀도를 측정한다.세포를 30, 000 세포의 밀도로 DMEM으로 12웰 플레이트의 우물로 시드하고, 이산화탄소 5%로 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 10 나노 몰러를 음의 대조군으로 1%DMSO를 사용하는 세포를 포함하는 각 우물에 추가하고, 5 %의 이산화탄소와 37 섭씨에서 인큐베이터로 플레이트를 전송합니다. 48 시간의 치료 후, 현미경으로 세포를 10 배율로 이미지화합니다.다음으로, HT29와 HT29-DR3 세포를 모두 DMEM을 가진 96웰 플레이트의 우물에 잘 3, 000 세포의 밀도로 종자하고 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 성장할 수 있게 한다. 다음 날, 텍스트 프로토콜에 설명 된 대로 복용량 에스컬레이션 diazonamide 농도 추가. 48시간의 치료 후 발광 계 세포 생존가능성 분석 키트를 사용하여 세포 생존가능성을 측정합니다.인큐베이터에서 96웰 플레이트를 제거하고 실온에서 약 30분 동안 방치하십시오. 그런 다음 각 우물에 50 마이크로리터의 분석 시약을 추가하고 실온에서 2 분 동안 접시를 흔들어 세포를 lyse합니다. 10 분 동안 실온에서 플레이트를 배양 한 다음 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 각 우물의 발광을 결정합니다.DR3를 안정적으로 발현하는 HT29 세포의 특성화는 클론이 다양한 수준의 DR3를 표현하는 반면 야생형 세포는 외인성 유전자 발현을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 유전자 1과 5는 DR3의 최고 수준을 표현하는 것을 볼 수 있고, 그래서 추가 실험을 위해 선택됩니다. HT29 및 HT29-DR3 세포의 형태는 다이아조나미드로 48시간 동안 치료된 후 관찰된다.HT29-DR3 세포는 깨진 세포 막 및 세포 파편을 가진 명백한 세포사멸을 표시합니다. 그러나 HT29 세포는 반올림 세포 모양을 나타내는 그대로 세포로 미토마이트 체포만 보여줍니다. 이러한 세포 유형의 세포 생존가능성은 다이아조나미드의 3나노몰로 48시간 동안 치료된 후 결정된다.HT29-DR3 세포는 80% 이상의 세포 사멸을 보이는 반면, 부모 HT29 세포는 미토마이트 체포의 형태로 만 약간의 반응만을 입증한다. 이것은 DR3의 과발현이 이 세포에 있는 diazonamide 유도한 세포간 통로를 재구성했다는 것을 표시합니다. 적절한 직렬 희석은 단일 클론의 최적 밀도를 얻는 데 중요합니다.모든 클론 실린더에 하나의 식민지만 포함되어 있는지 확인하고 인근 식민지를 오염하지 않는 것이 중요합니다. DR3 과발현 세포주 체외분자 메커니즘의 생화학 연구를 촉진. HT29-DR3 세포의 피하 주입을 통해 HT29-DR3 이노이식을 생성하고 생체 내에서 항미토미티제 유도 세포사멸의 메커니즘을 정교하게 하는 데 도움이 되었습니다.이 프로토콜은 다른 세포주에서 관심있는 유전자를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 유전자 녹아웃은 기능 적 연구를위한 또 다른 방법이며, 우리의 프로토콜은 유전자 녹다운 시스템에 적응 할 수 있습니다. 따라서, 일반적으로 유전자 기능을 해명할 수 있다.안전 처리를 위해 바이러스 릴레이를 쓰레기에 떨어뜨리는 것을 특정 용기에 놓는 것을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

우리는 overexpression 또는 shRNA 함유 인간 라모스 B - 세포주에서 어떻게 이러한 세포에 체세포 hypermutation를 측정하는 구성합니다.의 retroviral 또는 lentiviral 감염을 수행하는 방법을...

특정 유전자의 Overexpression 또는 최저 후 라모스의 B 세포에서 체세포 Hypermutation을 평가

E4orf4 유도 세포 죽음에 ACF 염색질 리모델링 요소의 기여가 측정되었다. 프로토콜은 doxycycline 치료는 ACF subunits Acf1과 SNF2h의 조건 최저를 유도하는 세포 클론의 선택이 포함되어 있으며, inducible 세포 라인에 E4orf4 유발 세포 죽음을 측정 할 수있는 DAPI 분석을 사용합니다.

E4orf4 - 유도 세포 사망에 최저 효과의 유전자 발현 및 측정의 조건부 최저위한 셀 라인의 작성

유사 분열을 겪고있는 암 세포에있는 phenanthridine PJ-34의 세포 독성 활동은 라이브 공 촛점 이미징 실시간으로 기록되었다. PJ-34 근절 인간의 유방암 MDA-MB-231 세포의 유사 분열에 여분의 중심체를 숨겨 세포. 정상 이중 초점 유사 분열과는 달리, 여분 중심체는 PJ-34의 존재에있는 두 개의 스핀들 극에 클러스터되지 않았습니다.

비정상적인 유사 분열과 관련된 세포의 죽음은 라이브 암 세포의 공 촛점 이미징에 의해 관찰

여기에서는 인접한 사멸 또는 죽어가는 세포와의 물리적 상호 작용에 의해 생존 가능한 세포에서 유도되는 세포 내 신호 전달 이벤트를 결정하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 죽은 세포의 식세포 흡수 또는 용해성 매개체의 방출과 대조적으로 죽은 세포의 수용체 매개 인식에 의해 유도되는 신호 전달 이벤트에 중점을 둡니다.

세포 내 이웃 셀을받은 사멸 세포 죽음과의 상호 작용에 의해 실행 가능한 세포에서 유도 된 이벤트를 시그널링의 식별

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

이 종이 저 해제 및 T 세포 수용 체 신호에 영향을 주는 그들의 목표의 확인에 대 한 화학 억제제의 스크린 라이브러리에 교류 cytometry 기반 분석 결과 사용 합니다. 여기서 설명 하는 방법 또한 높은 처리량 검사에 대 한 확장할 수 있습니다.

T 세포 수용 체 신호를 통해 화학 억제제 라이브러리의 심사의 중재자의 식별

여기에서, 우리는 2D 문화 보다는 생체 내 종양의 물리 화학 구배를 모방하는 3D 암 세포 스페로이드에 있는 생존과 죽음을 평가하기 위한 몇몇 간단한 방법을 제시합니다. 따라서 스페로이드 모델은 생체 내 조건으로의 번역을 개선하여 암 약물 효능의 평가를 허용합니다.

암세포의 3D 스페로이드 배양에서 세포 생존력과 사망 평가

프로토콜은 비 유전적 결함 전사 신장의 시험관 내 뮤린 암종 모델을 자세히 설명합니다. 여기서, CDK9의 만성 억제는 모든 암 유형의 약 20%에서 존재하는 임상적으로 과용된TE 를 모방하고 연구하기 위해 프로-염증 반응 유전자를 따라 RNA Pol II의 생산적인 신장을 억압하는 데 사용된다.

만성 CDK9 억제의 뮤린 세포주 기반 모델은 암에서 광범위한 비 유전 적 전사 신장 결점 (TE확실히)을연구합니다.

여기에 제시된 것은 면역 조직 화학을위한 포르말린 고정, 파라핀 내장 세포 펠릿 제어를 생성하기위한 프로토콜입니다.

포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿 면역조직화학 대조군을 위한 표준화된 공정

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

학습하세요 레트로바이러스 감염을 이용한 안정적 DR3 과발현 세포주 구축 방법을. 이 기술은 항유사분열제 유도 세포사멸 메커니즘 연구와 DR3 기능 분석에 필수적인 도구를 제공합니다.

Apoptotic 응답 안티 mitotic 치료 학을 평가 하기 위해 DR3 Overexpressing 셀 라인 구축

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