Name: Listeria monocytogenes 뇌의 감염 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 배우세요 Listeria monocytogenes가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 중추신경계를 감염시키는 메커니즘을 연구하는 방법을. 자동 관류 시스템을 활용한 이 기술은 뇌 조직 내 세균 정량화를 정확하게 수행할 수 있게 합니다.

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이 작품은 미국 공중 보건 서비스에 의해 지원 되었다 국립 보건원에서 AI103806를 부여.

모든 동물은 유지 하는 절차의 과정에서 불편을 최소화 하기 위해 최대한 신중 하 게 처리입니다. 기관 동물 관리 및 사용 위원회 및 모든 연방, 주 및 지방 법에 따라 실시 하는 절차. 또한 유의 하십시오 실험실 실험 Biosafety 수준 2 지침에 따라 실시 하는.
1. L. monocytogenes 마우스 감염 연구의 성장
<ol><li>
단단한 미디어 접시를 준비 하는 1 L 삼각 플라스 크에 두뇌 심 혼 주입 (BHI) 한 천 매체의 500 mL 압력솥. 56 ° C 물 욕조에 냉각 한 후 100 µ g/mL의 최종 농도에 스를 추가 미디어 하실 수 있습니다.
	<ol>
<li>페 트리 접시 접시에 미디어/페 트리 접시의 25 mL를 붓으십시오. 실 온 (22 oC-25 ° C)에서 건조 격판덮개를 허용 한다. 필요한 경우, 판 37 ° C까지 완전히 건조에서 건조 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
살 균 접종 루프 및 무 균 기술을 사용 하 여 얻을 전체 루프 냉동된 L. monocytogenes 의 변형 10403S11,BHI 미디어 플러스 30% 글리세롤에 냉동 주식 문화에서12 -80 ° C 냉장고에서 유지.
	<ol>
<li>행진 BHI 천/스에 L. monocytogenes 접시는 단일 세균성 식민지 고립 될 수 있다. L. monocytogenes 식민지 성장 하는 37 ° C 배양 기 하룻밤 (18 h 24 h)에 접시를 놓습니다.</li>
		<li>살 균 inoculating 루프를 사용 하 여 단일 선택 BHI agar에서 L. monocytogenes 식민지 접시와 100 µ g/mL 스 포함 된 BHI 국물의 5 mL를 포함 하는 살 균 테스트 튜브에 식민지를 예방.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
약간 정적 인큐베이터에서 하룻밤 30 ° 기울어져 L. monocytogenes 문화 관을 품 어.
	<ol>
<li>다음 날, 시각적으로 성장 (BHI 미디어 혼 탁 한 것) 및 문화의 균일 한 현 탁 액을 되도록 짧게 소용돌이 L. monocytogenes 문화를 검사 합니다.</li>
		<li>Aseptically의 세균성 문화 약 1 mL 수를 제거 하 고 600에서 광학 밀도 측정 nm (OD600)는 분 광 광도 계를 사용 하 여. 참고: 살 균 BHI 국물 L. monocytogenes 문화의 광학 밀도 측정 하기 전에 독서 분 광 광도 계에 대 한 빈으로 사용 됩니다. L. monocytogenes 문화 또한 묽 게 될 수 있습니다 (2에 5 배) 광학 밀도 읽기 전에 BHI에.</li>
		<li>문화의 10 직렬 희석을 도금 하 여 BHI 문화의 mL 당 L. monocytogenes 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 수를 결정 합니다. L. monocytogenes 문화의 광학 밀도 문화의 mL 당 박테리아 수 사이의 관계를 설정 하려면 유용 합니다. 일반적으로, L. monocytogenes 문화에 대 한 1.0의 OD600 약 1 x 109 mL 당 박테리아의 CFU 같습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. L. monocytogenes 감염의 쥐에 대 한 준비
<ol><li>24 시간 동물 감염, 전 18 BHI 국물 포함 하는 100 µ g/mL 스 L. monocytogenes 문화를 성장 하 고 OD600결정 / ~ 1 단계에서 표시 된 mL 당 CFU. 참고: 마우스 감염 사전 1 주 주문 일반적으로 하 고 감염 연구 수행 전에 동물 시설에 acclimated 됩니다. 이 연구에서는 6-8 주 오래 된 여성 BALB/c 마우스 (그룹 당 5 쥐) 하버드의과 대학 BSL2-레벨 동물 제약 시설에서 배리어 환경에서 지 내게 했다 고 음식과 물 광고 libitum제공.</li>
	<li>L. monocytogenes 문화에 따라 각 마우스를 감염 하는 데 필요한 양을 결정 합니다 ~ 세균성 문화의 mL 당 CFU. 멸 균 인산 염 버퍼 염 분 pH 7.2에에서는 L. monocytogenes 문화 (PBS)의 희석 박테리아의 적절 한 농도를 확인 합니다. 마우스는 일반적으로 정 맥 200 µ L 1-2 × 104 박테리아/동물의 CFU를 포함 하는 PBS의 감염.</li>
	<li>BHI 한 천 배지 100 µ g/mL 스 포함에 10 직렬 희석 도금으로 inoculum L. monocytogenes 수를 확인 합니다. L. monocytogenes 다음과 같이 마우스 당 주사의 수를 결정 하는 37 ° C 인큐베이터 하룻밤에 접시를 품 어. Inoculum (CFU) = (희석 요인 x 식민지의 수) / mL 도금 볼륨 (mL) 주입 x</li>
</ol>3. 통해 L. monocytogenes 꼬리 정 맥 주사와 쥐의 감염
<ol><li>
쥐를 포함 하는 새 장에서 뚜껑 및 음식 쓰레기통을 제거 하 고 5 분 동안 250 W 적외선 열 램프 아래에서 케이지를 놓습니다. 참고:이 방법은 수 팽창를 꼬리 정 맥 주사 쉽게 수행 하는 확인.<ol>
<li>신중 하 게 안전 하 게 꼬리 정 맥 주사 하는 동안 동물을 제 지 하는 장치를 억제 하는 적절 한 크기의 마우스에서 동물을 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>L. monocytogenes inoculum (단계 2.2)를 혼합 하 고 1 mL 주사기 26 G 바늘으로 장착에 inoculum을 로드.</li>
	<li>마우스의 측면 꼬리 정 맥을 찾아서 주사 사이트를 알코올 패드 또는 75% 에탄올 스프레이 사용 하 여 청소.</li>
	<li>
부드럽게 26 G 바늘과 주사기를 사용 하 여 측면 꼬리 정 맥에 L. monocytogenes 정지의 200 µ L로 마우스를 삽입할.
	<ol>
<li>면 거 즈를 사용 하 여 간단히 어떤 출혈을 멈추게 하는 사출 사이트에 압력을 적용 하 고 새 장에 동물을 배치. 참고: 모든 주입 하 고 적절 한 레이블 케이지 표시를 마우스에 대 한이 프로세스를 수행 합니다. L. monocytogenes inoculum의 포스트 주입 농도 확인 하려면 2.3 inoculum의 나머지 금액을 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 정 L. monocytogenes 감염 inoculum 마우스 당 평균 CFU 측정에서 사전 및 사후 주입 inoculum 샘플으로 보고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>감염 된 동물을 매일 모니터링 하 고 질병의 어떤 명백한 표시 (예, 모피, 돌출된 자세, 느린 운동, 체중 감량 쓸). 표시 하는 이전 연구에서 72 h 후 감염 (예를 들어, 24, 48 h 후 감염) 크게 죽어가는 고통 없이 희생 동물을 제거 합니다. 매일 모니터링 모든 나머지 동물은 감염 된 후 72 h에 희생 될 때까지 계속 합니다. 참고: L. monocytogenes 변형 10403S BALB/c 마우스에 대 한 50% 치 사 량 (LD50) ~ 1-2 × 104 CFU/동물 이다. 위에 표시 된 대로 L. monocytogenes 이 프로토콜을 사용 하 여의 LD50 복용량으로 감염 된 쥐 질병의 증상을 보이기 있습니다 그리고 조사 시작 72 h 후 감염 다음 감염에 굴복 하는 쥐를 기대할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 절 개 및 심장 관류의 마우스에 감염 된 L. monocytogenes
<ol><li>
감염 된 후 72 h (또는 이전 시간에서), CO2 질 식 자 궁 경관 탈 구 뒤 등 기관 동물 윤리 위원회에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 감염 된 쥐를 안락사. 참고: 혈액 컬렉션 수행 될 경우, 자 궁 경부 전위를 수행 하는 동안 혈관의 찢기 최소화 합니다.<ol>
<li>쥐 발 트 위치 응답의 부재에 의해 안락사 되는 확인 합니다. 참고: 심장 관류 수행 하는 것입니다, 4 mL 볼륨/min 흐름 속도로 자동된 펌프/관류 시스템을 설정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>해 부 팬에서 그것의 뒤에 동물을 놓고 복 모피/피부 표면에 75% 에탄올을 적용 합니다.</li>
	<li>가 위를 사용 하 여 복 부 벽에 절 개를 확인 하 고 바로 흉 곽 아래를 절 개를 확장.</li>
	<li>다이어 프 램 및 내장 장기를 노출 합니다. 참고: 있을 어떤 내장 장기를 괴롭히다 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>횡 경 막을 절단 하 여 흉 강을 열고 양측 노출은 심장의 좌 심 실에 흉 곽을 잘라.</li>
	<li>삽입 21 G 나비 바늘 왼쪽된 심 실에 관류 시스템에 연결 하 고 다음 신중 하 게 잘라 혈 (~0.2 mL) 오른쪽 아 트리 움 2 mL 튜브 10mm ethylenediaminetetraacetic를 포함 하 고 마음 잡고 부드럽게 무딘 집게를 사용 하 여, 산 (EDTA) 응고를 방지 하기 위해입니다. 마우스에 심장 관류의 회로도 그림 2에 표시 됩니다. 참고: 관류 수행을 하지 않으면 혈액 수 있습니다 심장 찔린 1 mL 주사기를 사용 하 여 수집 되며 신속 하 게 포함 하는 10 mM EDTA 응고를 방지 하기 위해 2 mL 튜브로 전송. L. monocytogenes-감염 된 장기는 다음 단계로 설명 (5.1) 수확.</li>
	<li>관류를 시작 하 고 10 mM EDTA를 포함 하는 PBS의 15-20 mL와 4 분에 대 한 동물을 perfuse. 참고: PBS-EDTA 솔루션 통해 오른쪽 아 트리 움 및 해 부 팬으로 흐르는 혈액을 관찰 하 여 재 관류를 평가 합니다. 두뇌와 간 완전 한 관류 수확된 장기 및 하지 순환 혈액에서 잔여 박테리아는 확인 후 blanched 나타납니다 합니다.</li>
</ol>5. 장기 수확 및 세균성 짐의 결심
<ol><li>다음 관류, 신중 하 게 모든 맥 관 구조와 인 대를 제거 하 여 수확 장기 (예: 간, 비장) 연결 된 고 장기 별도로 살 균 냉 (4 ° C) PBS의 5 mL를 포함 하는 살 균 15 mL 원뿔 튜브 합니다. 추가 처리가 발생할 때까지 얼음에 샘플을 저장 합니다.</li>
	<li>
두뇌를 수확, 목을 벨가 위를 사용 하 여 귀 뒤에 머리 하 고 잘라 두 피 피부 중간 중간 선 아래로 동물의 눈. 필요한 경우 트림 초과 조직 유지가 위의 두개골에 대 한 누르면.
	<ol>
<li>부드럽게 구멍 매그넘 (척수를 통해 전달 하는 두개골의 기지에서 구멍)에 위의 한 끝을 삽입 하 고 양쪽에 두개골 옆으로 잘라.</li>
		<li>부드럽게 잘라 두개골 사이 측면 압력을 적용 해야 되 고, 중간 선 아래 설치류의 눈. 두뇌의 섭 동을 방지 하 고 뇌 조직과 위 사이 최소 접촉을 유지.</li>
		<li>좋은 팁 집게를 사용 하 여 두개골 두뇌를 노출 하 고 뇌의 뇌 제거를 두개골의 기지 사이 주걱 장소을 엽니다. 참고:이 두뇌 신경 섬유의 찢 어에 발생 합니다.</li>
		<li>조심 스럽게 메 마른 차가운 PBS의 5 mL를 포함 하는 15 mL 원뿔 튜브에 두뇌를 전송 합니다.</li>
		<li>마우스 시체를 버리고 고 나머지 동물에 대 한 이러한 단계를 반복 합니다. 참고: 모든 장기 수확 되어, 일단 프로시저 영역을 청소 하 고 세균성 부담을 결정 하는 기관 균질에 대 한 준비.</li>
	</ol>
</li>
	<li>깨끗 하 고 조직 균질 화기 팁 삽입 10 s에 순차적으로 5% 표 백제, 살 균 물, 75% 에탄올, 살 균 물 각 별도 15 mL 원뿔 튜브에 포함 된에 균질 화기를 실행 하 여 캐비닛에 biosafety 배치의 끝을 소독.</li>
	<li>
감염 된 뇌를 균질 (~ 20 설정에 s 6, 최대 rpm) 15 mL 원뿔 튜브 아니 보이는 조직 파편 남아 때까지.
	<ol>
<li>깨끗 한 세균을 방지 하기 위해 균질 화기 단계 5.3에에서 설명 된 대로 다음 기관 샘플 오염 월.</li>
		<li>다른 기관 (예를 들어, 간, 비장)에 대 한 균질 화 과정을 수행 합니다.</li>
		<li>균질 프로세스가 완료 되 면 청소는 균질 화기 추가 사용까지 단계 5.3 및 저장소에 설명 된 대로.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
살 균 PBS에 기관 homogenates의 10 연속 희석을 준비 하 고 결정 기관 당 CFU BHI 천/스 판에 희석 접시. 참고: 유사한 방법은 혈액의 mL 당 CFU를 결정 하기 위해 수행 됩니다.<ol>
<li>모든 희석은 도금 후 하룻밤 37 ° C 배양 기 격판덮개 전송.</li>
		<li>다음 날, 기관 당 박테리아의 총 수 또는 혈액의 mL 다음과 같이 결정 각 접시에 식민지의 수를 계산: CFU/기관 (x 희석 요소 식민지의 수) = homogenate의 mL 도금 x 5 / CFU/mL의 혈액 (x 희석 요소 식민지의 수) = / mL 혈액의 도금</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심사를 선언합니다.

L. monocytogenes 는 인간의 생명이 meningoencephalitis를 일으킬 수 있다. 이전 연구는 혈액 뇌 장벽 (BBB)을 통과 하 고 두뇌를 식민지 화 박테리아의 능력을 증명 하고있다. 감염 시 뇌의 3 개 노선 제안: BBB 박테리아에 의해, 안으로 단 세포3및 axonal 마이그레이션 L. monocytogenes 긴장 시키는 포함 하는 박테리아에 의해 스텔스 수송의 침투를 직접 rhombencephalitis15. 두뇌는 매우 나가도록, L. monocytogenes 조직의 감염 시 혈액에서 순환으로 알려져 정도 L. monocytogenes 의 결정 이므로 중앙 신 경계를 식민지로 혈관에 침투 수 및 두뇌는 중요 합니다.
설명된 프로토콜에서 정 맥 꼬리 정 맥 주입 체계를 설정 하는 데는 L. m...

그람 양성 박테리아 Listeria monocytogenes facultative 세포내 병원 체 이며 대부분 치명적인 식품을 매개로 병원 체 전세계 중 하나. L. monocytogenes 오염 된 식품의 섭취 listeriosis 인간, 주로 임산부, 신생아, 노인, 그리고 immunocompromised 개인1타겟팅 심각한 침략 적인 질병 발생할 수 있습니다. L. monocytogenes 는 미국에서 식품을 매개로 병원 체에 의해 죽음의 주요 원인 중 하나입니다 그리고 케이스 사망자 listeriosis에서 요금은 높은 20-30%, 모든 식품을 매개로 병원 체2에 대 한 최고. 아니 백신 L. monocytogenes 현재 존재 하 고 박테리아의 능력을 효과적으로 혈액-뇌 장벽 (BBB)를 횡단 하 여 말 초 장기 및 뇌 확산 생명이 수 막 염 및 뇌3 의 식민으로 이어질 수 있습니다. , 4 , 5 , 6. 세균성 수 막 염은 일반적으로 심한; 치료를 받은 대부분의 사람들을 복구 하는 동안 감염 아이 들에 있는 심각한 합병증, 예를 들면, 뇌 손상, 청력 상실, 또는 학습 장애를 일으킬 수 있습니다. L. monocytogenes 모든 커뮤니티의 적어도 10%를 차지 하는 미국7에 수 막 염 인수 전망 이다.
두뇌와 meninges 세균성 보급을 위한 주요 경로 혈 류를 통해 이다. 뇌의 혈관에 순환 하는 박테리아 뇌 감염을 BBB를 교차 수 있습니다. BBB는 혈액에서 회람 하는 외국 입자에서 뇌를 보호 하는 매우 vascularized 배리어 시스템. 내 피 세포는 혈관8,9의 내부 표면 라인 레이어를 구성 합니다. L. monocytogenes, 뿐만 아니라 Neisseria meningitidis, 구 균, 대장균및 Haemophilus 함께 b 형 (Hib) 등 여러 세균 병원 균은 정착 할 수 BBB3,4,,56을 횡단 하 여 두뇌. 그러나, 조사 하면 감염 된 쥐의 뇌에 부담을 세균, 박테리아는 BBB 넘어, 여부 그렇지 않으면 두뇌에 있는 세균성 짐을 아직도 뇌의 혈관에 있는 박테리아를 나타내는 수 있습니다 중요 하다. 따라서, 그것은 두뇌 homogenates의 콜로 니 형성 단위 (CFU)를 결정 하기 전에 모든 혈액의 쥐 perfuse 필요가 있다.
이 연구에서 우리 두뇌의 L. monocytogenes 감염 검사 vivo에서 방법을 설명 합니다. 여기 설명 하는 방법, L. monocytogenes 스트레인 10403S 사용 했습니다. L. monocytogenes 10403S 감염10의 마우스 모델에서 조직의 listeriosis 공부를 가장 널리 사용 되는 실험실 변종 중 하나입니다. 이 프로토콜은 L. monocytogenes 뒤 쥐의 관류의 표준 정 맥 주입을 기반으로 합니다. 마우스에서 감염 프로토콜의 개요 개요는 그림 1에 표시 됩니다. L. monocytogenes-감염 된 두뇌 및 다른 기관 끼얹는다 비 또는 끼얹는다 쥐에서 수집 하 고 세균성 기관 부담 결정. 이러한 메서드는 뿐만 아니라 감염 된 동물에서 뇌의 총 세균성 식민지를 결정 하는 데 유용 하지만 BBB에는 vivo에서 두뇌의 침공을 중재 박테리아가 침투 여부를 결정 하는 데 도움이 있습니다. 그것은이 실험실 프로토콜 관련 기관 biosafety 위원회 및 동물 시설 관리 협의 따라 실시 해야 하는 것을 강조 하는 것이 중요.

<table><tbody><tr><td>뇌 심장 주입 미디어</td><td>Becton Dickinson</td><td>237200</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트&nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0382-50G</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR</td><td>25384-342</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>VWR</td><td>97062-832</td><td></td></tr><tr><td>IKA T18 ULTRA-TURRAX 기본 균질화 기</td><td>IKA</td><td>3352109</td><td>모델: T18BS1</td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU 800 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c 마우스</td><td>Jackson Laboratory</td><td>모델 #000651</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 주사기</td><td>Becton Dickinson</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>26 G 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>21 G 나비 바늘</td><td>Becton Dickinson</td><td>367281</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>VWR</td><td>21008-918</td><td></td></tr><tr><td>라운드-바텀 테스트 튜브</td><td>VWR</td><td>60819-546</td><td></td></tr><tr><td>인산염 버퍼 식염수&nbsp;</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 주걱</td><td>VWR</td><td>82027-520</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 가위 (6.5 인치)</td><td>VWR</td><td>82027-592</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 가위 (4.5 인치)</td><td>VWR</td><td>82027-578</td><td></td></tr><tr><td>스테인리스 스틸 무딘 집게&nbsp; (4.5 에)</td><td>VWR</td><td>82027-440</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 파인 팁 펜치&nbsp; (6 에)</td><td>폭스바겐</td><td>82027-406</td><td></td></tr></tbody></table>

listeria monocytogenes 뇌의 감염

Listeria monocytogenes Infection of the Brain

Listeria monocytogenes 식품을 매개로 감염와 자주 연결 되는 세포내 세균성 병원 체 이다. L. monocytogenes 의 교차 하는 혈액-뇌 장벽 (BBB) 기능은 관련으로 생명이 수 막 염 및 뇌염 발생할 수 있습니다. BBB 다양 한 독성 대사 산물 및 미생물 병원 체 감염, 다음 혈액에서 발견에서 두뇌 microenvironment를 보호 하 고 따라서 뇌 항상성 지원. 기계 장치는 뇌 감염 완벽 하 게 이해 되지 않는다을 BBB를 교차 하는 L. monocytogenes 는 혈액에 존재 하 고 L. monocytogenes에의해 뇌 감염을 연구 하는 강력한 모델 시스템의 부족이 있다. 여기, 우리는 간단한 마우스 감염 모델 박테리아 BBB 교차 하는지 여부를 확인 하 고 뇌 비보를 식민지 화 하는 박테리아의 부담을 quantitate 제시. 이 방법에서는, 동물 L. monocytogenes 와 함께 정 맥 감염 되었다 하 고 CO2 뒤에 자 궁 경부 전위에 노출에 의해 euthanized 고통 없이 했다. 동물의 심장 관류 감염 된 장기를 수확 전에 수행 되었다. 혈액 관류 전에 수집 하 고 기관 당 박테리아의 수 또는 mL의 혈액 한 천 배지에서 혈액 또는 기관 homogenates의 희석을 도금에 의해 결정 되었다 형성 식민지의 수를 계산. 이 메서드는 L. monocytogenes 에 의해 뇌의 감염을 강화 하 고 여러 세균성 병원 체의 연구에 대 한 쉽게 적응 시킬 수 있다 비 발한 수용 체 ligand 상호 작용 연구를 사용할 수 있습니다.

두뇌는 매우 나가도록 하 고 L. monocytogenes 세포 유형 혈액3,13에 있는 감염으로 알려져 있다. 설명된 프로토콜 L. monocytogenes 의 능력을 감염 쥐에 있는 두뇌의로 이어지는 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통과 하는 데 사용 됩니다. 박테리아 vivo에서BBB 교차 하는 경우를 확인 하려면 마우스에서 혈액의 재 관류는 두뇌에 있는 세균성 짐을 결정 전에 수행 됩니다. 그렇지 않으면, 얻은 CFU는 뇌의 혈관에 존재 하는 박테리아를 포함할 수 있습니다. L. monocytogenes 감염 두뇌 (그림 3A)와 (그림 3B) 간 전이나 후 관류 72 h 감염 된 후에 표시 됩니...

감염, 동안 Listeria monocytogenes 는 두뇌를 식민지로 혈액 뇌 장벽을 교차 수 있습니다. 이 프로토콜, 쥐의 감염에 따라 장기의 세균성 식민지를 평가 하는 방법을 보여 줍니다. 뇌 실질에 세균 숫자의 특정 결정에 대 한 전체 기관 살포를 수행 하는 절차를 제공 합니다.

Listeria monocytogenes 뇌의 감염

Listeria monocytogenes is an intracellular bacterial pathogen that is frequently associated with food-borne infection. The ability of&#160;L. ...

이 방법은 혈액 매개 박테리아가 중추 신경계와 뇌를 감염시키기 위해 혈액 뇌 장벽을 통과 할 수 있는지 여부에 대한 세균 성 병인 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술로, 감염된 동물의 혈액과 뇌 조직 내의 세균성 숫자는 뇌의 혈관 내에 거주하는 박테리아의 수를 제외하면서 결정될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 연구 동료 인 Pallab Ghosh가 될 것입니다.감염 후 72시간 에서 자동화된 관류 시스템을 분당 EDTA 10밀리미터로 보충한 PBS의 4밀리리터의 유량으로 설정합니다. 그리고 안락사 된 동물을 해부 팬에 수핀 위치에 놓습니다. 발 핀치에 대한 응답의 부족으로 안락사를 확인합니다.그리고 75 %에탄올로 복부를 적시. 가위를 사용하여 흉곽 바로 아래에 복부 벽 절개를 하여 다이어프램과 내장 기관을 노출하십시오. 그리고 흉부 구멍을 열기 위해 다이어프램을 잘라.왼쪽 심실을 노출하고 부드럽게 마음을 잡기 위해 집게를 사용하여 양측으로 문질러 케이지를 잘라. 21 게이지 나비 바늘을 왼쪽 심실로 관류 시스템에 연결된 21 게이지 나비 바늘을 삽입하고 오른쪽 아트리움을 조심스럽게 잘라 약 200 마이크로리터의 혈액을 10 밀리미터 EDTA가 함유된 2밀리리터 튜브로 수집하여 응고를 방지합니다. 그런 다음 PBS 플러스 EDTA의 15 ~20 밀리리터와 4 분 동안 동물을 perfuse.완전한 관류 후에, 두뇌와 간은 남은 박테리아가 순환 혈액이 아니라 수확한 기관에서 이다는 것을 지키는 희게 나타납니다. 관류에 따라 관심 있는 장기를 개별 멸균, 튜브 당 섭씨 4도의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원내 튜브로 조심스럽게 옮기시다. 참수 후 뇌를 수확하려면 가위를 사용하여 두피 피부를 눈 사이의 중간선 아래로 자르고 필요에 따라 과도한 조직을 다듬기 위해 두개골에 대한 팁을 유지하십시오.가위의 한 쪽 끝을 포라멘 매그넘에 부드럽게 삽입하고 측면양쪽의 두개골에 옆으로 자른다. 조심스럽게 두개골의 중간선 아래로 눈 사이의 두개골을 잘라, 측면 압력을 적용하고 뇌의 혼란을 피하기 위해주의. 집게를 사용하여 두개골을 열어 뇌를 드러내고 뇌의 밑면과 두개골 의 밑면 사이에 주걱을 배치하여 4도 의 5 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 조심스럽게 뇌를 옮길 수 있습니다.생물 안전 캐비닛에서 팁을 삽입하고 10초 동안 조직 균질화제를 순차적으로 5% 표백제,

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

리스테리아 monocytogenes는 생쥐에서 세균을 세포에 면역 반응과 유전 자화율을 연구를위한 모델 생물이다. 이 방법은 박테리아 부하를 측정하고 리스테리아 감염으로 인한 면역 세포의 변화를 결정하는 외과 분석을위한 생쥐의 간 및 비장의 단일 셀 suspensions를 생성하는 하나 있습니다.

감염된 마우스에 세균 하중과 면역 응답 측정 리스테리아 monocytogenes</em

출처: McMullen, P. D., Freitag, N. E. 리 스테리아 모노사이토제네를 이용한 감염 생쥐의 심장 세포 배양 내 박테리아 침범 및 심장 정착 평가. J. Vis. 경험 (2015)이 영상은 쥐의 꼬리정맥에 리스테리아 모노사이토제네스 를 주입하여 전신 감염을 확립하는 과정을 시연합니다. 이 영상은 박테리아 순환, 장기 정착, 그리고 조직 균질 처리, 연속 희석, 플레이트 부착을 통한 심장 내 박테리아 부하 정량화를 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 꼬리정맥 주입 후 마우스 심장 내 박테리아 부하 정량화

이 비디오는 리스테리아 모노사이토제네스에 감염된 관류된 쥐 뇌의 감염성 박테리아 부하를 정량화하는 방법을 보여줍니다.

리스테리아 모노사이토제네스 감염에 따른 쥐 뇌의 박테리아 집락화 평가

이 논문은 사용하는 마우스의 경구 감염에 대한 새로운 방법을...

경구 전송<em&gt; 리스테리아</em&gt; 오염 된 음식의 섭취를 통해 마우스의

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

리스테리아 단세포 유전자는 취약한 인구에 있는 임산부및 뇌막염에 있는 태아 감염을 일으키는 원인이 됩니다.  박테리아의 하위 인구는 심장 조직을 식민지화 할 수 있습니다, 환자와 실험실 동물에 심근염을 일으키는.  여기에서 우리는 감염된 동물에 있는 체외 및 심장 식민지에 있는 L. monocytogenes 심장 세포 침략을 평가하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

리스테리아 단세포 유전자를 사용하여 감염된 마우스에 있는 문화와 심혼 식민지에 있는 심장 세포의 세균성 침략 평가

이 프로토콜은, 리스테리아의 EGD 균주 (L. 모노 사이토 겐)을 C57BL / 6J 마우스에 접종하고, 자연 살해 (NK) 세포, 자연 살해 T (NKT) 세포에 의한 인터페론 - γ (IFN-γ) 응답을 측정하는 방법을 설명 적응 T 포스트 감염 림프구. 이 프로토콜은 또한 병원균의 수정 된 LD (50) 투여로 감염 후 쥐에서 생존 연구를 수행하는 방법에 대해 설명합니다.

와 실험 감염<em&gt; 리스테리아</em&gt; 호스트 인터페론-γ 응답 유학을위한 모델로

선정 Plasmodium falciparum</em인간 두뇌 내피 세포 Cytoadhesion위한> 기생충

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

의 뇌 혈관의 점착성의 염증성 백혈구 분리하기위한...

에서 뇌 - 분리 된 백혈구의 분리 및 분석<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA에 감염된 마우스

배우세요 Listeria monocytogenes가 혈액-뇌 장벽을 통과하여 중추신경계를 감염시키는 메커니즘을 연구하는 방법을. 자동 관류 시스템을 활용한 이 기술은 뇌 조직 내 세균 정량화를 정확하게 수행할 수 있게 합니다.

Listeria monocytogenes 뇌의 감염

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