Name: 낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 학습하세요 저산소 환경에서 인간 대식세포 분극의 단백질체학적 특성 분석 방법을. 라벨 프리 정량법을 활용하여 활성화 상태를 단백질 수준에서 특성화하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

오전 국가 리그 죄수 르 암과 라 Fondation 아크 부 라 검색 쉬르 르 암 라 하 여 젊은 그룹 지도자 프로그램 (ATIP/미래 Inserm-CNRS)에 의해 자금이 다. 우리는 생물학 플랫폼 (UTECHS MSBIO, 파스퇴르 연구소, 파리)에 대 한 질량 분석에서 Mariette Matondo 감사합니다. 우리는 원고의 그녀의 독서에 대 한 로렌 앤더슨을 감사합니다.

건강 하 고, 취소 확인 된 기증자 로부터 인간의 혈액 샘플 (LRSC) 인증된 프로토콜 (CODECOH DC-2018-3114)의 일환으로 EFS (프랑스 국가 혈액 서비스)에서 얻은 했다. 기증자는 혈액의 사용에 대 한 서명된 동의 했다.
1. 미디어와 버퍼 준비
<ol><li>대 식 세포 매체 [RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 비 본질적인 아미노산 (NEAA)]를 준비 하 고 37 ° c.에 따뜻한</li>
	<li>대 식 세포 매체 + AB 플라즈마 (SAB)에서 10% 인간의 혈 청을 준비, 그것은 (0.22 μ m 필터) 필터 다음 37 ° C에 따뜻한 (macrophage 매체 + 10%로이 SAB).</li>
	<li>정렬 버퍼 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) + 0.5% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) + 2 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) x [1]를 준비 하 고, 그것은 (0.22 μ m 필터), 필터링 하 고 4 ° c.에 그것을 유지합니다</li>
</ol>2. 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs) Leukoreduction 시스템 챔버 (LRSC)에서 격리
<ol><li>밀도 그라데이션 세포 분리 솔루션의 15 mL를 넣어 ( 재료의 표참조) 50 mL에 원심 튜브는 LRSC를 수신 하기 전에 실내 온도 (RT)에 따뜻한 수 있습니다 그래서. 참고: 밀도 온도에 따라 다릅니다. 이 단계 실시간에 equilibrate 수 있도록 사전에 수행 해야 합니다이 제품을 4 ° C에서 저장으로</li>
	<li>50 mL 원심 분리 관으로는 LRSC를 빈 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 하 고 혼합. 아주 천천히, 혼합 밀도 그라데이션 솔루션 2.1 단계 워밍업의 15 mL 위에 2.2 단계 준비의 25 mL를 추가 합니다. 참고: 수 단계가 단계를 혼합 하지 않도록 주의 하십시오. 혈액이 단계의 어떤 소요도 없이 밀도 그라데이션 솔루션에 추가 되어야 합니다.</li>
	<li>휴식 없이 700 x g에 25 분 동안 원심 분리 튜브 두 원심 참고: 조밀도 기온 변화도 원심 분리의 끝에, 맨 아래쪽에서 레이어는: 적혈구와 granulocytes 펠 릿, 밀도 그라데이션 솔루션 위상, PBMCs, 그리고 플라즈마의 레이어를 형성.</li>
	<li>피펫으로와 함께 그것을 발음 하지 않고 플라즈마 단계를 통과 하 고 새로운 50 mL 원심 분리 관으로 PBMC 레이어를 수집 합니다. 세척 단계 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기로 서 PBMCs에 1 x PBS의 최대 50 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 대 식 세포 매체의 40 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
</ol>3. 자기 라벨의 및 절연 CD14+ 세포 (Monocytes)
<ol><li>Malassez 챔버에 PBMCs를 계산 합니다. PBMCs (일반적으로 100 ~ 300 x 106 셀) 실험 수행에 필요한 금액을 철회, 원심 관, 및 300 x g에서 10 분 원심 분리기에 넣어.</li>
	<li>발음은 상쾌한 고 펠 릿 10 당 1.3 단계 준비 정렬 버퍼의 80 µ L에서 resuspend7 PBMCs. 추가 20 µ L 10 당 CD14 microbeads의7 PBMCs 믹스 잘 하 고 지속적인 동요에서 4 ° C에서 15 분 동안 품 어.</li>
	<li>세척 단계 및 300 x g.에서 10 분 원심 분리기는 상쾌한 발음 하 고 펠 릿 당 108 PBMCs 버퍼를 정렬의 500 µ L에서 resuspend 107 PBMCs 당 버퍼를 정렬의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>자기 필드 구분 기호에서 열을 배치 합니다. 버퍼를 정렬의 3 mL와 함께 그것을 rinsing 하 여 열을 준비 합니다.</li>
	<li>열에 세포 현 탁 액을 적용 합니다. 열 격리 되어야 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 (여기, 최대 109 PBMCs LS 열 사용 됩니다). 포함 레이블된 셀 흐름을 통해 수집 합니다. 참고:이 단계에서 시작, 모든 튜브 (부정과 긍정적인 선택) cytometry에 의해 나중의 다른 단계 검사에 대 한 보관 됩니다.</li>
	<li>열 정렬 버퍼의 3 x 3 mL을 씻어. 레이블이 없는 세포 단계의 3.12 같은 튜브를 통해 전달 수집 합니다. 추가 정렬 버퍼에 의해 세척 단계를 수행, 열 건조 하지 않도록 주의 하십시오. 열 컬렉션 튜브를 놓고 구분 기호에서 그것을 제거 합니다.</li>
	<li>버퍼 열에 정렬의 5 mL 플라스틱 즉시 단단히 열에 플런저를 추진 하 여 자석으로 레이블이 지정 된 셀에 밖으로 플러시. CD14의 순도 높이기 위해+ 두 번째 열에 셀, eluted 분수 농축입니다.</li>
	<li>새로운 열 3.4 3.7 단계 반복 합니다.</li>
</ol>4입니다. 도금 Monocytes의
<ol><li>Malassez 챔버에 monocytes를 계산 합니다. CD14의 순도 확인+ cytometry에 의해 세포. Monocytes는 실험에 필요한 금액을 철회 하 고 원심 분리 관에 넣어.</li>
	<li>10 분에 300 x g. Aspirate는 상쾌한 centrifuge 고 대 식 세포 매체에 monocyte 펠 릿 resuspend. 셀 접시와 SAB + 25 ng/mL 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (M-CSF) 차별화를 유도 하는 것 1 h. 50 분 매체를 발음 하 고 대 식 세포 매체와 + 10%에 대 한 합의 하자.</li>
</ol>5입니다. 하루 6 대 식 세포의 양극 화
<ol><li>매체 발음 대 식 세포 매체 + 10% 대체 SAB 다양 한 자극으로. 예를 들어 10 ng/mL 인터페론 감마 (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide M1 양극 화를 (LPS) 또는 20 ng/mL 인터 루 킨 4 (IL4) + 20 ng/mL 인터 루 킨 (IL13) 13 m 2 양극 화에 대 한 추가 합니다. 참고: 자극 사이 24 및 48 h 다른 테스트를 진행 하기 전에 수행할 수 있습니다.</li>
	<li>파견 솔루션 또는 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 수확.</li>
</ol>6. 낮은 산소 조건 세포 배양
<ol><li>4 단계에서 starting, monocytes 그리고 대 식 세포 hypoxic 조건 분석을 수행 하는 산소 제어 환경에서 유지 관리 합니다. Hypoxia 작업 역을 사용 하 여 실험 기간 동안 원하는 산소 부분 압력 하에서 세포를 유지 하기 위하여. 참고: 낮은 산소 압력 하에서 작업 하는 경우 그것은 중요 한 모든 미디어와는 역 아래 세척 버퍼를 준비 하 고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기 위해 충분히 기다릴. 예를 들어 60 mm 페 트리 접시에에서 10 mL PBS의 대략 2 h O2 부분 압력 시작 대기 압력에서 (우리 광섬유 산소 센서를 사용 하 여 측정)에 대 한 25 mmHg에 도달 필요 합니다. 많은 hypoxic 역 또는 incubators, 산소 압력 대기압의 백분율로 설정 됩니다. 정확한 측량이 필요한 경우 직접 mmHg에 산소 압력을 설정 하는 권한을 부여 하는 역을 사용 하 여이 낫다.</li>
</ol>7. 세포와에서 젤 소화 (프로토콜 1)
참고: 에이 다음 섹션, 펩 티 드를 가져오고 LC-MS/MS 분석을 수행 하는 데 사용 하는 두 개의 프로토콜을 설명 합니다. 세포 세포의 용 해 및 젤에 분류 및 소화, 프로토콜 1 설명 하 고 솔루션에서 소화 및 분류는 전자 초점 메서드를 사용 하 여 솔루션에 셀 세포 프로토콜 2에 설명 합니다.
<ol><li>세포 세포의 용 해 Laemmli 버퍼 [234 mM Tris-HCL (pH 6.8), 7.5 %SDS, 37% 글리세롤, 33.3% (v/v) β-mercaptoethanol, bromophenol 파랑 0.2 %w / v]를 수행 합니다. 4-12% 두번째-트리 스 아크릴 아 미드 젤에 각 샘플에 대 한 300000 셀에 해당 하는 단백질을 로드 합니다.</li>
	<li>각 단백질 견본 그림3에서 exemplified 6 젤 대역으로 분할 될 수 있도록 전기 이동 이동의 기간을 제어 합니다.</li>
	<li>(30% 에탄올 + 7.5% 초 산 20 분), 고정 솔루션 젤 수정 다음 얼룩 솔루션 (R-250 Coomassie 파란 45 분)을 추가 합니다. (30% 에탄올 + 7.5% 아세트산 밴드 표시 될 때까지) destaining 솔루션 추가 단백질 밴드 깨끗 한 메스로 절 개 하기 전에.</li>
	<li>주사위 각 500 µ L 튜브에 소개 전에 밴드 excised. 깨끗 한 유리 표면 keratins (이온된 수에 5 %SDS 솔루션 표면 청소를 사용할 수 있습니다)와 오염을 피하기 위하여 보증 된다.</li>
	<li>워시 젤 조각 한 워시 25 m m 염화 중 탄산염에 이기 (50 %v / v) 뒤 37 ° C에서 20 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 3 번. 10 분 100% 이기의 200 µ L 젤 조각을 탈수.</li>
	<li>각 젤 조각 10 m 55 m m iodoacetamide 25 m m 염화 중 탄산염 (200 µ L)에 실시간에 어둠 속에서 35 분 뒤 56 ° C (200 µ L)에서 45 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에 DTT (dithiothreitol)를 품 어</li>
	<li>알을 막으려고 품 어 실시간 세척에서 10 분 동안 25 m m 염화 중 탄산염에서 10 mM DTT의 200 µ L와 각 젤 조각 25 m m 염화 중 탄산염의 200 µ L에서 젤 조각 다음 10 분 동안 100% 이기의 200 µ L로 탈수.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 트립 신/리스-C 믹스와 함께 37 ° C에서 하룻밤 단백질 소화.</li>
	<li>추가 하 여 15 분, 다음 15 분 동안 5% 포 름 산의 50 μ에 대 한 50% 이기의 50 μ 그리고 마지막으로, 50 μ 15 분 수영장에 대 한 100% 이기의 젤 조각에서 결과 펩 티 드를 추출 하 고 펩 티 드의 흡착을 제한 하는 낮은 흡수 관에 각 분수를 건조 하 고 샘플 손실입니다. 추가 분석까지-80 ° C에서 샘플을 저장 합니다.</li>
</ol>8. 단백질 추출 및 솔루션에 소화 (프로토콜 2)
<ol><li>다음 세포의 용 해 버퍼의 150 µ L로 세포 세포의 용 해 (2 x 106 셀)를 수행:<ol>
<li>7 M 요소, 2 M thiourea, 40mm 트리 스, 그리고 4% 챕 스, 프로 테아 제 억제제 (완전 한 미니, EDTA 무료 프로 테아 제 억제 물 칵테일)와 보충.</li>
	</ol>
</li>
	<li>thermoshaker와 RT에 30 분 동안 해결책 균질 20 분 RT 13,800 x g에서 centrifuge 고는 상쾌한을 유지.</li>
	<li>2D 정리 키트와 오염 물질을 제거:<ol>
<li>키트에는 precipitant 솔루션, 공동 비례적 솔루션, 워시 버퍼, 그리고 세척 첨가제 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>Precipitant 솔루션의 300 µ L을 추가 하 고 잘 혼합. 15 분 추가 300 µ L 공동 비례적 솔루션의 ice에 품 어. 12000 x g 5 분에서 (적어도) 튜브를 원심. 작은 펠 릿은 표시 되어야 합니다. 빠르게 물의 resuspension 또는 펠 릿의 분산을 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다. 펠 릿을 방해 하지 않고는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>다시 뚜껑 경첩 및 펠 렛 튜브의 바닥에 남아 있는 액체를가지고 밖으로 직면 튜브 원심 짧은 펄스는 충분 합니다. 아니 보이는 액체 튜브에 남아 있어야 합니다.</li>
		<li>펠 릿을 방해 하지 않고 공동 비례적 솔루션의 40 µ L를 추가 합니다. 튜브 5 분 5 분 동안 원심 분리기에 대 한 얼음에 앉아 다음 제거 하 고 세척을 삭제 하자. 드 이온의 25 µ L를 추가 합니다. 각 동 5-10에 대 한 관. 펠 릿 분산 해야 하지만 물에 분해 되지.</li>
		<li>(사전-20 ° C에서 1 시간 이상 냉장) 워시 버퍼의 1 mL 및 세척 첨가물의 5 µ L를 추가 합니다. 와 동 펠 릿 완전히 분산 될 때까지 20-30 s 마다 10 분 이상 30 분 소용돌이-20 ° C에서 튜브를 품 어 참고: 튜브 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최대 1 주일 최소한의 단백질 저하 또는 수정.</li>
		<li>원심 관 (이상) 12000 × g에서 5 분 신중 하 게 제거 하 고 삭제는 상쾌한. 흰색 공 표시 되어야 합니다. (해당 되는 경우 펠 릿이 너무 건조 하 고, resuspend 하는 것이 어려울 것 이다) airdry 더 이상 5 분 동안에 펠 릿을 허용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>8 M 요소와 0.1 M 염화 중 탄산염의 300 µ L에서 단백질 펠 릿을 resuspend. 1 분에 강하게 소용돌이 색도계 분석 결과 사용 하 여 단백질 농도 결정 합니다.</li>
</ol>9. 솔루션 소화 (프로토콜 2)
<ol><li>700 mM DTT 수성 해결책의 5.1 µ L을 추가 하 여 이황화 다리를 감소 (최종 농도 12.5 m m)에서 resuspended 단백질에 8.4 단계와 thermoshaker와 함께 30 분 동안 37 ° C에서 품 어. 700 m m iodoacetamide 용액의 20.3 µ L을 추가 하 여 시스테인 잔류물을 알 (최종 농도 40 m m)는 thermoshaker와 함께 어둠 속에서 30 분 25 ° C에서 배양 하 고.</li>
	<li>샘플을 0.1 M 염화 중 탄산염의 990 µ L를 추가 합니다. 트립 신/리스-C 믹스 (효소: 기판 비율 1: 100 w/w)의 해당 볼륨을 추가 합니다. Thermoshaker는 37 ° C 하룻밤에 품 어.</li>
</ol>10. 청소 카트리지 (프로토콜 2)
<ol><li>젖은 1 열-볼륨 (1 mL) 메탄올의 카트리지. 1 열-볼륨 (1 mL) 80% 이기/HPLC 급 물 카트리지를 청소 하 고 흐름을 통해 삭제. 4 열-볼륨 (4 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지 equilibrate 그리고 흐름을 통해 삭제.</li>
	<li>샘플 10% 개미 산 성 또는 pH 2-3 (pH 산도 표시기 확인)에 물 90 µ L 시 어 지 다. Acidified 샘플을 로드 하 고 흐름을 통해 수집 합니다. 자형 (not 유지 펩 티 드 포함) 다시 로드 합니다. 6 열-볼륨 (6 mL) 0.1% 포 름 산/HPLC-등급 물 카트리지를 씻어.</li>
	<li>0.1% 개미의 acid/50% 이기/HPLC 급 물 펩 티 드 1 열-볼륨 (1 mL)으로 카트리지의 elute. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송. 진공 농축 기 (150 x g, 160 mBar에서 진공)를 사용 하 여 샘플을 집중 한다.</li>
</ol>11. 전자 초점 (프로토콜 2) 분류
참고: 펩 티 드 3에서 10의 pH 범위 13 cm 스트립 오프 젤 fractionator를 사용 하 여 그들의 전자 포인트에 따라 구분 됩니다. (아래 요약) 공급 업체에서 제공 하는 다음 프로토콜을 사용 했습니다.
<ol><li>준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션은 (600 µ L의 글리세롤 솔루션, 60 OFFGEL 버퍼의 µ L, 초순의 4.34 mL) 및 솔루션 (해결책의 1.776 mL)-초순의 444 µ L B.</li>
	<li>IPG 스트립, 프레임 및 제조업체의 지침에 따라 전극 조립.</li>
	<li>B 각 잘으로 솔루션의 솔루션 B. 추가 40 µ L의 1.8 mL과 샘플 resuspend 각 잘으로 150 µ L의 샘플을 로드 합니다.</li>
	<li>펩 티 드의 기본 방법 선택: OG12PE00 (3100 OFFGEL 낮은 해상도 키트, pH 3-10, 12-잘 프레임 사용에 대 한 펩 티 드 OFFGEL 기본 방법. 이 방법은 완성 된 (~ 20 h) 되었습니다 때까지 기다립니다. 제대로 분류 관에 분수를 수집 합니다.</li>
</ol>12. 청소 하버드 장치 열 역 C18 게시물-IEF (프로토콜 2)
<ol><li>1%의 한 번에 몇 μ를 점진적으로 추가 TFA 각 분수 드 이온된 수에 샘플을 시 어 지 다 하. PH는 약 3 또는 아래 pH 종이 사용 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>준비 하는 다음과 같은 솔루션: 솔루션 1 (이기의 5 mL, 10 µ L의 포 름 산, 초순 4.99 mL) 및 솔루션 2 (이기의 0.5 mL, 포 름 산, 초순 9.49 mL의 10 µ L).</li>
	<li>-스핀 열 솔루션 1의 150 µ L 젖은. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ와 스핀 열 세척. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.</li>
	<li>열을 통해 분수를 전달 합니다. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s. 솔루션 2의 150 μ 씻어. 원심 분리기 90 g와 흐름을 통해 삭제 x 750에서 s.</li>
	<li>솔루션 1의 50 μ와 분수 elute 90에 대 한 원심 분리기 s 750 x g.에서 한 번 더 이러한 단계를 반복.</li>
	<li>드라이-분수 (150 x g, 진공 160 mBar) 진공 집중 장치를 사용 하 여-80 ° C에서 저장</li>
</ol>13. Proteomic 데이터와 생물 정보학18 의 분석
<ol><li>나노-LC MS에 의해 얻은 데이터를 분석/MS 질량 분석기 MaxQuant (버전 1.5.2.8) 등 정량화 소프트웨어 안드로메다 검색 엔진을 사용 하 여.</li>
	<li>틀린 발견 비율 (FDR) 1% 단백질 및 펩 티 드와 아미노산 7의 최소 길이를 설정 합니다. C 터미널으로 효소 특이성을 설정 Arg를 리스. 프롤린 채권에 2 놓친된 분열을 허용 합니다. 변수 수정으로 고정된 수정 및 N 맨끝 단백질 acetylation 및 메티오닌 산화 시스테인의 carbamidomethylation를 선택 합니다.</li>
	<li>추가 통계 분석 소프트웨어와 데이터를 분석 합니다. FunRich 소프트웨어 (www.funrich.org/)를 사용 하 여 기능 농축 분석을 수행 합니다. 데이비드 소프트웨어 (https://david.ncifcrf.gov/)를 사용 하 여 유전자 온톨로지 농축 분석을 수행 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Okabe, Y., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+biology+perspective+on+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue biology perspective on macrophages.</a> Nature Immunology. 17 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+in+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: in vivo veritas.</a> The Journal of Clinical Investigation. 122 (3), 787-795 (2012).</li>
<li>Murray, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Polarization.</a> Annual Review of Physiology. 79, 541-566 (2017).</li>
<li>Chinetti-Gbaguidi, G., Staels, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+metabolic+disorders%3A+functions+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Lipidology%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in metabolic disorders: functions and regulation.</a> Current Opinion in Lipidology. 22 (5), 365-372 (2011).</li>
<li>Chow, A., Brown, B. D., Merad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+the+mononuclear+phagocyte+system+in+the+molecular+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Studying the mononuclear phagocyte system in the molecular age.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 788-798 (2011).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nature Reviews Immunology. 8 (12), 958-969 (2008).</li>
<li>Murray, P. J., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+and+pathogenic+functions+of+macrophage+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protective and pathogenic functions of macrophage subsets.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723-737 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny%2C+activation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li>
<li>Xue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-based+network+analysis+reveals+a+spectrum+model+of+human+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-based network analysis reveals a spectrum model of human macrophage activation.</a> Immunity. 40 (2), 274-288 (2014).</li>
<li>Csete, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+in+the+cultivation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Oxygen in the cultivation of stem cells.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1049, 1-8 (2005).</li>
<li>Johansson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional%2C+morphological%2C+and+phenotypical+differences+between+rat+alveolar+and+interstitial+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional, morphological, and phenotypical differences between rat alveolar and interstitial macrophages.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 16 (5), 582-588 (1997).</li>
<li>Pfau, J. C., Schneider, J. C., Archer, A. J., Sentissi, J., Leyva, F. J., Cramton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+oxygen+tension+affects+phenotype+in+cultured+bone+marrow-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environmental oxygen tension affects phenotype in cultured bone marrow-derived macrophages.</a> American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 286 (2), L354-L362 (2004).</li>
<li>Grodzki, A. C. G., Giulivi, C., Lein, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+tension+modulates+differentiation+and+primary+macrophage+functions+in+the+human+monocytic+THP-1+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Oxygen tension modulates differentiation and primary macrophage functions in the human monocytic THP-1 cell line.</a> PLoS One. 8 (1), e54926(2013).</li>
<li>Court, M., Petre, G., Atifi, M. E., Millet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Signature+Reveals+Modulation+of+Human+Macrophage+Polarization+and+Functions+Under+Differing+Environmental+Oxygen+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic Signature Reveals Modulation of Human Macrophage Polarization and Functions Under Differing Environmental Oxygen Conditions.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 16 (12), 2153-2168 (2017).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+proteome-wide+label-free+quantification+by+delayed+normalization+and+maximal+peptide+ratio+extraction%2C+termed+MaxLFQ%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction, termed MaxLFQ.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (9), 2513-2526 (2014).</li>
<li>Cox, J., Neuhauser, N., Michalski, A., Scheltema, R. A., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Andromeda%3A+a+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li>
<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
<li>Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+sample+preparation+method+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Universal sample preparation method for proteome analysis.</a> Nature Methods. 6 (5), 359-362 (2009).</li>
<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
<li>Richter, A., Sanford, K. K., Evans, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+oxygen+and+culture+media+on+plating+efficiency+of+some+mammalian+tissue+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Influence of oxygen and culture media on plating efficiency of some mammalian tissue cells.</a> Journal of the National Cancer Institute. 49 (6), 1705-1712 (1972).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

Proteomics 전체 셀 또는 subcellular 구획에서 다른 단백질의 표현을 공부 하는 강력한 도구 이므로 세포 세포의 용 해 프로토콜의 최적화 및 단백질의 소화 연구의 숫자에 의해 수정 되었습니다. 젤 소화 (polyacrylamide 젤 매트릭스에 단백질의 소화)17, 솔루션18 및 필터 지원 샘플 준비19에서 소화를 포함 하는 방법의 세 가지 주요 클래스 있다. 이 마지막 방법은 보편적으로 설명 하는 처음에 낮은 재현성 및 필터20에 단백질의 가능한 손실에 보고 되었습니다. 젤 소화 가능한 경우 소화의 효율성을 평가 하는 것은 쉽게, 어렵고 불리 될 수 있는 강력한 방법입니다. 솔루션에서 소화 소화와 IEF 후 샘플을 청소 하지만이 가능성을 제공 합니다. 비교 될 때 이러한 두 메서드는 동일한 샘플 사이, IEF 분별 프로토콜 솔루션에 소화 보다...

대 식 세포는 여러 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 조직의 항상성, apoptotic 세포의 제거를 포함 하 여, 세포 외 기질1의 리 모델링에 이르기까지 생리 기능에 타고 난 면역 세포. 이 세포는 강한 phenotypic가 소성2 분극 라고도 하는 많은 가능한 활성화 상태를 변환 하는 특징. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학3의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 소위 M1/M2 이분법, 있는 m 1 프로-염증 성 나타내고 M2 염증 세포를 사용 하 여 이러한 분극 분류 제안 되었습니다. 이 모델은 급성 감염, 알레르기, 비만4같은 다양 한 병 적인 상황에 잘 맞는. 그러나, 만성 염증된 조직 및 암, 그것은 증명 되었습니다이 분류는 대 식 세포 특정 세포 환경5,6, 에서 제공 하는 광범위 한 phenotypic 레 퍼 토리를 파악 수 없습니다. 7. 현재 일치는 대 식 세포 양극 화 더 나은 설명 다차원 모델을 사용 하 여 특정 microenvironmental 신호8을 통합 하는. 이 결론은 M1/M2 모델은 획득된 분극9에 비효율적 보여주는 인간 대 식 세포의 transcriptomic 분석을 통해 확인 됐다.
연구를 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명 프로토콜을 제공 하는 것을 목표로 제시. 우리는 다양 한 산소 레벨의 환경에 인간의 세포를 분화 하 고 레이블 없는 정량화를 수행 하기 위해 전체 대 식 세포 프로테옴에서 펩 티 드를 얻을 하는 방법을 설명 합니다. 이 정량화 다양 한 단백질의 표현 레벨의 비교를 허용 한다. 줄기 세포에 대 한 연구 환경 키 매개 변수10으로 산소의 중요성을 계시 했다, 우리는이 조직 매개 변수 인 간에 있는 대 식 세포 분극 영향을 미칠 수 어떻게 이해를 추구 합니다. 산소의 부분 압력에서에서 발견 되었습니다 범위 3 (총 대기 압력)의 20% ~ 20% (정확한 값은 약 18.6% 물의 존재 하면서 세포 문화 인큐베이터에서 일반적으로 사용 되는 약 해당 인체 에 계정).
이전 작품과 형태학의 조회11 지점과 이러한 차이 아마 부분적으로는 그들은 노출된12다른 산소 수준 때문에 치경 다 기능에서 중간 세포를 보이고 있다. 또한, 골 수 유래 세포 박테리아12낮은 산소 환경 노출 되 면 phagocytize를 증가 능력을 보여줍니다. 인간의 세포 THP1 차별화 된13, 반대의 효과가 발견 되었습니다 있지만 이러한 결과 산소 대 식 세포 생물학의 레 귤 레이 터는 고 인간의 세포에 분자 수준에서이 역할을 명확히 하는 데 필요한 아이디어를 지 원하는. 이전 연구에서 우리는 이러한 문제를 해결 하는 proteomics 접근 방식을 적용 했습니다. 단백질의 수천에 대 한 식 레벨을 동시에 측정 하 여 우리는 분극에 산소의 영향을 강조 하 고 새로운 분자 마커의 목록을 제공. 우리는 또한 일부 세포 기능에 이러한 연구 결과 관련 된 수 있습니다. 특히, 우리는 apoptotic 세포의 식 균 작용의 속도 증가 되었다 IL4/IL13-편광 세포에서 밝혀 proteomic 분석14ALOX15의 upregulation에 연결 했다 발견. 현재 연구에서 우리는 이러한 분석을 수행 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>저산소증 워크 스테이션</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 유세포 분석기</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>포름산(FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1,610,436</td><td></td></tr><tr><td>지질다당류, 대장균(LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>2D 클린업 키트</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체, 글루타맥스 보충제</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산(NEAA) 용액 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus column Reverse C18 micro spin column</td><td>Harvard Apparatus</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리 컬럼 LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>대식세포 집락자극인자 (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>인터루킨 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>인터루킨 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>인터페론 감마 (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (클론 T&Uuml; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Complete Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>밀도 구배 용액( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>인간 남성 AB 혈장(SAB)의 인간 혈청</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA) 용액 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma base</td><td>시그마 Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마 알드리치</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>시그마 알드리치</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>소듐 도데실 설페이트(SDS) 20%</td><td>시그마 알드리치</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 바이카보네이</td>트 <td>시그마 알드리치</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>아세토니트릴</td><td>시그마 알드리치</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>요오도아세트아미드</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Thiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA 분석 키트</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 멸균 플라스틱 피펫</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 역상 카트리지, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 proteomic 분석

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

대 식 세포는 타고 난 면역 세포 조직의 항상성 전염 성 병원 균에 대 한 응답에서 배열 하는 생리 기능 수에 관련 된. 이러한 셀의 다양 한 기능 활성화 상태로 또한 양극 화 라는 관련이 있습니다. 이러한 다양 한 분극의 정확한 분자 설명 대 식 세포 생물학의 분야에서 우선 순위입니다. 그것은 현재 다차원 접근은 분극 환경 신호에 의해 제어 되는 방법을 설명 하는 데 필요한 인정 했다. 이 보고서에서 우리는 인간의 세포에 다양 한 분극의 proteomic 서명을 얻기 위해 설계 된 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 대 식 세포 단백질 표정에-젤 분류 한 내용과 리스 C/트립 신-소화 세포 세포의 용 해에서 얻은의 레이블 없는 정량화를 기반으로 합니다. 우리는 또한 프로토콜 기반 솔루션에서 소화 하 고 전자 안으로 사용 하는 분류를 초점을 제공 합니다. 산소 농도 조직에 관련 된 환경 매개 변수, 때문에 우리는 어떻게 대기 구성 탐험이 프로토콜을 사용 또는 저 산소 환경에 영향을 미치는 macrophage 분극의 분류.

주변 혈액 단 세포 (PBMCs) 차등 원심 분리 하 여 얻은에서 시작, 프로토콜 허용 CD14의 인구를 얻는+ monocytes cytometry (그림 1)에 의해 98% 이상의 평가 순도 함께. 이러한 monocytes secondarily 다양 한 분극 (그림 2)으로 구분 됩니다. 젤에 분류 선택, SDS 페이지 젤에 마이그레이션 원하는 밴드의 번호에 맞게 이며 밴드 excised 됩니다 (그림 3). 소화는 젤의 삭제 밴드에서 secondarily 수행 후는 펩 티 드 추출 됩니다. 나노-LC (액체 크로마토그래피)를 사용 하는 펩 티 드 분석-MS/MS 질량 분 서 계. MS/MS 스펙트럼 알려진된 펩 티 드 (그림 4A)에 대...

우리는 인간의 세포의 proteomic 서명을 macrophage 분극에 낮은 산소 환경 영향의 결정에이 적용 하는 프로토콜을 제시.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

따라서 이 방법은 단백질 수준에서 다양한 환경에서 활성화 상태를 특성화하는 방법과 같은 대식세포 생물학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 라벨이 없는 정량화 방법을 사용하여 인간 대식세포에서 많은 단백질의 다른 발현을 얻을 수 있는 기회를 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 마리 말리어와 마갈리 법원이 될 것입니다.시작하려면 밀도 그라데이션 세포 분리 용액 15밀리리터를 각각 50밀리리터 원심분리 튜브에 추가하여 LRSC를 받기 전에 용액이 실온으로 따뜻해질 수 있도록 합니다. 밀도는 온도에 따라 달라지기 때문에 필수적입니다. LRSC를 50밀리리터 원심분리 튜브에 비웁힙시다.최대 50밀리리터까지 1배 의 PBS를 추가하고 섞습니다. 그런 다음, 매우 천천히, 평형 밀도 그라데이션 솔루션의 15 밀리리터 위에 믹스의 25 밀리리터를 추가합니다. 이 단계에서 위상을 혼합하지 않도록 주의하십시오.혈액은 이 단계의 방해 없이 밀도 그라데이션 용액에 추가되어야 합니다. 원심분리기는 700G에서 25분 동안 휴식을 취합니다. 밀도 그라데이션 원심분리의 끝에서, 바닥부터 상부까지의 층은 적혈구와 과립구이며, 펠릿, 밀도 그라데이션 솔루션 단계, PBMC 층 및 희석 된 플라즈마를 형성합니다.파이펫으로 플라즈마 상을 흡입하지 않고 통과합니다. 그런 다음 PBMC 층을 새로운 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 수집합니다. 300G.에서 10분 동안 세척 설정 및 원심분리기로 PBMC에 최대 50밀리리터를 추가하고 대식세포 배지 40밀리리터로 펠릿을 다시 정지시합니다.말라세즈 챔버에 PBMC를 소파 후, 원심 분리 튜브에 실험을 수행하는 데 필요한 PBMC의 양을 전송. 300G.에서 10분 동안 세포를 원심분리하고 1,000만 PBMC당 선별 버퍼의 80마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 1,000만 PBMC당 CD14 마이크로비드 20마이크로리터를 추가합니다.잘 섞고 일정한 동요 하에서 섭씨 4도에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라 1,000만 PBMC당 1밀리리터의 정렬 버퍼를 세척 단계로 추가하고 원심분리기를 이전과 같이 추가합니다. 그런 다음, 1억 PBMC당 500마이크로리터의 선별 버퍼에서 상체를 흡인하고 다시 중단한다.이제 분리기의 자기장에 열을 배치합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 헹구어 서 컬럼을 준비합니다. 셀 서스펜션을 열에 적용합니다.그런 다음 필요한 경우 후속 염색을 위해 레이블이 없는 셀을 포함하는 흐름을 수집합니다. 정렬 버퍼의 세 밀리리터로 컬럼을 세 번 세척합니다. 열을 말리지 않도록 주의하십시오.그런 다음 컬럼 아래에 수집 튜브를 놓고 분리기에서 제거합니다. 세척 후, 파이펫 5 밀리리터의 정렬 버퍼는 열로. 플런저를 컬럼으로 단단히 밀어 자석으로 표시된 세포를 즉시 플러시합니다.마지막으로 단핵구를 도금하고 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 대식세포 편광을 수행하기 전에 새 열로 이러한 단계를 반복합니다. 저산소 상태 분석을 수행하기 위해 산소 조절 환경에서 단핵구및 대식세포를 유지한다. 실험 중에 원하는 산소 부분 압력하에서 세포를 유지하기 위해 저산소작업스테이션을 사용한다.저산소압하에서 작업할 때는 역 아래의 모든 미디어 및 세척 버퍼를 준비하고 액체에서 올바른 부분 압력을 얻기에 충분히 기다리는 것이 중요합니다. 적응된 후드 아래 버퍼에서 셀 리시스를 수행합니다. 4-12%비스 트리스 아크릴아미드 젤에 각 샘플에 대해 300, 000 세포의 단백질을 적재한다.전기 전광 이동의 지속 시간을 제어하여 각 단백질 샘플이 여기에 표시된 대로 6개의 젤 밴드로 분할되도록 합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 고정 및 염색 한 후 깨끗한 메스로 단백질 밴드를 소비합니다. 500 마이크로 리터 튜브에 배치하기 전에 각 소비밴드를 주사위.이제 젤 슬라이스를 25밀리머암모늄 중탄산염 200마이크로리터에서 섭씨 37도에서 20분간 세 번 세척하여 각 단계 사이에 중탄산암보네이트를 폐기합니다. 25 밀리몰라 암모늄 중탄산염과 아세토닐릴에 한 번 씻고 이 것을 따르십시오. 그런 다음 10분 동안 100% 아세토나이트200 마이크로리터로 젤 조각을 탈수합니다.각 젤 조각을 10 밀리몰러 DTT와 25 밀리머 암모늄 중탄산염을 섭씨 56도에서 45분간 배양합니다. 그런 다음 DTT를 버리고 실온에서 어둠 속에서 35 분 동안 25 밀리마일라 요오도 아세타미드로 젤 조각을 배양하십시오. 알킬루션을 중지하려면 사용된 용액을 폐기하고 각 젤 조각을 실온에서 10분 동안 25밀리알라 암모늄 중탄산염에 10밀리머 DTT200 마이크로리터로 배양합니다.25 밀리모어 암모늄 중탄산염의 200 마이크로 리터에 젤 조각을 씻어. 그런 다음 10 분 동안 100 % 아세토나이트의 200 마이크로 리터로 탈수하십시오. 제조업체의 지시에 따라 트립신/Lys-C 믹스로 하룻밤 사이에 단백질을 섭씨 37도에서 소화합니다.저흡수 튜브에서 15분 동안 50마이크로리터50마이크로리터를 첨가하여 젤 조각에서 펩티드를 추출합니다. 15분 동안 50마이크로리터5%의 마이크로리터를 15분 동안 첨가한 후 15분 동안 100% 아세토나이트50마이크로리터를 추가합니다. 펩티드와 시료 손실의 흡수를 제한하기 위해 저흡수 튜브에서 각 분획을 당기고 건조시하십시오.텍스트 프로토콜에 자세히 설명된 대로 추가 분석이 될 때까지 샘플을 섭씨 80도에 저장합니다. 여기에 표시된 대표적인 순도는 CD14 양성 단핵구의 자기 비드 선택에 따라 유동 세포측정에 의해 평가된다. 분화된 인간 대식세포의 위상 대비 화상 진찰은 문화의 9 일 후에 2개의 다른 편광을 위한 얻어진 변종의 이질성을 보여줍니다.은 염색 SDS 페이지 젤을 사용한 오프젤 소화의 예가 표시됩니다. 세포 용해 및 용액 소화 후단백질의 평가는 용해 시 분해가 없는 것을 나타내며 소화효율을 나타낸다. 여기에 도시된 펩타이드의 충돌 유도 해리 스펙트럼은 양수 2의 전하를 가진 MS 스펙트럼에서 597.29의 질량 대 전하 비율에서 발견되는 펩티드의 예입니다.이 스펙트럼으로부터, 해당 서열이 결정되었다. 분석 후 최종 결과는 차별화된 표현 단백질을 사용하여 모든 편광 상태의 계층적 군집을 나타내는 열맵이다. 분석은 3%의 산소 조건에서 모든 편광에서 과발현되는 단백질의 클러스터를 제시합니다.이 절차를 시도하는 동안 프로토콜을 조정하기 위해 새 샘플에서 수행할 분획종류를 먼저 결정해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 일을 사용하여 proteomic 접근은 대식세포 생물학 편광 연구 결과의 필드에 있는 마지막 년 도중 이용된 게놈 접근에 상호 보완입니다. 개발 후, 이 기술은 인간과 또한 그밖 포유동물에서 면역 세포의 활성화의 각종 상태를 탐구하는 면역학의 필드에 있는 연구원을 위한 쪽을 포장합니다.DTT와 함께 작업하는 것은 위험할 수 있으므로 이 절차를 수행하려면 적응된 후드 아래에서 작업해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

proteomic-analysis-human-macrophage-polarization-under-low-oxygen

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

골수 유래 대 식세포를 사용하여 대식 세포 분극 조사

단핵구 유래 대 식세포는 타고난 면역 시스템의 중요한 세포입니다. 여기, 우리는 사용하기 쉬운...

<em&gt; 체외</em인간 대식 세포의 분화와 양극화의 이질성을 연구&gt; 모델

대식세포는 숙주 병원성에 관여하는 핵심 세포입니다. 대식세포는 단백질체 분석으로 분석하고 검출할 수 있는 표현형 및 기능적 다양성을 나타냅니다. 이 문서에서는 M1 또는 M2 표현형으로 분화된 인간 대식세포의 1차 배양에 대해 2D 전기영동을 수행하는 방법을 설명합니다.

2D 전기 영동에 의한 대 식세포의 프로테옴 프로파일 링

대사 재프로그래밍은 M1 및 M2 대식세포 분극의 특성이자 전제 조건입니다. 이 원고는 마우스 골수 유래 대식세포에서 해당작용 및 미토콘드리아 기능의 기본 매개변수를 측정하기 위한 분석을 설명합니다. 이 도구는 특정 요인이 대식세포의 대사와 표현형에 어떤 영향을 미치는지 조사하는 데 적용할 수 있습니다.

실시간 세포 외 유출 분석을 사용하여 편광 M1과 M2 골수 유래 대 식세포의 대사 특성

이 프로토콜 수 있습니다 격리 하 고 특성화 연구원 조직 상주 다양 한 세포 특징 염증된 조직 변화 무질서의 다이어트 유발 모델에서 추출.

절연, 특성화 및 비만 관련 염증에 의해 영향을 받는 조직에서 세포의 정화

본 프로토콜은 MFP 라벨이 부착된 악성 균주 H37Rv에 감염된 대식세포와 말초 혈액 단혈세포의 분화에 기초하여 인간 M1 또는 M2 편광 대식세포에서 진코박테리움 결핵 감염을 연구하고, M1의 마커를 포함한 10색 마커를 사용하여 유동 세포암법으로 분석하는 방법을 제공한다.

M1 및 M2 인간 단세포 유래 세포의 편광 및 진균 결핵 감염에 대한 유동 세포측정을 분석

M2 와 같은 종양 관련 대식세포 (TAM)는 암에서 종양 진행 및 가난한 예후와 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 THP-1 단핵세포와 같은 세포를 14일 이내에 M2와 같은 대식세포로 재현가능하게 분화하고 편광하는 상세한 가이드의 역할을 합니다. 이 모델은 종양 미세 환경 내에서 TAM의 항염증 효과를 조사하는 기초가 된다.

인간 단세포와 같은 THP-1 백혈병 세포선을 사용하여 M2와 같은 표현형으로 대식세포 분화 및 편광

여기에서는 현재 프로토콜의 신뢰성과 재현성을 개선하고 추가 연구를 촉진하는 것을 목표로 in vitro 임플란트 표면의 면역 조절 가능성을 평가하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 분비 사이토카인 프로파일, mRNA 발현 및 세포 표면 마커는 혈액 단핵구 유래 대식세포를 사용하여 모니터링하여 티타늄에서 배양된 대식세포 분극을 조사했습니다.

임플란트 표면의 M1 및 M2 인간 단핵구 유래 대식세포의 분극 및 특성화 

단핵구와 대식세포는 건강과 질병에 중요한 매우 가소성 및 재프로그래밍 가능한 면역 세포입니다. 그들은 특정 분화 프로그램과 표현형을 채택하여 광범위한 자극을 감지하고 반응합니다. 당사는 대식세포 분극 및 재프로그래밍을 연구하기 위해 in-vitro 모델을 표준화하여 연구를 위한 유용한 도구를 제공합니다.

In-vitro assay를 위한 human monocyte-derived Macrophage의 재프로그래밍 모델

여기에서는 골수, 비장 및 경색된 심장에서 대식세포를 추출하고 이후에 살아있는 세포의 대사 플럭스를 평가하는 방법을 자세히 설명합니다.

비장 및 심장 대식세포와 골수 단핵구의 생체 외 대사 플럭스 분석

학습하세요 저산소 환경에서 인간 대식세포 분극의 단백질체학적 특성 분석 방법을. 라벨 프리 정량법을 활용하여 활성화 상태를 단백질 수준에서 특성화하고 면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

낮은 산소 환경에서 인간 대 식 세포 분극의 Proteomic 분석

더 많은 동영상 탐색