Name: 머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 배우세요 gibberellin 측정을 위한 FRET 바이오센서 nlsGPS1을 이용한 식물 세포 내 호르몬 분포 분석 방법을 Arabidopsis에서 실시간으로 관찰하고 정량화하는 기술입니다.

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이 작품 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램 (보조금 계약 n ° 759282) 유럽 연구 회의 (ERC)에서 자금을 받고 있다.

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저자는 공개 없다.

GA 무서 워 기반 바이오 센서 nlsGPS1 보고 및 다세포 식물에 조지아 호르몬 그라디언트를 측정 하는 양적 방법을 제공 합니다. 질량 분석 및 transcriptional 기자 또는 신호 단백질-저하-기반 방법12, 간접 측정 하 여 직접 검색을 통해 향상 된 spatiotemporal 해상도 역학 계량 수 무서 워 기반 바이오 센서 13. 다양 한 조직의 종류에 고해상도 세포 이미징 조지아로 의미 있는 통찰력 규정과 다세포 컨텍스트에서 축적의 기능에 대 한 생물학과 스파크 새로운 가설을 얻을 수 있습니다. 예를 들어 nlsGPS1 바이오 센서 catabolic, 특정가 생 합성 및 전송 돌연변이 뿐만 아니라 spatiotemporally 유발된 물결, 동안에 변화를 모니터링 수 구체적으로 어떻게가 그라디언트는 설립에 테스트를 매우 유익 루트 및 주소 루트 셀 조지아 그라디언트에 대 한 응답. 센서 테스트 씨앗 발 아, 세포 신장, 및 꽃의 GA 중재 컨트롤을 제어 하는 메커니즘의 보존을 다른 모델 및 작물 종에 사용 될 수 있습니다.
NlsGPS1 바이오 센서의 무서 워 기반 영상에서 중요 한 단계는, 1) 픽셀 양적 무서 워 분석 중 포화 하지 해야, "감지기 이득" 2) 이미징 매개 기증자 방출 (DxDm)에 대 한 상수 유지 되어야 한다 고 수락자 방출 (DxAm) 인수, 3) 제어 nlsGPS1 NR 라인 유물, 및 4를 배제 하기 위해 사용 해야 합니다) 샘플 드리프트와 초점 변경 문제를 최소화 하기 위해 준비 되어야 한다. 또한, 샘플 재배 되 고 있는 환경 조건에 이후가 빛 기간 및 빛의 강도14,,1516 같은 환경 조건에 민감한 제어 하는 것이 중요 17. 분석의이 종류의 주요 한계는 높은 신호 대 잡음 비율 영상 잡음 비율 영상에 있는 증가 때문에 필요한입니다. 따라서, nlsGPS1 이미징 조직 및 장기는 청록색과 노란색 형광 단백질을 사용 하 여 비율 형광 현미경 검사 법에 순종 하는 데 유용 되지 것입니다-예를 들어 깊은 조직 형광 단백질 제대로 감지 되었습니다. 다른 한편으로, 비율 정보는 종종 선호 intensiometric 판독을 통해 내부 통제 규칙 유물에 따른 바이오 센서 식, 안정성, 밝기, 또는 주어진된 셀, 조직에에서 여 형태소 분석을 하는 데 도움이 있기 때문에 또는 조건. 예를 들어 바이오 센서 이미징 초조해 하 고 이미지 분석은 또한 조직5,6,,1819,20,의 다양 한 ligands의 다양 한 연구에 이용 되었다. 이미징 실험 및 이미지 분석 여기 보고, 예를 들어 깊은 루트 조직-형식에 새로운 통찰력을 얻을 수 있는 빛 시트 현미경 같은 새로운 이미징 방법에 맞게 수정할 수 있습니다.
1 세대 nlsGPS1 바이오 센서는 또한 조지아 exogenous 조지아 치료 따르는 세포내 증가에 보고할 수 있는 조지아 그라디언트의 고해상도 지도 제공 하는 높은 선호도 센서입니다. NlsGPS1의 현재 한계 중 하나는 센서는 빠르게 되돌릴 수 및, 따라서, 정상이 레벨에 아니지만, 가능성, 관심의 솔루션에 최대 최근 조지아 농도 보고입니다. 센서에 대 한 정확한 이직 률 이기도 하지 알려진와이, 낮은 가역 결합 일어나 고 있을 수 있습니다 내 생 GA 달콤하게의 감지 하는 걸로 어떤 조직 종류에는 몇 시간 분 이내. 그것은 또한 그 nlsGPS1가4 에 대 한 높은 선호도가지고 주의 하는 것이 중요 (Kd = 24 nM) 다른가 형태에 비해 (GA3 Kd= 240 nM, 조지아1Kd = 110 nM) 다른 생리 활성 가스 이미징 하는 경우 7. 조지아 바이오 센서의 미래 세대는 높은 선호도 유지 하면서 가역을 증가 하거나 다양 한 전조, 생리, 또는 catabolite 가스에 대 한 서로 다른 특이성을 전시 설계 될 수 있다.

식물 호르몬은 식물의 성장과 개발에 근본적인 역할을 한다. 이 작은, 모바일 신호 분자는 생 합성, 놓을, 짧은 및 긴 distance 전송1,2,,34등 여러 수준에서 일반적으로 통제 된다. 호르몬 신호 경로 및 다운스트림 transcriptional 응답 이해 년 동안 날카롭게 했다. 그러나, 호르몬 분배를 감독 하는 규제 입력 호르몬 신호 통로의 다양 한 세포질 응답을 연결, 셀룰러 규모 호르몬 수준의 spatiotemporal 정량화를 요구 합니다. 무서 워 기반 바이오 센서 phytohormones를 감지할 수 있는 세포 규모 호르몬 수준을 정할 수 과학자 사전 수 있습니다. 특정 ligand 바인딩 또는 생물 학적 자극에 반응 하는 감각 도메인에 연결 된 무서 워 쌍 (기증자 및 수락자 형광 단백질) 무서 워 기반 바이오 센서에 의하여 이루어져 있다. 작은 분자 바이오 센서에 대 한 ligand 바인딩 방향 무서 워 쌍의 두 가지 형광 단백질 사이의 거리의 변화 귀착되는 감각 영역의 구조적 변화를 트리거합니다. 무서 워 바이오 센서의 비율 분석 기증자 흥분과 기증자5,6이상의 수락자의 형광 방출 비율을 측정 하 여 수행 됩니다. Ligand 바인딩은이 방출 비율7에 변화로 감지입니다.
우리는 최근 식물 호르몬 ga. 가스는 종자 발 아, 세포 신장, 그리고 식물에서 꽃 단계 발달 전환 홍보할 수 있는 호르몬의 클래스에 대 한 무서 워 기반 바이오 센서 개발. NlsGPS1 바이오 센서는 핵 언어와 다양 한 식물 조직에가 역학에 spatiotemporal 통찰력을 제공. 애기 셀에가 녹는 수용 체, 지 베 렐 린을 구분 하지 않는 난쟁이 (GID), 한다 복잡 한 유도 신호2의 부정적인 레 귤 레이 터로 동작 하는 델라 단백질의 저하. 애기 가 수용 체 (AtGID1C) 델라 단백질 (AtGAI)의 74-아미노 산 잘림에 연결 된 nlsGPS1의 조지아 감각 도메인 구성 고 무서 워 쌍의 구성 된 기증자 형광 단백질으로 리안의 이합체 화 변형 및 수락자 형광 단백질8로 아프로디테 (codon 다양 금성). NlsGPS1 바이오 센서는 생리 활성 GA4 에 대 한 높은 선호도 센서 (Kd = 24가4nM) 및 다양 한 조직-종류 지도 및 조지아 그라디언트 계량에 이용 될 수 있다. Vivo에서 애기 가 레벨의 오해를 피하기 위해, 우리는 또한 개발 nlsGPS1의 응답 하지 않습니다 변종 (nlsGPS1-NR) 부정적인 컨트롤로 사용 하. NlsGPS1-NR 단백질 돌연변이 바인딩 주머니에 조지아의 바인딩을 방해 하는 및 GID 수용 체 단백질7,9와 상호 작용을 방해 하는 델라 단백질에 돌연변이 운반 합니다. 방출 비율 패턴 또는 nlsGPS1 및 nlsGPS1 NR 라인에서 변경이 바인딩 이벤트에 직접 관련 된 유물을 간주 수 있습니다. 그것은 또한 조지아4 nlsGPS1 바인딩 하지 빠르게 가역 이며 따라서, 세포 nlsGPS1 방출 비율 대표는 최근 밀집이 주어진된 핵 보다는 실시간으로 해석 되어야 하는 것이 중요 정상 상태 수준입니다. 결과적으로, 떨어지는 레벨의 분석 nlsGPS1와 수는 없습니다.
여기 우리 애기는 고해상도에 confocal 영상 기반 접근을 사용 하 여 모델 식물의 셀에 nlsGPS1 바이오 센서를 이용 하 여 상세한 프로토콜을 제공 합니다. 프로토콜 이미징 식물 뿌리와 안정 된 상태에서 및 시간-과정을 통해 hypocotyls에 정보를 제공합니다. 지도 및 조지아 배포판 계량 식물 종에서 뿐만 아니라 다양 한 조직 유형, nlsGPS1 센서를 활용할 수 잠재적으로.

<table><tbody><tr><td>nlsGPS1 Col0 애기장대 씨앗</td><td>NASC</td><td>N2107734</td><td></td></tr><tr><td>nlsGPS-NR Col0 애기장대 씨앗</td><td>NASC</td><td>N2107735</td><td></td></tr><tr><td>지베렐린 A4 (GA4)</td><td>Sigma</td><td>G7276</td><td>EtH 70%에 용해하고 -20°C로 유지합니다. C</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 용액(표백제)</td><td>Fisher S/5040</td><td>HSRA 064</td><td></td></tr><tr><td>수소 클로라이드 HCl</td><td>시그마</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>미세공 테이프</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>ibidi 스티커 슬라이드</td><td>Ibidi</td><td>81128</td><td>루트 이미징용 Luer 0.1</td></tr><tr><td>Ibidi 스티커 슬라이드</td><td>Ibidi</td><td>80168</td><td>Luer 0.2 하이포코틸 이미징</td></tr><tr><td>끈적끈적한 슬라이드용 유리 커버슬립</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>엘보우 루어 커넥터</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>Ibidi</td><td>108401</td><td></td></tr><tr><td>루어 잠금 커넥터</td><td>Ibidi</td><td>10826</td><td></td></tr><tr><td>프로그래밍 가능한 주사기 펌프</td><td>World Precision Instruments</td><td>AL-1000</td><td></td></tr><tr><td>진공 그리스</td><td>Sigma</td><td>18405</td><td></td></tr><tr><td>Murashige and Skoog 기초염</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>한천, 1kg</td><td>Melford</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드 접지 가장자리, 76mm x 26mm, 1.0mm - 1.2mm 두께</td><td>Fisher Scientific</td><td>12383118</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립 No.1 1/2 유리 22mm x 22mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12363138</td><td></td></tr><tr><td>루어 슬립 주사기 20mL</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>10785126</tr><tr><td>3M Micropor 수술용 종이 테이프</td><td>Fisher Scientific</td><td>12787597</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨, 500g</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221473-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>절대 에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>10428671</td><td></td></tr><tr><td>집게 시계 제작자 5 StSteel</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>INS4340</td><td></td></tr><tr><td>가위, 125mm, 스테인리스 스틸</td><td>Fisher Scientific</td><td>12338099</td><td></td></tr><tr><td>피팅 감속기 0.5-1.6</td><td>Ibidi</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8</td><td></td><td></td><td>컨포칼 레이저 현미경 1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 780</td><td></td><td></td><td>컨포칼 레이저 현미경 2</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td>3D 시각화 및 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>피지</td><td></td><td></td><td>이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>OriginPro</td><td>Origin Lab</td><td></td><td>통계 분석 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 nlsgps1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

Visualizing Cellular Gibberellin Levels Using the nlsGPS1 F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) Biosensor

Phytohormone 지 베 렐 린 (GA)은 식물에서 씨 발 아, 세포 신장, 및 발달 전환에 중요 한 역할을 재생 하는 작은, 모바일 신호 분자 이다. 지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)은 첫 번째 포스터 공명 에너지 전달 (무서 워)-vivo에서 세포가 레벨의 모니터링 수 있는 바이오 센서를 기반으로. 핵 지역화 GPS1 (nlsGPS1)의 형광 방출 비율을 측정 하 여 다른 조직 유형에서 endogenously 및 것 제공 조지아 그라디언트 spatiotemporal 매핑은 세포 수준에서 가능 합니다. 이 프로토콜 3 예제 실험에서 nlsGPS1 방출 비율을 이미지 하는 방법을 설명 합니다: 정상, 전 후 외 인 지 베 렐 린 A4 (GA4) 치료, 그리고 치료 시간 코스. 우리는 또한 nlsGPS1 방출 비율 피지, 상업 3 차원 (3 차원) 현미경 사진 시각화 및 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 하 고 제한 및 nlsGPS1를 사용 하 여 지 베 렐 린 수준의 척도 가능성이 함정을 설명 하는 메서드를 제공 합니다.

NlsGPS1를 사용 하 여, 의무가 형광 이미징, 루트 팁 및 어두운 성장 hypocotyls (그림 2)를 포함 하 여 조직에서 세포가4 레벨을 측정 가능 하다. 애기 루트에 nlsGPS1 방출 비율 그라데이션 meristematic과 영역에서가 저급 및 높은 늦게 신장 영역 (그림 2A 와 2B)에 나타내는 것입니다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 내 생 GA 그라디언트는 인 위 (그림 2C 및 2D) 아니다는 것을 제안 하는 nlsGPS1-NR 뿌리에서 관찰 되었다. NlsGPS1 방출 비율 그라디언트는 cotyledons 및 꼭대기 걸에 낮은 레벨 및 hypocotyl (그림 2E 와 2F)의 급속 하 게 늘이는 기초 지역에서 높은 수준의 어두운 성장 hypocotyls에서 또한 형성 되었다. 대조적으로, 방출 비율 그라데이션 하지 nlsGPS1 NR hypocotyls (그림 2G 및 2 H)에서 관찰 되었다. 애기 뿌리와 어두운 성장 hypocotyl 세포에서 내 생 GA 축적 셀룰러 연신 율 상관.
또한, 것 공급된가4 축적 우선적으로 애기 루트 (그림 3)의 부 지에 비해 신장 지역에서 내 인 성 및 외 인가 공부 하는 nlsGPS1를 사용할 수 있습니다 나타내는 패턴.
0.1 µ M와 치료를 다음 시간 과정 실험, nlsGPS1 묘 스티커 슬라이드 챔버에 배치 되었고 ¼ MS 액체 끼얹는다 동안 30 분 동안가4 . 동영상 분할 영역 (비디오 1)에 비해 루트 신장 지역에서 외 인 조지아4 의 빠른 축적을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig1.jpg"> 그림 1: 샘플 confocal 영상에 대 한 준비. 이러한 패널 표시 (A) (B) 정상 상태 실험 전 후 외 인 조지아4 치료, 및 (C)는 치료 시간 과정 실험을 사용 하 여 샘플 준비의 도식 표현 스티커-슬라이드 (C)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig2.jpg"> 그림 2: 조지아 그라데이션 애기 뿌리에 어두운 성장 hypocotyls. NlsGPS1 (A)와 (C) nlsGPS1 NR 뿌리의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 및 3 차원 이미지 (B) nlsGPS1 (D) nlsGPS1-NR의 3 차원 상업을 사용 하 여 분석 했다 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 애기 뿌리에 그라데이션 보였다. (E) nlsGPS1 (G) nlsGPS1 NR 어두운 성장 hypocotyl의 2 차원 이미지 ImageJ 소프트웨어를 사용 하 여 분석 했다 그리고 (F) nlsGPS1 (H) nlsGPS1-NR의 3 차원 이미지를 사용 하 여 분석 했다는 상업적인 3 차원 이미지 분석 소프트웨어입니다. 두 분석 내 생 GA4 어두운 성장 hypocotyls에 그라데이션 보였다. LUT 바 nlsGPS1 방출 비율의 잘못 된 색을 표시합니다. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. Hypocotyl 이미지 두 단계 위치를 사용 하 여 인수 했다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58739/58739fig3.jpg"> 그림 3: 뿌리에서 외 인 조지아 그라데이션. 첫 번째 두 개의 패널 표시 (A) 2 차원 및 nlsGPS1 루트 전에 세가4 (1 µ M)의 치료 후 20 분의 (B) 3 차원 이미지. YFP 이미지 식 컨트롤으로 보고 됩니다. 마지막 두 개의 패널 표시 (C) 평균 및 표준 편차 및 신장 영역 (흰색 프레임으로 정의 되는 영역)의 핵에 대 한 nlsGPS1 방출 비율의 (D) beeswarm 상자 줄거리. 신장 지역에 nlsGPS1 방출 비율 조지아4 치료 후 훨씬 더 높은 했다 (맨-휘트니 U 테스트 * * * P-값 &lt; 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/58739fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/58739/58739movie1.jpg"> 비디오 1: 스티커 슬라이드를 사용 하 여 nlsGPS1 루트의 관류 실험. 이 비디오는 nlsGPS1 ¼ MS 액체 끼얹는다 고 0.1 µ M가4 30 분 치료의 3 차원 이미지를 보여줍니다. 시간 과정에서 영상 획득 다음과 같은 간격으로 3 시간 마다 10 분: 모의 솔루션의 30 분 ( t 프레임 = 1, t = 2, t = 3), 조지아4 치료의 30 분 (프레임 t = 4, t = 5, t = 6), 모의의 2 h 그래서 lution (프레임 t = t 로 7 = 18) 솔루션. 인수, 이전 샘플은 2 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58739/Movie1.mov" target="_blank">가이 비디오를 보려면 여기를 클릭 하십시오에 대 한 모의 솔루션 끼얹는다. (다운로드 오른쪽 클릭.)</a>

지 베 렐 린 인식 센서 1 (GPS1)는 첫 번째 포스터 공명 에너지 전송 기반 바이오 센서 측정 지 베 렐 린 phytohormones spatiotemporal 고해상도 세포 수준 이다. 이 프로토콜은 시각화 하 고 애기 hypocotyls 및 루트 팁 유전자 인코딩된 nlsGPS1 바이오 센서를 사용 하 여 셀룰러 지 베 렐 린 레벨 계량 방법에 보고 합니다.

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

The phytohormone gibberellin (GA) is a small, mobile signaling molecule that plays a key role in seed germination, cellular elongation, and developmental ...

이 방법은 성장 조절 식물 호르몬의 분포에 관한 식물 개발 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 기베렐린을 검출하는 nlsGPS1과 같은 유전자 인코딩된 FRET 바이오 센서를 사용하여 세포 용액에서 아기도시스 조직에서 중요한 화합물의 동적 분포를 측정할 수 있습니다. 일반적으로 FRET 생체 센서를 분석하는 것은 의도 메트릭 이미징에 비해 소음과 추가 분석 단계를 증가시킨 비율 이미징을 포함하기 때문에 이 문제에 새로운 개인은 어려움을 겪을 것입니다.1/2 무라시게와 스쿠그 또는 MS 에이카 스퀘어 플레이트에 약 20개의 살균된 아라비도시스 씨앗을 파종하여 시작합니다. 기공 수술 용 테이프로 접시를 밀봉하고 계층화를 위해 섭씨 4도에서 1 ~ 3 일 동안 알루미늄 호일로 감쌉니다. 루트 이미징의 경우, 표시된 조건하에서 3일 동안 수직 방향으로 플레이트를 성장 챔버로 옮는다.암조 된 Hypocotyl의 경우, 발아를 동기화하기 위해 1 ~ 4 시간 광 펄스에 대한 성장 챔버로 플레이트를 전송합니다. 그런 다음 플레이트를 알루미늄 호일로 감싸서 3일 동안 수직 방향으로 성장 챔버에 넣습니다. 꾸준한 상태 측정을 위해 50 마이크로리터의 모의 용액을 깨끗한 현미경 슬라이드에 추가하고 3개의 핵 국소화 횡설수질 지각 센서 1 개 또는 nlsGPS1을 슬라이드에 부드럽게 배치합니다.그런 다음 깨끗한 커버 슬립의 각 모서리에 진공 그리스를 떨어 뜨리고 부드럽게 배치하여 묘목 위에 미끄러짐을 덮습니다. 필요에 따라 기포를 제거하기 위해 추가 모의 솔루션을 신중하게 추가합니다. gibberellin 4 또는 GA4 처리 전에, 진공 그리스로 채워진 20 밀리리터 주사기를 사용하고 깨끗한 유리 슬라이드에 2 센티미터 반 긴 균일하게 계층 3 반 센티미터 길이를 그릴 수있는 1 밀리미터 직경의 수정 된 200 마이크로 리터 파이펫 팁을 장착.사각형의 중앙에 50 마이크로리터의 모의 용액을 추가하고 깨끗한 집게를 사용하여 코틸레돈의 밑면에 모종을 표현하는 nlsGPS1을 들어 올려 모의 용액으로 조심스럽게 전달합니다. 진공 그리스 사각형의 중앙에 입증된 것처럼 진공 그리스로 발견된 커버 슬립을 놓고 모종을 방해하지 않고 여분의 모의 용액으로 저장소를 조심스럽게 채웁니다. 그런 다음 포스터 공명 에너지 전달 이미징을 수행하기 위해 흥미로운 CFP 및 YFP에 적합한 레이저가 장착 된 공초점 현미경에서 모종의 이미지를 습득합니다.치료를 위해 GA4의 경우 현미경 단계에서 슬라이드를 제거하고 20 분 동안 타이머를 설정하십시오. 모든 모의 용액이 교체될 때까지 커버 슬립의 왼쪽에 1개의 마이크로 어어 GA4로 보충된 1분기 MS 액체의 17마이크로리터를 추가하면서 커버 슬립의 오른쪽에서 모의 용액을 즉시 제거합니다. 그런 다음 유리 슬라이드를 현미경 단계에 다시 놓고 GA4 치료 영상을 획득하기 전에 또 다른 10 분을 기다립니다.관심 있는 조직을 위한 타임 코스를 설정하려면 200 마이크로리터의 모의 용액을 ibidi 스티커 슬라이드의 관류 채널의 중앙에 추가하고 nlsGPS1 묘목을 모의 용액에 부드럽게 배치합니다. 집게를 사용하여 포셉의 뒷면을 사용하여 모종 위에 커버 슬립을 부드럽게 놓고 끈적끈적한 슬라이드 주변의 끈적끈적한 재료와 강한 결합을 형성할 때까지 커버 슬립의 바깥쪽 가장자리를 부드럽게 누릅니다. 다음으로, 0.8mm 의 내경 팔꿈치 루어 커넥터 2개와 0.8mm 의 내부 직경 의 실리콘 튜브 조각을 사용하여 끈적 끈적한 슬라이드를 모의 용액으로 채워진 20mm 주사기에 연결하고 슬라이드를 유출 용액을 수집하기 위한 출구 용기에 연결합니다.플런저를 부드럽게 누르고 챔버에 충분한 용액을 분배하여 기포가 없는지 확인하고 주사기를 프로그래밍 가능한 주사기 펌프에 로드합니다. 그런 다음 펌프를 시작하여 시간 과정을 시작합니다. 시간 과정 동안 GA4 치료의 경우 펌프를 일시 중지하여 관류를 중지하고 주사기를 함유 한 모의 버퍼를 GA4로 보충 한 1 분기 MS 액체로 채워진 주사기로 교체하십시오.3D 이미지 분석을 위해 파일을 IMARIS 이미지 분석 소프트웨어 프로그램으로 가져오고 표면 마법사를 엽니다. 배경 빼기를 세 미크론으로 설정하고 임계값을 기본값으로 설정합니다. 핵의 분할 동안 신호의 근거리 수준으로 물체의 신호-잡음 배급이 비율측정 영상 분석을 위해 너무 낮을 것이기 때문에 희미한 형광을 가진 많은 핵을 포함하지 않도록 주의한다.그런 다음 YFP 방출을 사용하여 생성된 표면을 기반으로 CFP 및 FRET 방출 채널을 마스크합니다. XT 평균 강도 비율 확장을 사용하여 두 채널에서 개별 표면의 평균 강도 값 사이에 기증자 여기 기증자 방출로 나눈 기증자 흥분 수락기 방출의 비율을 계산한다. nlsGPS1 방출 비율로 개별 표면을 채색하려면 통계와 함께 색상 코딩을 선택하고 평균 강도 비율을 통계 유형으로 설정합니다.통계 아이콘에서 테이블에서 개별 값의 비율을 내보내고 값을 스프레드시트에 붙여 데이터를 그래픽으로 표현합니다. 애기독증 뿌리에서 nlsGPS1 방출비 그라데이션은 후기 신장 영역에서 의 결합 및 분열 영역에서 낮은 GA4 수준과 높은 GA 수준을 나타냅니다. 대조적으로, 내생 GA4 그라데이션은 아티팩트가 아님을 암시하는 nlsGPS1 무응답 뿌리에서 배출비 그라데이션이 관찰되지 않는다.nlsGPS1 방출 비 그라데이션은 또한 코틸레돈의 낮은 수준과 hypocotyl의 급속하게 길쭉한 기저 영역에서 일반적인 후크 및 높은 수준을 가진 어두운 성장 한 hypocotyls에서 형성됩니다. 대조적으로, 방출 비 그라데이션은 nlsGPS1 불반응성 저혈당에서 관찰되지 않습니다. 더욱이, 외인성 공급GA4는 nlsGPS1이 내인성 및 외인성 GA 패터닝을 연구하는 데 사용될 수 있음을 나타내는 아라비도시스 뿌리의 분단 영역에 비해 신장 영역에서 우대적으로 축적된다.또한, GA4 처리 nlsGPS1 묘목의 시간 과정 분석은, 뿌리 신장에 외인성 GA4의 빠른 축적을 밝혀 그래서 분할 영역에 비해. 이 절차를 시도하는 동안 이미징 매개 변수를 일정하게 유지하고 샘플 관류 중 드리프트 및 초점 변화 문제를 최소화하기 위해 정량적 이미징 중에 포화 픽셀을 피하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 루트 칩 유형 제어 구체 장치에서 성장 하는 이미징 뿌리 같은 다른 속도로 성장 하는 애기독시스 루트 팁에서 GA 그라데이션 변경 또는 그것의 개발 후 스트레스에 대 한 응답에 대 한 추가 질문에 대답 하기 위해 수행 될 수 있습니다., 이 기술은 추가 아랍 idopsis thaliana 조직에 횡설설수설의 동적 분포를 탐구 하는 식물 성장 분야에서 연구를 위한 길을 포장.

visualizing-cellular-gibberellin-levels-using-nlsgps1-frster

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

공간적 특정 phytochrome 반응의 분자 기초는 조직과 기관이 특정 phytochrome 결함을 전시 유전자 변형 식물을 사용하여 조사 중입니다. 특정 세포의 분리는 microarray 분석에 의해 다음 정렬 것은 공간적 특정 phytochrome 응답에 관련된 유전자를 확인하기 위해 활용되고있는 형광 활성화된 세포로 유도 phytochrome 발색단 고갈을 전시.

에서 외과를 이용한 셀 타입 특정 표현식 프로파일을 사용하여 조직 및 장기 특정 Phytochrome 응답 조사 Arabidopsis thaliana</em

현장 신진 대사 프로파일 링을위한 포스터 공명 에너지 전달을 통합 생물 센서 (FIBS)를 보정하는 방법에 대한 설명이 표시됩니다. FIBS는 비 침습적 메타 모델과 생물 공정 조건의 높은 처리량 검사의 발달을 돕는 대사 산물의 세포 내 수준을 측정하는데 사용될 수있다.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

유전적으로 암호화된 BAS FRET 센서를 사용하여 살아있는 세포의 담즙산 역학을 연구하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 이 담즙산 센서는 다양한 세포 유형에서 담즙산 수송 및 FXR 활성화를 연구(조절)하는 고유한 도구를 나타냅니다.

유전자 인코딩 FRET 기반 담즙 산성 센서를 사용하여 세포 내 담즙 산성 역학의 실시간 모니터링

G 단백질 결합 수용체에 의한 G 단백질의 선택적 활성화를 감지하는 간단한 방법은 세포 신호 전달에서 뛰어난 과제로 남아 있습니다. Fӧrster 공명 에너지 전달(FRET) 바이오센서는 GPCR을 G 단백질 펩타이드에 쌍으로 연결하여 살아있는 세포의 제어된 농도에서 구조적 변화를 조사하는 방식으로 개발되었습니다.

G 단백질 선택적 G​​PCR의 입체는 라이브 셀 서스펜션 형광 분석에서 FRET 센서를 사용하여 측정

최근 많은 FRET 기반 힘 바이오센서가 개발되어 세포 내 힘의 단백질 특이적 분해능을 가능하게 합니다. 이 프로토콜에서는 LINC(nucleoskeleton-cytoskeleton) 복합 단백질 Nesprin-2G의 링커용으로 설계된 이러한 센서 중 하나를 사용하여 핵 LINC 복합체에 대한 액토마이신 힘을 측정하는 방법을 보여줍니다.

포스터 공명 에너지 전달 (FRET) -force의 바이오 센서를 사용하는 프로토콜은 핵 LINC 단지에서 기계의 힘을 측정하는

이 프로토콜 aphids와 같은 hemipteran 곤충을 먹이로 생성 하는 식물에 칼슘 신호 분석을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 애기 thaliana GFP 칼슘 바이오 센서 GCaMP3으로 변형 시간적, 공간적 해상도 높은 칼슘 역학의 실시간 vivo에서 영상에 대 한 수 있습니다.

실시간 Vivo에서 녹음 애기 칼슘 신호의 곤충 먹이 형광 바이오 센서를 사용 하 여 중

세포외 글루타메이트 트리거 전신 칼슘 신호는 식물의 기계적 상처 및 초식 공격에 대한 식물 방어 대응의 유도에 매우 중요합니다. 이 문서에서는 칼슘과 글루타민염에 민감한 형광 바이오 센서를 표현하는 아라비도시스 탈리아나 식물을 사용하여 이러한 두 요인의 공간 적 및 측두동을 시각화하는 방법을 설명합니다.

아라비도시스에서 지역 및 전신 상처 신호의 넓은 필드, 실시간 이미징

두 형광단 분자 사이의 Förster 공명 에너지 전달(FRET)은 살아있는 세포에서 단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서는 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 수용체의 감작 방출을 감지하고 공초점 레이저 주사 현미경을 사용하여 기증자 분자의 소멸을 통해 살아있는 세포에서 FRET를 측정하는 방법에 대한 프로토콜이 제공됩니다.

FRET-Sensitized Emission with FRET-Sensitized Release를 사용한 살아있는 세포의 단백질 상호 작용 평가

이 문서는 와이드필드 형광 현미경 검사를 사용하여 모바일, 단일 분자 Förster 공명 에너지 전송 (smFRET) 기반 프로브의 현면 분석을위한 방법을 제시한다. 새로 개발된 소프트웨어 툴킷을 사용하면 정확한 FRET 효율과 분자 위치를 포함한 움직이는 프로브의 smFRET 시간 추적을 시간의 함수로 판단할 수 있습니다.

모바일 단일 분자 FRET 프로브의 자동화된 2차원 스파티오 측량 분석

이 프로토콜은 G 단백질 결합 수용체 리간드 자극 시 살아있는 HEK293 세포에서 G 단백질 활성화를 실시간으로 측정하기 위한 BRET 기반 바이오센서의 사용을 설명합니다. 여기서, β2-아드레날린성 수용체와 칸나비노이드 1형 수용체는 여러 G 단백질 아형과 다양한 GPCR에 걸쳐 센서의 효율성을 입증하는 예로 사용됩니다.

살아있는 세포에서 G 단백질 결합 수용체 활성을 측정하기 위한 BRET 기반 G 단백질 바이오센서

배우세요 gibberellin 측정을 위한 FRET 바이오센서 nlsGPS1을 이용한 식물 세포 내 호르몬 분포 분석 방법을 Arabidopsis에서 실시간으로 관찰하고 정량화하는 기술입니다.

머릿속 세포 지 베 렐 린 레벨 NlsGPS1 포스터 공명 에너지를 사용 하 여 전송 (무서 워) 바이오 센서

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