Name: 원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: 학습하세요 옥수수 비밀 단백질 연구를 위한 Ustilago maydis 트로이 목마 방법을 사용하여. 이 기술은 복잡한 유전자 변형 없이 단백질 기능과 감염 진행 과정을 실시간으로 분석할 수 있게 합니다.

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저자는 토마스 Dresselhaus, 마틴 Parniske, 누 Djella, 그리고 아 르 민 힐 데 브란트 실험실 공간 및 식물 소재 제공 감사 하 고 싶습니다. 트로이 목마 방법에 원래 작업 Leopoldina postdoc 친교와 NSF 프로젝트 IOS13 39229에 의해 지원 되었다. 이 문서에 제공 된 작업 (프로젝트 A14 및 나사 B14) SFB924 DFG의 지원 했다.

1. 미국 maydis 트로이 목마의 건설
참고: 그림 1을 참조 하십시오.
<ol><li>옥수수 cDNA 유전자 특정 뇌관과 교정의 DNA 중 합 효소를 사용 하 여에서 관심사의 유전자를 증폭. 기본 PCR 제품을 복제 하 고 대장균 플라스 미드 공급 업체의 지침. 구조를 변환 생어 시퀀싱 전에 다음 복제 단계 사용 하 여 관심 시퀀스의 정확한 유전자를 확인 합니다. 참고: PCR 사양 뇌관 순서 특이성 및 최적의 DNA 중 합 효소 반응 조건 최적화가 필요 합니다.</li>
	<li>신호 펩 티 드 (SP) 인코딩 순서 없이 관심의 옥수수 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.</li>
	<li>RSIATA 모티브와 Nco역방향 뇌관의 5´ 끝 확장 나 절단 사이트 (표 1).</li>
	<li>교정 DNA 중 합 효소 PCR 템플릿으로 1.1에서 생성 된 PCR 구문을 사용 하 여 함께 관심의 옥수수 유전자를 증폭.</li>
	<li>더블-다이제스트 PCR 제품 및 미국 maydis 변환 플라스 미드, p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-하15 Xba어 Nco I. 소화 PCR 제품 및 플라스 미드 정화.</li>
	<li>템플릿으로 p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-하 T4 DNA 리가 manufacturer´s의 지침을 사용 하 여 소화 PCR 제품을 선. 대장균 으로 결 찰 제품을 변환 하 고 생어에 의해 관심 시퀀스의 정확한 유전자 확인 연속.</li>
	<li>선형화는 p123 PUmpit2-SpUmpit2-Zm관심-mCherry의 유전자-제한 효소 Ssp와하 어 변환 solopathogenic 미국에 DNA maydis SG20016스트레인. Carboxin 선택에 의해 미국 maydis transformants를 분리 하 고 남부에 의해 격리 된 transformants 오 점 분석16확인. 참고: 관심, 적어도 3 개의 독립적인 미국 maydis 의 각 단백질에 대 한 transformants 절연 해야 하 고 임의의 배경 돌연변이의 표현 형 효과 추정 하는 분석 했다.</li>
</ol>2입니다. 문화 미디어
<ol><li>YEPSlight 액체 중간16준비: 1.0% (w/v) 효 모 추출 물, 0.4% (w/v) Bacto 펩 고 0.4% (w/v) 자당. DdH2O와 15 분; 121 ° C에서 압력솥의 모든 구성 요소를 분해 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.</li>
	<li>감자 포도 당 한 천 (agar PD)20준비: 3.9% (w/v) 감자 포도 당 한 천, 그리고 1.0% (w/v) 1 M Tris HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). 압력가 마로 소독 한 병에 직접 모든 구성 요소를 혼합 하 고 추가 ddH2O 플러스 자석 저 어 바. 15 분; 121 ° C에 고압 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.</li>
	<li>PD-숯 agar20준비: 3.9% (w/v) 감자 포도 당 한 천, 1% (w/v) 숯, 그리고 1.0% (v/v) 1 M Tris HCl pH 8.0 (f.c. 0.01 M). 압력가 마로 소독 한 병에 직접 모든 구성 요소를 혼합 하 고 추가 ddH2O 플러스 자석 저 어 바. 15 분; 121 ° C에 고압 더 높은 온도에 압력가 마로 소독의 시간 또는 반복 해 서 더 긴 기간에 대 한 매체의 품질을 줄일 것 이라고.</li>
</ol>3. 식물 감염
<ol><li>단백질 (예를 들어, 현미경-기반 셀 계산)를 전달 하는 트로이 목마에 대 한 응답에서의 옥수수 세포 분석 수행 미리. 미국 maydis-옥수수 세포 증식을 유도 하 고 후속 종양 형성 4-5 일 포스트 감염 주위 시작. 양적 질병 평가 조직 하 고 14 일 게시물 감염에 6에서 수행 되어야 합니다. 참고: 고유한 옥수수 재배 미국 maydis 감염 자화 율의 다른 수준을 표시합니다. 옥수수 c대 W23, A188, 개 스 피 플린트, 초기 황금 자그마한 또는 Va35 민감성이 병원이 체로 표시 하 고 따라서 트로이 목마 연구에 대 한 적합 한 재배.</li>
	<li>미국 maydis inoculum의 준비
	<ol>
<li>모든 트로이 목마 실험에 부정적인 컨트롤로 포함 조상 스트레인 SG200 유전자 변형 변형에 의해 감염에 부작용을 예상. 여기, 부정적인 컨트롤으로 관심사의 단백질의 분 비 되지 않은 버전을 표현 미 maydis 스트레인을 사용 합니다. 그러나, 실행할 수 (예를 들어, 큰 검 진)의 이유로 조상 스트레인 컨트롤의 쉽게 선택이 될 수 있습니다.</li>
		<li>실험을 시작 하기 전에 어떤 양의 감염 문화 필요 예상. 옥수수 조직의 종류에 따라 각 식물의 감염 미국 maydis 서 스 펜 션의 1-1.5 mL를 요구 한다 명심에서 하십시오. 참고: 야간 문화의 약 1 mL YEPS빛 매체의 0.2에 20 mL의 OD600 희석에 대 한 충분 한 이며 0.8-1.0의 OD600 와 미국 maydis 문화의 25 mL는 13-16 식물의 감염에 대 한 충분 한.</li>
		<li>PD 한 천에서 U. maydis 스크래치 접시 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, YEPS빛 매체의 5 mL에 접종 그리고 16 h 200 rpm에서 일정 한 동요와 28 ° C에서 성장 하는 문화.</li>
		<li>감염 전에 적절 한 성장과 400 X 배율에서 세균 오염에 대 한 표준 가벼운 현미경에 의해 미국 maydis 접종 문화를 검사 합니다. 참고: 적당 한 문화, 시가 모양의 버섯만 표시 (그림 2)입니다.</li>
		<li>야간 문화 100 µ L 900 µ L 신선한 YEPS빛 의 혼합 하 고 OD600 분 광 광도 계 분석에 빈으로 YEPS빛 매체를 사용 하 여 측정 한다.</li>
		<li>0.2의 OD600 신선한 YEPS빛 매체와 숙박 문화를 희석 하 고는 세에 의해 표시 중간 로그 성장 단계에 도달 될 때까지 200 rpm에서 일정 떨고와 28 ° C에서 성장 하는 문화600 nm 0.8-1.0. 참고: 미국 maydis 셀이이 조건 하에서 2 시간 마다 복제, 따라서 원하는 OD600 재배의 4-5 h 후에 도달 하면.</li>
		<li>10 분 동안 3000 x g 에서 회전 하 여 0.8-1.0의 OD600 세포를 수확 하 고는 상쾌한 삭제.</li>
		<li>워시 셀 펠 릿 ddH2오와 함께 한 시간 이 위해 ddH2O, 3000 x g 스핀 10 분의 1 문화 볼륨을 추가 하 고 삭제는 상쾌한.</li>
		<li>DdH2O 20 mL 유리 피 펫을 사용 하 여 그로 인하여 조정 (대 한 트로이 목마 분석 결과) 3.0 또는 1.0 (질병 등급)에 대 한 마지막 세600 셀 펠 릿을 신중 하 게 resuspend.</li>
	</ol></li>
	<li>트로이 목마의 확인: planta 옥수수 융해 단백질의 분 비에
	<ol>
<li>트로이 목마 스트레인17옥수수 모 종 감염.</li>
		<li>Confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 2-3 일 게시물 감염에서 감염 된 묘 목의 미세한 이미지를 수행 합니다. 이 위해 소비 세 잎 주입의 지점 아래 1 ㎝의 사각형 조각, 현미경 슬라이드에 샘플 놓고 ddH2o.의 한 방울을 추가 MCherry 융합 단백질을 시각화 하기 위해 자극 λ에서 견본 561 및 λ에서 기록 방출 = = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>성인 옥수수 잎의 감염
	<ol>
<li>성인 잎의 단계에 옥수수 식물을 육성 (때 적어도 잎 줄기 내에서 성장 하는 7). 참고: 이 단계는 14 h, 28 ° C 10 일/h, 22 ° C 밤 리듬 cv W23.를 사용 하 여 온실 조건에서 파 종 시 4 주 후에 도달 된다. 기간 옥수수 재배 온실 조건의 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.</li>
		<li>분열 조직 조직 스토킹에 지역화를 신중 하 게 줄기를 누릅니다. 분열 조직의 부드러운 조직에 더 줄기에서 전환 하 여 구분할 수 있습니다.</li>
		<li>펜을 사용 하 여 줄기에 분열 조직을 표시 합니다.</li>
		<li>미국 maydis 문화 촬영 분열 조직 또는 화 서 분열 조직 1 cm의 1.5 mL를 주사.</li>
		<li>6에서 12 일 게시 감염 질병 증상을 평가.</li>
	</ol></li>
	<li>술의 감염
	<ol>
<li>술 단계를 도달할 때까지 옥수수 식물을 성장 한다. 참고: 꽃 밥과 술 개발에 옥수수 cv W23. 자세한 일정은 앞에서 설명한1819. 술 전 meiotic anthers를 포함 하는 미국 maydis 감염;에 매우 취약 옥수수 cv. W23에서에서 tassels 4-7 cm의 크기 이다.</li>
		<li>줄기에 술을 지역화 하려면 신중 하 게 줄기를 누릅니다.</li>
		<li>팁 및 펜을 사용 하 여 줄기에 술의 기지를 표시 합니다.</li>
		<li>미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.</li>
		<li>술 주위 inoculum의 1.5 mL를 주사. inoculum의 동등 하 게 분배 되도록 천천히 끝, 중간 부분, 그리고 펜으로 표시 하는 술의 기본에 0.5 mL를 배치 합니다.</li>
		<li>10 일 게시 감염에서 질병 증상을 평가.</li>
	</ol></li>
	<li>귀 감염 참고: 귀 조직 개발 및 다른 옥수수 재배 온실 조건에 다릅니다 접종 전에 신중 하 게 관찰 해야 합니다. 비단을 자라 다를 시작 하는 귀는 미국 maydis 감염에 매우 취약.<ol>
<li>미국 maydis 문화 전송 (3.2.9 참조) 20 G x 1 피하 주사 바늘으로 3 mL 주사기로.</li>
		<li>껍질 잎 사이 공간으로 접종 바늘 주사 가능한 깊이 귀를 부상 없이.</li>
		<li>귀 주위 inoculum의 1.5 mL를 릴리스 합니다.</li>
		<li>주사기와 바늘을 제거 하 고 신중 하 게 동등 하 게 미 maydis 솔루션을 배포 하는 개 암 나무 열매를 마사지.</li>
		<li>14 일 게시 감염에서 질병 증상을 평가.</li>
	</ol></li>
	<li>미국 maydis inoculum의 생존 능력을 확인
	<ol>
<li>PD 숯불 한 접시에는 inoculum의 10 µ L를 삭제 하 고 2 일 동안 실 온에서 품 어. 참고: 경우는 각각 미국 maydis 문화 양식 필 라 멘 트, 솜 털, 백색 균 된다 표시 (그림 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

현대 작물 연구에서 유전 분자 분석 및 단백질 수준에 대 한 프로토콜을 요구합니다. 유전 접근을 통해 변환 사용할 수 또는 비효율적이 고 옥수수 등 대부분 작물 종에 대 한 시간이 아니다. 또한, 발기인 기자 시스템 등 신뢰할 수 있는 유전 도구 부족, 어려운 별개 조직 사이트에서 고해상도 spatiotemporal 원래의 단백질 기능을 공부 하는. Apoplastic 단백질 조직으로 heterologously 표현 하 고 순화 된 단백질의 침투에 의해 공부 될 수 있다. 그러나, 분리 단백질 식 발전에 불구 하 고 작물 조직으로 타겟된 침투 어렵고 종종 단백질 기능 분석에 대 한 비효율적인이 남아 있다. 트로이 목마 전략은 변환 또는 단백질 침투를 요구 하지 않는 다른 접근 이다. 미국 maydis옥수수 병원 체의 분 비 기구를 채용 하 여 감염 된 조직의 공장 apoplast으로 이론적으로 어떤 관심사의 단백질의 납품을 얻을 수 있습니다. 관심사의 단백질의 크기에 대 한이 기술의 한계는 아직 ...

Biotrophic 병원 체 Ustilago maydis 1옥수수 smut 질병 원인이 되는 에이전트입니다. 그것은 모든 공중 부분 melanized, 검은 포자를 포함 하는 큰 종양에 따른 옥수수의 감염. 글로벌 수준에서 미국 maydis 종양 멕시코의 gastronomical 진미로 평가 되는 동안 옥수수 생산량의 약 2%의 연간 손실 발생으로 추정 된다. 식물 감염 옥수수 표 피 세포의 첫 번째 계층에 침투를 lysing 효소 세포 벽을 분 비 하는 appressorium에 의해 시작 됩니다. 1 차 감염 사이트에서 미국 maydis 성장 침 및 intercellularly, 모든 주1,2레이어 1 ~ 2 셀에 침입. 5 일 시 보이는 종양으로 공장 비 대에 성공적인 감염 결과 감염1,,34게시. 모든 감염 단계 곰 팡이 균 invaginate 호스트 세포질1,2에 직접 접촉 하지 않고 공장 세포질 막. 감염 균과 식물 원형질 막 사이 공간을 꽉 apoplasmic biotrophic 상호 작용 영역 이라는 호스트/병원 체 인터랙티브 사이트로 간주 됩니다. 극복 하기 위해 공장 타고 난 면역 계통, 미국 maydis biotrophic 상호 작용 영역1에 effector 단백질의 배열을 은닉 한다. 반면 다른 사람 biotrophic 상호 작용 영역5,6,,78에 어떤 이펙터 식물 세포에 의해 찍힌다. 1 apoplastic 이펙터 UmPit2 신호 펩 티 드 ZmZIP1 ZmPROZIP에서 apoplastic 프로 테아 제 활동9,10의 출시를 방지 하기 위해 옥수수 apoplastic 프로 테아 제와 상호 작용 하는.
지난 십년 동안 미국 maydis 되었다만 식물 병원 체 상호 작용에서 곰 팡이 유전학 뿐만 아니라 생명 공학 파악된 수명 주기, 쉬운 유전 접근 가능성 때문에 귀중 한 도구에 대 한 모델 및 분리 식의 분 비 단백질11,,1213. 모두 기존과 파격적 단백질 분 비에 대 한 신호 posttranslational 수정14의 제어를 허용 결정 되었습니다. 최근, 미국 maydis 트로이 목마 도구 작은, 공부를 해 라15옥수수 단백질 분 비로 고용 되었다. 트로이 목마 접근 작은, 분 비 단백질은 꽃 밥 개발에 관여 하는 ZmMAC1의 기능 분석을 성공적으로 사용 되었다. ZmMAC1 유도 만능 세포 및 세포 운명 명세의 새로 형성된 된 셀15의 periclinal 부문 합니다. 같은 방법으로는 옥수수 손상 관련 된 펩 티 드 ZmZIP1의 생물 학적 기능으로 밝혀졌다. 미국 maydis 귀착되 었 다 ZmZIP1 옥수수 은닉 종양 형성10손상. 따라서, 트로이 목마 접근 방식을 나타내는 단백질도 않는 spatiotemporal 고해상도 현장 연구에 귀중 한 대체 경로 필요 안정적인 옥수수 변환 라인도 함께 조직 침투의 세대 heterologously 표현 및 순화 된 단백질입니다. 특히, 트로이 목마 전략 옥수수 apoplast에 어떤 분리 단백질의 분 비와 같은 조직 내에서 감염 되지 않은 식물 세포 감염 대 의 직접 비교 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 관심사의 단백질을 공부 하는 미국 maydis 트로이 목마 스트레인을 생성 하기 위한 주요 단계를 보여 줍니다. 그것은 더 포함 (성인 잎, 술과 귀) 3 다른 옥수수 조직 유형의 감염 절차에 정확한 정보 미 maydis, spatiotemporal 감염 진행 및 단백질 기능을 공부에 대 한 전제 조건입니다. 이러한 대상 조직. 아니 추가 사양은 옥수수 유전자 증폭에 부여 하 고 있기 때문에 이러한 단계는 특정 대상 및 악기 종속적 기법, 영상 현미경입니다. 따라서,이 프로토콜은 표준 분자 생물학 기술의 숙련 된 사용자에 게 제시 된다.

<table><tbody><tr><td>2mL 주사기&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 피하 주사 바늘</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA</td><td></td><td></td><td>interrest 유전자를 발현하는 옥수수 조직에서</td></tr><tr><td>숯</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td></td><td></td>은 <td>현지에서 사용 가능한 장비를 사용합니다</td></tr><tr><td>큐벳 (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터-셰이커 28 &deg로 설정; C, 200 rpm</td><td></td><td></td><td>사용 현지 장비 사용</td></tr><tr><td>400배 배율</td><td></td><td></td>의 광학 현미경 <td>사용 현지 장비 사용</td></tr><tr><td>Nco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>교신자에게 문의하십시오&nbsp;</td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (유리, 긴 팁)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td>는 <td>pENTR 또는 pJET Potato Dextrose Agar와 같은 다른 기본 클로닝 벡터로 교환할 수 있습니다</td></tr><tr><td>.</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie 펜</td><td></td><td></td><td>은 현지에서 사용 가능한 장비를</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>사용합니다</td></tr><tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td> (한국어</tr></tbody></table>판)

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Homer´s 트로이 말 신화에서 영감을, 우리 옥수수 병원 체 Ustilago maydis vivo에서 phenotypic 분석을 허용 하는 옥수수 apoplast으로 분 비 단백질을 제공 하도록 설계. 이 방법은 옥수수 변환에 의존 하지 않는 하지만 미생물 유전학 및 병원 균의 분 비 기능을 악용. 여기, vivo에서의 검사 전달 감염 사이트 및 직물의 다른 종류에서 spatiotemporal 고해상도 단백질 분 비 수 있습니다. 트로이 목마 전략 정도 기능 단백질 도메인, 분석에서 대상 단백질 효과, 또는 온 사 이드 단백질 overdosage를 위한 강력한 도구를 만드는 연구를 특성화 하기 위해 옥수수 기능 손실 고기를 보완 하기 위해 이용 될 수 있다 옥수수 작물 시스템에서 단백질 연구입니다. 이 작품 뒤에 3 개의 다른 옥수수 조직 형식에이 메서드를 적용 하는 표준화 된 감염 프로토콜 트로이 목마 긴장을 생성 하는 방법에 정확한 프로토콜을 포함 합니다.

미국 maydis 트로이 목마 실험에 대 한 구문은 플라스 미드 p123 PUmpit2-SpUmpit2-관심-mCherry의 유전자-하에 복제 됩니다. 관심의 옥수수 유전자 mCherry 형광 기자와 하는 epitope에 융합-태그. 융해 단백질의 표정은 감염21동안 활성화 특히 미국 maydis Umpit2 발기인의 제어. Biotrophic 상호 작용 영역으로 관심 펩 티 드의 단백질의 직접 분 비를 코딩 지역 미국 maydis Umpit221 (그림 1)의 신호...

이 작품 옥수수 조직의 세 가지 유형으로 옥수수 단백질 분 비의 원래의 장소에 배달에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 스트레인의 복제에 대해 설명 합니다.

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

유전 및 단백질 수준에 프로세스를 조사하는 것은 작물 연구에서 중요합니다. 우리의 접근은 다른 감염 측및 조직에 가장 높은 공간 측두성 해상도를 가진 분비한 미로 단백질의 검사를 가능하게 합니다. 트로이 목마 방법은 유용한 오토마토 분비 기능을 탐구한다.그것은 시간이 많이 걸리고 도전적인 미로 변환을 우회하고, 미로 아펠 플라츠 내에서 분비 된 단백질에 대한 자세한 연구를 용이하게한다. 추가 된 미로 잎, 술 및 귀의 적절한 감염에 대한 자세한 정보. 및 표적 조직에서 감염 진행 및 단백질 기능에 대한 성공적인 연구를 보여줍니다.절차를 시연하는 것은 실험실에서 졸업생인 이사벨 피들러(Isabell Fiedler)가 될 것입니다. 실험을 시작하려면 멸균 저온 살균 기르 파이펫을 사용하여 페디아트 플레이트에서 유마두를 긁습니다. 유마두와 YEPS 빛 매체의 5 밀리리터를 접종.16시간 동안 200rpm에서 일정한 흔들림으로 28도에서 문화를 성장시다. 다음날 신선한 YEPS 빛의 900 마이크로리터와 100 마이크로리터의 하룻밤 문화를 혼합합니다. YEPS 라이트 매체를 분광광계 분석에서 빈 값으로 사용하여 OD-600을 측정합니다.신선한 YEPS 라이트 매체로 하룻밤 문화를 희석하여 OD-600의 2개에 희석합니다. 문화권이 200rpm에서 일정한 흔들림으로 섭씨 28도에서 성장하게 하고, 8~1.0의 OD-600으로 표시된 중간 로그 성장 단계에 도달할 때까지. 인큐베이션 후, 10 분 동안 3000 번 치로 회전하여 세포를 수확하십시오.상부체를 폐기합니다. 다음으로, DDH2O의 배양부 1부로 셀 필렛을 한 번 세척한다. 셀을 3000시간 치에서 10분 동안 회전시키고 상체를 폐기합니다.그런 다음, 20 밀리리터 유리 파이펫을 사용하여 DDH2O에서 셀 필렛을 조심스럽게 다시 중단합니다. 따라서 트로이 목마 분석에 대한 최종 OD-600 ~ 3.0 또는 질병 등급의 경우 1.0을 조정합니다. 미로 식물을 성인 잎의 단계로 육성하여 적어도 잎 7이 줄기 안에서 자랍니다.다음으로, 유마드 문화를 20 게이지 bi 하나의 피하 바늘로 3 밀리리터 주사기로 옮는다. 줄기를 조심스럽게 눌러 거울 줄기 조직을 국소화하십시오. 거울 줄기의 베이스는 더 단단한 줄기에서 부드러운 조직으로의 전환으로 구별 될 수 있습니다.펜을 사용하여 줄기에 거울 줄기를 표시합니다. 촬영 거울 줄기 또는 꽃무성 거울 줄기 위의 유마드 문화의 1센티미터 1.5 밀리리터를 주입합니다. 미로 식물이 술 단계에 도달하면 줄기를 조심스럽게 눌러 줄기의 술들을 국소화하십시오.펜을 사용하여 줄기에 술의 끝과 베이스를 표시합니다. 유마드 문화를 3 밀리리터 주사기로 옮기고 20 게이지 bi 1 피하 바늘을 사용하여 술 주위의 접종비의 총 1.5 밀리리터를 주입합니다. 무접종의 동등한 분포를 보장하기 위해 펜으로 표시된 술의 끝, 중간 및 바닥에 5 밀리리터를 천천히 놓습니다.유마드 문화를 20 게이지 bi 1 피하 바늘로 3 밀리리터 주사기로 옮는다. 귀를 손상시키지 않고 가능한 한 깊게 껍질 잎 사이의 공간에 접종 바늘을 주입한 다음 귀 주위의 접종 비응고 1.5 밀리리터를 방출합니다. 다음으로 주사기와 바늘을 제거하고 조심스럽게 코브를 마사지하여 유마드 용액을 동등하게 분배합니다.PD 숯 오거 플레이트에 10 마이크로리터의 접종을 떨어 뜨립니다. 그런 다음 실온에서 2 일 동안 배양하십시오. Hyphae 분비 ZM Mach1은 형광및 체리 신호로 둘러싸여 있습니다.대조적으로, 비분균 최면은 곰팡이 세포질에서 형광 신호를 보여줍니다. 부적절한 술 국소화 또는 부동적 분포는 비감염된 술또는 짝수 분포에 비해 술의 부분적인 감염을 초래할 수 있다. PD 숯 오거에서 배양된 솔로 병원성 트로이 목마 프로게스터 균주 SG-200은 표시된 대로 접시에 흰색 보풀 필라멘트를 형성합니다.유목민 균주 FB1 전염성 필라멘트 형성 전에 짝짓기를 필요로하는 동안. 감염 후, 트로이 목마 간 단백질의 가능한 반응은 질병 등급 또는 현미경 이미징을 포함한 다양한 방법을 사용하여 분석될 수 있다. 많은 병원균의 경우, 변형과 분비도 잘 이해되며 유사한 방식으로 탐구 할 수 있습니다.따라서 변환에 취약하지 않은 호스트의 연구를 활성화합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

출처: Beernink, B. M. 외 재조합 여우꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염성 클론을 주입하여 옥수수 묘목을 직접 농연균화합니다. J. Vis. 경험 (2021)이 영상은 아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 시연합니다. 이 연구는 아그로박테리움 감염, 전신 바이러스 확산, RNA 간섭에 의한 표현형 변화 과정을 개괄합니다.

아그로박테리움 매개 재조합 바이러스 클론을 옥수수 묘목에 전달하여 유전자 침묵을 위한 방법

생체영양 병원체 우스틸라고 수교를 이용한 옥수수 및 테오신테 식물을 접종하는 바늘 주입 방법의 사용이 설명된다.  상기 바늘 주입 접종 방법은 병원체가 아프레소리아 형성을 통해 식물에 유입되는 식물 잎 사이에 곰팡이 병원균의 통제된 전달을 용이하게 한다. 이 방법은 매우 효율적이며, 미국 maydis와재현 가능한 접종을 가능하게 합니다.

옥수수와 테오신테 라인에 우스틸라고 성 실증의 병원성을 평가하기위한 신속하고 효율적인 방법

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

여기 선물이 분석 Aspergillus flavus 성장과 아플 라 톡 신 생산 옥수수 커널에서 항진균 단백질을 표현 하는 프로토콜.  우리는 감염 및 실시간으로 성숙한 커널에 곰 팡이의 확산을 모니터링 GFP 표현 A. flavus 긴장을 사용 하 여. 분석 결과 신속 하 고 신뢰할 수 있는, 재현.

Aspergillus flavus 성장 및 유전자 변형 옥수수 표현 Lablab purpureus L.에서에서 α-아 밀라 아 제 억제제에서 아플 라 톡 신 생산의 억제

식물 형태 유전자는 반발성 유전자형의 유전적 변형을 개선하는 데 사용될 수 있다. 여기에 설명된 것은 3개의 중요한 공공 옥수수 근친선에 대한 아그로박테리움-매개유전형형(QuickCorn) 프로토콜이다.

아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

농균 계 주사 (농업 주입) 프로토콜은 옥수수 묘목으로 여우 꼬리 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 클론의 접종을 위해 제시된다. 이러한 방식으로 접종은 바이러스 감염, 마커 유전자의 바이러스 유발 유전자 침묵, GFP의 바이러스 과발현으로 이어집니다.

재조합 폭스테일 모자이크 바이러스와 사탕수수 모자이크 바이러스 감염 클론주사에 의해 옥수수 묘목의 직접 농경화

여기에서 우리는 옥수수 중엽 세포에서 플라스미드의 대규모 라이브러리를 테스트하기 위해 수백만 개의 옥수수 원형질체를 일시적으로 형질감염시키는 고처리량 프로토콜을 제시합니다.

옥수수 중엽 원형질체의 확장 가능한 형질감염

단일 셀의 순서는 고해상도 게놈 변화를 해결하기위한 점점 인기 액세스 도구입니다. 우리는 하나의 셀에 복사 번호 변경을 식별하기 위해 단일 셀 시퀀싱을 사용하는 프로토콜을 제공합니다.

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Saccharomyces cerevisiae의 내인성 위치에서 히스톤 유전자의 돌연변이를 생성하는 전략이 제시됩니다.

대상<em&gt; 현장에서</em신진 효모에서&gt; 돌연변이 유발 히스톤의 유전자

여기는 신경 근육 학 질병 마우스 모델에서 재조합 형 adeno 관련 바이러스 serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한의 배달에 설명 합니다. 쥐에서 단일 주변 관리 연구 미르 기능과 치료 가능성 비보수 있는 기회를 제공 하는 모터 신경 및 근육에 지속적인된 미르 overexpression 귀착되는.

설치류에 신경 근육 학 질병을 치료 하는 재조합 형 Adeno 관련 바이러스 Serotype 9를 사용 하 여 예측에 관한 체계적 전달

학습하세요 옥수수 비밀 단백질 연구를 위한 Ustilago maydis 트로이 목마 방법을 사용하여. 이 기술은 복잡한 유전자 변형 없이 단백질 기능과 감염 진행 과정을 실시간으로 분석할 수 있게 합니다.

원래의 배달 옥수수 단백질에 대 한 Ustilago maydis 트로이 목마 사용 하

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