Name: 빛 주도 분자 모터 표면에 단일 분자 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 학습하세요 빛 주도 분자 모터의 합성 및 표면 고정 방법을 통해 단일 분자 수준에서 회전을 시각화하는 기술입니다. 이 프로토콜은 분자 기계 연구에 중요한 지침을 제공합니다.

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이 작품 과학 연구 (NWO-CW), 유럽 연구 회의 (ERC; 고급 부여 번호 694345 B.L.F.), 교육, 문화 및 과학 네덜란드 조직에 의해 재정적으로 지원 되었다 (인력 프로그램 없음. 024.001.035)입니다.

참고: 유기 합성이이 프로젝트의 주요 핵심입니다. 그림 1 주요 단계와 대상 분자를 얻을 하는 방법을 보여 줍니다.
1입니다. 1b의 준비
참고: 용 매 분석 학년에서 구매 되었다.
<ol><li>
케 톤 (3)의 합성 참고: 처음에, 5-회원 링 케 톤 2 요오드 그룹은 기능성 그것이 더 반응 하기 때문에. 이 반응은 아르곤 분위기에서 수행 됩니다.<ol>
<li>밀봉 된 튜브 (100 mL) 2 (640 m g, 2.3 mmol)을 포함, CuI (219 mg, 1.1 mmol), 및 NaI (3.44 g, 23 mmol), 추가 1, 4-dioxane (50 mL)와 N, N'-디 메 틸 ethylenediamine (202 m g, 2.3 mmol).</li>
		<li>140 ° C에 반응 온도 설정 하 고 24 시간 동안 저 어.</li>
		<li>실내 온도 (RT) 혼합물을 냉각 vacuo, 용 매를 제거 하 고 플래시 크로마토그래피에 의해 나머지 재료를 정화: SiO2 (40 g); eluent: pentane: EtOAc = 10:1 (총 550 mL =). 제품 노란색, 끈적끈적한 기름 (642 mg, 91%)으로 얻을 수 해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 5의 합성 참고: 바튼 켈로그 반응을 사용 하 여 중앙 이중 결합을 형성. 이 반응은 아르곤 수행 됩니다.<ol>
<li>50 mL 둥근 바닥 플라스 크에 Lawesson의 시 약 (415 mg, 1.1 mmol), 케 톤 3 (219 mg, 0.68 mmol)과 톨루엔 (10 mL)를 추가 합니다.</li>
		<li>2 시간에 대 한 환류에 혼합물을가 열 하 고 그 후 용 매를 증발.</li>
		<li>플래시 열 하 여 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (24 g), eluent: pentane: 에틸 아세테이트 = 30: 1 (총 155 mL =) 블루 솔루션을 THF의 20 ml에서 redissolved 이후에 해당 thioketone를.</li>
		<li>블루 솔루션에 디 아조 화합물 4 (476 mg, 1.37 mmol)의 THF 솔루션 (20 mL)을 추가 하 고 밤새 50 ° C에서 새로 혼합된 솔루션을 저 어. 참고:이 전체 합성의 가장 중요 한 단계입니다. 디 아조 화합물 및 thioketone 솔루션 신선 하며 반응 하기 전에 하 여야 한다.</li>
		<li>용 매를 증발 하 고 착 색 인쇄기에 의해 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (24 g), eluent: pentane: 채널2Cl2 = 10:1 (총 220 mL =) 모터 5 (250 mg, 50%)를 로 빨간 고체.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 6의 합성 참고: 중앙 이중 결합을 형성 하는 경우 아세틸렌 moiety에 의해 요오드 그룹을 교체 합니다.<ol>
<li>20 mL Schlenk 튜브, 추가 3 (165 mg, 0.26 mmol), Pd (PPh3)2Cl2 (2.5 몰 %), CuI (5 몰 %). 다음, THF (10 mL) 추가 (나-홍보)2뉴 햄프셔 (2 mL) 전에 10 분 동안 아르곤으로 부풀어 야 하는.</li>
		<li>10 분에 대 한 실시간에 혼합물을 저 어. 그런 다음 triisopropylsilyl 아세틸렌 (42 밀리 그램, 0.27 mmol)을 추가 합니다.</li>
		<li>대 한 혼합물을 저 어 다음는 수성 포화 NH4Cl 솔루션 (25 mL)에 부 어.</li>
		<li>채널2Cl2 (3 x 20 mL) 혼합물을 압축을 풉니다. 더 결합 된 유기 레이어 포화 소금물과 건조 세척 (나2이렇게4).</li>
		<li>용 매를 제거 하 고 플래시 크로마토그래피에 의해 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (12 g), eluent: pentane: 채널2Cl2 = 10:1 (220 mL)를 갈색 기름 (171 mg, 99%)으로 8 .</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 8의 합성 참고:이 반응 아르곤 수행 됩니다.<ol>
<li>1, 4dioxane 6 (161 mg, 0.24 mmol), pinacol 에스테 르 7 (240 밀리 그램, 0.71 mmol), K3포4 (300 밀리 그램, 1.44 mmol)과 Pd (PPh3)4 (98 mg, 0.096 mmol)의 혼합물을 저 어 (20 mL) 50ml 16 Schlenk 튜브에에서 90 ° C에서 h입니다.</li>
		<li>Rt 혼합물을 냉각 하 고 에틸 아세테이트 (30 mL), 그것을 희석 유리 필터와 여과 수행.</li>
		<li>용 매를 제거 합니다. 플래시 칼럼 크로마토그래피에 의해 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (12 g), eluent: pentane: 채널2Cl2= 1:6 (총 122 mL =) 에스테 르 8 갈색 기름 (156 mg, 56%)으로 항복.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 9의 합성
	<ol>
<li>솔루션에 추가 TBAF (0.1 mL) 8 (120mg, 0.13 mmol)의 THF (10 mL)에 0 ° c.에 Schlenk 튜브 20 ml</li>
		<li>1 h, 0 ° C에서 혼합물을 저 어 다음는 수성 포화 NH4Cl 솔루션 (20 mL)에 부 어.</li>
		<li>결합 된 유기 레이어 포화 소금물과 건조 세척 추출 CHCl3 (3 x 10 mL), 후 (나2이렇게4).</li>
		<li>용 매를 제거 하 고 플래시 크로마토그래피에 의해 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (12 g), eluent: pentane: 에틸 아세테이트 = 1:3 (124 mL) 어두운 레드 오일 (116 mg, 95%)으로 9 를.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 12의 합성 참고:이 반응 아르곤 수행 됩니다.<ol>
<li>20 mL Schlenk 튜브, 추가 모터 9 (75 mg, 0.10 m m o l), PBI 11 (68 mg, 0.10 mmol) Pd (PPh3)2Cl2 (2.5 mol %), CuI (5 mol %). 다음, THF (10 mL) 추가 (나-홍보)2뉴 햄프셔 (2 mL) 전에 10 분 동안 아르곤으로 부풀어 야 하는.</li>
		<li>밤새 혼합물을 저 어 하 고는 수성 포화 NH4Cl 솔루션에 붓는 다.</li>
		<li>CHCl3 (3 x 20 mL) 추출, 후 씻어 건조 포화 소금물와 결합 된 유기 레이어 (나2이렇게4).</li>
		<li>용 매를 제거 하 고 플래시 크로마토그래피에 의해 찌 꺼 기를 정화: SiO2 (12 g), eluent: CHCl3 (100 mL)를 자동차 12 어두운 빨강 단색으로 (66 mg, 57%).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
모터 1b의 합성 참고: 에스테 르 화합물을 얻을 때 최종 대상 분자를 만들기 위해 그것은.<ol>
<li>50 mL 플라스 크에 에스테 르 12 (90 mg, 0.038 mmol) THF (5 mL), MeOH (5 mL), 및 NaOH(aq.) (1 M, 5 mL)에 녹이 고 16 h 75 ° C에 혼합물을가 열.</li>
		<li>Rt 혼합물을 냉각 하 고 물 5 mL를 추가 합니다. 로터리 증발에 의해 THF와 MeOH를 제거 합니다.</li>
		<li>갈색 침전을 형성 하는 1의 pH에 도달할 때까지 HCl(aq.) (1 개 M)를 가진 혼합물을 적정 하십시오. 혼합물을 여과 하 고 씻어 냉 수 (10 mL)와 함께 브라운 솔리드 vacuo에서 건조. 이 갈색 고체 대상 분자 1b (55 mg, 85%) 이다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모터의 준비 기능성 단층 MS-1b
<ol><li>피 라 솔루션에 그들을 immersing 하 여 석 영 슬라이드 청소 (3:7 비율 30% H2O2 H2의 등4) 1 h. 린스 copiously 이중 증류수 3 x, 다음 린스 MeOH와 함께 90 ° C에서. 표면 개 질 하기 전에 스트림의 N2 슬라이드 건조.</li>
	<li>Silanize 피 청소 석 영 톨루엔과 MeOH copiously 12 헤 린스에 대 한 실시간에 갓 증류수 톨루엔에 3-aminopropyl (diethoxy) methylsilane의 1 m m 솔루션에 immersing 하 여 슬라이드.</li>
	<li>톨루엔, 후 MeOH, 석 영을 먼저 sonicate 그리고 아르곤의 스트림 아래 그들을 건조.</li>
	<li>아민-코팅 슬라이드 1b (10-4 M) RT에 12 h의 DMF 용액에 담가.</li>
	<li>씻어 DMF, 물, 및 MeOH, 슬라이드 다음 아르곤의 스트림 아래 그들을 건조. 건조 후, 슬라이드 사용 하기 위해 준비 되어 있다.</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tynoczko, J. L., Styer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry+5th+ed%22">Biochemistry 5th ed</a>. , W.H. Freeman. New York. (2006).</li>
<li>Erbas-Cakmak, S., Leigh, D. A., McTernan, C. T., Nussbaumer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Machines.</a> Chemical Reviews. 115, 10081-10206 (2015).</li>
<li>Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Art+of+Building+Small%3A+From+Molecular+Switches+to+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The Art of Building Small: From Molecular Switches to Motors.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 56, 11059-11078 (2017).</li>
<li>Stoddart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Machines.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 410-411 (2001).</li>
<li>Kinbara, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Intelligent+Molecular+Machines%3A+Directed+Motions+of+Biological+and+Artificial+Molecules+and+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Toward Intelligent Molecular Machines: Directed Motions of Biological and Artificial Molecules and Assemblies.</a> Chemical Reviews. 105, 1377-1400 (2005).</li>
<li>Kay, E. R., Leigh, D. A., Zerbetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Molecular+Motors+and+Mechanical+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthetic Molecular Motors and Mechanical Machines.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 46, 72-191 (2007).</li>
<li>Kottas, G. S., Clarke, I. L., Horinek, D., Michl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Rotors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Rotors.</a> Chemical Reviews. 105, 1281-1376 (2005).</li>
<li>Watson, M. A., Cockroft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+Molecular+Machines%3A+Membrane+Bound%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Man-made Molecular Machines: Membrane Bound.</a> Chemical Society Reviews. 45, 6118-6129 (2016).</li>
<li>Kassem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Motors.</a> Chemical Society Reviews. 46, 2592-2621 (2017).</li>
<li>Sauvage, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSauvage%2C+JP+%22Molecular+Machines+and+Motors%22">Molecular Machines and Motors</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>van Delden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+molecular+motor+on+a+gold+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional molecular motor on a gold surface.</a> Nature. 437, 1337-1340 (2005).</li>
<li>Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita, K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+rotation+of+F1-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the rotation of F1-ATPase.</a> Nature. 386, 299-302 (1997).</li>
<li>Hutchison, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-bound+molecule+that+undergoes+optically+biased+Brownian+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A surface-bound molecule that undergoes optically biased Brownian rotation.</a> Nature Nanotechnology. 9, 131-136 (2014).</li>
<li>Krajnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+Imaging+of+UV-Driven+Surface-Bound+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Defocused Imaging of UV-Driven Surface-Bound Molecular Motors.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 7156-7159 (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로젝트 관련 상당한 양의 합성 작업; 따라서, 가장 중요 한 단계는 최종 분자 쪽으로 유기 합성 이다. 총 종합 중 바튼 켈로그 반응 분자 모터의 중앙 이중 결합은 형성 하는 반응 이므로 주요 단계입니다. 현재, 여러 가지 방법은 이러한 유형의 구조를 형성 하기 위하여 사용 되었습니다. 여기, 디 아조 thioketone 커플링 사용 되 고 각각 위와 더 낮은 반 디 아조와 thioketone 화합물으로 준비 되었습니다. Thioketone 및 디 아조 화합물은 일반적으로 불안정 아래; 따라서, 반응 해야 합니다 빠른 엄격 하 게 불활성 분위기에서.
기존 메서드 제한 표면에 분자 모터를 주로 bipodal 시스템 기반으로 합니다. 그러나, 이전에 디자인된 bipodal 모터의 isomerization 프로세스 intermolecular 상호 작용으로 인해 방해 했다. 또한, 일부 bipodal 예제 추가 첨부 파일 이전 활성화를 필요 합니다. 현재 메서드는 모터의 강력한 부착 표면에 충분 한 절연된 공간 제공 tetrapodal 방식으로 이것을 수행.
이 방법의 제한 형광 태그의 선택입니다. 모터의 회전 365 nm 파장에 의해 트리거됩니다 고 따라서 겹쳐 수 해야 특정 파장을 가진 염료만 사용할 수 있습니다. 또한, 합성 경로 대상 분자 쪽으로 설명된 프로토콜에 있는 가혹한 조건 반응의 완성에 필요한 몇 가지 단계가 필요 합니다. 미래에 더 손쉬운 합성 디자인은 아마 필요 단일 분자 이미징에 대 한 더 많은 고급 분자는 필요 합니다.
결론적으로, 설계 및 높은 기능성된 빛 구동 하는 분자 모터의 합성 처음으로 설명 되어 있습니다. 합성 하는 노력의 몇 가지 세부 사항은 잘 설명 되어 있습니다. 또한, 석 영 슬라이드 표면에 모터를 이식 하는 방법을 설명 하 고 샘플은 단일 분자 운동14의 시각화에 대 한 추가 시험 될 수 있다.

살아있는 유기 체에서 일상 생활을 유지 하기 위해 작동 하는 풍부한 분자 모터 있다. 그들은 연료 생산, 전송, 이동성,1등 다양 한 작업을 수행할 수 있습니다. 자연에서 이러한 매혹적인 예의 영감에서 그리기, 과학자2 분자 레벨 제어 동의로 에너지의 다른 종류를 변환 하는 지난 몇 년간 인공 분자 모터의 일련을 개발 했습니다. , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. 2016 년에 화학에 있는 노벨상 3 개척자이 분야에서 수 여 되었다. 벤 Feringa, 수 상자, 중 지속적인 단방향 회전 하는 동의 받을 수 있는 빛 기반 분자 모터를 개발 했다.
그러나, 분자 수준에 브라운 움직임, 분자 충돌 및 진동로 알려진 또한 임의 모션은 일반적으로 이러한 분자 모터의 추가 응용 프로그램에 대 한 주요 장애물. 브라운 모션 어떤 감독된 동작을 방해할 수 있습니다. 표면에 분자 모터를 수감 하는 것은이 문제를 극복 하기 위해 옵션 중 하나 있을 수 있습니다. 이렇게 함으로써, 다른에 관하여 분자의 한 부분의 상대 회전 표면11상대적인 회전자의 절대 회전으로 변환 됩니다. 또한, 단일 분자 이미징 기술 사용 하 여 움직임을 시각화 도움이 됩니다. 따라서,이 작품에 의해 얻은 결과 합성 분자 모터에 더 많은 통찰력을 얻을 데 도움이 됩니다.
요시다와 Kinosita (그림 2a)의 작품을 개척12,13 디자인 그림 2b에서 현재 작업에 대 한 영감으로 역임 했다. 빛 주도 분자 모터의 아래쪽 고정자로 표면에 첨부 됩니다. 로 터 부분 이다 공업화 경직 된 팔 및 형광 라벨. 시스템에 두 개의 서로 다른 방사선 파장을 적용할 때 다른 형광 태그 자극 것입니다 하는 동안 하나는 모터의 회전 하 게 됩니다. 원칙적으로로 터 파트의 회전 하는 동의 형광 그룹의 회전을 트리거합니다. 따라서, 형광 태그의 회전 defocused 넓은 필드 형광 현미경 검사 법에 의해 다음 있습니다. 이 메서드를 제공 합니다, 처음으로 절대 회전 및 따라서 합성 모터의 회전을 시각화 하는 방법으로는 분자 모터의 상대 회전 변환 하는 방법을.
이 문서에서는 세부 설계, 총 합성, 그리고 솔루션에 단일 분자 이미징에 사용 되는 분자 모터의 isomerization 연구 합니다. 분자 구조는 그림 3에 표시 됩니다. 또한, 석 영 표면에 분자 모터를 연결할 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>NMR 분광계</td><td>Varian</td><td>AMX400</td><td>양성자 nmr 연구</td></tr><tr><td>시약 유기 반응 시</td><td>약 시그마</td><td>분석 등급</td><td>시약 유기 반응</td></tr><tr><td>실리카겔&nbsp;</td><td>Merck</td><td>230-400 메시 ASTM</td><td>플래시 크로마토그래피&nbsp;</td></tr><tr><td>솔벤트</td><td>Acros</td><td>분광 광도계 등급&nbsp;</td><td>플래시 크로마토그래피&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-vis 조사 UV-vis</td>흡수 분광 광도계를 위한 <td>UV 램프</td><td>ENB</td><td>280C</td></tr><tr><td></td><td>JASCO</td><td>V-630&nbsp;</td><td>UV-vis 측정</td></tr></tbody></table>

빛 주도 분자 모터 표면에 단일 분자 이미징

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

설계 및 표면에 단일 분자 수준에서 합성 회전 모터의 직접적인 시각화를 위한 목표로 합성 시스템의 합성은 설명 했다. 이 작품에는 주의 깊은 디자인, 상당한 합성, 노력과 적절 한 분석 필요합니다. 솔루션에는 분자 모터의 회전 하는 동의 1H NMR과 대 한 UV 흡수 분광학 기법에 의해 표시 됩니다. 또한, 아민 입히는 석 영에 모터를 이식 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법은 분자 기계에 더 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

분자 모터의 방사선 자외선과 수행 됩니다 (최대 λ = 365 nm). 방사선 조사, 시 중앙 이중 결합 주위 사진 유도 된 E Z isomerization 발생합니다. 이 과정 동안, 분자는 불안정 한 이성질체를 안정에서 변환 됩니다. 열 활성화 된 나선 반전 단계 다음 전체 분자의 긴장을 풀어 다음과 같습니다. 그러면 원래의 안정 된 상태로 됩니다. 1 H NMR 분광학 다음 회전 과정 (그림 4a)을 평가 하기 위해 채택 된다. 샘플의 솔루션은 NMR 튜브 다음 UV 빛의 램프에서 준비 (최대 λ = 365 nm)는 관 옆에 위치. 방사선의 2 시간 후 1H NMR 스펙트럼에서 뚜렷한 변화를 찾을 수 있습니다. 이러한 변화는 불안정-1b (그림 4b)으로 간주 되는 새로운이 성체의 생성을 나타냅니다. 3.3 ppm (더블 더블 릿) 2.9 ppm (더블 릿)에서 교대 H는는 1H NMR 분광학에서 볼 수 있다. 1.4 ppm에서 신호 메 틸 그룹의 흡수로 지정할 수 있으며 downfield 1.6 ppm 1.4 ppm에서 교대. 샘플 어둠 속에서 실 온에서 하룻밤 보관은, 원래 스펙트럼 수 있습니다 (그림 4a) 복구. 그것은 열 나선 반전 안정-1b 1b 불안정을 변환 하는 과정을 나타냅니다.
1b 모터의 회전 하는 동의에 공부 하기 위하여 표면, 표면 부착 모터 어셈블리 MS-1b (MS = 표면에 모터) 준비 된다. 석 영 슬라이드는 먼저 공업화와 아민. 이 단계 후 석 영은 몰두 RT에 1b의 DMF 솔루션 (10-4 M)에서 하룻밤. 합성 석 영 MeOH와 DMF, 물, 씻어 서 이다. 준비 된 석 영 슬라이드 다음 UV/vis 연구에 대 한 제출 됩니다. MS-1b (실선)의 UV/vis 흡수 스펙트럼은 그림 5b에 표시 됩니다. 스펙트럼에서 본, 주요 흡수 밴드와 흡수 프로 파일은 솔루션 (그림 5a)에서 관찰 하는 비슷합니다. 그것은 또한 모터 특성 absorptions 보여줍니다 (420 nm) 및 PBI (456 nm, 490 nm, 524 nm). 이러한 봉우리 아민 코팅 표면에 모터 1b의 성공적인 첨부를 하시기 바랍니다. 또한, 석 영 슬라이드 15 분 반구 및 스펙트럼 변화 불안정 MS-1b의 세대를 나타내는 솔루션의 관찰 된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig1.jpg"> 그림 1 : 대상 분자 1b의 준비로 합성 체계. 계획 시 약, 용 매, 및 반응 조건에 사용 되는 각 단계에 표시 됩니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig2.jpg"> 그림 2 : (한) F0F1의 구조의 회로도 그림-ATPase 단방향 회전 (허가12재현)의 시각화를 위한 표면에 투입. (b) 합성 표면 바운드의 개념적 디자인 빛 기반 분자 모터 단일 분자 이미징에 대 한.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig3.jpg"> 그림 3 : 모터 코어 및 PBI 레이블 사이 경직 된 긴 팔을 베어링 표면 바인딩된 분자 모터 1b의 구조. 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig4.jpg"> 그림 4 : 의 지방 족 지역에서 1 모터 1b의 H NMR 스펙트럼 (CD2Cl2,-20 ° C, c = 10-3 M) 방사선 조사 전에 (한) 안정-1b (365 nm). 방사선 조사 후 (b) 사진 고정 상태 혼합물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58750/58750fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig5v2.jpg"> 그림 5 : UV/vis 흡수 스펙트럼. (한) 모터 1b의 UV/vis 흡수 스펙트럼 (채널2Cl2, 0 ° C), 안정적인 이성질체 (실선) 및 PSS에 불안정 한 이성질체 (파선). (b) MS-1b (석 영, 4 ° C) (실선) 하기 전에 (파선) 방사선 조사 후.

원고를 합성 하 고 단일 분자 이미징에 대 한 표면에 분자 모터를 이식 하는 방법을 설명 합니다.

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

이 프로토콜은 단일 분자 수준에서 인공 광 구동 분자 모터의 회전을 시각화하는 첫 번째 예를 제공합니다. 여기에 사용되는 합성 기술은 여러 기능 성 그룹과 복잡한 분자 기계의 합성을 허용하도록 설계되었습니다. 첫째, 아르곤 분위기 하에서 는 640밀리그램의 로터 전구체 화합물 2개, 구리 요오드 219밀리그램, 교반 바가 장착된 100밀리리터 슐렌크 튜브에 3.44그램의 요오드 나트륨을 배치합니다.밀폐된 튜브를 슐렌크 라인에 연결하고 1, 4-디옥산 및 263 밀리그램의 트랜스 1, 2-Diaminocyclohexane의 50 밀리리터를 추가합니다. 140섭씨140도에서 혼합물을 저어 24시간 동안 저어주면 요오드용 브롬을 교환합니다. 그런 다음 혼합물을 실온으로 냉각시키고 진공 상태에서 용매를 증발시키십시오.실리카 젤 플래시 크로마토그래피에 의해 화합물을 정화하고 휘발성을 제거하여 요오드 대체 화합물 3을 끈적끈적한 노란 오일로 얻습니다. 다음으로, 로슨의 시약 415밀리그램과 스티어 바가 장착된 슐렌크 플라스크에 219밀리그램의 화합물 3을 배치합니다. 페덴서를 통해 플라스크를 슐렌크 라인에 연결하고 아르곤으로 세 번 제거합니다.톨루엔 10밀리리터를 넣고 2시간 동안 혼합물을 역류하여 화합물 3을 티오케톤으로 변환합니다. 용매를 증발시키고 플래시 크로마토그래피로 티오케톤을 정화합니다. 순수한 분획에서 휘발성을 제거하고 테트라 하이드로 푸란의 20 밀리리터에 고립 된 티오케톤을 용해.다음으로, 476 밀리그램의 갓 준비된 화합물 4를 녹여서, 이는 STATor diazo 전구체이며, 또 다른 20밀리리터의 THF에 녹입니다. 화합물 4의 용액을 티오케톤 용액에 추가하고 16시간 동안 아르곤 산하에 혼합물을 역류하여 로터와 스테이터 사이의 이중 결합을 형성한다. 과도한 용매를 증발시키고, 플래시 크로마토그래피에 의해 원유 생성물을 정화하고, 휘발성을 제거하여 모터 화합물 5를 적색 고체로 얻습니다.다음으로, 모터 5, 4.56 밀리그램의 바이스(triphenylphosphine)의 팔라듐 염화제, 2.48밀리그램의 구리 요오드를 20밀리리터 슐렌크 튜브에 스티어 바가 장착된 튜브에 넣습니다. 튜브를 밀봉하고 슐렌크 라인에 연결합니다. 10 분 동안 혼합물을 통해 THF의 10 밀리리터와 디이소 프로필라민과 거품 아르곤의 두 밀리리터를 결합합니다.그런 다음, 혼합물을 슐렌크 튜브로 옮기고 10분 동안 실온에서 아르곤 밑의 반응 혼합물을 저어줍니다. 트리이소프로필실릴 아세틸렌 42밀리그램을 넣고 15~16시간 동안 교반하여 요오드를 TIPS 아세틸렌으로 교체하세요. 그런 다음, 포화 수성 암모늄 염화의 25 밀리리터에 제품 혼합물을 부어.디클로로메탄의 3개의 20 밀리리터 부분으로 제품을 추출하고 포화 염수 50 밀리리터로 결합된 유기 층을 한 번 세척합니다. 씻어낸 유기농 층을 황산나트륨 위에 말리십시오. 건조제를 걸기하고 과도한 용매를 제거합니다.플래시 크로마토그래피로 잔류물을 정화하고 진공 상태에서 휘발성을 제거하여 모터 6을 갈색 오일로 얻습니다. 교반 바가 장착된 50밀리리터 플라스크에는 PBI 라벨 모터 12개 90밀리그램, THF 5밀리리터, 메탄올 5밀리리터, 1마리 수성 수산화나트륨 5밀리리터를 결합합니다. 혼합물을 섭씨 70도에서 6시간 동안 저어서 스테터의 에스테르를 가수분해합니다.그런 다음 저어주면서 혼합물을 실온으로 식힙니다. 이중 증류수 5밀리리터를 추가하고 회전 증발로 휘발성 용매를 제거합니다. 혼합물이 pH 에 도달할 때까지 수성 1-어금전산을 첨가하여 모터 1b가 갈색 고체로서 용액에서 침전됩니다.여과에 의해 고체를 복구하고 시원한 물 10 밀리리터로 세척하고 진공 상태에서 건조시. 다음으로, 1시간 동안 90°C에서 피라냐 용액에 석영 슬라이드를 담그십시오. 슬라이드를 두 배로 증류한 물 5밀리리터와 메탄올을 한 번 으로 헹구십시오.질소 가스로 슬라이드를 건조시십시오. 그런 다음, 갓 증류된 톨루엔에서 3-아미노프로필(diethoxy)메틸실레인의 1밀리머용액을 준비한다. 실온에서 12시간 동안 이 솔루션에 슬라이드를 담근 다음, 톨루엔과 메탄올 각각 5밀리리터로 실라화된 슬라이드를 헹구세요.슬라이드를 톨루엔과 메탄올에 각각 2분 씩 순차적으로 담그고 아르곤 가스 의 흐름 아래에서 건조시다. 다음으로 각 슬라이드에 대해 디메틸포르마미드에 모터 1b의 0.1 밀리머용용액 5밀리리터를 준비합니다. 1b의 단층으로 석영 표면을 12시간 동안 실온에서 1b 용액에 담그십시오.DMF, 물 및 메탄올로 기능화된 슬라이드를 순서대로 세척합니다. 아르곤 가스로 슬라이드를 건조시키고 아르곤 아래 밀봉 된 용기에 보관하십시오. 분자 모터 1b는 형광 태그에 로터의 코어를 연결하는 견고한 페닐 에틸렌 테트라머 암과 함께 적당한 수율로 합성되었다.양성자 NMR 스펙트럼은 하와 Hc 사이의 중요한 비키날 커플링을 보여주지 않았으며, 이는 하와 Hc가 모두 의사도 에대한 방향에 있는 것과 일치합니다. 축 적도 비키날 커플링은 Hb와 Hc.조사 사이에 365나노미터 광 유도 이소성 이소성 주위의 이소성 제거를 이 불안정한 이소머로 관찰하였다. 메틸 신호의 다운필드 변화와 하와 Hc 사이의 비키날 커플링의 발달은 모두 메틸 그룹이 의사도 에쿼토리알임을 나타냈다.화합물이 실온에서 어둠 속에서 유지되었을 때, 열 나선 반전은 플루오렌을 지나 미끄러 져 나프 탈렌과 분자에 부담을 발표했다. 이것은 대칭 불소 스타터 때문에 그것의 원래 구성으로 분자를 반환했습니다. 안정되고 불안정한 이좀러의 UV/vis 분광법은 단단한 팔과 형광 태그에 대한 특성 흡수 영역에서 겸손한 차이를 보였다.석영에 모터 1b의 단층의 성공적인 조립은 UV / vis 분광법에 의해 확인되었다. 단층은 사진 고정 상태에서 불안정한 이좀러에 도달하기 위해 15 분만 조사해야했습니다. 다이아조와 티오케톤 화합물이 모터 5의 성공적인 합성을 보장하기 위해 신선하게 만들어졌는지 확인하는 것이 중요합니다.분자 기계의 연구 분야는 복잡한 분자 기계를 설계, 합성 및 시각화하는 중요한 지침을 제공하기 때문에 이 방법의 이점을 누릴 수 있습니다. 피라냐 용액은 슬라이드를 청소하는 데 사용됩니다. 이 용액은 산성성이 높고 신중하게 사용해야 합니다.

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