Name: 녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 학습하세요 EGFP 발현 대장균을 이용한 마우스 복막 대식세포 식균작용 평가 방법을. 이 프로토콜은 선천성 면역 기능 연구에 활용되며 노화와 면역 변화를 이해하는 데 기여합니다.

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국립 자연 과학 재단의 중국 (no. 31800046)는 자연 과학 재단의 요 녕 성 (no. 20170540262)이이 작업 지원. 이 작품은 두 번째 병원의 대련 의료 대학에서 과학 연구 센터의 실험실에서 달성 되었다. 저자는 cytometry, 그녀의 지원에 대 한 샤 오 린 상 및 보 숨어와 동-Chuan 양 비디오 생산에 그들의 지원을 감사 하 고 싶습니다.

모든 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 국가 학회 건강 지침에 따라 수행한 및 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회의 대련 의과대학에 의해 승인 했다. 16-달-오래 된 (와 함께 30-35 g의 몸 무게)와 8 주 오래 된 (20-25 g) SPF (특정 병원 체 자유로운) 남성 C57BL/6 마우스 대련 의과대학의 SPF 동물 센터에서 입수 했다. 모든 마우스 액세스와 동물 주택에 음식과 물 광고 libitum를 유지 했다. 온도 20-24 ° C에서 유지 되었다, 습도 40%-70%, 이었고 조명 12 h 빛/12 h 어두운 했다. 동물 실험 전에 적어도 7 일 동안 환경에 적응을 허용 되었다.
1. 건설 애완 동물-스모-EGFP 플라스 미드의 EGFP 식의 유도
<ol><li>합성 EGFP 유전자 조각 (717 bp 시퀀스 사용자 지정 유전자 합성 서비스에 의해 합성 참조 테이블의 자료 와 보충 파일 1 시퀀스) 앞으로 뇌관 (단편 증폭 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') 및 뇌관 역 (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), 고 충실도 Taq DNA 중 합 효소를 사용 하 여.</li>
	<li>마지막 주기 (PCR 조건에 대 한 보충 파일 1 참조) 후 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 제품 다음 단계에서 TA 복제에 대 한 단일 3' 아데닌 돌출부는 되도록 72 ° C에서 30 분 확장을 사용 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법으로 PCR 제품을 확인 하십시오.</li>
	<li>애완 동물-스모 벡터에 PCR 제품을 복제 ( 재료의 표참조) T4 DNA 리가와 방법5 를 복제 하는 TA를 사용 하 여. 30 분 동안 실내 온도 (20-25 ° C)에 반응을 품 어. 벡터는 뉴클레오티드 653 및 1 bp 5 ' T-각 가닥에 오버행으로 654 사이 오는지.</li>
	<li>화학적으로 유능한 BL21(DE) E. 콜라이 긴장으로 결 찰 제품을 다음과 같이 변환: 5 µ L 추가 (100 ng) BL21(DE) 90 42 ° C에 열 충격을 통해 유능한 세포의 100 µ L PCR 제품의 s; 3 분 동안 얼음에 혼합물을 계속 하 고, 37 ° C에서와 120 rpm에서 1 h 동안 흔들어 37 ° C에 미리 데워 lysogeny 국물 (파운드) 매체의 400 µ L 추가.</li>
	<li>100 µ L 유도 유 당 (0.5 m m o l/L), 파운드-대 (100 µ g/mL) 판의 표면에 박테리아의 EGFP 식 스트레인 저조한 접종 37 ° C에서 접시를 밤새 품 어. 참고: 지금까지 EGFP 성공적으로 표현 하는 경우에 일부 식민지 어둠 속에서 빛나는 녹색 빛으로 관찰할 수 있습니다.<ol>
<li>DNA 시퀀싱에 의해 삽입 된 EGFP 조각 확인 식민지, 선택 합니다. DNA 연속을 위한 뇌관은: 앞으로, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; 역, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>긍정적인 식민지 100 µ g/mL 대와 파운드 매체의 5 mL에 접종. 2 h, 120 rpm에서 인큐베이터를 떨고 37 ° C에 품 어 다음, 0.5 mmol/L의 최종 농도에 유도 유 당을 추가 하 고 EGFP 식 유도 6 h에 대 한 동요를 계속. 경험적으로 때 6 h, 600에서 광학 밀도 흔들어 nm (OD600) 0.7에 도달 수 있습니다 이상.</li>
	<li>슬라이드에 세균성 문화 매체의 10 µ L을 추가 하 고는 coverslip로 커버 한 표현의 EGFP 거꾸로 형광 현미경 검사. EGFP 표현 박테리아는 몇 주 동안 2-8 ° C에 매체에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 마우스 복 막 대 식 세포 분리 및 주 문화
<ol><li>100 mL의 증류수 그리고 압력솥 사용 하기 전에 불 임에 혼합물을 thioglycolate의 3.5 g을 추가 합니다. 마우스의 복 막 주입에 대 한 후드에 1 mL 균 주사기로 thioglycolate 매체를 펌프. 감염을 피하기 위해 주사기 당 한 마우스를 사용 합니다. Thioglycolate 사용 하 여 대 식 세포의 수를 증가할 수 있다. 상주 복 막 대 식 세포는 고립 될 수 있다 thioglycolate 없이 하지만 낮은와 대 식 세포 생성.</li>
	<li>현지 동물 보호와 사용 위원회에 의해 승인 하는 방법을 사용 하 여 마우스 anesthetize 1 mL 주사기, 바늘 23 G를 사용 하 여 마우스의 복 막 구멍으로 3.5 %thioglycolate 매체의 1 mL를 주사. 참고: 마 취 유도, 복 막 주입 쉽게 수행 될 수 있습니다 및 주입으로 인 한 내부 장기에 부상의 위험을 감소 시킨다.</li>
	<li>3 일 동안 물과 음식 광고 libitum 와 마우스를 유지. 매일 동물의 몸 무게와 음식 섭취 량을 모니터링 합니다. 몸 무게 감량 3 일 이내 10% 보다 큰 경우에, 실험에서 동물을 제외 합니다.</li>
	<li>3 일 후, 마우스를 빠르게 sevoflurane 닫힌된 상자에 의해 마 취 유도 후 자 궁 경부 전위에 의해 안락사. 또는, 마우스를 안락사를 로컬 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었습니다 방법을 사용 합니다.</li>
	<li>75% 에탄올 소독, 마우스 (10 cm 직경)와 함께 그릇에 넣어 고 후드에 신속 하 게 그것을 전송. 접시에 마우스를 놓고 마우스의 위치를 해결 하기 위해 보드에 앞 발을 고정 합니다.</li>
	<li>20 G에 연결 된 5 mL 주사기를 사용 하 여 바늘, 30 °-40 ° 각도에서 바늘 경사를 배치 인산 염 버퍼 감기 (4-10 ° C)의 5 mL 식 염 수 (PBS) 낮은 복 부에에 주입 마우스의 복 막 구멍, puncturing 창 피하고 있습니다. 경우는 대 장 (또는 다른 기관) 구멍은, 마우스를 해당 셀 더 이상 사용할 수 없습니다 실험,로이 기본 세포 배양에 적합 하지 않은 세포를 활성화할 수 없습니다.</li>
	<li>마우스의 복 부의 두 측면에 부드러운 마사지를 수행 합니다. 그런 다음, 부드럽게 그리고 천천히 액체를 발음. 50 mL 원심 분리기 관으로 복 막 액체 분배. 이 2 배 또는 3 배 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>냉장된 원심 분리기 (4-8 ° C)에서 400 x g 에서 10 분 동안 정지 세포 원심 삭제는 상쾌한 고 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 RPMI 1640 매체에 셀 펠 릿 resuspend. 셀을 계산 합니다. 경험적으로, 셀 밀도 약 5 x 106 셀/mL 셀은 매체의 10 mL에 resuspended 때.</li>
	<li>교류 cytometry 분석 결과 및 형광 현미경에 대 한 24-잘 접시에 잘 당 5 x 105 셀에 대 한 6 잘 플레이트의 각 음에 5 x 106 셀을 추가 합니다. 밤새 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 세포 문화. 문화 매체 때문에 이들의 대부분은 세포 nonadherent 세포를 제거 하는 3 h 후는 새로 고칠 수 있습니다. 부착 세포는 주로 대 식 세포, 그리고 그들은 잘 조직 문화 취급 하는 플라스틱에 고착 할 수 있다.</li>
</ol>3. 대 식 세포 식 균 작용 분석 결과 형광 현미경을 사용 하 여
<ol><li>세포 생존 능력 및 셀 밀도 밝은 분야 현미경으로 세포를 관찰 합니다.</li>
	<li>24-잘 접시에서 문화 매체를 제거 합니다. 표 1에 설명 된 대로 각 우물에 신선한 문화 매체의 100 µ L와 10 µ L 세균성 중지 (약 2 × 107 셀)을 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2 배양 기에서에서 1 시간에 품 어.</li>
	<li>부드럽게 noninternalized 박테리아를 잘 당 3 x-5 x 차가운 PBS의 500 µ L 씻어.</li>
	<li>30 분 동안 실내 온도에 PBS에 4% 포름알데히드와 셀을 품 어.</li>
	<li>고정된 셀 3 세척 PBS 가진 x (500 µ L/잘).</li>
	<li>Phalloidin 633 형광의 200 µ L 염색 활용된 작업 솔루션 추가 ( 재료의 표참조) F-말라 얼룩. 60 분에 대 한 실 온에서 어두운, 습 한 장소 (60%-80%)에 게 린스 셀 3 PBS 가진 x (500 µ L/잘) 어떤 과잉 phalloidin 제거 하. F-말라 얼룩, 세포질 설명 수 고 내 면된 박테리아를 구별 하는 데 도움이.</li>
	<li>세포 핵 얼룩 및 실 온에서 어두운, 습 한 장소에 5 분 동안 품 어 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 작업 솔루션 (1 µ g/mL)의 200 µ L를 추가 합니다. PBS 가진 1 x 린스 (500 µ L/잘)와 같은 양의 증류수를 가진 1 x. 그런 다음, 셀 거꾸로 형광 현미경 관찰에 대 한 준비가 될 것입니다.</li>
</ol>4. 대 식 세포 식 균 작용 분석 결과 cytometry 사용 하 여
<ol><li>실험 오류를 최소화 하 고 결과의 적절 한 해석 하 게 그룹을 설정 하 고 표 2에 나열 된 실험에 대 한 튜브를 제어.<ol>
<li>컨트롤 그룹에 대 한는 얼음 ( 표2에서 그룹 4)에 배치 됩니다, 6 잘 플레이트에서 매체를 제거 하 고 그것을 씻어 PBS 가진 1 x. 다음, 세포를 분리 하 여 교류 cytometry 튜브에 그들을 전송 우물에 70 m m 감기 EDTA의 1 mL를 추가 합니다. 튜브에 세균 현 탁 액의 50 µ L을 추가 하 고 1 시간에 대 한 얼음에 배치.</li>
		<li>다른 그룹에 대 한 문화 매체를 제거 합니다. 각 우물에 신선한 매체의 1 mL를 추가 합니다. 표 2에 설명 된 대로 그룹 설정에 따라 우물에 세균 현 탁 액의 50 µ L를 추가 합니다. 다음, 37 ° C, 5% CO2 인큐베이터 1 시간에에서 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Noninternalized 대장균의 형광을 풀기 위해 우물에 0.8% 크리스탈 바이올렛 (CV) 물 솔루션의 200 µ L을 추가 하 고 곧, 거짓 양성 결과의 표면에 EGFP 표현 대장균 바인딩에 의해 피할 영향력은 대만 내 면 되지. 3 셀을 씻어 모든 잔여 이력서를 제거 하는 PBS 가진 x.</li>
	<li>다음, 세포를 분리 하 여 교류 cytometry 튜브에 그들을 전송 우물에 70 m m 감기 EDTA의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 400 x g 에서 튜브 원심 및 삭제는 상쾌한.</li>
	<li>Resuspend 셀을 PBS의 100 µ L를 추가 합니다. 그룹 설정에 따라 튜브, 또는 사용 IgG2a PE isotype F4/80-PE-활용 된 항 체 (마우스 대 식 세포에 표면 항)의 5 µ L를 추가 합니다. 짧게 소용돌이 어둠 속에서 5-10 분 동안 얼음에 샘플을 품 어.</li>
	<li>각 관으로 PBS의 1 mL을 추가 하 고 5 분에 대 한 400 x g 에서 원심 분리기는 상쾌한 삭제. 교류 cytometry 분석에 대 한 PBS의 200-300 µ L로 셀 펠 릿 resuspend 각 튜브를 실행 하 고 f 4/80+ 세포의 적어도 10, 000 건의 데이터.</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 단계는 매우 간단 하 고 간단 합니다. 중요 한 단계 중 하나는 대장균에 EGFP 식을 유도 하는 것입니다. 일반적으로, EGFP, 같은 진핵생물에서 유전자를 대장균같은 원핵생물에서 표현 하 계획 하는 경우는 단백질의 기본 구조 및 활동 변경 단백질 비활성 집계 (포함 시체)를 형성할 것 이다 위험이 있다. 애완 동물-스모 벡터를 사용 하 여 애완 동물-스모-EGFP 플라스 미드를 건설 EGFP 스모 융해 단백질 성공적으로 표현 하 고 빛을 신호 했다 충분히 강한 형광 현미경과 교류 cytometer 검색할 수 합니다.
다른 중요 한 단계는 대 식 세포에 의해 내 면화 하지 했다 박테리아의 형광을 끄다. Trypan 블루 fluorescein isothiocyanate (FITC)의 형광을 담금질 하기 위해 표시 되었습니다 비록-레이블이 열 살해 박테리아, 그것은 작동 하지 않았다 라이브 대장균에 대 한. 0.8% ...

대 식 세포 식 균 작용 분석 자주 타고 난 면역 기능을 공부 하는 데 사용 됩니다. 타고 난 면역 반응 감염 민감성을 나타낼 수 있습니다. 대 식 세포 세포 라인 면역학 연구에 널리 사용 됩니다. 그러나, 확장된 통로 유전자 손실이 발생할 수 있습니다 및 이러한 셀 라인에서 면역 기능을 손상. 따라서, 기본 복 막 대 식 세포는 세포 기능1을 공부 하는 이상적인 개체.
타고 난 면역 반응 세 본문에 그대로 생각 했다, 비록 phagocytic 능력 그는 더 젊은에2,3바디 비해 줄어들 수 있습니다. 여기, 우리가 영 (8 주-오래 된)와 세 (16 개월) 마우스 EGFP 표현 대장균은, 빠르고, 편리 하 고 경제적으로 실현 가능한를 사용 하 여 복 막 대 식 세포의 식 균 작용을 평가 하는 방법을 보여줄 것입니다.
이러한 박테리아는 안정 되 고 대 식 세포는 4% (w/v) paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 하기 때문에 EGFP 표현 E. 콜라이 긴장의 사용이 분석이 결과의 장점 중 하나입니다. 또한, 대장균의 EGFP 표현 사용 하 여 연구원은 필요 하지 않습니다 더 먹어서, 시간 후 얼룩. 또한, 대 식 세포는 대장균 EGFP 표현 버섯 또는 구슬 fluorescein 표시를 사용 하 여 보다 더 먹어서 분석 결과 대 한 적당 한 만드는 대장균 표면 항 원에 대 한 immunoresponsive.
EGFP 표현 대장균, 함께 먹어서 분석 결과 쉽게 2 시간에서 달성 고 두 흐름 cytometry 및 형광 현미경 검사 법, 연구자의 목적에 따라 측정. 때문에이 메서드는 직접 phagocytic 능력을 측정, 결과 다른 간접적인 방법 보다 더 재현.
이 방법은 또한 RAW264.7 세포 라인에서 검증 된 그리고 인간 주변 혈액 단 세포4. 텍스트 아래이 분석 결과 수행 하기 위한 자세한 단계별 지침을 제공 하 고 연구원은 그들의 실험의 요구에 맞게 수정할 수 있습니다 중요 한 단계를 강조.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences-Biotin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>안티 마우스 CD16/32 항체</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO 단백질 발현 시스템</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 유전자 합성 서비스</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE 안티-마우스 항체 for FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; 도립 현미경</td><td>Leica Microsystems-PE</td><td>,</td><td></td></tr> <tr><td>Rat IgG2a, &kappa;-isotype control</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr>, <tr><td>Phalloidin 633, 형광 염료, 복합 작업 용액</td>, <td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr>, <tr><td>Thioglycollate medium</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

이 원고 먹어서 분석 결과 수행 하는 간단 하 고 재현할 수 방법을 설명 합니다. 이 방법의 첫 번째 부분 포함 애완 동물-스모-EGFP 벡터 구축 (스모 = 작은 유비퀴틴-같은 한정자) 녹색 형광 단백질 (EGFP) 대장균 (BL21DE)에서 향상 된 표현. EGFP 표현 대장균 은 37 ° C에서 1 시간에 대 한 대 식 세포와 coincubated 부정적인 제어 그룹은 시간의 동일한 금액에 대 한 얼음에 알을 품을. 다음, 대 식 세포는 평가 대 한 준비. 이 기술의 장점 간단 하 고 간단한 절차, 그리고 먹어서 두 흐름 cytometer 및 형광 현미경에 의해 측정 될 수 있다. EGFP 표현 대장균 안정 하 고 대 식 세포는 paraformaldehyde로 고정 한 후에 강한 형광 신호를 표시 합니다. 이 방법은 뿐만 아니라 대 식 세포 세포 선 또는 기본 세포 생체 외에서의 평가 적합 하지만 granulocyte 및 monocyte 주변 혈액 단 세포에서 식 균 작용의 평가 위해 또한 적당 한. 결과 보여 젊은 (8 주 된) 쥐에서 복 막 대 식 세포의 phagocytic 기능 세 (16 개월) 쥐에서 대 식 세포의 그것 보다 높다. 요약 하자면,이 방법은 대 식 세포 식 균 작용 고 타고 난 면역 계통 기능 공부를 위해 적당 한 이다.

애완 동물-스모 벡터 대장균에서 네이티브 단백질의 식을 수 있도록 작은 유비퀴틴-같은 한정자를 사용 합니다. 스모 퓨전 크게 쉽게 감지 될 수 있도록 EGFP 가용성을 높일 수 있다. EGFP 식 성공적으로 유 당에 의해 유발 됩니다, 경우 (그림 1A) 어둠 속에서 녹색 식민지를 관찰할 수 있습니다. 녹색 점, EGFP 표현 대장균을 나타내는 40 x 목표 렌즈 (그림 1B)를 사용 하 여 형광 현미경으로 관찰할 수 있습니다.
현미경 분석 젊고 세 그룹에서 복 막 대 식 세포의 형광 이미지 (그림 1C)을 보여줍니다. 그림 1 c</s...

여기, 우리 향상 된 녹색 형광 단백질 표현 대장균을 사용 하 여 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

이 프로토콜은 EGFP 표현 대장균을 사용하여 대식세포의 식세포 능력을 평가하는 간단하고 유익한 방법을 시연하였다. 안녕하세요, 제 이름은 다롄 의과 대학 제2병원의 준유입니다. 오늘 우리는 당신에게 쉽게 보여주고 쉽게 2 시간 이내에 수행 할 수있는 대식 세포증을 평가하는 방법을 시각화 할 것입니다.이 방법은 타고난 면역 기능의 연구에서 널리 사용되었다. 선천적인 면역 기능은 노인에 그대로 남아 있는 것으로 여겨진다. 그래서 오늘 우리는 노인과 젊은 마우스에서 복막 대식제를 분리하고이 두 그룹의 phagocytic 능력을 볼 것입니다.글쎄, 시작하자. 먼저, EGFP 유전자 단편을 합성하고 고충실도 Taq DNA 폴리머라제를 사용하여 단편을 복제한다. 그런 다음 PCR 제품을 pET SUMO 벡터로 리게이트합니다.셋째, 결찰 제품을 대장균 균주로 변환하고 유당으로 발현하는 EGFP를 유도한다. 이러한 EGFP 표현 E.coli는 phagocytosis 분석의 마커역할을 하였다. 다음으로, 마우스 회막 대식세포가 분리되고 배양되었다.그런 다음 EGFP를 표현하는 대장균은 37도 센티미터에서 1시간 동안 대식세포로 주조되었습니다. 담금질 단계 후, 대식세포는 형광 현미경 과 유동 세포계 모두에 의해 평가할 준비가 되었습니다. EGFP 유전자 단편을 합성하고 고충실도 Taq DNA 폴리머라아제를 사용하여 전방 및 역 프라이머로 조각을 증폭시한다.PCR 제품에 다음 단계에서 TA 복제를 위한 단일 3 엔드 아데닌 오버행이 있는지 확인하려면 마지막 주기 후 72도 에서 30 분 연장이 권장됩니다. 아가로즈 젤 전기포고증으로 PCR 제품을 확인하십시오. 단편이 올바르게 증폭되면, 717 bp 대역은 겔에서 관찰될 수 있다.T4 DNA 리구아제와 TA 복제 방법을 사용하여 PCR 제품을 pET SUMO 벡터로 복제한다. 30 분 동안 실온에서 반응을 배양. BL21 유능한 셀의 100 마이크로 리터에 PCR 제품의 5 마이크로 리터를 추가합니다.세포를 42도 센티미터에서 90초 동안 열충격을 가한 다음 혼합물을 얼음에 3분간 보관합니다. 37도 센티미터에서 예열된 LB 배지 400 마이크로리터를 추가합니다. 37도 센티미터와 120 rpm에서 한 시간 동안 흔들리고 있습니다.벡터 변환 된 대장균을 선별하기 위해 밀리리터 카나마이신 당 100 마이크로 그램으로 LB 플레이트표면에 박테리아를 접종합니다. 접시를 37도 센테리스 오븐에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 밀리리터 카나마이신 당 100 마이크로그램으로 LB 미디어의 5 밀리리터로 양성 식민지를 접종.2 시간 동안 120 rpm에서 37도 센티미터 의 인큐베이터 흔들어 인큐베이터에서 배양하십시오. 그런 다음 유도유당을 리터당 0.5 밀리몰의 최종 농도에 추가하고 EGFP 발현을 유도하여 6시간 동안 계속 흔들어 있다. 경험적으로, 6 시간 흔들 때, OD600에 도달 할 수있다 0.7 이상.마지막으로, 형광 현미경을 사용하여 EGFP 발현의 정도를 확인합니다. 세균 배양 배지의 마이크로리터 10마이크로리터를 슬라이드에 추가합니다. 그런 다음 커버 슬립으로 덮습니다.형광 현미경의 밑에 EGFP의 발현을 검사합니다. 증류수 100밀리리터에 3.5그램의 티오글리콜레이트를 넣습니다. 사용하기 전에 자동 복제로 살균하십시오.티오글리콜레이트 배지를 후드의 1밀리리터 멸균 주사기로 흡인시합니다. 감염을 피하기 위해 주사기 당 하나의 마우스. 23 게이지 바늘을 사용하여 마우스 복막 구멍에 3.5 %의 티오글리콜레이트 배지 1 밀리리터를 주입하고 3 일 동안 물과 음식 광고 리비툼으로 마우스를 유지합니다.3 일 후, 폐쇄 된 상자에 세보플루란에 의해 마취를 신속하게 유도 한 후 자궁 경부 탈구에 의해 마우스를 안락사. 그런 다음 마우스를 75%에탄올로 접시에 넣고 멸균하고 후드로 빠르게 옮습니다. 접시에 마우스를 놓고 마우스 위치를 수정하기 위해 보드에 전면 발을 고정합니다.20 게이지 바늘이 있는 5밀리리터 주사기를 사용하여, 하복부에 차가운 PBS 5밀리리터를 마우스 복막 구멍에 주입하여 창자에 구멍을 뚫지 않도록 하십시오. 마우스 복부의 양면에 부드러운 마사지를 수행합니다. 그런 다음 복부 액을 부드럽고 천천히 흡인시합니다.복막 유체를 50밀리리터 원심분리기 튜브에 분배합니다. 이 단계를 두 세 번 반복합니다. 4-8 센티미터에서 400g에서 10 분 동안 중단 된 세포를 원심 분리합니다.10%의 태아 소 혈청으로 RPMI 1640 배지에서 상체를 버리고 세포 펠릿을 재연한다. 유동 세포 분석 분석및 500, 000 세포당 500개의 세포를 형광 현미경을 위한 24웰 플레이트에 5백만 개의 세포를 첨가합니다. 하룻밤 사이에 5%의 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 37도 센티미터로 배양합니다.배양 배지는 이들 대부분이 림프구이기 때문에 3시간 후에 비부착 세포를 제거하기 위해 새로 고칠 수 있다. 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰하여 세포 생존력과 세포 밀도를 평가한다. 여기에 표시된 이미지는 기본 셀의 정상적인 상태였습니다.일반적으로, 대식세포 밀도는 높지 않았고, 이는 하막 세포의 주요 부분이 림프구이기 때문이다. 24웰 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 신선한 배양 배지 100 마이크로리터와 세균 성 배지 10 마이크로 리터를 추가합니다.그런 다음 1 시간 동안 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 37도 센티미터에서 플레이트를 배양합니다. 3~5회 감기 PBS 500 마이크로리터로 부드럽게 씻어 내면화되지 않은 박테리아를 씻어냅니다. 실온에서 PBS에서 4%의 포름알데히드로 세포를 30분 동안 배양합니다.PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다. P할로이딘 633 컨쥬게이트 작업 용액을 첨가하여 F-액틴을 얼룩지게 합니다. 실온에서 어둡고 습한 장소에 60분간 보관하십시오.DAPI 작업 용액을 추가하여 세포 핵을 염색하고 실온의 어두운 장소에서 5 분 동안 배양하십시오. PBS로 한 번 헹구고 증류수에서 동일한 부피를 한 번 헹구습니다. 녹색으로 표시된 EGFP 표현 E.coli는 phagocytosis의 마커역할을 했습니다.실험 오류를 최소화하고 결과를 적절하게 해석하려면 표 2에 나열된 실험에 대한 그룹 및 제어 튜브를 설정합니다. 얼음 위에 놓일 대조군의 경우, 6웰 플레이트에서 배지를 제거하고 PBS로 한 번 세척합니다. 그런 다음 리터 콜드 EDTA 1 밀리리터당 70밀리몰을 우물에 추가하여 세포를 분리하고 유동 세포측정 관으로 옮춥니다.50 마이크로리터의 세균 현탁액을 튜브에 넣고 1시간 동안 얼음 위에 놓습니다. 다른 그룹의 경우 배양 배지를 제거하고 각 웰에 1 밀리리터 신선한 배지를 추가합니다. 표 2에 설명된 바와 같이 그룹 설정에 따라 50 마이크로리터의 박테리아 현탁액을 우물에 넣습니다.그런 다음 6웰 플레이트를 37도 센티미터에 5%의 이산화탄소 인큐베이터를 1시간 동안 배치합니다. 비내부화 E.coli의 형광을 담금질하려면 0.8 %의 크리스탈 바이올렛 워터 용액 200 마이크로 리터를 우물에 넣고 곧 흔들리고 있습니다. 이 단계는 대식세포 표면에 결합하지만 내부화되지 않은 EGFP E.coli에 의한 거짓 양성 결과를 피하기 위한 것입니다.PBS로 셀을 세 번 씻아 잔류 결정 바이올렛을 제거하십시오. 그런 다음 리터 콜드 EDTA 1 밀리리터당 70밀리몰을 우물에 추가하여 세포를 분리하고 유동 세포측정 관으로 옮춥니다. 원심 분리 튜브 2, 000 rpm 5 분 및 상체를 폐기.세포를 다시 중단하기 위해 PBS의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 그룹 설정에 따라 F4 ATP 공액 항체5마이크로리터를 튜브 또는 동종타입에 첨가한다. 소용돌이는 어둠 속에서 5~10분 동안 얼음 에 샘플을 잠깐 배양합니다.각 튜브와 원심분리기 2, 000 rpm 5분에 밀리리터 PBS 1개를 추가합니다. 상부체를 폐기합니다. 유동 세포 측정 분석을 위해 PBS의 200 에서 300 마이크로 리터로 세포 펠릿을 다시 중단합니다.각 튜브를 실행하고 F4/80 양성 세포의 적어도 10, 000 이벤트에 대한 데이터를 수집합니다. 다음은 젊고 노인 집단의 복막 대식세포형형 이미지입니다. 적색 형광은 F-액틴을 나타낸다.녹색은 EGFP 표현 E.coli를 나타내고, 파란색은 DAPI에 의해 얼룩진 핵을 나타낸다. 이 심상은 젊은 마우스에서 대식세포가 숙성 마우스에서 그 보다는 더 강한 phagocytic 능력을 가지고 있었다는 것을 건의합니다. F4/80 양성 및 EGFP 양성 세포는 대식세포의 식세포 능력을 나타냈다.이러한 결과는 형광 현미경 결과의 추세와 일치합니다. 글쎄, 당신은 볼, 타고난 면역 세포의 수는 노인 마우스에서 보존 할 수 있지만, phagocytic 능력은 젊은 마우스에 비해 크게 감소. 대식세포증을 평가하기 위해 많은 방법이 사용되었습니다.여기에서 우리는 편리하고 빠르며 경제적으로 실현 가능한 개선 된 방법을 보여줍니다. EGFP 발현 E.coli를 사용하면 연구원의 선호도에 따라 유동 세포계와 형광 현미경으로 쉽게 수행하고 측정할 수 있습니다. 또한이 방법은 직접 phagocytic 능력을 측정합니다.결과는 다른 간접 적인 방법 보다 더 재현.

using-enhanced-green-fluorescence-protein-expressing-escherichia-coli

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Peyer의 패치를 다루는 전문 뿌리 - 관련 상피의 M 세포는 창자 - 관련 림프 조직에서 점막 immunosurveillance을위한 중요한 역할을한다. 여기 우리는 M 세포에 의해 세균 transcytosis에 대한 평가 방법을...

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

대 식세포는 긴 타고난 및 적응 면역 반응의 중요한 구성 요소로 인식되고있다. 대식 세포와 미생물 사이의 상호 작용의 진화 유전 적, 생화학 적 측면에 관한 지식의 최근의 폭발은 대 식세포에 과학적인 관심을 갱신했다. 이 문서에서는 마우스 골수에서 대식 세포를 구별하는 방법을 설명합니다.

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녹색 형광 단백질에 융합을 기반으로 대장균에서 재조합 막 단백질의 발현에 대한 심사에 대한 효율적인 접근 방법이 제시된다.

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Enterohemorrhagic 생물 발광 표시 된 박테리아를 사용 하 여 대장균 (EHEC) 식민지에 대 한 마우스 모델의 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 비-침략 적 vivo에서 이미징 시스템 라이브 동물에 의해 이러한 발광 박테리아의 탐지 EHEC 식민의 우리의 현재 이해를 미리 수 있습니다.

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여기는 마우스 주민 복 막 대 식 세포에 의해 회전 디스크 confocal 현미경 이미지 단일 phagocytic 이벤트를 사용 하 여 방법에 설명 합니다. 프로토콜은 다른 phagocytic 세포를 확장할 수 있습니다.

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단일 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 Efferocytosis의 정량화

여기 우리 보고 murine 치경 대 식 세포와 폐에서 세균성 클리어런스 phagocytic 기능을 분석 하는 일반적인 방법. 이러한 방법을 연구 fluorescein isothiocyanate 구슬의 생체 외에서 먹어서 및 녹 농 균 녹색 형광 단백질의 vivo에서 먹어서. 우리는 또한 쥐에 피 녹 농 균 을 삭제 하는 방법을 설명 합니다.

치경 대 식 세포 식 균 작용 및 생쥐에서 박테리아 클리어런스

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체외 전사 mRNA를 가진 1 차적인 대식세포의 고효율 형질감염

여기에서는 감염 중 병원성 박테리아를 장기 전체에서 검출하고 형광 리포터 활동을 정량화할 수 있는 절차에 대해 설명합니다.

고분해능 3차원 전장기 단층촬영(High-resolution three-dimensional whole-organ tomography of microbial infections)

이 프로토콜은 7-9일 된 신생아 마우스 골수 세포를 분리하고 L929 세포의 상층액을 과립구 집락 자극 인자(M-CSF)의 공급원으로 사용하여 분화된 대식세포를 생성하는 비효소적이고 간단한 방법을 설명합니다. 골수 유래 대식세포는 표면 항원 F4/80, CD206, CD11b 및 기능적 역량에 대해 추가로 분석되었습니다.

신생아 마우스 골수 분리 및 골수 유래 대식세포의 준비

학습하세요 EGFP 발현 대장균을 이용한 마우스 복막 대식세포 식균작용 평가 방법을. 이 프로토콜은 선천성 면역 기능 연구에 활용되며 노화와 면역 변화를 이해하는 데 기여합니다.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

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