Name: 대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 학습하세요 HIV 잠복기 역전 에이전트가 바이러스 전사 및 접합에 미치는 영향을 체외 고처리량 분석으로 평가하는 방법을. 이 기술은 잠복 바이러스 재활성화 및 제거 연구에 활용됩니다.

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이 작품 프로젝트 그랜트 APP1129320 및 호주의 NHMRC에서 프로그램 그랜트 APP1052979에 의해 지원 되었다. 우리가이 작업의 성공적인 완료를 위한 필수 구문 및 통보를 제공 하기 위한 박사 아담 틀리는, 박사 마리나 알렉산더, 박사 제니 L. 앤더슨과 미셸 Y.이 감사 합니다. 우리는 또한 그들의 조언과이 연구에 사용 된 교류 cytometer 유지에 관대 한 지원에 대 한 DMI 흐름 시설 직원을 감사 합니다.

참고: 복제에 대 한 절차, 변환 및 시퀀싱은 다른18,19논의. 본 프로토콜 transfection 포유류 식 벡터 (그림 3)에서 시작합니다.
1. 듀얼 컬러 기자와 HEK293T 세포의 transfection 구성
<ol><li>Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL) 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 보충에 HEK293T 세포 배양 녹고, 후 2-3 회 transfection에 그들을 사용 하기 전에 통행 HEK293T 세포 실험. 이 녹고 절차에서 회복 하기 위해 세포 시간을 줄 것 이다. 주의: Mycoplasma 세포 배양의 오염 심각한 문제가 남아 있습니다. 좋은 실험실 연습 및 세포 배양의 일상적인 테스트 mycoplasma 오염의 위험을 감소 하 고 유포20방지에 필수적입니다.</li>
	<li>뿌리기 전에 1:2 1 일 셀을 분할 하 고 신선한 DMEM 매체에 그들을 전송. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 육성</li>
	<li>Transfection, 전날 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 혈 청의 흔적을 제거 하려면 Dulbecco의 인산 염 버퍼 (DPBS) 염 칼슘 (캘리포니아2 +), 마그네슘 (마그네슘2 +)의 무료 셀을 세척.</li>
	<li>문화 그릇에 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 5 mL을 분배 하 고 2 ~ 5 분 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 그것을 배치.</li>
	<li>세포를 분리 하는 때 더 세포를 손상 시킬 수 있는 트립 신 활동을 억제 하기 위해 10% (v/v) FBS 보충 DMEM의 5 mL을 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 아래로 풀 헤어 셀 정지를 pipetting으로 resuspend.</li>
	<li>Trypan 푸른 얼룩 (0.4%)에 셀 1시 10분 희석.</li>
	<li>할을 차지 하지 trypan 블루 현미경 (10 x 목표)는 haemocytometer을 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>세포 수의 평균 10000 곱한 여 밀리 리터 당 가능한 셀의 수를 계산 하 고 얼룩 trypan 블루에서 희석 비율 (1:10).</li>
	<li>DMEM 매체 10% 보충의 100 μ 2 × 104 셀 접시 바닥이-96-잘 빠진 접시 24 h에 대 한 항생제 없이 FBS.</li>
	<li>각 잘 희석 400 pLTR.gp140/EGFP의 ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV 계NL4.3 및 100의 ng pCMV Tat101AD8의 ng-혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 플래그 DNA. 부드럽게 혼합. 일치 빈 문신 벡터 pcDNA3.1 (-)을 사용 하 여 문신 없이 실험에 대 한 있습니다. 참고: 내 무료 DNA의 사용이 좋습니다. 그것을 위해 내 무료 DNA midi 또는 maxiprep 핵 산 정화 키트를 사용 하 여 준비 합니다. 1.7와 1.9 사이 여야 260/280 세 비율을 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다.</li>
	<li>부드럽게 사용 하기 전에, 지질 시 약을 혼합 한 다음 희석 혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 0.65 μ. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.</li>
	<li>희석된 지질 시 약 희석된 DNA 결합 되어 있습니다.</li>
	<li>부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다. 참고: 1.15 단계를 진행 합니다. 30 분 이내</li>
	<li>100 μ 셀 위에 drop-wise 지질 시 DNA 복합물의 당 분배.</li>
	<li>접시와 락으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>
5 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
	<ol>
<li>각 반응 혼합은 단일 잘 (96-잘) transfection에 대 한 충분 합니다. 조정 금액 및 약물 및 테스트, 조합 수에 따라 부품의 볼륨 및 pipetting 변형에 대 한 계정. 모든 조건 일반적으로 triplicates에서 테스트 합니다.</li>
		<li>100 추가 우물 transfect CMV 구동 EGFP와 DsRed 익스프레스 DNA 플라스 미드 보상 목적의 ng.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transfected HEK293T의 치료 대기 시간 반전 하는 에이전트와 세포
참고: 각 분석 결과 이전 셀 확산 분석 결과와 약물의 높은 복용량에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 결정 합니다.
<ol><li>각 아이라 성장 매체와 적절 한 작동 농도를 희석 (예:, JQ1(+))에 대 한 1 μ M. 주의: 10 m m의 농도를 적절 한 용 매로 동결 건조 된 약 reconstitute 동결-해 동 주기를 반복된을 피하기 위해-80 ° C에서 모든 재고 LRAs 단일 사용 약 수 (각 5 μ)에 저장 합니다.</li>
	<li>신중 하 게 transfection 매체는 멀티 채널으로 발음 하 고 적절 한 아이라 (표 1)를 포함 하는 100 μ 중간으로 바꿉니다. 매체 문화 플레이트 표면에서 쉽게 분리 알려져 있습니다 transfected HEK293T 셀을 분리 하지 않으려면 우물의 벽 함께 매우 부드럽게를 추가 합니다.</li>
	<li>48 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어</li>
</ol>3. 교류 Cytometry 분석에 대 한 고칠 수 생존 염료와 Transfected 세포의 얼룩
주의: 죽은 세포와 파편 제거 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다.
<ol><li>잘 당 고 부드럽게 pipetting 위아래 (~ 5 번)는 다중 채널와 미디어의 볼만 피하 면 서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 μ를 사용 하 여 미디어에 셀을 분리 합니다. 필요한 경우, 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 당 35 µ L를 사용 하 여 혈 청을 포함 하는 매체와 중화 전에 37 ° C에서 5 분을 배양 접시에서 세포를 분리 합니다.</li>
	<li>96-잘 V-하단 플레이트에 셀을 전송 합니다.</li>
	<li>4 ° C에서 500 x g 에 5 분에 대 한 셀을 회전 다음 셀을 건드리지 않고 매체/PBS를 신중 하 게 발음 합니다.</li>
	<li>워시 세포 단백질/혈 청 무료 PBS의 200 μ와 적어도 1 시간.</li>
	<li>4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 centrifuge 다음는 상쾌한 접시를 기울이기 및 셀을 건드리지 않고 워시 버퍼를 제거 하 여 삭제 합니다.</li>
	<li>단백질/혈 청 무료 PBS에 생존 염료 1:1000를 diluting 하 여 고칠 수 생존 염료의 작업 솔루션을 준비 합니다. 잘 당 희석된 얼룩의 50 µ L를 준비 합니다. 참고: 생존 염료 파란색, 빨간색, 보라색 레이저와 함께 사용 하기 위해 적합 한 색상의 범위에서 사용할 수 있습니다. Resuspending 50 μ 무수 DMSO (구성 요소 B)으로 동결 건조 된 염료 (구성 요소 A)의 한 유리병으로 고칠 수 생존 염료의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 사용 하는 aliquot (1 μ 각),-20 ° C에 게는 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>각 잘을 희석된 가능성 염료의 50 μ를 추가 하 고는 멀티 채널을 위아래로 pipetting으로 세포를 혼합.</li>
	<li>얼룩 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 10-15 분.</li>
	<li>워시 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA와 PBS)의 150 μ 1-2 번 씻어.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>어둠 속에서 4 ° C에서 10-15 분에 대 한 워시 버퍼에서 갓된 1% 포름알데히드의 100 μ와 셀을 수정 합니다. 주의: 포름알데히드는 매우 독성이 있다. 피하기 위해 장갑과 보호를 위한 안전 유리를 착용 하는 동안 흡입 증기 두건에서 1% 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>워시 워시 버퍼의 100 μ로 1-2 번 셀.</li>
	<li>4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.</li>
	<li>워시 버퍼의 70 μ에 셀 펠 릿을 resuspend. 참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 고정된 셀 흐름 cytometer에 다음날 분석을 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.</li>
</ol>4. EGFP 및 DsRed Cytometry 및 데이터 분석에 의해 측정
참고: 교류 cytometer에 HIV 전사 (%EGFP) 및 접합 (DsRed %)를 분석 합니다. 70 μ m 세포-스 트레이너 또는 100 μ m 나일론 메쉬 노즐 막힘 방지를 실행 하기 전에 샘플을 필터링 합니다.
<ol><li>적어도 cytometer 및 컴퓨터를 시작 10 분 전에 워밍업 레이저를 사용 하 여.</li>
	<li>샘플을 실행 하 고 데이터 수집을 시작, 이전에 칼 집 탱크 0.9% 식 염 수 솔루션와 염소 태블릿 폐기물 탱크에 추가 되도록.</li>
	<li>기포의 흐름 셀을 확인 합니다.</li>
	<li>탐지기와 필터는 실험에 대 한 적절 한 확인 합니다. 참고: EGFP, 블루 레이저의 사용 (488 nm) 및 530/30 대역, DsRed 익스프레스 최적으로 노란 레이저를 사용 하 여 검색 하는 동안 (561 nm) 및 610/20 대역. 블루 레이저 (488 nm) 610/20 대역 또한 DsRed 식 검색을 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>Cytometer 성능 및 감도 감지기에 걸쳐 교정 비즈를 실행 하 여 확인 합니다.</li>
	<li>앞으로 조정 (FSC-A) 및 측면 (SSC-A) 분산형 전압으로는 주요 인구 화면 샘플 및 명확 하 게 뚜렷한 흠 없는. 참고: FSC (앞으로 흩어져 빛)은 빛의 측정 SSC (측면-흩어져 빛) 동안 셀 셀 면적 (크기)의 볼륨에 따라 평면 각도에서 회절은 비례 하는 직각에 광 회절 측정 셀 단위 그리고 내부 복잡성입니다.</li>
	<li>인구의 EGFP + DsRed 발견자와 반대로 최소 좀 보장 단일 스테인드 샘플을 사용 하 여 수동 또는 자동 보정을 수행 합니다. 주의: 보상으로 각 셀 단독으로 고칠 수 생존 염료와 스테인드 뿐만 아니라 단 하나 색깔 형광 성 단백질을 표현 하는 세포의 샘플을 사용 합니다. FITC와 PE 보상 구슬 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 보상 다른 스펙트럼 특성 때문에 사용 하지 마십시오. 보상 제어 충분히 밝은 긍정적이 고 부정적인 인구를 해결 해야 합니다.</li>
	<li>플롯 만들고 게이츠 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤을 사용 하 여 설정 합니다.</li>
	<li>취득 하 고 샘플 당 10000 가능한 셀 이벤트의 최소. 남자 통과 레이저 요격을 피하기 위해 중간 또는 낮은 속도로 샘플을 실행 합니다. 펄스 형상 게이팅 같은 사용 SSC-A SSC-H 남자 제거 대. 안정성 확인 SSC-A 대 시간을 그려서 실행의 어떻게 볼 흐름은 실행 하는 동안.</li>
	<li>실행의 끝에, 집중된 청소 에이전트와 교류 cytometry 응용 청소 다음 5 분 동안 물.</li>
	<li>셧다운 시스템, 폐기물을 폐기 하 고 다시 취득 후 칼 집 탱크를 채우기.</li>
	<li>교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 세포 파편과 덩어리 (남자) 앞으로 옆 분산형 기반 제외 다음 생존 색소 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포를 제거 (부정 인구 라이브 셀에 =). 접합된 제품 DsRed의 비율 뿐만 아니라 EGFP와 DsRed (그림 4), 셀을 식별 /(DsRed + EGFP) (그림 5).</li>
	<li>HIV 전사 및 치료 세포와 개인 또는 LRAs (그림 5)의 조합에 노출 하는 셀을 비교 하 여 접합에 아이라의 효과 결정 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Ex vivo 바이러스 재 활성화를 측정에 어려움을 감안할 때, 모델 시간 내내 latently 포함 HIV 대기 시간을 공부 하기 위하여 개발 되었다 생체 외에서 다양 한 범위의 감염 T 세포-라인 (J-라트, ACH2, u 1), (휴식의 잠재 감염의 기본 모델 O'Doherty, Lewin, 그린 및 Spina 모델) 또는 미리 활성화 된 CD4 + T 세포 (Sahu, 마리니, Planelles, Siliciano, 깐 모델) 단일 라운드 또는 복제 유능한 기자 바이러스22. HIV CD4 + T 세포 휴식에서 대기 하는 시간의 생리 적 상태를, 듀얼 형광 기자 시스템 LTR 기반 개 그-eGFP 마커 및 장소에 CMV 구동 mCherry 이반 사도 스키의 그룹에 의해 개발 된 RGH (빨강-녹색-HIV) 기자 등 일어 났 죠 Nef23의. 비슷한 컬러 듀얼 기자 바이러스, 듀오-Fluo, LTR 구동 EGFP 식와 EF1α 발기인<su...

효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포1에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ' 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포4,,56,7 ,8. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5' LTR 억압 고 에이즈 식9,10,11,,1213의 활성화. 그러나 Ex vivo14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.
에이즈 식 비효율적인 접합16 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)17의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.
여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3' 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장18아미노산 38에 레 브의 2nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.

<table><tbody><tr><td><강>세포 배양</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T 세포(인간 배아 신장 세포)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>SV40 복제 영역을 운반하는 벡터를 복제합니다.</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate</td></tr><tr><td>Fetal Bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>원산지 호주</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue stain, 0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), 페놀 레드</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Lipid transfection reagent</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) reduced serum medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>무 혈청 배지</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 플라스미드</td><td>클론텍 (TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>포유류 세포에서 EGFP의 발현, CMVIE promoter.</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech(TaKaRa)</td><td>632429</td><td>포유류 세포에서 DsRed-Express의 발현, CMVIE promoter.</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFP. RevD38 / DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td> <td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1 (+)</td> <td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>DMSO에서 10 mM 재고; 작업 농도 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JQ1 (-)</td> <td>케이맨 화학</td><td>물질 11232</td><td>DMSO에서 10 mM의 재고; 작업 농도 1 &mu; M</td></tr><tr><td>Phorbol Myristate 아세테이트 (PMA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>100 &mu에 재고; DMSO의 g/mL; 작업 농도 10 nM</td></tr><tr><td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td> <td>Remel</td><td>HA15 / R30852701</td><td>1 &mu 재고; 지/&무; PBS의 L; 작업 집중 10 &Mu; g / mL</td></tr><tr><td>Vorinostat (VOR)</td> <td>케이맨 화학</td><td>10009929</td><td>DMSO에서 10 mM의 재고; 작업 농도 0.5 &mu; M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td></td><td>P180500 DMSO에서 10 mM의 재고; 작동 농도 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>Mycoplasma Detection Kit, PCR 기반</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</td></tr><tr><td>유세포 분석 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석기 (4 레이저 - 파란색, 빨간색, 보라색 및 노란색)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>유세포 분석기 (3 레이저 - 파란색, 빨간색 및 보라색)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정성 근적외선 데드 세포 염색 키트</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>생존도 염료: 633 또는 635nm 여기용, 400 분석. 구성 요소 A와 B는 모두 키트에 제공됩니다.</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS& T Research Beads</td><td>BD Biosciences</td><td>655050</td><td>캘리브레이션 비드</td></tr><tr><td>Sphero Rainbow Calibration Particles(8 피크)</td><td>BD Biosciences</td><td>559123</td><td>3.0 - 3.4 mm</td></tr><tr><td>Sheath solution</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g NaCl in 10 L</td></tr><tr><td>water HAZ-Tabs</td><td>Guest Medical</td><td>H8801</td><td>소독용 염소 방출 정제</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 솔루션 Decon 90 5%.</td></tr><tr><td>차아염소산나트륨 (12-13% 용액)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 용액 표백제 1 %.</td></tr><tr><td>7x</td><td>MPBio</td><td>IM76670</td><td>유세포 분석기의 농축 세척제. 작업 솔루션 7x 1%.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plasks (75 cm2, canted neck, cap vented)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 플레이트(96웰 플랫 바닥) 뚜껑 포함)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (10 mL)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>원심분리기 튜브 (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Serological 피펫(25 mL), 멸균</td><td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫(10 mL), 멸균</td><td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>혈청 피펫(5 mL), 멸균</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>시약 저장용기(50 mL), 멸균</td><td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 셀 스트레이너 캡</td><td>포함 Corning</td><td>352235</td><td>12 x 75mm 스타일, 70mm</td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100mm</td></tr><tr><td>적정 튜브 마이크로 시험관, 벌크</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>마이크로 튜브</td></tr><tr><td>5mL 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관, 캡 없음</td><td>Corning</td><td>352008</td><td>12x75mm 테스트 튜브용 12x75mm</td></tr><tr><td>스타일 스냅 캡</td><td>Corning</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>계수 챔버, Neubauer는 이중 그물 룰링, 브라이트 라인 (적혈구계, LO-Laboroptik)</td> <td>ProSciTech</td><td></td><td>SVZ4NIOU 1mm의 3x3 큰 사각형2; 깊이 0.100mm; 부피 0.1 mL; 최소 면적 0.0025 mm2</td></tr><tr><td>Coverslips (Menzel-Gl&auml; ser)</td><td>Grale Scientific</td><td>HCS2026</td><td>20 x 26 mm</td></tr><tr><td>현미경</td>, <td>Nikon TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5810R, 냉장</td><td>Eppendorf</td><td>5811000487</td>, <td>로터 A-4-81 포함, 15/50 mL 코니컬 튜브용 어댑터</td></tr>, <tr><td>FLUOstar Omega microplate reader</td>, 세포 증식 분석용 <td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>Plate reader. 필터 490nm.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow Cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>유세포 분석기 데이터 분석 프로그램, FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar 다중 사용자 리더 제어, 버전 5.11</td></tr><tr><td>Omega - 데이터 분석</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><td>FLUOstar 데이터 분석, 버전 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Excel:mac 2011</td><td>버전 14.0.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>버전 7.0c</td></tr></tbody></table>

대기 시간 반전 hiv 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV에 안정적이 고 잠재적인 바이러스, 면역 체계에 보이지 않는 유지 하 고 현재 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 의해 타겟이 되지 형태의 항구 셀의 저수지의 존재 때문에 불 치이 남아 있다. 전사 및 접합 CD4 + T 세포 휴식에서 HIV-1 대기 시간을 강화 하기 위해 표시 되었습니다. 대기 시간 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) "충격 및 죽이기" 접근의 사용에 의해의 반전이이 저수지를 제거 하기 위해에서 광범위 하 게 공부 하고있다 하지만 있다 지금까지 표시 되지 않습니다의 적절 한 개발의 부족으로 인해 임상 시험에 있는 성공 분자가이 저수지를 교란 효율적으로 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에는 안정적이 고 효율적으로 HIV 전사에 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) 평가 및 접합 방법을 제공 한다. 이 방법은 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 동시에 전사 및 접합에 아이라의 효과 측정할 수 있는의 사용 cytometry에 의해을 기반으로 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부착 셀에에서 셀에 대 한 적절 한입니다. 그것은 높은 처리량의 시스템에서 약물의 많은 수를 테스트 하기 위한 유용 합니다. 메서드는 기술적으로 구현 하는 간단 하 고 비용 효율적인. 또한, cytometry 사용 세포 생존 능력의 평가 허용 하 고 따라서 동시에 독성 약물.

에이즈-1의 표현 (EGFP) unspliced 및 bromodomain 억제제 JQ1와 치료 다음과 (DsRed) 제품을 접합에 대 한 대표적인 결과 그림 5 에 나와 있습니다. JQ1(+)와 문신 크게 EGFP 표현 세포의 비율 증가 (2.18 및 4.13 FC DMSO에 각각; n = 3) unspliced 성적 지표. 또한, JQ1(+) 크게 접합된 제품 (7.37 FC DMSO에) 문신으로 비슷한 레벨의 비율 뿐만 아니라 DsRed (46.6 FC DMSO에)를 표현 하는 세포의 백분율을 증가 (59.6 및 5.83 FC DMSO, 이상 각각) JQ1(+)의 능력을 확인 HIV 전사 및 접합 설정 하려면 다른 한편으로, stereoisomer 제어 JQ1(-)와 치료 곧 에이즈 전송 및 프로토콜의 성공을 확인 접합에 JQ1(+) 효과.
<p class="jove_content" fo:keep-toget...

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

이 절차의 전반적인 목표는 시험관 내, HIV mRNA 처리에 대기 시간 반전 에이전트의 충격을 평가하는 것입니다. 이 프로토콜은 LRA가 HIV 전사 및 접합에 미치는 영향을 동시에 평가하기 위한 간단효율적이고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 LA가 잠복 저장소의 바이러스 재활성화 및 허가를 유도하는 능력에 대한 통찰력을 제공했습니다.세포를 재배한 후, DMEM 배지 100마이크로리터에 20, 000을 배치하고, 10%의 FBS로 보충하고, 96웰의 평평한 바닥 판의 우물에 항생제없이 24시간 동안 배치한다. 다음날 이중색 기자 구도가 희석됩니다. Tat와 Rev DNA는 무혈제 배지 50 마이크로리터로 부드럽게 섞습니다.지질 시약을 부드럽게 혼합한 다음 반응당 0.65 마이크로리터를 혈청 프리 배지 50마이크로리터에 희석시 희석시. 부드럽게 섞고 실온에서 5분간 배양합니다. 희석된 지질 시약을 희석된 DNA와 결합하고 부드럽게 섞습니다.실온에서 20분 동안 배양하세요. 그런 다음, 이 지질 시약 DNA 복합체의 100 마이크로리터를 각 우물의 세포 위에 현명하게 떨어뜨리는 것을 분배합니다. 접시를 부드럽게 앞뒤로 흔들어 섞습니다.그리고 가습 된 인큐베이터에서 접시를 5 시간 동안 5 %의 이산화탄소와 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그 후, CMV 구동 EGFP의 100 나노그램을 가진 추가 우물과 DsRed는 보상 목적을 위해 DNA 플라스미드를 표현합니다. 시작하려면 각 대기 시간 반전 에이전트를 성장 매체를 사용하여 적절한 작업 상태로 희석합니다.다중 채널 파이프 헤드를 사용하여, 조심스럽게 트랜스퍼션 매체를 흡인하고, 적절한 대기 시간 반전제를 포함하는 매체의 100 마이크로리터로 교체한다. 가습 된 인큐베이터에서 37 %의 섭씨37 %의 이산화탄소를 48 시간 동안 배양하십시오. 세포를 염색하기 시작하려면 다중 채널 파이프 헤드를 사용하여 각 웰에 100 마이크로리터의 PBS를 추가합니다.머리를 약 5회 위아래로 부드럽게 파이프합니다. 세포가 미디어로 분리되는 거품을 피해야 합니다. 다음으로, 세포를 96웰 V-하단 플레이트의 우물로 옮킨다.원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 세포를 건드리지 않고 배지와 PBS를 흡인합니다. 단백질과 세럼 무료 PBS의 200 마이크로 리터와 함께 적어도 한 번 세포를 씻어.원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간. 접시를 기울여 상체를 버리고 셀을 건드리지 않고 세척 버퍼를 제거합니다. 이 후에 단백질 및 혈청 무료 PBS에서 고정 생존성 염료를 1 대 1000의 비율로 희석시키고, 작업 용액을 준비한다.각 우물에 희석 된 염료50 마이크로 리터를 추가하고 파이프 헤드를 위아래로 섞습니다. 섭씨 4도에서 배양하십시오. 10~15분 동안 호일을 사용하여 빛으로부터 보호합니다.그런 다음 세척 버퍼 150 마이크로 리터로 세포를 한두 번 씻으면 씻습니다. 그 후, 원심분리기는 중력500배, 섭씨 4도에서 5분간, 상수부를 폐기한다. 세포를 고치려면 새로 준비된 1% 포름알데히드의 마이크로리터 100마이크로리터를 추가하고 버퍼를 세척합니다.그리고 10~15분 동안 빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 배양합니다. 그 후, 세척 버퍼 의 100 마이크로 리터와 함께 한 두 번 세포를 씻어. 원심분리기는 중력의 500배, 섭씨 4도에서 5분간.상체를 버리고, 세척 버퍼의 70 마이크로 리터에서 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 교정 구슬을 실행하여 사이토미터 설정 성능과 감도를 확인한 후, 스테인드 샘플로 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 주 인구가 화면에 있고 명확하게 식별할 수 있도록 합니다. 단일 스테인드 샘플을 사용하여 수동 또는 자동 보정을 수행하여 EGFP 양성 집단을 DsRed 검출기로 최소한의 유출을 보장하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.형광을 사용하여 하나의 컨트롤을 뺀 다음 플롯을 만들고 게이트를 설정합니다. 다음으로, 주 인구가 화면에 있고 명확하게 식별할 수 있도록 스테인드 샘플로 전방 및 측면 분산 전압을 조정합니다. 샘플당 최소 10, 000개의 실행 가능한 셀 이벤트를 획득하고 기록합니다.그런 다음 흐름 세포 측정 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 데이터를 분석합니다. HIV-1, 결합되지 않은 및 접합 제품의 발현을 위한 대표적인 결과는 브로모도메인 억제제 JQ1로 치료한 후 JQ1 양성 및 Tat 모두 EGFP를 발현하는 세포의 비율을 크게 증가시키는 것을 보여줍니다. 이는 접합되지 않은 성적 증명서를 나타냅니다.JQ1 양성도 DsRed를 표현하는 세포의 비율을 크게 증가시키는 것으로 보입니다. 그리고 Tat와 유사한 수준으로 접합 제품의 비율을 증가. 이것은 JQ1 의 능력을 확인 HIV 전사및 접합에 설정하는 긍정적 인.그러나, 스테레오소머 제어 JQ1 음성치료, HIV 전사 및 접합에 대한 JQ1 양성 효과를 폐지한다. 일단 마스터되면, 이 방법은 개별적으로 또는 조합하여 약물을 사용하여 수행 될 수있다. 효율적으로 시너지 효과를 낼 수 있는 능력에 대한 테스트.이는 약물과 독성의 낮은 복용량으로 이어질 것입니다. 각 개발 후, 이 기술은 전 생체 내 환자 샘플에서 대기 시간의 기본 모델에서 효율적인 약물 조합을 테스트하기위한 길을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Uncoating는 HIV - 1 수명주기의 초기 단계에 필수적인 단계이며 capsid 쉘의 해체와 바이러스 ribonucleoprotein 복합 (vRNP)의 출시로 정의됩니다. 여기, 우리는 HIV - 1 virions에서 그대로 코어를 분리 및 그들의 uncoating을 quantifying 기술을...

HIV - 1 코어의 시험 관내 Uncoating에서

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

여기에서 우리는 세포 독성을 설명하고 화합물의 신속하고 정확한 검사를 허용 한 라운드 감염의 분석은 세포 독성 (CC 50)을 결정하고, WT 및 약물 HIV-1 저항에 대한 IC 50 값.

HIV 역전사 및 인테그라 제 억제제의 빠른 검사

HIV-1 발병기전은 바이러스 특성과 숙주 유전적 요인에 의해 정의됩니다. 여기에서는 gag 유전자 염기서열 변이가 바이러스의 체외 복제 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 재현 가능한 측정을 할 수 있는 강력한 방법을 설명합니다.

제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해<em&gt; 시험관</em&gt; HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

감염된 세포의 게놈 DNA에서 레트로바이러스 통합 부위를 증폭하고, 증폭된 바이러스-숙주 접합부를 염기서열분석한 다음, 이러한 염기서열을 참조 게놈에 매핑하는 프로토콜을 설명합니다. 또한 BEDTools를 사용하여 다양한 게놈 주석과 관련된 통합 부위의 분포를 정량화하는 기술에 대해서도 설명합니다.

레트로 바이러스 통합 사이트의 증폭, 차세대 시퀀싱 및 게놈 DNA 매핑

HIV-1 복제 주기의 통합 후 단계를 표적으로 하는 RNA 분자의 효능 및 독성을 평가하는 방법이 설명되어 있습니다. 이러한 방법은 새로운 분자를 스크리닝하고 기존 분자의 형식을 최적화하는 데 유용합니다.

유전자 또는 약물 치료에 사용하기 위해 HIV-1 생산을 표적 RNA를의 효능 및 독성 평가

이 보고서는 급성 감염 세포의 세포질 추출물에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1) 사전 통합 복합체(PIC) 관련 통합 활성을 측정하기 위한 체외 분석에 대해 설명합니다. PIC 관련 HIV-1 DNA를 이종 표적 DNA에 통합하는 것은 중첩된 실시간 중합효소 연쇄 반응 전략을 사용하여 정량화됩니다.

측정 체외 HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

우리 보고 에이즈-1 융합 통해 녹색 형광 단백질 감지 식 교류 cytometry 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 세포 기반 분석 결과 설명 합니다. 그것은 셀 및 셀 감염 시스템에서 (특히에서 융해 단계) 바이러스 항목의 억제제를 테스트를 사용할 수 있습니다.

높은 처리량 Cre Lox 활성화 에이즈-1 바이러스 막 융해의 억제제를 식별 하기 위해 바이러스 막 융합 분석 결과

이 프로토콜 신생아 NSG 쥐 방사선 조절로 인간 조 혈 줄기 세포의 intrahepatic 주입을 통해 humanized 쥐 (hu-NSG)를 설정 하는 방법을 제공 합니다. Hu NSG 마우스 HIV 감염 및 조합 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 취약 하 고 HIV 복제 및 대기 시간 조사에 대 한 적합 한 병 태 생리 모델 역할.

HIV 복제 및 대기 연구를 위한 인간 답게 끄 덕/SCID/IL2rγnull (hu-NSG) 마우스 모델

여기 우리는 초기 3'-테르미니의 공평한 결정 뿐만 아니라 단일 가닥 DNA 분자의 mutational 프로필을 제공 하는 깊은 시퀀싱 방법을 제시. 주요 응용 프로그램은 초기 retroviral 보완 DNAs (cDNAs) retroviral 반전 녹음 방송 과정 중에 생성 된 중간체의 특성 이다.

결정 3'-테르미니와 에이즈-1 중 초기 단일 가닥 바이러스 성 DNA 분자의 순서 반대로 감염 된 세포에서 전사

여기에서는 특히 HIV-1 감염에 중점을 두고 소포체(ER) 스트레스 및 풀린 단백질 반응(UPR) 활성화를 측정하기 위한 몇 가지 확립된 방법에 대해 설명합니다. 이 기사에서는 또한 ER 스트레스/UPR이 HIV-1 복제 및 바이러스 감염성에 미치는 영향을 조사하기 위한 일련의 프로토콜에 대해 설명합니다.

HIV-1에 감염된 T 세포에서 소포체 스트레스 및 풀린 단백질 반응을 측정하고 HIV-1 복제에서 그 역할을 분석합니다.

학습하세요 HIV 잠복기 역전 에이전트가 바이러스 전사 및 접합에 미치는 영향을 체외 고처리량 분석으로 평가하는 방법을. 이 기술은 잠복 바이러스 재활성화 및 제거 연구에 활용됩니다.

대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

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