Name: 회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: 배우세요 회전 디스크-TIRF 현미경법을 이용한 세포 접착 형성의 고급 시각화 기술을. 이 방법은 세포막 단백질의 정밀한 위치 파악과 살아있는 세포의 3차원 동역학 연구에 활용됩니다.

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우리는 크게 과학계를의 대학 의료 센터 함부르크-Eppendorf 샘플을 평가 대 한 우리를 지원 하기 위한 감사 합니다. 즉, 우리 사 빈 Windhorst NIH3T3 세포, YFP-Vinculin에 대 한 안드레아 Mordhorst와 RFP Lifeact에 대 한 마 렌 루돌프에 대 한 감사합니다.

1입니다. 셀의 준비
<ol><li>실험에 앞서 2 일 씨 2 ml 당 6-잘 세포 배양 접시의 가득 차 있는 성장 매체의 3 * 105 헬러 또는 NIH3T3 세포. 셀이이 프로토콜을 통해 층 류 두건에 처리 됩니다 확인 하십시오.</li>
	<li>실험 전에 언젠가 경험적으로 결정된 프로토콜 예:또는 제조업체의 권장 사항을 transfection 시 약 준비:<ol>
<li>RFP Lifeact의 1 µ g을 희석 하 고 1 µ g YFP Vinculin의 200 µ L의 총에서 감소 혈 청 매체. 소용돌이 transfection 시 간단히, 추가 4 µ L 200 µ L DNA와 소용돌이를 다시 합니다. 실 온에서 15-20 분 transfection 믹스를 품 어.</li>
		<li>셀에 직접 dropwise 전체 transfection 믹스를 추가 합니다. 접시를 흔들어 혼합 하 고 다시는 인큐베이터에 배치.</li>
	</ol>
</li>
	<li>실험 당일, 라이브 영상에 대 한 샘플을 준비:<ol>
<li>Fibronectin 코트 35 m m 유리 하단 접시의 유리 표면에 PBS에의 10 µ g/mL 솔루션을 준비 합니다. TIRF 성능 최적화를 위해 고품질 0.17 m m 유리 coverslips만을 사용 하 고 플라스틱 하단 요리를 피하십시오. 실 온에서 30 분은 다음 그것을 제거 하 고 하자 접시 건조 솔루션 유리 표면에 둡니다.</li>
		<li>증류수에 mL 당 109 입자 x 1.8 밀도 0.1 µ m 다중 형광 구슬 솔루션을 희석 하 고 fibronectin 코팅 유리 표면에 30-60 s에 대 한 솔루션을 추가 합니다. 즉시 솔루션을 제거 하 고 건조 하는 게 요리. 참고:이 단계는 세포를 뿌리기 전에 또는 비드 기반 이미지 등록 2 색 참조 이미지를 얻으려고 TIRF 비행기를 찾을 수 있어야 하는 경우에 필요.</li>
		<li>0.1 m M ascorbic 산 (AA) 솔루션을 준비 하 고 성장 매체 (금주 모임-매체)에 0.1 m m의 최종 농도에 희석. 37 ° C 물 욕조에 솔루션 장소. 참고: 사용 하 여 형광 최적화 된 세포 배양 가능 하면 같은 phenolred-무료 (ribo-) 플 라빈 감소 매체. AA는 안티 산화 에이전트 라이브 이미징14동안 phototoxic 효과 줄일 수 있습니다. 우리는이 분석 결과, 즉 더 많은 세포 보다 AA 추가 없이 적용 하는 조건 하에서 건강 한 등장에 그것을 성공적으로 테스트 했습니다. 그러나, 매체의 pH 0.17 pH 단위에 의해 낮아졌다.</li>
		<li>2 mL PBS로 세포 세척, 추가 250 µ L 트립 신-EDTA와 대기 셀 때까지 완전히 분리 (37 ° C 배양 기에서 2-3 분). Resuspend 셀 1 mL에 신중 하 게 미리는 피 펫과 AA-매체를 예 열 하 고 15 mL 셀 문화 관에서 4 mL AA 매체에 추가. 현미경 주변 37 ° C, 5% CO2 로 설정 하는 인큐베이터에 약간 열린된 뚜껑으로 세포 현 탁 액을 넣습니다.</li>
		<li>1 mL 중 유리 하단 접시에 AA-매체를 예 열 하 고 미리가 열된 현미경의 소유자에 추가 (다음 단락 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 라이브 영상
<ol><li>안정적인 37 ° C, 5% CO2 와 습 한 분위기를 달성 하기 위해 현미경의 환경 제어를 시작 합니다. 참고: 여기, 작은 무대 최고의 보육 실 사용 되었습니다 약 15 분 더 큰 부 화기 내의 허용된 안정적인 설정을 안정 조건 달성 하기 위해 더 많은 시간이 필요 합니다.</li>
	<li>셀 서 스 펜 션 적용 되기 전에 모든 수집 설정을 현미경에서 수정:<ol>
<li>30 시간 간격 설정 s 및 60-90 분에 기간 하드웨어 기반 자동-초점의 모든 시간 포인트 (값 "1")에 대 한 자동 초점 기능을 활성화.</li>
		<li>카메라 노출 및 이득, 뿐만 아니라 모든 채널에 대 한 레이저 파워를 조정 합니다. 수준 높은 이득, 낮은 노출 시간 및 낮은 레이저 힘은 사진 독성을 줄이기 위해 추천. 참고: 여기에 제시 된 데이터는 200 ms 노출 인수 되었다, 레벨 500 20% 레이저 전력 0.5 W/² 488 대의 여기 농도 같게 하 이득 및 561 대 1 W/² nm, 각각.</li>
		<li>0.4 µ m 간격을 가진 10 µ m z-스택 회전 디스크 채널에 대 한 설정 합니다. -Z-스택 TIRF 채널에 대 한 활성화 합니다. "0", 즉 낮은 비행기로 맨 아래 오프셋 설정의 하드웨어 자동 초점 초점 위치 될 것입니다.</li>
		<li>멀티 포인트 기능 "무대 위치"를 활성화 합니다. 참고: 3 순위까지 기록할 수 있습니다 30 s 시간 간격.</li>
	</ol>
</li>
	<li>눈에서 또는 컴퓨터 화면에 피 형광 조명 형광 구슬 찾기 다음 하나의 TIRF 채널을 활성화 하 고 TIRF 조명을 나타내는 값으로 조명 각도 설정. 현미경 패널에 버튼을 누르면 자동 초점을 활성화 하 고 오프셋 휠 초점을 조정 합니다. 2 색 데이터 집합, 즉 TIRF-488 및 취득 TIRF-561, 후속 구슬 기반 이미지 등록 (참조 3.1 포인트).<ol>
<li>선택 사항: TIRF 조명, 추가 자유롭게 떠 있는 형광 색 구슬 서 스 펜 션의 몇 가지 microliters (참조 포인트 1.3.2.). TIRF 채널의 라이브 뷰를 활성화 하 고 조명 각도 증가. 비 점착 구슬 올바른 TIRF 조명8를 보장 하는 중요 한 각도 넘어 사라질 것 이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>다시 반전 닫힌된 튜브, 2-3 시간 여 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 이미징 접시에 셀의 1 mL를 적용.</li>
	<li>신속 하 게 낮은 수준의 피 형광 조명 더블 페 셀을 찾을. 밝은 분야 조명을 사용 하 여 라이브 카메라 미리 보기에 있는 셀을 중심 하 고 위치를 표시 합니다. 관심의 또 다른 1 2 포인트를 찾아서 위치 목록에 저장. 참고: 처음부터, 셀 쉽게 수 분리 단계 운동으로 인해, 따라서 4-5 위치를 설정 하 고 모든 이미지 수집을 시작 하기 전에 다시 확인. 그 후, 1-2 위치를 삭제 합니다.</li>
	<li>"순서" 단추를 클릭 하 여 데이터 수집을 시작 합니다.</li>
</ol>3. 이미지 후 처리 ImageJ에
<ol><li>피지15등록 무료 hyperstack를 생성 하려면 "SD-TIRF_helper" 라는 매크로 2-4 채널 SD TIRF timelapse 데이터 집합에 적용할 수 있는 작성 되었습니다. 하위 폴더 "매크로"는 피지에서 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" 파일을 저장 하 고 메뉴 명령을 클릭 하 여 매크로 실행 "플러그인 > 매크로 > 실행...".<ol>
<li>색상 채널 등록 수정 필요, 옵션을 선택 하 고 새로운 비드 기반 등록 기준 (랜드마크 파일) 만들거나 하기 전에 만든 기존 파일을 사용 하 여. 참고: turboreg 플러그인16 형광 구슬 참조 이미지에 적용 됩니다. 플러그인 설치에 대 한 일반적인 지침에 따르면 피지 소프트웨어에 플러그인을 설치 합니다.</li>
		<li>바이오-형식 가져오기 도구를 사용 하 여 데이터를 가져올 하 고 보기 옵션으로 hyperstack를 선택 합니다. 이미지 데이터 집합 로드, 첫 번째 단계와 두 번째 단계에서 TIRF 시리즈에서 SD 시리즈를 선택 합니다. 피지는 채널 및 무대 위치, 즉, 일반적으로 모든 SD 채널 및 모든 TIRF-채널 선정 되었습니다 모든 단계 위치에 대 한 hyperstack로 표시 하 여 정렬 하는 데이터를 표시 합니다. 참고: 데이터 가져오기는 다양 한 파일 형식에서 가능한 예를 들어 TIFF-시리즈 또는 플랫폼 종속 파일과 같은 형식이 *.nd. 파일 형식은 하지 수집 소프트웨어 독립, 압축 없는 TIFF 형식으로 내보낼 경우에 인정 될 수 없습니다.</li>
		<li>미리 정해진된 랜드마크 파일을 로드 하 여 해당 채널을 등록 수정을 적용 됩니다.</li>
		<li>SD-그리고 TIRF 모든 채널에 대 한 원하는 색상 룩 업 테이블 (LUT)을 선택 하 고 단일, 다차원 hyperstack에 그들을 병합. 참고: TIRF 채널의 처리, 중 수 0 강도 값과 z-비행기 z-비행기 SD 데이터 집합의 수와 일치 하는 플레인 위에 추가 됩니다. 이 단계는 최종 hyperstack의 시각화에 대 한 중요 한. 이 방법론은 TIRF 조명의 깊이부터 올바른, (200nm7미만) SD 스택 z 단계 크기 보다 작습니다 (400 nm).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission%3A+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Letters%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Optics Letters. 19 (11), 780(1994).</li>
<li>Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> Journal of Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), New York, N.Y. 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophysical Journal. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+%28STORM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nature methods. 3 (10), 793-796 (2006).</li>
<li>van de Linde, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+with+standard+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes.</a> Nature protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).</li>
<li>Zobiak, B., Failla, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+spinning+disk-TIRF+microscopy+for+faster+imaging+of+the+cell+interior+and+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Advanced spinning disk-TIRF microscopy for faster imaging of the cell interior and the plasma membrane.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 282-290 (2018).</li>
<li>Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+with+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+for+the+cell+biologist%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist.</a> Journal of Cell Science. 123 (21), 3621-3628 (2010).</li>
<li>Burchfield, J. G., Lopez, J. A., Vallotton, P., William, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exocytotic+vesicle+behaviour+assessed+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exocytotic vesicle behaviour assessed by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Traffic. 11 (4), 429-439 (2010).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy.+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy. present technology and future trends.</a> Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228 (3), 390-405 (2007).</li>
<li>Trache, A., Lim, S. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+microscopy+for+real-time+imaging+of+mechanotransduction+studies+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Integrated microscopy for real-time imaging of mechanotransduction studies in live cells.</a> Journal of Biomedical Optics. 14 (3), 034024(2009).</li>
<li>Stehbens, S., Pemble, H., Murrow, L., Wittmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+protein+dynamics+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy.</a> Methods in Enzymology. , 293-313 (2012).</li>
<li>Waldchen, S., Lehmann, J., Klein, T., Van De Linde, S., Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+cell+damage+in+live-cell+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-induced cell damage in live-cell super-resolution microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 1-12 (2015).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Image+Processing%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li>
<li>Partridge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+attachment+and+generation+of+mature+focal+adhesions+by+integrin-containing+filopodia+in+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of attachment and generation of mature focal adhesions by integrin-containing filopodia in cell spreading.</a> Molecular Biology of the Cell. 17 (10), (2006).</li>
<li>Dubin-Thaler, B. J., Giannone, G., Döbereiner, H. G., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanometer+analysis+of+cell+spreading+on+matrix-coated+surfaces+reveals+two+distinct+cell+states+and+STEPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Nanometer analysis of cell spreading on matrix-coated surfaces reveals two distinct cell states and STEPs.</a> Biophysical Journal. 86 (3), 1794-1806 (2004).</li>
<li>Choi, C. K., Vicente-Manzanares, M., Zareno, J., Whitmore, L. A., Mogilner, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+and+%CE%B1-actinin+orchestrate+the+assembly+and+maturation+of+nascent+adhesions+in+a+myosin+II+motor-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin and α-actinin orchestrate the assembly and maturation of nascent adhesions in a myosin II motor-independent manner.</a> Nature Cell Biology. 10 (9), 1039-1050 (2008).</li>
<li>Bachir, A. I., Zareno, J., Moissoglu, K., Plow, E. F., Gratton, E., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-associated+complexes+form+hierarchically+with+variable+stoichiometry+in+nascent+adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-associated complexes form hierarchically with variable stoichiometry in nascent adhesions.</a> Current Biology. 24 (16), 1845-1853 (2014).</li>
<li>Sun, Z., Guo, S. S., Fässler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin-mediated+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Integrin-mediated mechanotransduction.</a> Journal of Cell Biology. 215 (4), 445-456 (2016).</li>
<li>Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustafsson, M. G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+3D+microscopy+of+live+whole+cells+using+structured+illumination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1044-1046 (2011).</li>
<li>Chen, B. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lattice+light-sheet+microscopy%3A+Imaging+molecules+to+embryos+at+high+spatiotemporal+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution.</a> Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).</li>
<li>Fu, Y., Winter, P. W., Rojas, R., Wang, V., McAuliffe, M., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+superresolution+via+multiangle+TIRF+microscopy+with+sequential+imaging+and+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Axial superresolution via multiangle TIRF microscopy with sequential imaging and photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (16), 4368-4373 (2016).</li>
<li>Boulanger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+high-resolution+3D+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+by+incidence+angle+scanning+and+azimuthal+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fast high-resolution 3D total internal reflection fluorescence microscopy by incidence angle scanning and azimuthal averaging.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (48), 17164-17169 (2014).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

이 문서에서 라이브 셀 이미징 실험, 즉 높은 수집 속도 3 다른 단계에 분당 2 SD TIRF 이미지 스택 등을 수행 하기 위한 적절 한 구성에서 SD 및 TIRF 현미경의 첫번째 성공적인 구현을 제시 했다 위치, 해당 총 168 프레임 (약 3 프레임 / 초), 하 인수 했다. 했다 몇 SD TIRF 현미경12,13, 주로는 3D에서 세포 프로세스에 따라 충분히 높은 이미징 속도의 부족을 설명한 미만 2의 시간적 해상도 이미지 스택 당 s는 경우가 많습니다. 제시 설치 이미징 최고 초당 0.78 이미지 스택 3.5의 얻을 수 있습니다 3D 기 역학 조사 되었습니다 라이브 실험에 큰 이미지 스택 당 s7을 시연 했다. 또한, 이전 SD TIRF 현미경 이미징 모드, 다중 채널 인수에 대 한 속도 더 줄여 당 하나의 감지기를 했다. 기술적으로, 분할 보기 구성을 구현...

우리의 일, 가벼운 현미경 검사 법 기술 고정에 높은/슈퍼 해상도 이미징 및 살아있는 견본을 제공 하는 급속 하 게 개발 하고있다. 와 같은 슈퍼 해상도 기법 자극 방출 소모 (호텔 위치), 구조화 조명 현미경 (SIM) 및 사진 활성화 지역화 현미경 (팜) 또는 직접 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍), 각각, 있다 상업적으로 사용할 수 있는 활성화의 subcellular 구조는 분자 규모1,2,3,4,,56에 거의 정보를 보여주는 영상. 그러나,이 접근 아직도 있는 대용량 두 번째 수집 속도 여러 프레임 구상 될 필요가 라이브 이미징 실험에 대 한 적용을 제한 했다. 원형질 막, 예를 들어 엔도-를 통해 규제 하는 매우 동적 프로세스의 다양성 / exocytosis, 접착, 마이그레이션 또는 신호, 고속 대용량 세포 내에서 발생. 최근,이 격차를 채우기 위해 통합된 현미경 검사 법 기술이 했다 제안된 라는 회전 디스크-TIRF (SD-TIRF)7. 자세하게, TIRF 현미경 특별히 분리와 원형질 막8,9지역화, SD 현미경 검사 법은 가장 중요 한 중 하나 빠른 라이브 이미징 기술을 시각화 및 추적에 대 한 허용 세포질10,11subcellular 세포. 그러나 단일 설치에 두 이미징 기술 조합 지난12,13에서 이미 실현 되어,, (그림 1)을 여기에 제시 된 현미경은 마침내 라이브 이미징 SD TIRF 실험을 수행 하 기준을 충족합니다 두 번째 속도 초당 3 프레임에서 상기 프로세스. 이 현미경 상업적으로 사용할 수 있기 때문에,이 원고의 목표 세부 사항에서 설명 하는 이미지 수집, 등록, 및 시각화 SD TIRF 현미경과 관련 된 오픈 소스 도구와 프로토콜을 제공입니다.
설치는 독립 포트를 통해 두 검색 단위에 연결 된 거꾸로 한 현미경 기반-왼쪽된 포트 TIRF와 사진-정품 인증/표백 SD 장치 및 스캐너 장치를 후면 포트에 연결 되어 실험. 최대 6 레이저 (405/445/488/515/561/640 nm) 여기에 사용할 수 있습니다. 여기 및 형광 신호, 어느 100 x의 탐지 / NA1.45 기름이 나 60 x / NA1.49 오일 TIRF 목표, 각각, 고용 되어 있다. 내보낸된 빛 dichroic 거울 (561 nm 긴 통과 또는 514 nm 긴 패스)에 의해 분할과 다양 한 대역 통과 필터에 의해 필터링 (55 nm 넓은 중심으로 525 nm, 54 nm 넓은 가운데 609에 녹색과 적색 형광에 대 한 nm 각각) 두 EM-CCD 카메라 앞 시대입니다. Zobiak 외 에 설치에 대 한 더 많은 기술적인 세부 사항 나열 된 note 하시기 바랍니다 7. TIRF 구성에서 SD 단위 0.5 경 내에서 가벼운 경로에서 이동 s 검색 동일한 두 카메라를 사용할 수 있도록 1 년경에 비해 두 이미징 형식 사이의 빠른 전환 수 있도록 과거에 보고 된 s13 < /c2 >. 이 기능을 통해 듀얼-채널 동시 수집, 따라서 4 채널 SD TIRF 이미징 이전에 최고 속도 및 정확성을 수행할 수 있습니다. 또한, SD 및 TIRF 이미지 사이의 정렬 필요 하지 않습니다. 하지만 두 카메라 사이의 이미지 정렬, 실험을 시작 하기 전에 확인 하 고 필요한 경우 수정 있다. 다음 프로토콜에서 등록 수정 루틴 자체 서 면된 ImageJ 매크로에 구현 되었습니다. 또한, 매크로 주로 SD-및 그들의 다른 차원에도 불구 하 고 데이터 집합 TIRF의 동시 시각화 수 있도록 설계 되었습니다. 수집 소프트웨어 자체는 이러한 기능을 제공 하지 않았다.

<table><tbody><tr><td>Microscope 및 액세서리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SD-TIRF 현미경</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti 완벽한 초점 시스템</td><td>Nikon</td><td></td><td>Inverted microscope stand</td></tr><tr><td>CSU-W1 T2</td><td>Yokogawa</td><td></td><td>Spinning disk unit in dual-camera configuration</td></tr><tr><td>iLAS2&nbsp;</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td>TIRF/FRAP 스캐너</td></tr><tr><td>Evolve&nbsp;</td><td>Photometrix</td><td></td><td>EM-CCD 카메라</td></tr><tr><td>PiezoZ 스테이지</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>전동 Z 스테이지</td></tr><tr><td>Bioprecision2 XY 스테이지</td><td>Ludl Electronic Products</td><td></td><td>전동 XY 스테이지</td></tr><tr><td>스테이지 상단 배양 챔버</td><td>Okolab</td><td>볼드 라인</td><td>온도, CO2 및 습도 공급</td></tr><tr><td>세포 배양</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HeLa 자궁경부암 세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC-57</td><td></td></tr><tr><td>NIH3T3 섬유아세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC-59</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 변형 이글 배지 + 글루타MAX-I (DMEM</td><td>)Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>환원 혈청 배지</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청(FCS)</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신(PenStrep)</td><td>Gibco</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>완전 성장 배지(DMEM에 10% FCS 및 1% PenStrep 보충)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TurboFection</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0531</td><td>트랜스펙션 시약</td></tr><tr><td>아스코르브산(AA)</td><td>Sigma</td><td>A544-25G</td><td></td></tr><tr><td>6웰 세포 배양 플레이트</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td>35mm, 0.17mm 유리 커버슬립</td></tr><tr><td>피브로넥틴, 소 플라즈마</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33010018</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 개선 챔버</td><td>VWR</td><td>631-0696</td><td></td></tr><tr><td>TetraSpeck 비드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td></td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RFP-Lifeact</td><td></td><td></td><td>Maren Rudolph, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center, Hamburg Eppendorf,</td></tr><tr><td>Germany YFP-Vinculin</td><td></td><td></td><td>Andrea Mordhorst, Institute of Medical Microbiology, University Medical Center, University Medical Center, 함부르크 Eppendorf, Germany</td></tr><tr><td>소프트웨어 및 플러그인</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>VisiView</td><td>Visitron Systems</td><td></td><td>버전 3</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>버전 1.52c</td></tr><tr><td>Turboreg 플러그인</td><td></td><td></td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td></tr> <tr><td>매크로 "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm"</td><td>이 간행물</td><td></td><td>https://github.com/bzobiak/ImageJ</td></tr><tr><td>Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>버전 6.2.2</td></tr></tbody></table>

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

살아있는 세포에 접착 형성 등 프로세스 원형질 막과 세포 내부에 광범위 한 변화를 포함 한다. 이러한 높은 동적 이벤트를 시각화 하기 위해 라이브 샘플의 빠른 이미지를 허용 하는 두 가지 보완 가벼운 현미경 검사 법 기술을 결합 했다: 회전 하는 디스크 현미경 (SD) 및 고해상도 볼륨 녹음 및 총 내부 반사 형광 (TIRF) 정확한 현지화 및 원형질 막의 시각화에 대 한 현미경 검사 법 포괄적이 고 완전 한 이미징 프로토콜 샘플 준비, 현미경 교정, 이미지 형성 및 취득 안내, 다 색 SD TIRF 라이브 이미징 시리즈 높은 spatio 시간적 해상도 결과 대 한 표시 됩니다. 모든 필요한 이미지 후 처리 단계 다차원 라이브 이미징 데이터 집합, 즉 등록 및 개별 채널의 조합 생성 ImageJ의 오픈 소스 소프트웨어에 대 한 자체 서 면된 매크로에 제공 됩니다. 개시 동안 형광 단백질의 이미징 및 접착 단지의 성숙 뿐만 아니라 말라 cytoskeletal 네트워크의 형성이 새로운 접근에 대 한 원리의 증거로 사용 되었다. 셀룰러 환경에서 하 고, 동시에, 높은 감지 막 관련 된 분자의 정확한 지 방화에 이러한 복잡 한 프로세스에 대 한 자세한 설명을 제공 하는 높은 해상도 3D 현미경 및 TIRF의 조합 신호-배경 비율입니다.

분석 결과 개발 되었다 SD TIRF 이미징의 잠재력을 보여 spatio 시간적 조직 세포 접착 동안 골격와의 상호 작용 및 세포-매트릭스 접착 단지 계시 해야 한다. 따라서, 점착 헬러 또는, 양자 택일로, NIH3T3 세포 YFP Vinculin와 RFP Lifeact 18-24 h에 대 한 페 했다 trypsinized 그리고 fibronectin 코팅 유리 하단 요리에 시드. 이러한 셀 라인 선정 됐다 그들의 발음된 골격 및 높은 견고성에 대 한 라이브 이미징 실험 반대, 예를 들어 1 차 셀. 그는 그들은 트립 신 치료 후 매우 민감한 상태에서 이미징 저항할 수 있습니다. 현미경, YFP/RFP 표현 셀 선정 됐다 고 접착 과정 관찰 60 분 동안 시간 경과 (그림 2 및 영화 1, 2). 이 특정 분석 결과 거의 하지 명확 하 게 설명 문학17,...

신속 하 고 높은 해상도 허용 하는 고급 현미경, 고립 된 플라즈마 멤브레인와 주변 세포내 볼륨의 이미지를 제시 한다. 회전 디스크 및 총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 한 설정의 통합 3.5까지 높은 수집 속도에서 라이브 이미징 실험을 허용 이미지 스택 당 s.

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

회전 디스크 TIRF 현미경 검사는 사이토스켈레탈 네트워크 형성 중 단백질의 역할을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 기술은 세포에서 생기는 빠른 세포 접근의 3 차원 화상 진찰을 허용하고 혈장 막에 놓인 형광 분자의 정확한 현지화. 이 방법은 미생물학, 세포 생물학 및 플라즈마 막과 세포 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 것이 중요한 모든 분기와 같은 연구 영역에 통찰력을 제공 할 수 있습니다.이 방법은 플라즈마 멤브레인의 구조를 지역화하는 것이 중요하고 나머지 세포 부피의 고해상도를 유지하려는 라이브 이미징 실험으로 확장 될 수 있습니다. 고려해야 할 중요한 것은 TIRF 조명 및 다른 이미징 매개 변수를 설정하고 전염된 세포의 초점을 찾기 위해 적절한 세포주 선택입니다. 이 프로토콜의 시각적 데모는 이미지 수집 중에 셀 처리문제를 방지하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.실험 이틀 전, 종자 3, 000 HELA 또는 NIH 3T3 세포는 6웰 세포 배양판의 각 웰에 전체 성장 배지의 2밀리리터로 한다. 다음 날, 트랜스페트 시약을 준비합니다. 첫째, RFP Livact의 마이크로그램 1개와 YFP Vinculin의 마이크로그램 1개를 총 200마이크로리터의 감소된 혈청 배지에 희석시 희석시.간질 시약을 잠시 소용돌이. 그런 다음 혼합물의 4 개의 마이크로 리터를 DNA 의 200 마이크로 리터에 추가합니다. 시약을 다시 소용돌이게 한 다음 실온에서 15~20분 동안 배양 혼합물을 배양합니다.배양 후 전체 경질 믹스 드롭 와이즈를 세포에 직접 추가합니다. 접시를 흔들어 우물을 섞은 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다. 실험 당일, PBS의 밀리리터 용액 당 10 마이크로그램으로 35mm 유리 바닥 접시를 먼저 코팅하여 라이브 이미징 샘플을 준비합니다.실온에서 30분 동안 유리 표면에 용액을 두은 다음 제거하고 접시공기를 건조시키십시오. 다음으로, 증류수의 밀리리터당 18억 개의 입자의 밀도로 0.1 미크론 직경다형 비드 용액을 희석시켰다. 30~60초 동안 Fibronectin 코팅 유리 표면에 용액을 추가합니다.그런 다음 용액을 제거하고 접시 공기가 건조하게하십시오. 형광 구슬로 접시의 사전 코팅은 두 가지 이유로만 필요하며, 먼저 세포를 시드하기 전에 TIRF 평면을 찾거나 이미지 등록을위한 두 가지 색 비드 이미지를 획득하려는 경우. 이제 성장 배지에서 0.1 밀리머의 최종 농도에서 0.1 어금니 아스코르브 산 용액을 첨가하여 산화 방지 성장 배지를 준비한다.37도 의 수조에 배치하여 미디어를 미리 따뜻하게하십시오. 다음으로, PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하고 접시의 각 우물에 트립신 EDTA의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 세포를 배양하고 세포가 완전히 분리 될 때까지 2 ~ 3 분 기다립니다.전동 된 산화 성장 배지의 1 밀리 리터에서 세포를 주의 깊게 중단하고 15 밀리 리터 세포 배양 튜브에서 배지의 추가 4 밀리리터에 추가. 셀 서스펜션을 5%의 이산화탄소로 완충한 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 약간 열린 뚜껑을 놓습니다. 먼저, 안정적인 세포 배양 조건을 달성하기 위해 현미경의 환경 제어를 시작합니다.그런 다음 예온된 현미경의 샘플 홀더에 예온 된 산화 방지 성장 배지의 1 밀리리터를 포함하는 유리 바닥 접시를 놓습니다. 다음으로, 이미징 소프트웨어에서 현미경으로 획득 설정을 설정합니다. 획득 시간 간격을 30초로 설정하고 지속 시간을 60분에서 90분 사이로 설정합니다.또한 값을 하나로 설정하여 매 시간 마다 하드웨어 기반 자동 초점의 자동 초점 기능을 활성화합니다. 이제 카메라 노출을 200밀리초로 조정하고 게인 레벨을 500으로 조정하고 레이저 전원을 모든 채널에 대해 20%로 조정합니다. 높은 게인 수준, 낮은 노출 시간 및 낮은 레이저 전력광 독성을 줄이기 위해 권장 됩니다.그런 다음 회전 디스크 채널의 Z 스택을 0.4 미크론 간격으로 10미크론으로 설정한 다음 하단 오프셋을 0으로 설정하여 가장 낮은 평면이 하드웨어 자동 초점의 초점 위치가 되고 TIRF 채널의 Z 스택을 비활성화합니다. 마지막으로 다중 점 함수 스테이지 위치를 활성화합니다. 이렇게 하면 30초 간격으로 최대 3개의 위치를 기록할 수 있습니다.이제 형광 구슬을 상피 조명으로 찾고, 하나의 TIRF 채널을 활성화하고, TIRF 조명을 나타내는 값으로 조명 각도를 설정합니다. 다음으로 현미경 패널의 버튼을 눌러 자동 초점을 활성화하고 오프셋 휠로 초점을 조정합니다. 포커스가 되면 후속 비드 기반 이미지 등록을 위해 TIRF 488 및 TIRF 561을 사용하여 2색 데이터 집합을 획득합니다.인큐베이터에서 세포를 제거하고 폐쇄 된 튜브를 2 ~ 3 번 반전하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 세포의 1 밀리리터를 이미징 접시에 바그러 주세요. 낮은 수준의 상피 성광 조명을 가진 이중 전형 세포를 빨리 찾아보십시오.일단 발견되면, 밝은 필드 조명을 사용하여 라이브 카메라 미리 보기에서 셀을 중앙화하고 위치를 표시합니다. 그런 다음 관심 지점1~2점을 추가로 찾아 위치 목록에 저장하고 시퀀스 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 처음에, 세포는 쉽게 단계 운동으로 인해 분리 할 수 있으므로 4 ~ 5 개의 위치를 설정하고 나중에 하나 또는 두 개의 위치를 폐기하는 것이 좋습니다.피지에서 등록 무료 하이퍼 스택을 생성하기 위해, 먼저 다운로드하고 제공된 파일 SD-TIRF_helper_jove 저장합니다. 피지 서브 폴더 매크로에서 ijm. 플러그인으로 시작하여 매크로를 클릭하고 마지막으로 실행하여 매크로를 실행합니다.색상 채널에 등록 수정이 필요한 경우 옵션을 선택하고 랜드마크 파일이라고 하는 새 비드 기반 등록 참조를 만듭니다. 다음으로, 바이오포맷 가져오기로 데이터를 가져오고 하이퍼스택을 보기 옵션으로 선택합니다. 이미지 데이터 세트를 로드하고, 첫 번째 단계에서 회전 디스크 시리즈와 두 번째 단계에서 TIRF 계열을 선택합니다.이 시점에서 피지는 채널 및 스테이지 위치에 의해 정렬 된 데이터를 표시합니다. 미리 결정된 랜드마크 파일을 로드하여 각 채널에 등록 수정을 적용합니다. 그런 다음 회전하는 모든 디스크 및 TIRF 채널에 대해 원하는 색상 조회 테이블을 선택하고 단일 다차원 하이퍼 스택으로 병합합니다.TIRF 이미지를 처리하는 동안 여러 개의 zed 평면이 하단 평면에 추가되고 이 숫자는 회전하는 디스크 데이터 집합의 평면 수와 일치합니다. 이는 최종 하이퍼스택의 시각적 표현에 매우 중요합니다. 이 비디오에 설명된 설정을 사용하여 YFP 및 RFP 표현 셀을 선택하고 60분 의 타임랩스 동안 그들의 접착 과정을 관찰하였다.예상대로, 세포는 둥근 모양이었고, 환경을 감지하고 기판과 접촉하는 막 돌출부로 처음에 약하게 부착되었다. 세포 매트릭스 접촉은 소위 초기 접착의 형성시 신속하게 강화. 시간이 지남에 따라 유착 복합체는 초점 접착력으로 확대되고 성숙되었습니다.이 길쭉한 구조물은 세포의 주변에 주로 명백했습니다. 이것은 세포 매트릭스 접착력의 강화뿐만 아니라 액틴 섬유의 번들뿐만 아니라 유도 actomyosin 섬유에 의해 가해진 힘에서 유래했다. 세포는 또한 액틴 네트워크 형성의 결과로 평평해졌다.획득 속도는 다음 매개 변수, 시간 간격, 노출 시간, zed 평면 수 및 위치 수에 따라 달라집니다. 따라서 높은 획득 률에 대해 이러한 매개 변수를 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 최신 방적 디스크 기술의 구현은 회전 디스크 TIRF 현미경 검사법을 높은 시간적 속도로 이미징을 허용하는 새로운 초해상도 현미경 기술로 바꿔놓을 것입니다.회전 디스크 현미경 검사는 세포 내부와 세포막 사이에 발생하는 프로세스를 연구하기위한 매우 강력한 기술이다. 우리는 몇 초 이내에 매우 큰 이미지 스택을 획득하여 소포의 역학을 따를 수 있음을 보여 주었다. 콜라주 레이저 빛은 눈에 위험합니다.빔을 직접 들여다보지 말고 직접 광 노출을 피하기 위해 계측기의 안전 예방 조치를 사용하지 마십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

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배우세요 회전 디스크-TIRF 현미경법을 이용한 세포 접착 형성의 고급 시각화 기술을. 이 방법은 세포막 단백질의 정밀한 위치 파악과 살아있는 세포의 3차원 동역학 연구에 활용됩니다.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

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