Name: 분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 학습하세요 전단 흐름이 murine 가장자리 지역 B 세포의 이동 방향을 변화시키는 메커니즘을 현미경 이미징과 유체역학 장치를 이용하여 분석하는 방법을. 이 기법은 상업용 장비와 무료 소프트웨어로 초보자도 쉽게 수행할 수 있습니다.

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이 작품 K. 시티에 "도이치 가운데" SFB 854/TP11에서 교부 금에 의해 지원 되었다

<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li>
<li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1%2C+ICAM-2%2C+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest%2C+polarization%2C+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li>
<li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li>
<li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li>
<li>Cinamon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+receptor+1+promotes+B+cell+localization+in+the+splenic+marginal+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate receptor 1 promotes B cell localization in the splenic marginal zone.</a> Nature Immunology. 5 (7), 713-720 (2004).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9 (1), 54-62 (2008).</li>
<li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li>
<li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+way+out%3A+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li>
<li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+zone+B+cells%3A+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
<li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261(2017).</li>
<li>ImageJ. MTrack2. , Available from:
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<li>MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).</li>
<li>ImageJ. Manual Tracking. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. ibidi Pump System. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. ">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. </a> (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기 전단 흐름의 힘을 감지 하 고 그들의 마이그레이션 변경 하 여 응답 하는 셀의 마이그레이션 분석 하는 방법을 설명 합니다. MZBs의 분석이 보여주었다 MZBs 마이그레이션 저절로 ICAM-1과 흐름의 존재, 흐름을 마이그레이션할 것입니다. 우리의 이전 작품에서는, 우리는 MZBs VCAM-1에 흐름을 마이그레이션하지 마십시오 하지만 대신 자리에 고정 남아 보였다. Murine 비장 한계 영역 되어 주로 ICAM-1, 빨간 펄프 ICAM-1와 VCAM-1 모두 포함 됩니다. 이러한 데이터에서 MZBs 동안 흐름 빨간 펄프에만 한계 영역을 마이그레이션할 것이 유추 될 수 있습니다. 분석 흐름12의 힘에 의해 비장 빨간 펄프를 mislocalized 했다 결함이 접착으로 MZBs를 사용 하 여 생체 내에서 검증 되었다. 이러한 이유로, MZBs 시스템은 다른 세포 유형 공부에 사용 하는 경우에 여기에 설명 된 흐름 마이그레이션 시스템을 테스트 하기 위한 좋은 긍정적인 제어를 나타냅니다...

면역 세포는 인체에서 가장 운동 셀 이며 종종 혈액과 림프 흐름에서 전단 힘에 맞설 해야 합니다. 그러나, 백혈구1,2,3,,45의 전단 힘 유도 마이그레이션에 비교적 몇 가지 연구 있다. 선물이 여기 흐름 체 외에 면역 세포의 응답을 분석 하는 안정적이 고 양적 프로토콜. 수행 하는 분석 결과의 구성 요소, 제조 필요 하지 않습니다 그리고 모든 장비 및 소모품을 상업적으로 사용할 수 있습니다. 프로토콜, 세포 정화 및 마이그레이션 분석을 포함 하 여 하루에 수행할 수 있습니다. 마지막으로, 한계 영역 B 세포 (MZBs)의 마이그레이션 설명, 비록 프로토콜 마이그레이션 다른 종류의 면역 세포의 흐름에 대해 분석 하 적응 될 수 있다. 따라서, 그것은이 분석 결과 사용 하 여 조건의 종합 패널 백혈구의 광범위 한 범위를 체계적으로 분석 가능 합니다.
MZBs, 마우스에서 발견 되는 비장에 셔틀만 B 세포의 인구는 여 포의 인테리어와 한계 영역6,7,,89. 한계 영역 면역 세포 약 5-10 셀 두께의 계층입니다. 셀 레이어 봉투 뿌리 하 고 MZBs와 대 식 세포 또한 고정 자연적인 살인자 T (iNKT) 세포, 모 수석 세포 (DCs), 및 호 중구, 다른 사람의 사이에서10주로 이루어져. 한계 영역에서 셀은 뿌리를 둘러싼 한계 부 비 동에 종료 비장 동맥에서 발생 하는 단방향 혈에 노출 됩니다. 혈액 한계 영역을 통해 한계 공동에 구멍에서 흐르는 고 빨간 펄프에서 정 맥 sinuses에 수집 이며 순환11복원. 혈액의 자유로운 흐름은 MZBs 이상 세척 하 고 혈액에 항 원에 노출. MZBs와 혈액에 노출 되지 않습니다, 뿌리의 내부 한계 영역 사이 자동으로 왕복 하 여 뿌리에 항을 수행. 따라서, 뿌리 쪽으로 MZBs 셔틀로 그들은 혈액 흐름12 (그림 1A)의 전단 힘을 마이그레이션 해야 합니다.
이 프로토콜에서 양적 어떻게 면역 세포와 같은 MZBs 아무 흐름 또는 높은 흐름 체 외에 응답을 결정 하는 방법을 설명, 그들은 어떻게 공개 하기 에 비보를 마이그레이션할 프로그램. 첫 번째 단계에서 MZBs 자석 구슬 상용 키트에서 항 체 결합을 사용 하 여 마우스 비장에서 순화 된다. 갓 격리 MZBs 흐름 챔버 슬라이드의 우물에 도입, integrin ligands에 정착 수 있으며 펌프 시스템 (그림 2A)를 사용 하 여 마이그레이션 버퍼의 흐름에 노출. 셀 시간 경과 비디오 현미경 시스템을 사용 하 여 몇 군데 있습니다. 이미지 무료 ImageJ 플러그인, MTrack213,14, 셀을 자동으로 추적 하는 분석에 대 한 처리 됩니다. 트랙 속도, 직진도, 및 마이그레이션 인덱스를 포함 하 여 다양 한 매개 변수를 확인 하려면 무료 Ibidi Chemotaxis 도구15 다음 측정할 수 있습니다. 이러한 값 vivo에서 면역 세포 움직임을 제어 하는 힘을 이해 하기 위해서는 전단 흐름 유도 마이그레이션에 마이그레이션 억제제, 세포 자극, 발산, 및 다른 마이그레이션에 영향을 미치는 화학 물질의 효과 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>VWR 세포 여과기, 70 &micro; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터, 30 &마이크로; m</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MZB 및 FOB 세포 분리 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-366</td><td></td></tr><tr><td>B220 CD45R, 클론 RA3-6B2, FITC</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>CD21 / CD 35, 클론 7G6, APC</td><td>BD Biosciences</td><td>558658</td><td></td></tr><tr><td>CD23, 클론 B3B4, PE</td><td>Biolegend</td><td>101608</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Biochrom</td><td>L2035</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS 1x</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>BSA 알부민 분획 V, 지방산 무함유</td><td>Roth</td><td>"0052.3"</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>796-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi &micro;-slides VI 0.4, 소수성, 코팅되지 않은</td><td>Ibidi</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>관류 세트, 흰색, 50cm, 0.8mm</td><td>Ibidi</td><td>10963</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi 펌프 시스템</td><td>Ibidi</td><td>10902</td><td></td></tr></tbody></table>

분석 murine 가장자리 지역 b 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

가장자리 지역 B 세포 (MZBs)는 낭 봉투 마우스 비장 한계 영역에 있는 B 세포의 인구. 모 낭에 도달, 혈액 흐름의 전단 힘을 MZBs 마이그레이션 해야 합니다. 선물이 여기 생체 외에서이 흐름 유도 MZB 마이그레이션 분석 하는 방법. 첫째, MZBs 마우스 비장 으로부터 격리 됩니다. 둘째, MZBs 흐름 챔버 슬라이드에서 integrin ligands에 정착, 전단 흐름에 노출 되며 마이그레이션 동안 현미경 이미지. 셋째, 이미지는 마이그레이션할 MZBs의 MTrack2 자동 셀 ImageJ를 위한 플러그인을 추적을 사용 하 여 처리 되 고 결과 셀 트랙 Ibidi chemotaxis 도구를 사용 하 여 정량은. 마이그레이션 데이터 셀 이동 하는 얼마나 빨리, 얼마나 자주 그들은 방향을 변경, 전단 흐름 벡터의 이동 방향에 영향을 미치는 여부 및 어떤 integrin ligands 관련 공개. MZBs를 사용 하 고, 비록 메서드를 쉽게 전단 흐름의 힘에 응답 하는 백혈구의 마이그레이션 분석 하는 데 적용할 수 있습니다.

우리는 마이그레이션 MZBs의 흐름 (0 dyn/cm2) 없이 ICAM-1-코팅 슬라이드에 비교 하 여 위에 약술 된 프로토콜을 사용 하 고 전단 흐름 (4 dyn/cm2)에 노출. 세포는 아무 흐름 (0 dyn/cm2) 및 (4 dyn/cm2) 분포를 보여 셀 마이그레이션 영화와 트랙 (그림 4A)의 모양에 MTrack2, 및 결과 추적 파일이 중첩 된 자동 추적 했다. 셀 트랙 다음 트랙 (그림 4B) 각 영화의 플롯을 생성 하기 위해 Ibidi Chemotaxis 도구 (ICT)으로 수입 했다. 평균 마이그레이션 인덱스 (ICT에서 "FMIy" 라고 함), 속도, 직진도 ("ICT에서 똑 바 름" 이라고 함), 및 4 영화 두 조건이 각각에서 계산 된 셀 트랙의 직선 거리 (ICT ...

가장자리 지역 B 세포 (MZBs) 다시 흐름을 그들의 마이그레이션 경로 향하는 여 전단 흐름의 힘에 응답할. 이 프로토콜에는 기록 하 고 분석 응용 장치, 펌프, 현미경 이미징 시스템, 그리고 무료 소프트웨어를 사용 하 여 마이그레이션 방법을 보여 줍니다.

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

이 방법은 세포골격이 전단 력을 보내는 방법과 인테그린 리간드 및 케모카인이 백혈구의 흐름 유도 이동에 미치는 영향과 같은 면역 세포 이동 분야의 주요 질문을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 초보자가 쉽게 수행할 수 있는 새로운 유형의 마이그레이션 분석이라는 것입니다. 그것은 단지 시판 될 수있는 장비와 시약뿐만 아니라 무료 소프트웨어를 사용합니다.이 방법은 한계 영역 B 세포에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 활성화 된 T 세포와 같은 다른 면역 세포에도 적용 될 수 있습니다. 실험 전날, ICAM-1의 알리쿼트를 해동하고 PBS에서 밀리리터당 5마이크로그램의 최종 농도로 희석한다. 그런 다음, 플로우 슬라이드의 원하는 챔버에 ICAM-1의 30 마이크로 리터를 추가합니다.슬라이드를 습한 챔버에 넣고 섭씨 4도에 설정하여 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 100 개의 PBS 마이크로 리터를 하나의 우물에 추가 한 다음 챔버의 다른 우물에서 100 마이크로 리터를 철회하여 챔버를 세척하십시오. 그런 다음, 챔버에 블로킹 버퍼 100 마이크로리터를 추가하고, 90 분 동안 실온에서 습한 챔버에서 슬라이드를 배양한다.다음으로, PBS의 100 마이크로리터를 하나의 우물에 추가하여 챔버를 씻고, 다른 우물에서 철수한 다음, 챔버에 100 마이크로리터의 마이그레이션 버퍼를 추가합니다. 이제 슬라이드를 사용할 준비가 되었습니다. 실험전까지 실온에서 습한 챔버에 보관하십시오.먼저 유체 펌프를 연결하고 유체 장치를 부착합니다. 그런 다음 펌프 소프트웨어를 켭니다. 다음으로, 마이그레이션 버퍼의 5~10 밀리리터로 튜브를 한 번 씻으시다.이 약 1 분 정도 걸릴 것입니다. 그런 다음 11.7 밀리리터의 마이그레이션 버퍼를 두 저장소에 동등하게 추가하고 기포를 제거합니다. 지금, 커넥터 조각에서 약 10 센티미터 튜브를 고정하고 현미경에 가열 된 인큐베이션 챔버에 유체 단위를 배치합니다.소프트웨어에서 슬라이드 선택을 마이크로 슬라이드 VI 0.4로 설정하고 튜빙 옵션을 흰색으로 설정합니다. 또한 원하는 전단 응력은 평방 센티미터 당 약 4 개의 dyne과 이미징 시간을 30 분으로 설정합니다. 그런 다음 펌프 소프트웨어에 값을 입력하여 원하는 유량 및 전단 응력설정합니다.다음으로, 현미경 잠복실, 유체 장치 및 이주 버퍼 알리쿼트를 섭씨 37도로 미리 데우도록 합니다. 따뜻해지면 유체 펌프를 테스트하여 마이그레이션 버퍼가 저장소에서 앞뒤로 흐르고 시스템에 기포가 없도록 합니다. 먼저, 백혈구를 분리하고, 동반텍스트 프로토콜에 기재된 바와 같이 한계 영역 B 세포를 정화한다.그런 다음 슬라이드 바닥을 에탄올 약정 조직으로 청소합니다. 30 마이크로리터의 셀 서스펜션을 챔버의 한 우물에 넣고, 저장된 마이그레이션 버퍼의 마이크로리터 30개를 다른 우물에서 철수시다. 슬라이드를 덮고 30분 동안 배양하여 세포가 부착되도록 합니다.그런 다음 긍정적인 반월상연경이 우물에서 나올 때까지 슬라이드의 각 웰에 미리 따뜻해지는 마이그레이션 버퍼를 천천히 추가합니다. 파이펫 팁으로 기포를 제거합니다. 세포 접착력에 영향을 미치는 인자와 일관성을 유지하는 것이 중요하므로 버퍼와 셀을 37도 유지하며 버퍼를 챔버로 파이프할 때 과도한 힘을 사용하지 않도록 하십시오.슬라이드를 현미경 단계로 고정하고 커넥터 조각에서 유체 튜브의 표시되지 않은 측면을 제거합니다. 그런 다음 기포가없는 긍정적 인 반월 상연이 끝날 때까지 마이그레이션 버퍼로 튜브의 끝을 채웁니다. 튜브 의 끝을 뒤집어 서체 챔버의 상단 우물에 삽입합니다.튜브를 고정하는 동안 튜브의 표시된 끝에 대한 절차를 반복하십시오. 이제 이미징 시스템을 라이브 모드로 전환하고 슬라이드 중간에 있는 시야를 선택합니다. 여기서, 세포에 초점을 설정한 다음 세포의 검은 윤곽을 향상시키고 흰색 내부를 생성하기 위해 약간 초점을 제거합니다.검은색 배경과 흰색 센터는 자동 추적 프로그램에서 사용하기 쉽습니다. 10배 건조 목표를 사용하여 5초마다 하나의 이미지를 30분마다 기록하는 이미징 서열 프로그램을 설정합니다. 그런 다음 녹음을 시작합니다.튜브에서 클램프를 제거하고 펌프를 켭니다. 이렇게 하면 비 부착 된 세포가 씻겨 내고 부착 된 세포가 마이그레이션되기 시작합니다. 이미징 프로그램의 끝에서, 라벨과 영화를 저장합니다.셀 마이그레이션의 억제제 또는 수정자를 사용하는 경우, 슬라이드 또는 유체 학적 단위의 마이그레이션 버퍼에 넣기 전에 세포 현탁액의 세포에 추가 될 수 있습니다. 자동 마이그레이션 트랙 분석을 시작하려면 ImageJ 프로그램을 엽니다. MTrack2_kt Java 파일을 ImageJ 플러그인 폴더에 복사합니다.플러그인 메뉴에서 컴파일 및 실행을 선택합니다. 그런 다음 ImageJ를 다시 시작하고 플러그인이 플러그인 메뉴에 나타납니다. ImageJ의 셀 마이그레이션 동영상에서 이미지 스택을 열고 여기에 표시된 대로 이미지를 처리하여 비디오를 컬러 프레임에서 흰색 배경의 검은 색 개체로 셀을 보여주는 고대비 이미지로 변환합니다.다음으로 이미지를 두 번 선명하게 하고 이미지를 비적한 다음 이미지를 8비트로 변환합니다. 이미지 메뉴에서 밝기/대비 조정 하위 메뉴로 이동하여 대비 슬라이더를 최대 대비로 설정합니다. 이렇게 하면 셀이 검은색 배경에 흰색 개체로 표시됩니다.그런 다음 임계값 조정 하위 메뉴로 돌아가서 셀이 흰색 배경에 검은 개체로 표시되도록 합니다. 지금, 자동 셀 추적 플러그인 MTrack2 kt를 실행합니다. 옵션 화면에서 파티클 크기를 최소 한 픽셀로 설정하고 파티클 크기를 최대 30픽셀로 설정합니다.속도 값을 10픽셀로 설정하지만 한계 영역 B 셀은 일반적으로 5초 간격으로 연속 프레임에서 2픽셀을 초과하지 않습니다. 셀 트랙은 이제 ibidi Chemotaxis 도구를 사용하여 분석을 위한 준비가 되었습니다. 이 두 필드는 ICAM-1 코팅 슬라이드에서 시드된 한계 영역 B 셀의 마이그레이션 경로를 보여 줍니다.이 문서에서 설명한 메서드를 사용하여 셀을 MTrack2로 자동으로 추적했습니다. 왼쪽에서, 세포는 정적 조건하에서 심화되었고, 오른쪽 세포는 평방 센티미터 당 4 개의 왕조의 전단 흐름에 노출되었다. 개별 셀 트랙은 각 영화의 트랙 플롯을 생성하기 위해 ibidi Chemotaxis 도구로 가져올 수 있습니다.여기서 개별 셀 트랙은 빨간색으로 표시되어 원점의 하류또는 상류로 끝나면 검은색으로 종료되었음을 나타냅니다. 흐름과 유동 조건 모두에 대한 네 개의 개별 영화에서 셀 트랙의 분석은 여기에 표시됩니다. 여기에는 두 조건에 대한 평균 방향 이동 지수, 세포 속도, 경로 직선 및 최종 직선 거리가 포함됩니다.이 비디오를 시청한 후, 전단 흐름을 향해 한계 영역 B 셀의 방향 이동을 이미지하는 방법과 자동으로 셀을 추적하는 방법에 대해 잘 이해해야 합니다. 이 절차 도중, TIRF 현미경 검사법과 같은 그밖 방법은 세포골격 및 통합이 전단 응력에 어떻게 반응합니까와 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다?

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을...

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

장 림프구의 정량적 특성화에 대한 관심이 높아지고 있는데, 이는 이러한 세포가 다양한 장 및 전신 질환에서 중요한 역할을 한다는 인식이 높아짐에 따라 발생합니다. 이 프로토콜에서는 후속 유세포 분석 특성 분석을 위해 다른 소장 구획에서 단일 세포 집단을 분리하는 방법을 설명합니다.

쥐 소장 림프구의 분리 및 유세포 특성

림프구는 적응 면역 반응의 주요 플레이어입니다. 여기에서는 in vitro 및 in vivo에서 원하는 분자의 림프구 활성화의 생리학적 기능을 결정하기 위한 림프구 정제 프로토콜을 제시합니다. 설명된 실험 절차는 대조군 림프구와 유전자 변형 림프구 간의 기능적 능력을 비교하는 데 적합합니다.

분리 및 쥐 림프구의 활성화

피부에서 배출 림프절로의 세포 이동을 추적하기 위한 마우스의 분석법이 설명되어 Bacille Calmette-Guérin에 발바닥 패드 감염 후 림프절로 동원된 피부 수지상 세포의 특성을 분석할 수 있습니다.

와 감염시 배수 림프절에 쥐 피부 수지상 세포의 마이그레이션을 연구하는 CFSE 기반 분석<em&gt; 소 결핵균</em&gt; Bacille 칼 메트 - GUERIN

여기에서는 체외에서 중추신경계로의 림프구 전이를 조사할 수 있는 인간 혈액-뇌 장벽 모델에 대해 설명합니다.

를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em&gt; 체외</em&gt; 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델

이 프로토콜에서 림프구는 다공성 멤브레인에 의해 하단 챔버로부터 분리 된 트랜스 이민 시스템의 상부 챔버에 배치됩니다. 케모카인은 하단 챔버에 첨가되어 케모카인 그라데이션을 따라 활발한 이동을 유도합니다. 48 시간 후, 림프구는 트랜스 이민을 정량화하기 위해 두 챔버에서 계산됩니다.

Ex Vivo 트랜스이민 시스템에서 림프구 마이그레이션 평가

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

본 명세서에 의한 복막, 비장 및 골수 조직에서 뮤린 면역 B 세포 구획의 이질성에 대한 간단한 분석을 설명한다. 프로토콜을 다른 마우스 조직으로 조정하고 확장할 수 있습니다.

뮤린 B 세포 발달의 유동 세포 측정 특성화

이 프로토콜은 정량 분석을 통해 특정 환경 조건에서 T 세포 이동의 일차 쥐 T 세포 분리 및 타임 랩스 현미경 검사 방법을 제공합니다.

일차 쥐 CD8+ T 세포에 대한 Real-Time In Vitro Migration Assay

학습하세요 전단 흐름이 murine 가장자리 지역 B 세포의 이동 방향을 변화시키는 메커니즘을 현미경 이미징과 유체역학 장치를 이용하여 분석하는 방법을. 이 기법은 상업용 장비와 무료 소프트웨어로 초보자도 쉽게 수행할 수 있습니다.

분석 Murine 가장자리 지역 B 세포 생체 외에서의 전단 흐름 유도 마이그레이션

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