Name: 스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 화학 건조법을 이용한 스캐닝 전자 현미경 기술로 시아노박테리아, 유글레노이드 및 Drosophila melanogaster의 형태학적 특징을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 특수 장비 없이도 세포 구조와 표면 질감을 명확하게 시각화할 수 있습니다.

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이 작품 연구의 사무실 및 중앙 미시간 대학에서 대학원에서 MAK로 MLS와 여름 학술 상 교부 금에 의해 투자 되었다. 남조류는 해안 연구, 텍사스 A & M 대학교 코 퍼스 크리스티에 대 한 Zimba 및 플랑크톤 연구소, 센터의 부분에 의해 공급 되었다. Euglenoids는 Triemer 연구소, 미시간 주립 대학에 의해 공급 되었다.

1. 준비 및 고정
<ol><li>박테리아를 준비 합니다.<ol>
<li>14:10 h에 28 ° C의 온도에 F/2 미디어24,25 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 해결 하기 위해 15 분을 허용, 후 세균 펠 릿 크기에 약 0.05 mL 충분 한 문화 microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 전송 합니다. 미디어를 제거 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0) 정착 액의 1.5 mL를 바꿉니다, 그리고 부드럽게 여러 번 반전 및 4 ° c.에서 밤새 품 어</li>
		<li>고정된 셀 10 mL 여과 장비 (그림 1)으로 유리 피 펫을 포함 하는 셀의 크기에 따라 0.8 또는 0.2 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 25 m m 필터를 전송 합니다. 쪽 팔을 봉인 하 고 깔때기에 문화를 포함 하는 고무 마 개와 퍼 널. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 정착 액을 제거 합니다. 참고: 셀 밀도 폴 리 카보 네이트 필터를 최적화 하지 않으면 문화 사용 시작의 양을 조정 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단 세포 조류 (euglenoids)를 준비 합니다.<ol>
<li>AF-6 미디어26 14:10 h에 22 ° C의 온도에서 미디어에 추가 하는 상용 토양 물 매체의 150 mL L-1 에서 unialgal 문화 성장 빛 어두운 주기에. 낮은 밀도의 2 개 mL를 전송 (600 < 0.5 세) 8 µ m 모와 폴 리 카보 네이트 25 m m 필터를 포함 하 여과 장비 (그림 1)를 10 mL에 유리 피 펫과 문화. 쪽 팔을 봉인 하 고 깔때기에 문화를 포함 하는 고무 마 개와 퍼 널. 참고: 셀 밀도 폴 리 카보 네이트 필터를 최적화 하지 않으면 문화 사용 시작의 양을 조정 합니다.</li>
		<li>문화에 직접 4% 오스뮴 tetroxide (OsO4) 3 방울을 추가 하 고 30 분 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 정착 액을 제거 하는 동안 알을 품을 수 있도록. 참고: OsO4 는 급성 독 소 (피부, 구강, 그리고 흡입 노선), 부식, 눈과 호흡기 감광 손상 피부. OsO4 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>초파리 melanogaster (과일 파리)23를 준비 합니다.<ol>
<li>100%의 이산화탄소를 사용 하 여 성인 파리 anesthetize 장소는 작은 플라스틱 마 개 유리병 또는 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서 성인 (약 10 ~ 30 파리) 취.</li>
		<li>4 ° c.에 정착 액 (1.25%도, 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.2) 2 시간 (또는 숙박) 1 mL에 마 취 파리를 담가 파리는 정착 액의 표면에 플 로트, 경우 조직의 총 침수에 대 한 허용 정착 액의 표면장력을 약하게 2.5% 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octylphenyl 에테르의 몇 방울을 추가 합니다. 정착 액 유리 피펫으로 사용 하 여 제거 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 세척 및 탈수
<ol><li>워시와 남조류를 탈수.<ol>
<li>3 시간 10 분 동안 실 온에서 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.0의 5 mL와 함께 고정된 샘플을 씻으십시오. 플라스 크와 퍼 널 세척을 막히고 유지. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 각 세척을 제거 합니다.</li>
		<li>깔때기에 5 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 지속적인 집중을 유지 하면서 샘플을 탈수. 등급된 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 95%, 및 100% 에탄올의 2 변화. 플라스 크 및 퍼 널 손실 방지 퍼 널에서 에탄올을 포함 하도록 막히고 두 통해 계속 증발 및 필터를 통해 수동 흐름.</li>
		<li>두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 에탄올을 제거 합니다. 일회용 알루미늄 접시 건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올을 포함 된 무게를 필터/샘플을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 하 고 단 세포 조류 (euglenoids)를 탈수.<ol>
<li>10 분 동안 실내 온도에 3 번 이온된 수의 5 mL와 고정된 샘플을 씻으십시오. 플라스 크와 깔때기를 깔때기에서 세척 포함 막히고 유지. 두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 각 세척을 제거 합니다.</li>
		<li>깔때기에 5 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 지속적인 집중을 유지 하면서 샘플을 탈수. 등급된 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 95%, 및 100% 에탄올의 2 변화. 플라스 크 및 퍼 널 손실 방지 퍼 널에서 에탄올을 포함 하도록 막히고 두 통해 계속 증발 및 필터를 통해 수동 흐름.</li>
		<li>두 마 개를 제거한 후 부드러운 진공 여과 플라스 크에 의해 에탄올을 제거 합니다. 일회용 알루미늄 접시 건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올을 포함 된 무게를 필터/샘플을 전송 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세척 하 고 탈수 초파리 melanogaster (과일 파리).<ol>
<li>Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 세 번 1 mL의 0.1 M 인산 버퍼 pH 7.2 10 분 동안 실내 온도에 고정된 샘플을 씻으십시오. 유리 피 펫, 파리를 제거 하지 않도록 주의 되 고 각 세척을 제거 합니다.</li>
		<li>탈수 microfuge 관에 1 mL의 볼륨에서 10 분 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 샘플. 에탄올 농도: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. 파리를 제거 하지 않도록 주의 되는 유리 피 펫과 에탄올을 제거 합니다.</li>
		<li>건조 하기 전에 샘플을 충당 하기 위해 충분히 100% 에탄올 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 샘플을 유지 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 건조
<ol><li>화학 건조 t-부 틸 알코올 (미정)27을 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>20 분 20 분에 대 한 100 %TBA 1:1 솔루션 두 번 반복 하는 대체에 대 한 미정과 100% 에탄올의 1:1 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션을 교체 합니다. 37 ° C에서 유지 솔루션 미정을 동결 하지 않습니다 있도록. 참고: 100 %TBA 25.5 ° C;의 어는 점 1:1 솔루션 실내 온도에서 동결 하지 것입니다. 미정 가연성, 눈 자극, 흡입, 유해한 이며 호흡기 자극, 졸음, 또는 현기증을 일으킬 수 있습니다. 미정은 적절 한 개인 보호 장비 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등을 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>일회용 알루미늄 접시 무게에 1.5 mL microcentrifuge 튜브에 경우 미정에 샘플을 전송. 일단 알루미늄 무게 접시에 미정을 제거 하 고 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 신선한 100% 미정 대체 키를 누릅니다. 10 분 동안 4 ° C에서 TBA를 고정 합니다.</li>
		<li>진공 desiccator (bell jar) 냉동된 젤 팩 미정 동결을 유지 하 게 전송 합니다. 철수 하 고 3 시간 이상 냉동된 미정의 진공 승화 하 여 건조 또는 하룻밤 샘플 수 있도록 로타리 펌프와 진공을 유지.</li>
	</ol>
</li>
	<li>화학 건조 hexamethyldisilazane (HMDS)20를 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>HMDS의 1:2 솔루션으로 100% 에탄올 솔루션 대체 및 100% 에탄올 20 분에 대 한 대체 HMDS의 2:1 솔루션으로 1:2 솔루션 및 20 분에 대 한 100% 에탄올 대체 2:1 100% 솔루션 20 분 대 한 HMDS 반복 한 번. 참고: HMDS는 가연성 및 급성 독 소 (피부 경로). HMDS는 장갑, 눈 보호, 실험실 코트 등 적절 한 개인 보호 장비를 사용 하 여 화학 증기 두건에서 처리 되어야 합니다.</li>
		<li>일회용 알루미늄 접시 무게에 경우 1.5 mL microcentrifuge 튜브에에서 HMDS에 샘플을 전송. 알루미늄 접시, 무게 100% 대체 되 면 충분 한 신선한 100% HMDS HMDS 샘플을 커버.</li>
		<li>신선한 방 습 제로 (5-6 cm 깊은) 플라스틱이 나 유리 비 진공 desiccator 샘플 전송 고 화학 증기 두건에서 합니다. 또는 샘플에 떨어지는에서 파편을 방지 하기 위해, 상자와 같은 느슨한 뚜껑, 건조 화학 증기 두건에서 직접 샘플을 놓습니다. 12에서 24 h 동안 건조를 샘플을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4입니다. 장착
<ol><li>남조류와 euglenoids를 탑재 합니다.<ol>
<li>레이블을 나타냅니다 무엇 상단에 배치 되는 스텁 장착 중 12 또는 25 m m 알루미늄의 하단. 12 m m stub을 사용 하는 경우 분기를 깨끗 한 면도날 또는 메스로 말린 셀 폴 리 카보 네이트 필터를 잘라 또는 전체 필터 25 mm stub을 사용 하는 경우.</li>
		<li>접착제 또는 stub의 상단에 보안 탄소 접착제 탭에서 각 필터를 배치 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마운트 초파리 melanogaster (과일 파리).<ol>
<li>상단에 배치 되는 무엇을 나타내는 알루미늄 장착 스텁 하단의 라벨. 말린된 파리 접착제 또는 탄소 정밀 핀셋으로 해 현미경 스텁의 상단에 확보 된 접착제 탭에서 원하는 위치에 놓습니다.</li>
		<li>실버 전도성 접착제, 즉, 실버 페인트는 명세서의 외부 가장자리 주위에 적용 됩니다. 이쑤시개를 사용 하 여 전도성을 보장 하기 위해 파리에 은색 페인트를 연결 합니다. 원하는 영상 영역을 터치 페인트를 허용 하지 않습니다.</li>
		<li>스텁 홀더 상자에는 명세서를 놓고는 desiccator에서 오픈 스텁 홀더 상자를 배치 합니다. 적어도 3 h 건조 또는 최상의 결과 위해 하룻밤 사이에 은색 페인트를 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 스퍼터 코팅
<ol><li>아르곤 가스의 4 ~ 5 플러시를 수행 하 여 스퍼터 코팅 장치를 준비 합니다. 습도가 높은 경우 (즉, 방 공기에 대 한 일반적으로 촉촉한 느낌이 50% 상대 습도), 6 ~ 7 플러시를 수행. 스퍼터는 제조업체의 지침에 따라 명세서 코트.</li>
	<li>표본에 따라 코트 샘플 사용:<ol>
<li>남조류와 필터, 타이머 180 s 스트레이트 코트에 스퍼터를 설정 합니다.</li>
		<li>진 핵 조류와 필터, 즉, euglenoids, 타이머 120 s에, 똑 바른 다음 20 s 45 ° 각도로 3 개의 측에 대 한 코트 스퍼터를 설정 합니다.</li>
		<li>즉, 비행 머리 큰 샘플에 대 한 타이머 60 s에, 똑 바른 다음 30 s 45 ° 각도에서 양쪽에 대 한 코트 스퍼터를 설정 합니다. 참고: 코팅 완료 후 명세서 컬러로 밝은 회색 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6입니다. 영상
<ol><li>이차 전자 (SE) 검출기를 포함 하는 스캐닝 전자 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플.<ol>
<li>박테리아에 대 한 다음 설정을 적용: 3-5 kV 가속 전압 (AC), 20-30 프로브 전류 (PC), 그리고 5 m m 작동 거리 (WD). Euglenoids, 사용 3 k v AC, 30 PC 및 5mm WD. 파리, 5 k v AC, 30 사용 PC, 그리고 5 ~ 10 mm WD.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세부 사항 또는 수 개체의 크기에 따라 확대를 조정 합니다. 깨끗 한 이미지를 생산까지 stigmators, 가늠 구멍, 및 초점을 조정 합니다. SEM.의 제조업체의 지침에 따라 고해상도 설정을 사용 하 여 이미지 캡처</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

여기 우리는 세 가지 유형의 다른 사람 유기 체 또는 직물의 많은 종류의 기능을 검사에 적용할 수 있는 생물의 외부 형태학 상 특성에 대 한 자세한 정보를 SEM을 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜의 각 단계에서 발생할 수 있습니다 아래에 자세히 설명 되어 있는 오류의 잠재적인 포인트가 있다.
정착 액 및 세척 여기에서 주어진 볼륨 특정 있지만, 일반적으로 정착 액 및 세척 이어야 한다 5-10 배 볼륨의 표본. 문제가 발생할 경우, 예를 들어, 모든 정착, 세척, 탈수 시간, 우리의 경험에 기반으로 샘플의 shriveling 해야 할 수 있습니다 탈수 또는 건조의 각 단계에서 시간을 증가. 단일 셀 샘플에 따라도 고정 및 오스뮴 tetroxide에서 후 고정을 할 수 할 수 있습니다. 경우 결투 정착 필요 단계 1.1.2 박테리아 후 OsO4 같은 버퍼에 동일한 금액의 2%를 커버 하 고 단계 1.2.2 단일 셀에서에서 진행. 직...

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 이차 전자 형태 및 샘플1의 지형에서에서 이미지를 생성 하 고 에너지 전자의 집중된 광선을 사용 합니다. SEM는 직접 샘플, 표면 구조 및 3 차원 모양 제공 큰 해상도의 실제 크기와 가벼운 현미경 검사 법에 비해 피사계 큰 깊이 결정 하기 위해 사용할 수 있습니다. 전자 현미경 (EM)의 또 다른 형태, 전송 전자 현미경 (TEM) 내부 구조의 정밀한 세부 사항 가진 이미지를 생성 하는 샘플을 통해 전달 하는 집중 된 전자를 사용 합니다. 가장 빛 또는 SEM 보다 더 높은 해상도 작은 단일 원자 구조를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다, 그것은 세 가지 주요 단점: 광범위 한 샘플 준비, 보기의 작은 필드와 필드2,3의 얕은 깊이. 비록 다른 시각 프로토콜 특정 세포, 세포, 또는 조직4,5,6,7,,89, 검사를 SEM을 사용 하 여 존재 10 ,이 프로토콜은 독특한 형태학 평가 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 방법 설명.
Sem의 지질, 산업, 및 소재 과학14, 나노 입자11,12, 폴리머13및 수많은 응용 프로그램을 포함 하는 무기 재료를 조사 하기 위한 광범위 한 응용 프로그램을 발견 했다 15,16. 생물학, SEM 오래 개별 단백질에서 전체 유기 체17,18에 이르기까지 생물 학적 샘플을 조사 하기 위한 방법으로 사용 되었습니다. Sem의 과학적 발견을 알리기 위하여 형태학 표면 세부 정보를 사용할 수 있으므로 특정 값입니다. SEM 분석은 구조, 크기, 그리고 다양 한 생물 학적 샘플의 표면 특성에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법입니다.
일반적으로 SEM 고속 전자의 일관 된 빔을 지원 하기 위해 높은 진공 (10-6 Torr 최소) 밑에 운영 한다, 때문에 액체는 진공을 형성 하지 아니 액체 (물, 기름, 알콜) 샘플 챔버에 허용 됩니다. 따라서, 모든 샘플 SEM을 사용 하 여 검사 해야 합니다 탈수 일반적으로 건조 과정 뒤 등급된 에탄올 시리즈를 사용 하 여 에탄올을 제거. 공기 건조, 동결은, 임계점 건조 (일일) 장치, 또는 t-부 틸 알코올 (미정) 또는 hexamethyldisilazane (HMDS)19, 를 사용 하 여 건조 하는 화학 물질의 사용을 포함 하 여 SEM에서 사용 하기 위해 생물 학적 조직의 건조의 여러 방법이 있다 20 , 21 , 22. 가장 자주, 건조 방법의 선택은 경험적 이후 각 생물 학적 샘플 각 건조 방법에 다르게 반응할 수 있습니다. 각각의 장단점을 비교 하는 것은 적절 한 방법을 선택 하는 데 유용 하므로 어떤 주어진된 샘플에 대 한 모든 이러한 방법의 적절 한, 있을 수 있습니다.
실내 온도에 또는 건조 오븐 (60 ° C)에서 샘플을 건조 공기는 가장 간단한 방법은, 대부분의 생물 학적 샘플 건조-손상 shriveling 등을 표시 하 고 축소, 왜곡은 견본에서 결과. 동결은 과정 또한 제거 물 (또는 얼음) 샘플, 하지만 플래시-냉동 수 샘플을 필요로 하 고 승화, 잠재적으로 샘플 손상의 과정을 통해 얼음 제거 진공에서 배치. 또한, 사용자는 lyophilizer에 액세스할 수 있어야 합니다. SEM에 대 한 샘플을 탈수에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 방법 (일일)을 건조 하는 중요 한 포인트입니다. 일일 비용, 액체 이산화탄소 (CO2)와, 특정 온도 압력 조건 함으로써 표면 장력을 만들지 않고 증발 임계점 (31.1 ° C와 1,073 psi), CO2 로 알려진에서 샘플에 에탄올이 대체 됩니다. 샘플의 형태 및 구조 기능을 효과적으로 유지. 일일은 일반적으로 표준 방법, 그것은 몇 가지 단점이 있습니다. 첫째, 과정 뿐만 아니라, 하지만 또한 액체 이산화탄소의 사용을 필요로 하는 중요 한 포인트, 건조 기에 대 한 액세스를 필요 합니다. 둘째, 건조 수 있는 샘플의 크기의 임계점 건조 기 챔버 크기 제한 됩니다. 셋째, 일일 동안 액체의 교류는 샘플을 손상 시킬 수 있는 난 기류를 발생할 수 있습니다.
화학 건조 일일 비용 이상의 많은 장점을 제공 하 고 SEM 샘플 준비에서 널리 이용 되는 적당 한 대안 역할. 미정 및 HMDS와 같은 화학 dehydrants 사용 하 여 샘플의 구조적 무결성 유지 하면서 다른 방법에, 저렴 한, 빠르고 간단한 대안을 제공 합니다. 우리는 최근에 조직 또는 일일 비용 또는 미정 성인 초파리 망막 조직을23건조 방법으로 사용 하는 경우 캡처한 최종 이미지의 품질의 무결성에 차이가 있었다는 것을 보여주었다. 일일, 달리 미정 HMDS 필요 하지 않습니다는 건조 또는 액체 CO2 하 고 건조 하는 샘플의 크기에 제한이 없습니다. 화학 물질을 얻는 이외에 표준 화학 증기 두건 및 적절 한 개인 보호 장비 (장갑, 실험실 외 투, 및 안전 고글) 건조 과정을 완료 하는 데 필요 합니다. 미정 및 HMDS는 가연성, 미정은 적은 독성과 더 저렴 (약 1/3의 HMDS 비용) HMDS 보다.
이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이러한 생물 대표 다양 한 크기 (4 m m 0.5 µ m)과 세포 다양성 (단 세포 다세포에), 아직 모든 SEM 분석을 쉽게 순종 견본 준비에 필요한 작은 변화만. 이 프로토콜 화학 탈수 및 SEM 분석을 사용 하 여 생물의 세 종류의 형태학 세부 사항을 검사 하는 방법을 설명 합니다 및 많은 organismal 검토에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

<table><tbody><tr><td>금&ndash; 팔라듐</td><td>테드 펠라, Inc.</td><td>91212</td><td></td></tr><tr><td>은 전도성 접착제 503</td><td>전자 현미경 과학</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 트랙 에칭 멤브레인; 직경 25mm, 기공 크기 8 &mu; m, 폴리 카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>WHA110614</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 트랙 에칭 멤브레인; 직경 25mm, 기공 크기 0.8 &mu; m, 폴리카보네이트, 검은색</td><td>시그마</td><td>WHA110659</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore 트랙 에칭 멤브레인; 직경 25mm, 기공 크기 0.2 &mu; m, 폴리카보네이</td>트 <td>시그마</td><td>WHA110606</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 계량 접시&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 마운팅 스텁 (12 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75210</td><td></td></tr><tr><td>알루미늄 마운팅 스텁 (25 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>75186</td><td></td></tr><tr><td>접착 탭&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>76760</td><td></td></tr><tr><td>전도성 탄소 접착 탭</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>77825</td><td></td></tr><tr><td>F/2 media</td><td>텍사스 대학교 오스틴의 조류 배양 컬렉션</td><td>https://utex.org/products/f_2-medium</td><td>카탈로그 번호 없음 - 링크 참조&nbsp;</td></tr><tr><td>AF6 media</td><td>Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td><td>https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td><td>카탈로그 번호 제공 없음 - 링크 참조&nbsp;</td></tr><tr><td>토양 물 매체</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>153785</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르 (Triton X-100)</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Hummer 6.2 Sputter Coater</td><td>Anatech USA</td><td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td><td>카탈로그 번호 제공 없음 - 링크 참조&nbsp;</td></tr><tr><td>히타치 3400N-II SEM&nbsp;</td><td>히타치</td><td>https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2& gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE</td><td>회사는 이 모델을 더 이상 판매하지 않는 것 같습니다&nbsp;</td></tr></tbody></table>

스캐닝 전자 현미경 (sem)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

스캐닝 전자 현미경 (SEM) 개별 단백질에서 세포, 조직, 세포, 및 전체 유기 체에 이르기까지 생물 표본 연구에 적용 된 널리 사용할 수 있는 기술 이다. 이 프로토콜은 두 개의 화학 건조 방법, hexamethyldisilazane (HMDS) 및 t-부 틸 알코올 (미정), 및 SEM.를 사용 하 여 간결한과 진 핵 생물의 이미지를 그들의 응용 프로그램에 초점을 맞추고합니다 이 문서에서는, 우리가 해결, 세척, 탈수, 건조, 탑재, 코트, 스퍼터 및 생물의 세 종류를 이미지 하는 방법을 설명: 박테리아 (Toxifilum mysidocida, Golenkina sp., 그리고 알 수 없는 sp.), 2 euglenoids Monomorphina 속에서 (M. aenigmatica, M. pseudopyrum), 그리고 과일 파리 (Drosophila melanogaster). 이 프로토콜의 목적은 구조, 크기, 표면 특성에 대 한 생물의 큰 범위를 광범위 하 게 적용 될 수 있는 표본에 대 한 자세한 정보를 얻기 위해, 저렴 한, 빠르고 간단한 방법을 설명 하는 형태소 평가입니다. 이 프로토콜의 성공적인 완료는 그들의 시스템에이 기법을 적용 하 여 샘플을 시각화 하기 위해 SEM을 사용 하는 다른 수 있게 됩니다.

남조류는 글로벌 탄소, 산소, 그리고 질소 사이클28,29에 중요 한 생물의 간결한 그룹. 박테리아30의 예상 6000 종의 가장 커버와 함께 셀을 연결 하는 mucilaginous 칼 집 있고 다른 구조에31, 될 수 있는 모양, 함께 해결 미세32. 셀 크기, 모양, 및 안료 현재 개별 종 구별 그리고 수 중 서식 지에서 cyanobacterial "꽃"28으로 구상 될 수 있다. 현대 cyanobacterial 분류 가능한 가벼운 현미경, TEM, SEM을, 뿐만 아니라 분자 데이터33를 사용 하 여 모든 형태학 상 특징을 결합 합니다. 남조류의 점액...

SEM 분석 또는 phenotypic 종 식별에 원조 하는 효과적인 방법입니다. 이 세 가지 대표적인 유형의 생물의 특정 형태학 정보를 검사 하는 방법을 설명 합니다 프로토콜과 organismal 많은 기능 검사에 광범위 하 게 적용 될 것 이라고 및 조직 유형.

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

이 프로토콜은 두 가지 화학 건조 방법, Hexamethyldisilazane 및 T-butyl 알코올 및 SEM을 사용하여 대핵 및 진핵 생물을 모두 이미징하는 응용 프로그램에 중점을 둡니다. 이 기술의 주요 장점은 분석을 위해 샘플을 준비하기 위해 임계 점 건조기와 같은 특수 건조 장비를 사용할 필요가 없다는 것입니다. 이 프로토콜은 3가지 유형의 유기체에 대한 화학적 탈수 및 SEM 분석을 사용하는 방법을 설명하지만 많은 유기체 및 조직 유형을 검사하는 데 광범위하게 적용 될 것입니다.절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 학부 생인 매디슨 쿤(Madison Koon)이 될 것입니다. 시작하려면, 하룻밤 고정에 의해 시아노 박테리아를 준비합니다. 그런 다음 폴리카보네이트 25mL 필터를 포함하는 10mL 여과 장비로 이송합니다.여과 장비의 사이드암과 깔때기를 고무 스토퍼로 밀봉하여 깔때기의 문화를 억제합니다. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드럽게 진공 청소기를 청소하여 고정을 제거합니다. 단일 세포 조류 유글레노이드를 준비하려면 이전에 10 mL 여과 장비로 옮겨진 배양에 직접 4 % osmium 테트옥사이드 3 방울을 추가하여 수정하십시오.30 분 인큐베이션 후, 스토퍼를 모두 제거하고 여과 플라스크에 부드러운 진공 청소기를 제거합니다. 플라스크와 깔때기를 스토퍼로 닫고 세척을 유지하면서 실온에서 0.1 M 인산염 버퍼 pH 7.0의 5mL로 고정 된 유글레노이드를 세 번 세척하십시오. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드러운 진공으로 각 세척을 제거합니다.연속 침수를 유지하면서 시료를 탈수하려면 플라스크와 깔때기를 깔때기에 깔때기에서 에탄올을 포함하기 위해 스토퍼로 닫혀 있는 동안 깔때기에서 5mL의 부피로 10분 동안 등급이 매겨진 에탄올 계열을 사용한다. 두 스토퍼를 모두 제거한 후 여과 플라스크에서 부드럽게 진공 청소기를 제거하여 에탄올을 제거합니다. 샘플을 100% 에탄올이 함유한 일회용 알루미늄 계량 접시에 샘플을 전달하여 시료를 덮습니다.TBA를 사용하여 유글레노이드의 화학적 건조를 수행하기 위해 먼저 알루미늄 접시의 100% 에탄올 용액을 TBA 1~1용액과 100% 에탄올로 20분 간 교체하십시오. 그런 다음 1 대 1 솔루션을 100 % TBA로 20 분 동안 교체하고 프로세스를 두 번 반복합니다. TBA를 제거하고 샘플을 덮을 수 있는 충분한 신선한 100% TBA로 교체하십시오.TBA를 동결하기 위해 10분 동안 섭씨 4도에 접시를 놓습니다. 샘플을 냉동 젤 팩을 사용하여 진공 건조기로 옮기면 TBA를 동결하십시오. 로터리 펌프를 사용하여 진공을 대피하고 유지하여 냉동 TBA의 진공 승화로 시료를 3시간 이상 건조시 할 수 있습니다.아페노이드에 시아노박테리아를 장착하려면 25mm 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 라벨을 부착하여 위에 놓여있는 것을 나타냅니다. 그런 다음 각 필터를 스텁 상단에 고정된 탄소 접착제 탭에 놓습니다. Drosophila 멜라노가스터를 준비하기 위해, 마취 된 파리를 섭씨 4도에서 2 시간 동안 고정 된 1 mL에 담그고 완전히 물에 잠겼습니다.유리 파이펫을 사용하여 고정을 제거합니다. 고정 드로소필라 샘플을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 0.1M 인산염 버퍼 1mL, pH 7.2로 10분 동안 실온에서 3회 세척한다. 유리 파이펫을 사용하여 각 세척을 제거하여 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오.이어서, 각각 10분 동안 등급에 등급이 매겨진 에탄올 계열을 사용하여 1mL의 부피로 마이크로퍼지 튜브내의 샘플을 탈수한다. 유리 파이펫을 사용하여 각 세척을 제거하여 샘플을 제거하지 않도록 주의하십시오. 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브에 100%에탄올을 장착하여 샘플을 덮습니다.HMDS를 사용하여 파리의 화학 건조를 수행하기 위해 먼저 100% 에탄올 용액을 HMDS 1~2솔루션과 100% 에탄올로 20분 간 교체합니다. 그런 다음 솔루션을 HMDS 2~1솔루션과 100% 에탄올로 20분 간 교체합니다. 마지막으로 이 솔루션을 100% HMDS로 20분 간 교체한 다음 프로세스를 한 번 반복합니다.1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 및 HMDS에 있는 시료를 일회용 알루미늄 계량 접시에 옮기십시오. 100% HMDS를 시료를 덮을 수 있는 100%HMDS를 충분히 신선한 100% HMDS로 교체하십시오. 알루미늄 접시 내에 직접 샘플을 화학 연기 후드에 놓고 상자와 같은 느슨한 뚜껑으로 건조하여 이물질이 시료에 떨어지는 것을 방지하고 12~24시간 동안 건조시할 수 있도록 합니다.드로소필라 를 장착하려면 알루미늄 장착 스텁의 바닥에 라벨을 부착하십시오. 정밀 핀셋을 사용하여 말린 파리를 해부 현미경으로 스텁 상단에 고정된 탄소 접착제 탭에 원하는 위치에 배치합니다. 스텁의 바깥쪽 가장자리에 은 전도성 접착제를 적용합니다.이쑤시개를 사용하여 은페인트를 파리에 연결하여 전도도를 보장하여 페인트가 원하는 이미징 영역에 닿지 않도록 합니다. 스텁 홀더 상자에 스텁을 놓은 다음 열린 스텁 홀더 박스를 데시카이터에 넣고 실버 페인트가 3시간 이상 건조되도록 합니다. 스퍼터 코팅 장치를 준비하려면 아르곤 가스의 4 ~5 플러시를 수행하십시오.코팅할 샘플에 따라 타이머를 원고에 설명한 대로 다른 설정으로 설정합니다. 스퍼터는 제조업체의 지시에 따라 스텁을 코팅합니다. 마지막으로, 사용된 샘플에 의존하는 설정이 있는 이차 전자 검출기를 포함하는 스캐닝 전자 현미경을 이용한 이미지 샘플.이 프로토콜을 사용하여 SEM을 위한 시아노박테리아의 성공적인 준비는 세포의 모양과 질감을 포함하여 세포의 세부사항뿐만 아니라 세포에서 점액 및 투영의 칼집을 볼 수 있는 이미지를 산출했습니다. 콜로라도에서 필라멘트 담수 종의 SEM 이미지는 점액의 눈에 보이는 칼집을 보여줍니다. 오하이오에서 담수 박테리아의 SEM 이미지는 때때로 점액의 얇은 층에 의해 함께 개최 식민지를 형성하는 개별 세포를 보여줍니다.필라멘트와 같은 돌출은 개별 세포에서 확장됩니다. 텍사스 연안 해역의 높은 명분 하구에서 알 수없는 필라멘트 종의 이미지는 개인과 분할 세포를 보여줍니다. SEM은 두 개의 다른 유글레노이드 종의 펠리클 스트립을 시각화하는 데 사용되었다.모노모르피나와 아닉마티카를 모노모르피나 의사 피럼과 비교할 때, 후방 끝에서 나오는 펠리클 스트립의 눈에 보이는 발등 배열이 꼬리를 형성하여 종결에 대한 필로겐을 돕습니다. 정상적인 drosophila 눈의 SEM 이미지는 강모와 렌즈의 정렬 된 배열을 보여 주지만 알츠하이머 병과 관련된 단백질의 표현은 거친 눈 표현형을 만듭니다. 거친 눈 표현형을 억제하거나 향상시키는 유전자는 질병 진행에 생리적인 역할을 할 수 있습니다.다음은 이미지 수집 중에 나타나는 부족한 스퍼터 코딩으로부터 부적절한 건조 기술과 전자 충전으로부터 눈의 붕괴 구조의 예를 포함하여 피하기 위해 잠재적 인 구덩이 낙하의 예입니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 존경받는 공모와 매우 크게 생물을 활용하지만, 모든 생물학의 많은 하위 분야에 걸쳐 과학적 발견에 중요한 유용하고 형태학적 정보를 수집하기 위해 SEM 분석에 적합합니다. T-부틸 알코올, Hexamethyldisilazane, 그리고 osmium 테트옥사이드와 함께 일하는 것은 위험할 수 있으며, 적절한 안전 조치는 항상 사용자를 보호하기 위해 관찰되어야한다는 것을 잊지 마세요, 특히 이러한 화학 물질을 취급 할 학생.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

주사 전자 현미경(SEM)은 주로 생물학적 샘플의 표면 특징을 이미지화하는 강력한 도구입니다. 그러나 적절한 시료 전처리는 고품질 이미지를 얻는 데 매우 중요합니다. 이 비디오는 SEM을 위해 온전한 성인 초파리를 준비하는 탈수 및 건조 단계에 중점을 둡니다.

화학적 건조: 주사 전자 현미경(SEM)을 위한 생물학적 시료 준비

출처: Bucher, T. 외, 『B. subtilis 바이오필름 연구를 위한 소분자 바이오필름 억제제 특성화 모델로서의 방법론』. J. Vis. 경험(2016)이 영상은 고해상도 이미징을 위해 성숙한 박테리아 바이오필름 집락을 준비하는 과정을 보여줍니다. 고정, 탈수, 장착, 금속 코팅 단계를 다루어 바이오필름 형태를 보존하고 시각화합니다.

형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

주사 전자 현미경 관찰을 위한 생물학적 샘플 처리의 문제에는 세포 붕괴, 습한 미세 환경의 샘플 처리 및 세포 파괴가 포함됩니다. 꽃 분열 분열체, 난균 낭종 및 곰팡이(Agaricales)와 같은 까다로운 샘플을 준비하는 데 적합한 저렴하고 비교적 빠른 프로토콜이 여기에 컴파일되고 자세히 설명되어 있습니다.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

이 보고서는 두꺼운 생물학적 표본의 주사 투과 전자 단층 촬영을 수행하기 위한 샘플 준비 프로토콜과 특정 이미징 조건을 설명합니다.

주사 투과 전자 단층 촬영에 의해 준비 및 두꺼운 생물 샘플의 관측

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

여기에서, 우리는 주사 전자 현미경 검사법 (SEM)를 사용하여 섬세한 조직 견본을 화상 진찰을 위한 상세한 처리 프로토콜을 제시합니다. 세 가지 다른 처리 방법, 즉, hexamethyl disilazana (HMDS) 화학 건조, 간단한 공기 건조 및 임계 점 건조는 각각 경질 계란 껍질, 초기 발달 단계에서 배아 및 곰팡이 배양을 준비하기 위해 설명됩니다.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 프로토콜은 균근 진균으로 발아된 식물 조직 및 종자에서 진균 집락을 연구하기 위해 주사 및 투과 전자 현미경, 빛, 공초점 및 형광 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 적용하여 진균종속영양 식물 샘플을 수집, 고정 및 유지하기 위한 자세한 절차를 제공하는 것을 목표로 합니다.

균종속영양 식물 조직의 곰팡이 집락화 및 종자의 공생 발아를 해석하기 위한 현미경 기술

우리는 미생물군 및 생물막과 함께 식물 및 곰팡이 바이오매스를 포함하는 매우 이질적이고 섬세한 샘플을 시각화하기 위한 최적화된 주사 전자 현미경 프로토콜을 제안합니다. 이 프로토콜을 사용하면 미생물군 조직의 공간적 차원을 설명할 수 있습니다.

Attine Ants' Gardens의 미생물군: 주사 전자 현미경을 통한 미생물 풍경 시각화

우리는 sectioning, 고정, 삽입을위한 과정을 설명하고, 늦은 단계의...

의 전자 현미경을위한 배아의 준비 Drosophila 태아의 심장 관

학습하세요 화학 건조법을 이용한 스캐닝 전자 현미경 기술로 시아노박테리아, 유글레노이드 및 Drosophila melanogaster의 형태학적 특징을 분석하는 방법입니다. 이 기법은 특수 장비 없이도 세포 구조와 표면 질감을 명확하게 시각화할 수 있습니다.

스캐닝 전자 현미경 (SEM)에서 형태소 분석에 대 한 화학 건조를 사용 하 여 간결한 진 핵 유기 체의 준비

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