Name: Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: 배우세요 Candida albicans 유전체 편집을 위한 CRISPR 기반 효율적인 프로토콜입니다. 이 방법은 진균 병원성 연구와 새로운 치료제 개발에 필수적인 정밀한 유전자 변형을 가능하게 합니다.

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저자는 독서에 대 한 박사 Gennifer Mager 감사 및 원고에 대 한 유용한 의견. 이 작품 볼 주립 대학교 실험실 시작 자금 및 NIH-1R15AI130950-01 D.A.B.에 의해 지원 되었다

1. 식별 및 가이드 RNA 시퀀스의 복제
<ol><li>
가이드 RNA 시퀀스의 식별
	<ol>
<li>5'-NGG-3 식별 ' 정지 codon 삽입 되는 위치에 가까운 팸 시퀀스. (그림 1A) 표시 된 팸 시퀀스 모두에서 발견 된다 TPK2 (그림 1A)의 처음 100 기본적인 쌍. 참고: Http://osf.io/ARDTX 11,12각 C. albicans 열려있는 독서 프레임을 대상으로 하는 가이드 시퀀스를 찾을 수 있습니다.</li>
		<li>20 있을 것입니다 앞으로 가이드 Primer_3 시퀀스 식별 기지 직접 상류 NGG 팸의 사이트 및 5 개 이상 포함 되지 것입니다 연속에서 Ts. 직접 기초에 왼쪽 상류 끌어서 NGG의 커서 20 기초, 다음 추가 뇌관 뇌관 탭에 클릭.</li>
		<li>앞으로 가이드 시퀀스에 보완 될 것입니다 반대로 가이드 Primer_3 시퀀스를 식별 합니다. 참고: PAM_3를 사용 하는 가이드는 표시 (그림 1B).</li>
		<li>뇌관을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "뇌관 데이터 복사" 선택 합니다. 텍스트 편집 프로그램에는 시퀀스를 붙여 넣습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(표 1, 그림 1B) 복제를 촉진 하기 위하여 앞으로 반전 가이드 oligos에 걸리다 시퀀스를 추가 합니다.
	<ol>
<li>구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 ATTTG를 추가 합니다.</li>
		<li>구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 3' 끝에 G를 추가 합니다.</li>
		<li>구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 AAAAC를 추가 합니다.</li>
		<li>구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 3' 끝에 C를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
BsmBI와 다이제스트 CaCas9 식 벡터 pV1524입니다. 참고: pV1524 포함는 암 피 실린 (앰프r)과 nourseothricin (Natr). Cas9 C. albicans코 돈 최적화 되었습니다.<ol>
<li>추가 하 여 플라스 미드를 소화: pv1524, 버퍼 x 10의 5 μ, BsmBI, 그리고 H의 1 μ의 2 μ g을 1.5 mL 튜브에 50 μ2O. 20 분 55 ° C에서 품 어 (또는, pv1524 Esp3I, 37 ° c.에 BsmBI의 isoschizomer와 함께 15 분 소화)</li>
		<li>실내 온도 (RT) 고 스핀 30에 대 한 튜브의 하단에 응축을가지고 2,348 x g 에서 s. 1.4 단계로 진행 또는-20 ° c.에 소화 플라스 미드를 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인산 가수분해 효소 소화 등뼈를 취급 합니다.
	<ol>
<li>종 아리 장 인산 가수분해 효소 (CIP)의 1 μ 소화 혼합물에 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>상업적으로 사용할 수 있는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 정화 키트 (키트와 함께 제공 하는 지침)를 사용 하 여 소화 플라스 미드 정화 하 고 차입 버퍼 (EB)의 30 μ에 elute.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Phosphorylate 고 anneal 가이드 Primer_3 앞으로 반전 가이드 Primer_3.
	<ol>
<li>추가 앞으로 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3, 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3 역, 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 및 H2O를 PCR 튜브의 43 μ.</li>
		<li>두 번째 PCR 튜브에서 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 그리고 분자 생물학 급 H2O의 44 μ를 추가 합니다. 참고: 이 부정적인 제어 될 것입니다.</li>
		<li>다음 5 분 동안 95 ° C에서 30 분 동안 37 ° C에서 thermocycler에서 반응 혼합물을 품 어.</li>
		<li>Anneal에 16 ° C에 느린 경사로 속도에 혼합물을 냉각, oligos. 다음 4 ° c.에 단련 된 oligo 혼합물을 놓습니다</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1.4.3 단계에서 소화 pv1524로 단련된 oligos를 선.
	<ol>
<li>PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ, 단련된 올리고 믹스의 0.5 μ 1 μ CIP 처리 소화 플라스 미드 (20-40 ng) 및 H2O 10 μ 총 볼륨을 정화.</li>
		<li>PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ의 1 μ 소화 CIP 처리 정화 벡터 (20-40 ng), 부정적인 컨트롤 혼합, 그리고 H2O 10 μ 총 볼륨 최대의 1 μ.</li>
		<li>다음 10 분 동안 65 ° C에서 30 분, 16 ° C에서 thermocycler 두 튜브를 품 어 다음 25 ° c에 냉각</li>
	</ol>
</li>
	<li>결 찰 혼합물의 5 μ를 화학적으로 유능한 병원 성 대장균 DH5α 표준 열 충격 변환 프로토콜을 사용 하 여 변환 합니다. LB 앰프/Nat 미디어 (200 μ g/mL 앰프, 50 μ g/mL Nat) 선택 합니다. 참고: PV1524와 더블 선택 미디어에 파생 상품 선택 실패 Nat/CaCas9/가이드 모듈의 손실 FLP/FRT 절단 박테리아에 의해 발생 합니다.</li>
	<li>Miniprep에 의해 4 개의 transformants에서 플라스 미드를 정화 하 고 시퀀싱 뇌관 (표 1) 삽입 시퀀스를 시퀀스. 참고: 4 transformants를 시퀀싱 하는 시간의 대부분 적어도 1 정확한 복제를 식별 하기 위해 충분 하다.</li>
	<li>잘라-20 ° c.에 사이트 BsmBI에 한 번 복제 가이드 RNA 순서 있는 플라스 미드를 저장</li>
</ol>2. 설계 및 수리 서식 파일의 생성
<ol><li>유전자 시퀀스에 정지 codon 및 제한 소화 사이트 (그림 1C표 1) 인코딩 뉴클레오티드를 추가 하 여 정지 codon를 삽입 합니다. 참고: 삽입 팸 시퀀스를 중단 됩니다. 참고: 제한 소화 사이트 클론 (그림 1C)의 효율적인 심사를 용이 하 게 복구 템플릿 순서로 포함 됩니다.</li>
	<li>10 돌연변이 만들 수의 하류 기초 끌어서 커서 60 기초 상류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 이 복구 템플릿 Forward_3을 추가 합니다. 10 돌연변이 만들 수의 상류 기초 끌어서 커서 60 기초 하류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 복구 템플릿 리버스 3 추가 됩니다. (그림 1C)</li>
	<li>
뇌관 연장 수리 서식 파일 생성을 수행 합니다.
	<ol>
<li>100 μ m 복구 템플릿 앞으로 뇌관, 100 μ m 복구 템플릿 리버스 뇌관의 1.2 μ, deoxynucleotide 된 (dNTPs)의 6 μ의 1.2 μ 추가 (총 농도 40 m m), 6 버퍼, Taq 중 합 효소 (3 단위)의 0.6 μ H2O 4 PCR의 각각의 45 μ의 μ 튜브입니다.</li>
		<li>뇌관 연장 PCR의 20과 30 라운드 사이의 실행을 수행 합니다. 예제 확장 조건: 95 ° C에서 2 분 (30 s 95 ° C, 50 ° C, 68 ° C에서 1 분에 1 분에서) x 34, 68 ° c.에서 10 분</li>
		<li>1.5 mL 튜브에 모든 4 PCR 튜브의 내용을 결합 하 고 PCR 정화 키트를 사용 하 여 H2o.의 50 μ에서 제품을 정화</li>
		<li>뇌관 연장 제품 260에서 흡 광도 결정 하 여 충분 한 DNA를 확인을 quantitate nm. 참고: 뇌관 연장 제품의 전형적인 마지막 농도 ~ 200-300 ng / µ L.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. C. albicans 복구 템플릿 및 플라스 미드의 변화
<ol><li>
테/리튬 아세테이트를 확인 합니다.
	<ol>
<li>믹스 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, 100 m m 리튬 아세테이트, 그리고 H2O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
플레이트 만들기
	<ol>
<li>믹스 40% 말뚝 3350, 100 m m 리튬 아세테이트, 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, H2O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
소화 단계 1.9에서에서 올바르게 복제는 플라스 미드.
	<ol>
<li>플라스 미드, 10 x 버퍼의 4 µ L, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.4 µ L의 10 μ g, 0.5 µ L KpnI의, SacI의 0.5 µ L 및 H20 ~ 40 µ L 총 1.5 mL 튜브에 볼륨. 37 ° C에서 하룻밤 (그림 1D) 품 어.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
C. albicans SC5314, 야생-타입 prototroph OD600 6 미만 이상적으로 0.27 m m Uridine (YPD + Uri), 보충 효 모 펩 포도 당에서 25 ° C에서의 숙박 문화를 성장.
	<ol>
<li>2,348 x g 에 5 분 동안 회전 하 여 5 세600 단위 변환 당 세포의 작은 고 5 세600 100 µ L 테/리튬 아세테이트에 수송과 셀의 중단.</li>
	</ol>
</li>
	<li>나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 단계 3.4.1, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 플라스 미드 소화 단계의 3.3.1, 순화 된 복구 서식 4) 6 µ g의 3) 10 µ g의 2) 40 µ L에서에서 세포의 1) 100 µ L 및 5) 접시의 1 mL.</li>
	<li>나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 셀의 1) 100 µ L, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 3) H2O 볼륨 단계 3.5 판의 4) 1 mL에서 DNA 변형의 동등의 2) 40 µ L. 참고:이 부정적인 제어 될 것입니다.</li>
	<li>Pipetting으로 변환을 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 25 ° C에서 품 어 보자.</li>
	<li>열 44 ° C 물 목욕 25 분에 배치 하 여 세포를 충격.</li>
	<li>벤치탑 원심 분리기에서 2,348 x g 에 5 분 동안 회전 시키십시오 하 고 표면에 뜨는 접시 혼합물을 제거 합니다. 2,348 x g에서 YPD + Uri와 다시 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 여 한 번 세척.</li>
	<li>0.1 ml YPD + Uri의 세포를 중단 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 25 ° C에서 셰이 커에 품 어.</li>
	<li>플레이트와 200 μ g/mL nourseothricin YPD + Uri에. 식민지는 2-5 일에 표시 됩니다.</li>
</ol>4입니다. 단일 식민지를 위한 줄무늬
<ol><li>
분기에는 100 x 15 mm 페 트리 접시를 분할 하 고 각 사분면을 라벨.
	<ol>
<li>사분면의 긴 측면에 걸쳐 메 마른이 쑤 시 게 또는 주걱와 행진 변환 접시에서 식민지 중 하나를 터치 합니다.</li>
		<li>무 균 기술을 사용 하 여 단일 식민지를 위한 streak 고 30 ° C에서 2 일 동안 성장 식민지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5입니다. 식민지 PCR
<ol><li>
앞으로 체크 뇌관 (FCP) ~ 200 기지 상류의 쌍 도입 된 제한 사이트 및 역방향 체크 뇌관 (RCP) ~ 300 자료 쌍 하류 디자인.
	<ol>
<li>FCP, RCP, 내 중 합 효소 (ExTaq 1.5 단위)의 0.3 μ, dNTPs의 3 μ의 0.3 μ의 0.3 μ 추가 (총 농도 40 m m), 3 ExTaq 버퍼, 그리고 H2O 1.5 mL 튜브에의 23 μ의 μ. 참고: 0.5 μ/반응 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 추가 PCR 효율을 개선할 수 있습니다.</li>
		<li>4.1.2 단계에서 단계 5.1.1, P10 피 펫 팁을 사용 하 고는 agar를 방해 하지 않도록 주의 복용에서 혼합물 단일 효 모 식민지의 0.25 μ를 추가 합니다.</li>
		<li>PCR에 의하여 DNA를 증폭 하 고 증폭 성공, 튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 되도록 젤에 PCR의 5 μ를 실행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 식민지 PCR의 제한 소화
<ol><li>추가 10 μ의 PCR 제품 (튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않기로 돌), 버퍼의 3 μ, 제한 효소, 1 μ H2O, 16 μ 그리고 제조업체의 지침에 따라 품 어 리를 식별 하는 agarose 젤에 해결 ct 게놈 편집입니다. 참고: 여기에서 사용 하는 제한 효소 TPK2 특정 복구 서식 파일에 인코딩 하는 사이트입니다.</li>
</ol>7. 종자 저장
<ol><li>성장 제한 소화 YPD + Uri에서 30 ° c.에 의해 확인 된 식민지에서 숙박 문화</li>
	<li>스토리지-80 ° c.에 대 한 적합 한 튜브를 1 mL의 문화 및 (글리세롤의 최종 농도 25%를 데리고) 50% 글리세롤의 1 mL을 추가</li>
	<li>-80 ° c.에 정확한 복제품을 저장하시오 참고: 올바른 종자 몇 년 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
</ol>8. Natr 마커 제거
<ol><li>효 모 펩 糖 (YPMaltose)에 올바른 transformant 행진 (2% 糖).</li>
	<li>질주 된 접시에서 식민지를 선택 하 고 액체 YPMaltose 20 g/L 맥 아당에서 30 ° C에서 48 h에 대 한 효 모 문화.</li>
	<li>YPMaltose 20 g/L 맥 아당에 200-400 셀 접시 하 고 24 시간에 30 ° C에서 품 어.</li>
	<li>YPMaltose 및 YPMaltose 200 μ g/mL 자연과학에 접시를 복제</li>
	<li>24 h 30 ° C에서 품 어. 참고: 더 이상 YPMaltose 200 μ g/mL nourseothricin에 성장 하지만 YPMaltose에 성장 식민지 Natr 마커 (CaCAS9)을 잃 었 하 고 RNA를 안내 합니다.</li>
	<li>Natr 마커 (CaCAS9) 및 가이드 RNA 7.1-7.3 단계에서 다 잃은 긴장을 저장 합니다. 참고: 유사한 플라스 미드, pV1393, SAP2 MAL2 promotor 반대로 사용합니다. YCB-BSA에 성장 pV1393 유전자 편집에 사용 되는 경우 flippase 및 Natr 의 제거를 유발 한다.</li>
</ol>

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<li>Nguyen, N., Quail, M. M. F., Hernday, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient%2C+Rapid%2C+and+Recyclable+System+for+CRISPR-Mediated+Genome+Editing+in+Candida+albicans%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">An Efficient, Rapid, and Recyclable System for CRISPR-Mediated Genome Editing in Candida albicans.</a> mSphere. 2 (2), (2017).</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

C. albicans CRISPR C. albicans 게놈에 효율적으로 편집합니다. pV1524 인코딩 효 모 코 돈 최적화 Cas9 하 고 조사 쉽게 CaSNR52 발기인 (그림 1)11의 하류 가이드 RNA 시퀀스를 복제할 수 있다 그런 설계 되었습니다. 그것은 그 가이드 시퀀스의 단일 복사본만 복제 되었습니다 CaCas9 식 벡터에 시퀀싱에 의해 여분의 사본 게놈 편집 방해 것으로 보장 해야 합니다. 가이드의 여러 복사본을 지속적으로 도입 하는 경우 한 결 찰에 사용 된 단련된 가이드의 농도가 낮은 해야 합니다. 벡터 및 프로토콜 설명 어떤 C. albicans 유전자의 수 있습니다. C. albicans 는 2 중만 단일 변환은 유전자의 두 대립 유전자를 대상으로 필요 합니다. 또한, CRISPR-CaCas9 게놈 편집의 processive 자연 유전자 가족의 여러 구성원을 대상으로 연구를 수 있습니다. 분 비 aspartyl 프로 테아 제 (얼 간) 및 agglutinin와 같은 시퀀스 단백질 (ALS) 등 많은 유전자 가족은 C. albicans 독성에 대 한 중요 합니다. CRISPR를 편집 하는 게놈이 유전자 가족의 조사를 촉진할 것 이다.
위에서 설명한 프로토콜 null (그림 2)에 해당 하는 phenotypic 결과 열려있는 독서 프레임 정지 codon를 소개 합니다. 다양 한 유전 교대 복구 서식 파일을 변경 하 여 만들 수 있습니다. 넌센스, missense, 및 침묵 돌연변이 재결합 적절 한 수리 템플릿을 통해 삽입할 수 있습니다. 제한 사이트의 합리화 transformant 심사로 그 없이12,13시퀀싱 하 여 검사 해야 합니다. 또한, C. albicans CRISPR 선호도 태그를 삽입 하 고 promotor 스왑, 수행 하 고, 녹아웃 (그림 3)를 생성 하는 이상적인 시스템을 만드는 연구자를 삽입 및 삭제, 생성에 있습니다. 이 돌연변이 대 한 올바른 transformants에 대 한 심사 복구 서식 파일의 올바른 결합을 확인 하는 편집을 시퀀싱 하는 데 필요한 만큼 더 힘 드는입니다. 또한, 남부 오 유전자의 복사본을 추가로 게놈에 추가 위치에 삽입 되지 않습니다 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. NGG 팸 사이트의 요구 사항을 대상으로 지정할 수 있는 게놈의 지역에 약간의 제한 배치 합니다. 대체 nucleases Cpf1 등을 사용 하는 대체 CRISPR 시스템의 개발 또는 유사 시스템 가지고/지 Cas9에 많은 이러한 제한14경감. 이 이번에 수 사관의 지식, 이러한 시스템 하지 아직 적용 되었을 C. albicans에.
그런 종 Saccharomyces cerevisiae, 인간의 병원 체 Candida glabrata11, Naumouozyma castellii, 등의 다양 한 적용 될 수 있습니다 위의 프로토콜에서 설명 하는 CRISPR 시스템 개발 되었습니다. . 변환 및 효율적인 편집이 효 설명된 프로토콜에 약간의 변화를 필요 하지만 이러한 대체 게놈을 편집 하기 위해 프레임 워크는 C. albicans12에 대 한 설명에 비슷해. 또한, 효 모 게놈 편집 하는 절차를 개발 하는 우수한 메커니즘을 제공 합니다. 효 모, ADE2 돌연변이 때 아데닌 생 합성 통로에 전조 축적, 붉은 세포를 선회. 이 쉽게 관찰 표현 형 조사가 편집된 셀을 식별 하 고 신속 하 게 게놈 프로토콜 편집을 문제 해결을 수 있습니다. 버섯에 사용할 수 있는 광범위 한 분자 생물학 도구 상자와 함께, 수많은 효 모 종 편집에 대 한 프로토콜 개발된15,16되었습니다. 곰 팡이에 게놈 편집 기술의 광범위 한 응용 프로그램 다양 한 과학 분야에 큰 영향을 미칠 가능성이 있다.
CRISPR는 크게 C. albicans에 게놈 엔지니어링의 효율성 개선 하지만 CRISPR까지 사용 되지 않은 C. albicans의 게놈 넓은 스크린을 수행 하. C. albicans 에 통로 합류 nonhomologous 끝은 비효율적인12현재 프로토콜 변이 소개 하는 수리 서식 파일이 필요 합니다. 모든 유전자에 대 한 복구 템플릿 oligos의 세대는 게놈 넓은 스크린의 실행에 상당한 장벽이 다. DNA 합성 및 CRISPR 기술 발전의 감소 비용의 합류 더 실현 가능한 삭제 라이브러리의 개발을 하게된다. 예를 들어, CaCas9 벡터에서 복구 서식 파일의 표현 대상으로 모든 유전자11지속 가능한 플라스 미드 라이브러리의 개발에 대 한 방법을 포장 한다. 또한, CaCas9 식 벡터 C. albicans 게놈으로 통합을 요구 하지 않는 과도 Candida CRISPR 프로토콜 개발된17되었습니다. 또한, 증가 효율18편집 가이드 식 증가 게놈. 이들은, 그리고 CRISPR 기술, 다른 진보는 C. albicans19,20,,2122게놈 넓은 스크린의 발전에 중요 한.
C. albicans 게놈은 2 중, A 및 B 대립 유전자는 항상 동일한5. 이러한 heterozygosity 모두 도전과 기회를 제공합니다. 만약 한 두 대립 유전자를 대상 하는 것을 목표로, 팸 사이트, 가이드 시퀀스, 및 유전자의 두 복사본에 행동 한다 복구 서식 파일을 사용 해야 합니다. 그러나, C.albicans CRISPR 시스템 단일 대립 유전자를 대상으로 조사 수 있습니다 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 유전자에 존재에 따라. 이러한 정밀 검사 대립 유전자 사이의 기능적 차이를 조사 수 있도록 가능성이 있다. 특정 대립 유전자를 대상으로 수행 되어야 합니다 신중 하 게, 손실 heterozygosity (LOH) 대립 유전자 또는 전체 염색체의 관찰 되었습니다. 단일 C. albicans 편집할 때 대립 유전자, 하나의 클론은 2 중 SNP 프로필을 유지 하는 경우 확인 하려면 인접 한 DNA 시퀀스를 검사 해야 합니다. 또한, 오프 대상 효과 C. albicans CRISPR에 대 한 매우 낮은 하지만 전체 게놈 시퀀싱 주요 변종에 대 한 간주 될 수 있습니다.

Candida albicans 는 가장 널리 퍼진 인간 곰 팡이 병원 체1,2,3. C. albicans 및 포유류 분자 생물학의 이해 차이 항진균 치료제의 다음 세대의 개발에 매우 중요 하다. 신속 하 고 정확 하 게 유전자 조작 C. albicans수를 조사 해야 합니다.
C. albicans 의 유전자 조작 역사적으로 도전 하고있다. C. albicans 플라스 미드를 유지 하지 않습니다, 그리고 따라서 모든 구조는 게놈으로 통합 되어야 합니다. 또한, C. albicans 는 2 중; 따라서, 유전자 밖으로 노크 하거나 소개 하는 돌연변이, 그것 중요 한 경우 되도록 복사본 모두 변경된4되었습니다. 또한, 일부 C. albicans loci heterozygous, 더 복잡 한 유전 심문5있습니다. C. albicans유전자 조작 동종 재결합6의 여러 라운드를 수행 하는 일반적입니다. 그러나, 게놈 및 힘 드는 구조 개발의 2 중 특성이 만들었습니다이 잠재적으로 지루한 과정을, 특히 여러 변경이 필요한 경우. 이러한 제한 및 C. albicans 의 의학 중요성 조사 C. albicans 게놈 보다 쉽게 조작할 수 있도록 새로운 기술 개발을 요구 한다.
정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 클러스터-중재 게놈 편집 연구자는 게놈의 순서를 변경할 수 있는 강력한 도구입니다. CRISPR 세 가지 구성 요소가 필요 합니다: 대상 DNA 앞 1) Cas9 nuclease 2) 20 시퀀스, 관심의 대상으로 Cas9 가이드 RNA를 기반 및 3) 복구 템플릿 DNA 분열 사이트를 복구 하 고 만들어진된 변경7, 통합 하는 8. 일단 가이드 제공 대상 게놈 시퀀스 Cas9, Cas9 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 (NGG) 필요 직접 DNA9다니엘 가이드 시퀀스의 업스트림. 모두 20 기본 가이드 및 팸 시퀀스 특이성을 표적으로 하기의 높은 학위를 제공 하 고 제한 대상에서 분열.
CRISPR 시스템은 다양 한 생물의 게놈 편집과 다양 한 문제10태 클을 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 관심사의 C. albicans 유전자를 편집 하기 위해 유연 하 고 효율적인 CRISPR 프로토콜이입니다. 실험 번역 종료를 일으키는 원인이 되는 유전자를 정지 codon를 소개 합니다. 다른 편집 도입 수리 템플릿에 따라 만들 수 있습니다. 조각 nourseothricin (Natr)로 표시 된 효 모에 포함 된 코 돈 최적화 된 Cas9 (CaCas9)과 가이드 RNA 중립 사이트에서 C. albicans 게놈으로 통합 됩니다. Cotransformation 복구 서식 파일 인코딩을 원하는 돌연변이와 동종 재결합 하 고 효율적인 게놈 편집 분열의 복구 이끌어 낸다. 아래에서 설명 하는 것은 TPK2, 하지만 모든 C. albicans 오픈 프레임 대상으로 지정할 수 여러 번 CRISPR에 의해 읽기의 편집 이다. CRISPR 시스템 FRT 사이트에 의해 형벌 이다 고 flippase CaCas9 식 플라스 미드에 인코딩된의 유도 의해 C. albicans 게놈에서 제거할 수 있습니다. C. albicans CRISPR 시스템에는 정확 하 고 빠르게 편집 C. albicans 게놈11,12조사 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agares</td><td>BD Bacto</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>agarose</td><td>amresco</td><td>0710-500G</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>BD Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bsmb1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>송아지 장 인산가수분해효소(CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290L</td><td></td></tr><tr><td>컷 스마트 버퍼</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>3609</td><td></td></tr><tr><td>빙하 아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2810000ACS</td><td></td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>BDH VWR 분석</td><td>BDH9230</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>Kpn1</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>MP</td><td>3002-032</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>L-트립토판</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>맥아당</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5885</td><td></td></tr><tr><td>분자생물학 물</td><td>시그마-알드리치</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>NEB3.1 버퍼</td><td>뉴잉글랜드 Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>누르세오트리신</td><td>베르너 바이오에이전트</td>스 <td>74667</td><td></td></tr><tr><td>폴리(에틸렌 글리콜) PEG 3350</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>Sac1</td><td>New England Biolabs</td><td>R3156L</td><td></td></tr><tr><td>연어 정자 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9680</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Taq 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0267X</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>우리딘</td><td>시그마-알드리치</td><td>U3750</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>BD Bacto</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Equipment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrophoresis Appartus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR machine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>복제 도금 장치</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rollerdrum 또는 셰이커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 crispr 중재

CRISPR-mediated Genome Editing of the Human Fungal Pathogen Candida albicans

이 메서드는 2 중 인간 곰 팡이 병원 체의 효율적인 CRISPR 중재 게놈 편집에 대해 설명 합니다 Candida albicans. Cas9, 요구 한다 CRISPR 중재 게놈 C. albicans 에서 편집 RNA, 안내 및 서식 파일을 복구. 플라스 미드 표현 하는 효 모 코 돈 최적화 Cas9 (CaCas9)가 생성 되었습니다. 시퀀스를 안내는 팸에서 직접 본 사이트 (NGG) Cas9 식 벡터에 복제 됩니다. 복구 서식 파일 다음 뇌관 연장에서 시험관에의해 이루어집니다. C. albicans 에 복구 템플릿 및 벡터의 cotransformation 게놈 편집 이끌어 낸다. 사용 된 복구 서식 파일에 따라 조사 뉴클레오티드 변경, 삽입 또는 삭제를 발생할 수 있습니다. C. albicans 는 2 중으로 변이 만들어집니다, 유전자의 두 대립 유전자에는 A 및 B 대립 유전자에 Snp를 대상으로 가이드와 함께 방해 또는 복구 템플릿 법인 항구 하지 않습니다. 모든 가족 구성원에 적합 한 보존된 시퀀스 있으면 소스의 유전자 가족 동시에 편집할 수 있습니다. C. albicans CRISPR 시스템 설명 FRT 사이트에 의해 형벌 이다 고 flippase를 인코딩합니다. Flippase의 유도 따라 항생제 마커 (CaCas9) 및 가이드 RNA 게놈에서 제거 됩니다. 게놈을 연속을 편집을 수행 하기 위해 탐정 수 있습니다. C. albicans CRISPR 강력한 곰 팡이 유전 공학 도구 이며 사소한 변경 설명된 프로토콜에 다른 균 종 등 C. glabrata, N. castellii, S. cerevisiae의 수정을 허용 합니다.

시퀀스의 가이드 C. albicans TPK2, 대상 복구 서식 파일 및 RNAs c 앰프 니 촉매 소 단위, 위에 제안한 지침에 따라 설계 되었습니다. 시퀀스 (표 1, 그림 1)에 표시 됩니다. 가이드 RNAs CaCas9 식 벡터에 복제 되었고 야생-타입 C. albicans서식 파일 복구 cotransformed. 에코리 제한 소화 사이트 복구 서식 파일에서 정지 codons 팸 사이트 중단 및 올바른 돌연변이 (그림 1)에 대 한 심사를 용이 하 게. Transformants 단일 식민지를 위한 줄무늬 그리고 복구 템플릿 (그림 2)의 설립에 대 한 식민지 PCR 및 제한 소화에 의해 상영. 제한 소화는 신속 하 게 돌연변이 시퀀스에서 야생-타입을 구분합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Oligonucleotide 이름</td>
			<td>Oligonucleotide 시퀀스</td>
		</tr>
<tr>
<td>앞으로 가이드 Primer_3</td>
			<td>
ATTTGgggtgaactatttgttcgccG
</td>
		</tr>
<tr>
<td>역 가이드 Primer_3</td>
			<td>
AAAACggcgaacaaatagttcacccC
</td>
		</tr>
<tr>
<td>복구 템플릿 Forward_3</td>
			<td>tcagcaatatcagcaacaatttcaacaaccgcagcaacaactttatTAAGAATTCggcga</td>
		</tr>
<tr>
<td>복구 템플릿 Reverse_3</td>
			<td>attttgtccagtttgggctgcagcagggtgaactatttgttcgccGAATTCTTAataaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>앞으로 체크 뇌관</td>
			<td>ttaaagaaacttcacatcaccaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>역방향 확인 뇌관</td>
			<td>actttgatagcataatatctaccat</td>
		</tr>
<tr>
<td>시퀀싱 뇌관</td>
			<td>ggcatagctgaaacttcggccc</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1:이 연구에 사용 하는 올리고 뉴클레오티드의 목록. 사이트 목적 복제에 대 한 추가 대문자로 하 고 가이드 뇌관에 굵게 시퀀스. 게놈 DNA를 변형 복구 서식 파일에서 시퀀스는 대문자로 하 고 굵게.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig1.jpg"> 그림 1 : 가이드 RNA 및 복구 템플릿 디자인의 다이어그램. (A)의 TPK2의 처음 100 개의 뉴클레오티드의 모든 PAM 시퀀스 표시. 이 연구에서 사용 하는 순서는 팸 시퀀스 3 (PAM_3) 강조 표시 됩니다. (B) 가이드 RNA PAM_3를 사용 하 여 디자인 합니다. SnapGene를 사용 하 여 디자인의 기본 뇌관 20 개는 소문자 파란색입니다. 복제에 필요한 추가 기지 오프셋 표시와 녹색 있습니다. (C) 수리 TAA 정지 codon 및 에코리 사이트 템플릿 뇌관 TPK2 독서 프레임에 삽입 됩니다. 야생-타입 시퀀스와 다른 DNA는 빨간색과 대문자. (D) 예 방법 가이드는 PAM_4를 사용 하 여 DNA의 긍정적인 물가에 설계 되었습니다. (E) 가이드 RNA와 KpnI와 SacI 소화의 복제 후 pV1524의 회로도. Neut5L-5'-Neut5L-3' C. albicans 게놈에 있는 Neut5L 사이트에 벡터를 대상. CaENO1p promotor를 누 룩에 최적화 된 CaCas9의 표현 이다. Natr nourseothricin 저항 카세트입니다. CaSNR52p promotor 운전 가이드 RNA 식 (sgRNA) 이다. FRT 사이트 죽 습 고 flippase (FLP) flippase 식 시 CRISPR 카세트를 제거 하 여 재결합. 회로도 (E)와 유사한 Vyas 외에 의해 출판 되었다. 11. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig2.jpg"> 그림 2 : 소개 및 정지 codon 그리고 에코리 제한 사이트 TPK2를 확인. 뇌관 증폭에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다. 야생-타입 및 돌연변이 시퀀스 젤 아래 표시 됩니다. 이 그림은 Vyas 외.11에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58764/58764fig3.jpg"> 그림 3 : 삭제 (A) 및 (B) 삽입 생성 복구 템플릿 설명 만화. 회색 (A)에 대시 묘사 중간 시퀀스 복구 템플릿 뇌관에는 없음. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58764/58764fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

Candida albicans 의 효율적인 게놈 엔지니어링 pathogenesis 및 치료제의 개발을 이해 하는 데 중요 하다. 여기, 우리는 신속 하 고 정확 하 게 편집 C. albicans 게놈 CRISPR를 사용 하 여 프로토콜을 설명. 프로토콜에는 다양 한 유전 수정 점 돌연변이, 삽입, 삭제 등을 소개 하는 조사 수 있습니다.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

This method describes the efficient CRISPR mediated genome editing of the diploid human fungal pathogen Candida albicans. CRISPR-mediated genome editing ...

이 방법은 분자 수준에서 곰팡이와 포유동물의 차이를 밝히는 데 도움이 될 수 있습니다. 이러한 차이는 새로운 치료 접근 방식을 식별하기 위해 활용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 고전적인 상동성 재조합 기술보다 C.Albicans의 게놈을 보다 효율적으로 수정한다는 것입니다.가이드 RNA 서열을 식별하기 위해 정지 코돈이 삽입되는 위치에 가까운 NGG PAM 서열을 식별한다. 여기에 도시된 모든 PAM 서열은 TPK2의 첫 번째 100베이스 쌍, 순환 AMP 키나아제 촉매 서브유닛에서 발견되는 모든 PAM 서열이다. 전방 가이드 프라이머 3개의 시퀀스를 식별합니다.이 시퀀스는 NGG PAM 사이트의 상류에 있는 20개의 기지가 될 것이며 5개 이상의 T를 연속으로 포함하지 않습니다. NGG의 바로 상류의 베이스를 클릭하고 커서 20 베이스를 드래그합니다. 그런 다음 프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다.이제 역방향 안내서 프라이머 3개의 시퀀스를 식별하여 앞으로 가이드 시퀀스에 대한 칭찬이 됩니다. NGG의 바로 상류에 있는 베이스에 핥고 커서 20베이스를 드래그합니다. 각 프라이머에 대해 프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다.프라이머를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 복사 프라이머 데이터를 선택합니다. 시퀀스를 텍스트 편집 프로그램에 붙여 넣습니다. 오버행 시퀀스를 추가하여 앞으로 및 역방향 가이드 올리고스를 추가하여 복제를 용이하게 합니다.뉴클레오티드 서열 ATTTG를 전방 가이드 프라이머 3의 5개의 프라임 엔드에 추가하고 3개의 전방 가이드 프라이머프라이머의 3개의 프라임 엔드에 G를 추가한다. 마지막으로, 뉴클레오티드 서열에서 AAAAC는 역가이드 프라이머 3의 5개의 프라임 엔드로 구매하기 전에 역가이드 프라이머 3의 3개의 프라임 엔드에 C를 첨가한다. 염료는 1.5 밀리리터 튜브에 pv1524, 10x 버퍼, bs9b1 및 물을 50 마이크로 리터에 추가하여 칸디다 최적화 된 cas9 발현 벡터를 테스트하고 20 분 동안 섭씨 55도에서 배양합니다.소화 혼합물을 실온으로 식히고 2348회 G에서 30초 간 회전하여 튜브 바닥에 응축을 가져옵니다. 인산염을 소화된 백본을 치료하려면, 종아리 장내 인산염 1마이크로리터를 소화 혼합물에 추가합니다. 1시간 전에 섭씨 37도에서 반응을 배양합니다.지금, 인광 및 멸폐 앞으로 가이드 프라이머 3 및 역 가이드 프라이머 3, 10 x T4 리간제 버퍼와 결합 하 여, T4 폴리 뉴클레오티드 키나아제, 그리고 PCR 튜브에 물. 10x T4 리개아제 버퍼, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 분자 생물학 등급 물을 두 번째 PCR 튜브에 음의 대조군으로 추가합니다. 온도 순환기에서 30분 동안 37도, 섭씨 95도에서 5분간 반응 혼합물을 배양합니다.가장 느린 경사로 속도로 혼합물을 냉각하여 섭씨 16도까지 냉각하여 올리고를 음침합니다. 그런 다음 안구 된 올리고 혼합물을 섭씨 4도에서 배양합니다. 이제 아닐링 된 올리고를 소화 된 PV1524로 리디플합니다.첫 번째 PCR 튜브에서는 10x T4 Ligase 버퍼, t4 DNA 리간세, 아닐드 올리고 믹스, 소화된 CIP 처리 정제 플라스미드, 물을 10 마이크로리터 총 부피에 추가합니다. 마찬가지로 아닐리고 혼합물 대신 음의 제어 혼합물을 사용하여 제2 PCR 튜브를 준비한다. 온도 16도에서 온도 16도에서 두 튜브를 30분 동안 배양한 다음 섭씨 65도에서 10분 간 식히고 마침내 섭씨 25도까지 식힙니다.결찰다음, 결찰 혼합물을 화학적으로 유능한 세포로 변환한 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 플라스미드를 정화하고 시퀀스합니다. 수리 템플릿을 설계하려면, 유전자 서열을 클릭하고 정지 코돈 및 제한 소화 부위를 인코딩하는 뉴클레오티드를 추가하여 스톱 코동을 삽입한다. 왼쪽 버튼 10 개의 베이스 다운스트림에서 돌연변이가 만들어질 위치를 클릭하고 커서 60 베이스를 상류로 드래그합니다.프라이머 탭에 핥아 프라이머를 추가합니다. 이렇게 하면 수리 템플릿이 세 앞으로 추가됩니다. 그런 다음 돌연변이가 만들어지는 곳의 상류10베이스를 클릭하고 커서 60베이스를 하류로 드래그합니다.프라이머 탭을 클릭하여 프라이머를 추가합니다. 이렇게 하면 복구 템플릿 이세 되면 됩니다. 수리 템플릿을 생성하려면 4개의 PCR 튜브 각각에 수리 템플릿 포워드 프라이머, 수리 템플릿 역프라이머, 탈옥뉴클레오티드 트리포산염, 완충, TACH 폴리머라제 및 물을 추가합니다.이제 PCR의 20~30라운드를 실행하여 프라이머 확장을 수행합니다. 올바르게 복제된 플라스미드를 소화하려면 1.5 밀리리터 튜브에 플라스미드, 10배 버퍼, 소혈표 알부민, KPN 1, SAC 1 및 물을 40 마이크로리터에 추가합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오.한편, C.albicans SC5314의 하룻밤 문화를 성장, 야생 형 프로토 트로프, 에서 25 소변 보충 YPD에서 섭씨. 600 나노미터 또는 6 미만의 OD 600에서 광학 밀도로 배양을 성장시다. 펠릿 5 OD 600 세포는 G.2348 시간 G.에서 5 분 동안 회전하여 변환 당 세포의 5 개 OD 600 단위.다음 TE / 리튬 아세테이트의 100 마이크로 리터에서 펠릿 세포를 일시 중단.이제 1.5 밀리리터 튜브에 순서대로, 재부유 된 세포, 삶은 및 빠르게 냉각 된 연어 정자 DNA, 플라즈마 소화, 정제 된 수리 템플릿 및 플레이트 버퍼를 추가하십시오. 변형 DNA와 동일한 부피로 물을 대체하는 것을 제외하고는 동일한 방식으로 음의 대조를 준비합니다. 하룻밤 사이에 변형을 배양 한 후, 가열 25 분 동안 섭씨 44도 수조에 배치하여 세포를 척.벤치 상단 원심분리기에서 2348회 G에서 5분간 회전하고 플레이트 혼합물 상판을 제거합니다. 우리딘 보충 YPD와 원심분리기의 1 밀리리터를 다시 추가하여 한 번 씻으십시오. Uridine 보충 YPD의 0.1 밀리리터에서 세포를 일시 중단 한 후, 하룻밤 25섭씨에서 롤러 드럼이나 셰이커에 서스펜션을 배양.다음 날, 우리딘에 세포를 접시 보충 YPD와 200 nourseothricin의 밀리 리터 당 마이크로 그램. 식민지는 2~5일 후에 나타나며 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 단일 식민지에 대해 줄무늬가 있어야 합니다. 콜로니 PCR을 수행하려면, 도입 된 제한 부위의 스트림까지 약 200 베이스 페어 및 역프라이머 약 300 베이스 쌍 다운스트림을 설계합니다.전방 체크 프라이머 0.3 마이크로리터, 리버스 체크 프라이머 0.3 마이크로리터, 열안정 폴리머라제 0.3 마이크로리터, dNTP의 마이크로리터 3개, XTAC 버퍼 3개, 마이크로리터 23마이크로리터를 튜브에 첨가한다. 그런 다음 P10 파이펫 팁을 사용하여 혼합물에 단일 효모 콜로니의 0.25 마이크로리터를 추가하고 애저에 방해하지 않도록 주의하십시오. PCR에 의해 DNA를 증폭한 후, 증폭이 성공적일 수 있도록 젤에 PCR의 5마이크로리터를 실행하여 튜브 바닥의 세포 파편 펠릿을 방해하지 않도록 주의하십시오.C.Albicans에서 CRISPR 중재 게놈 편집을 위한 대표적인 결과는 여기에서 표시됩니다. C.Albicans는 C.Albicans TPK2를 대상으로 하는 가이드 RNA 및 수리 템플릿으로 변형되었습니다. EcoR1 제한 소화 사이트 및 수리 템플릿에서 코돈 중지PAM 사이트를 방해하고 올바른 돌연변이에 대한 검사를 용이하게합니다.콜로니 PCR다음에 제한 소화가 야생 유형을 편집된 시퀀스와 빠르게 구별합니다. 이 절차를 시도하는 동안 PV1524로 복제된 가이드 RNA의 여러 복사본을 확인하는 것이 중요합니다. 따라서 게놈 편집 효율을 낮출 수 있습니다.잊지 마세요, C.Albicans는 BL2 병원체이며, 항상 적절한 실험실 복장과이 절차를 수행하는 동안 모든 안전 절차를 따르십시오.

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연구

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Genetics

유전학

유전자 Ustilago이 maydis 검댕 곰팡이 조작에 우리는 강력한 유전자 교체 전략을 설명합니다. 이 프로토콜은 감염 표현형을 조사하기 위해 삭제 돌연변이를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 형광 표지 단백질을 코딩하는 서열을 추가하여, 예를 들어, 임의의 방법으로 유전자를 수정하도록 확장 될 수있다.

플랜트 병원체의 유전자 조작<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; 곰팡이 생물과 식물 미생물 상호 작용을 연구하는

PCR 매개 유전자 변형은 시각화 및 효모 세포 및 단백질의 정량을 용이 칸디다 종의 형광 단백질 융합체를 생성하기 위해 사용될 수있다. 여기서, 우리는 칸디다에서 형광 단백질 융합 (Eno1-FP)을 구축하기위한 전략을 제시한다.

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여기, 우리는 CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins 및 homology 종속 복구 서식 파일을 사용 하 여 C. 선 충 의 게놈을 엔지니어링 하는 방법 제시.

빠른 고 손쉬운 파이프라인 C. 선 충 을 사용 하 여 CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins에서 게놈 포인트 돌연변이 생성에 대 한

여기, 선물이 미토 콘 드리 아 호흡 및 Candida Albicans 에 glycolytic 기능 조사 stepwise 프로토콜 추가 유출 분석기를 사용 하 여.

칸디 다 albicans 를 사용 하 여 실시간 세포 외 유출 분석의 바이오에 너 지론 조사

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CRISPR/Cas12a 멀티플렉스 게놈 편집 사카로미세세세레비시아와 이스트 픽셀 아트의 창조

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필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

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CRISPR/Cas9 Dpy-10 공동 CRISPR 스크리닝 마커 및 조립된 리보뉴클레오단백질 복합체를 사용하여 C. elegans rbm-3.2 유전자의 편집.

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칸디다 알비칸스 Cdr1-mGFPHis 분석을 위한 소규모 플라즈마 멤브레인 준비

이 프로토콜은 인간 곰팡이 병원균 칸 디다 알비칸스에서 뉴클레아제(CUT&amp;RUN)를 사용하여 표적 하에서의 절단 및 방출을 위한 실험 방법 및 데이터 분석 워크플로우를 기술한다.

칸디다 알비칸스에서의 전사 인자-DNA 결합 상호작용의 게놈 전체 프로파일링: 포괄적인 CUT&amp;RUN 방법 및 데이터 분석 워크플로우

이 프로토콜은 플라나리아 Schmidtea 지중해를 곰팡이 감염 시 숙주-병원체 상호작용을 연구하는 모델 시스템으로 활용하는 최적화되고 상세한 가이드를 제공합니다. 이 방법은 인간 곰팡이 병원체인 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 플라나리아를 감염시키는 이전 절차를 기반으로 하며, 재현성과 실험적 일관성을 높이기 위한 상세한 지침을 제공합니다.

지중해에서 칸디다 알비칸스 감염을 최적화하여 균류 발병기전과 숙주 방어 연구를 위한 프로토콜

배우세요 Candida albicans 유전체 편집을 위한 CRISPR 기반 효율적인 프로토콜입니다. 이 방법은 진균 병원성 연구와 새로운 치료제 개발에 필수적인 정밀한 유전자 변형을 가능하게 합니다.

Candida albicans 인간의 곰 팡이 병원 체 게놈 편집 CRISPR 중재

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