Name: 꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: 배우세요 꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인성과 독성을 평가하는 방법을. 다양한 균주 간 독성 차이를 분석하여 병원체-숙주 상호작용 메커니즘을 이해할 수 있습니다.

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우리는 진단 미생물학을 대만에 선 충 C. 핵심 시설에서 지원에 대 한 감사와 항균 성 저항 실험실의 국립 쳉 쿵 대학 병원 Aeromonas 제공 하기 위한 격리. 우리는 또한 꼬마 유전학 센터 (CGC) 그리고는 WormBase를 인정합니다. 우리는 또한 원고 편집 Savana 무어 감사 합니다.
이 연구는 P.L. 첸을 과학의 부 및 기술의 대만 (가장 105-2628-B-006-017-MY3)과 국립 쳉 쿵 대학 병원 (NCKUH-10705001)에서 교부 금에 의해 부분적으로 지원 되었다.

1입니다. 문화 매체의 준비
참고: 솔루션 준비에 대 한 표 1을 참조 하십시오.
<ol><li>M9 중간12준비, KH2포41.5 g, 나2HPO4, 5.66 g 및 이온된 물 500 mL에 NaCl의 2.5 g을 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 실내 온도에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M MgSO4 처음 사용 하기 전에 0.5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>선 충 류 성장 매체 (NGM)12를 준비 하려면 3g NaCl, 2.5 g 세균성 펩, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 20 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 욕조에 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl2의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.</li>
	<li>약 5 mL NGM 각 6 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 돌려.</li>
	<li>풍부한 NGM (ENGM)를 준비 하려면 3g NaCl, 5 g 세균성 펩, 1 g 효 모 추출 물, 및 이온을 제거 된 물 1 리터에 30 g 한 천 분해. 20 분을 위한 121 ° C에 고압 물 목욕에서 55 ° C에 냉각 될 때까지 기다립니다 고 1 M CaCl2의 1 mL, 1 mL의 1 M MgSO4, 5% 에탄올, 콜레스테롤의 1 mL 및 인산 염 버퍼의 25 mL를 추가 합니다. 잘 섞어 소용돌이 친다.</li>
	<li>약 10 mL ENGM 각 9 cm 배양 접시에 부 어. 접시의 표면에 거품 생산을 하지 마십시오. 1 박 및 4 ° c.에 저장 하려면 패키지 실내 온도에 격판덮개를 두고 사용 하기 전에 실내 온도에 가져와.</li>
	<li>S 중간12준비, 40 mL S 기저, 0.4 mL 1 M 칼륨 구 연산 염 혼합, 0.4 mL 추적 솔루션, 1 M CaCl2, 0.12 mL의 1 M MgSO4, 에탄올에 5% 콜레스테롤 40 µ L의 0.12 mL 및 사용 하기 전에 8 m m FudR의 1 mL 금속.</li>
</ol>2. C. 선 충6,,912 의 동기화
<ol><li>15 mL 튜브에 살 균 이온된 수 10 mL와 함께 벗 성인 무대에서 약 2000 벌레를 씻어. 박테리아 3 x, 튜브의 아래쪽에는 벌레를 유지 충분히 세척 한다.</li>
	<li>풀 벌레 다운 500 x g 에서 1 분 샘플 원심 상쾌한, 제거 하 고 3.5 mL 이온을 제거 된 물에는 벌레를 유지.</li>
	<li>1 mL NaOCl (10-15%) 및 0.5 mL 5 M 코 튜브에 추가 합니다. 동안 흔들어 하 여 균등 하 게 혼합 < 6 분 웜 시체를 lyse.</li>
	<li>후 계란 벌레에서 출시 되는 세포를 막으려고 10 mL 이온된 물을 추가 합니다. 풀 다운 계란을 제거 가능한 상쾌한 1200 x g 에서 1 분 동안 원심 분리기. 씻어 15 mL M9 중간 적어도 3 배. 참고: 단계 1.1 M9 매체의 구성에 대 한 참조.</li>
	<li>1 mL M9 매체에 계란을 유지. 1 박 (약 12-18 h) 20 ° C에 외피에 대 한 3.5 c m 접시에 계란을 전송 합니다. 참고:는 부 화 후 계란 벌레 유 충 애벌레 (L1) 초단으로 불리는 해치 것입니다.</li>
	<li>M9 매체에서 L1 벌레의 10 µ L 밖으로 플라스틱. 벌레의 수를 계산 하 고 L1의 농도 웜 M9 매체에 계산.</li>
	<li>씨앗 최대 10000 incubated L1 무대 벌레를 피펫으로와 대장균 OP50 확산 9 cm ENGM 접시에.<ol>
<li>이 단계에서는 확산 0.5 mL 하룻밤 Luria Bertani (파운드) 9 cm ENGM 접시에 국물과 함께 대장균 OP50 경작. 16-18 h 37 ° C에서 접시를 품 어 참고: 오염을 방지 하려면 확산 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 합니다.</li>
		<li>L1 벌레를 뿌리기 전에 실내 온도에 냉각 하십시오. 씨앗 최대 10000 incubated L1 단계 웜 대장균 OP50와 ENGM에.</li>
	</ol>
</li>
	<li>44 h 또는 4번째 애벌레 (L4) 단계로 성장 때까지 20 ° C에서 벌레를 품 어. 참고: 1.3 ENGM 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오. 벌레 L4 단계에서 반달 모양 몸 측면의 중앙에 흰 점이 있다.</li>
	<li>사용 하 여 동기화 된 L4 단계 다음 분석 실험에서 벌레. N2 Aeromonas dhakensis 와 선 충 C. 생존 분석 결과에 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas dhakensis벌레는 야생 타입을 사용 합니다. RW1596 웜 (myo-3(st386); 를 사용 하 여 stEx30 [묘-3p::GFP::myo-3 + rol-6(su1006)]) Aeromonas dhakensis와 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과에.</li>
</ol>3. 선 충 C. 생존 분석 결과 Aeromonas6,9
<ol><li>L1 웜 확산 대장균 OP50와 ENGM에 시드 날, 각 4 개의 Aeromonas 긴장 또는 대장균 OP50 및 16 h 37 ° C에서 각각 2 mL 파운드 국물과 함께 문화 단일 식민지를 선택 하십시오. 참고: 오염을 방지 하려면이 단계는 층 류 후드에서 수행 되어야 한다. 여기서 다음 세균성 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.</li>
	<li>세균성 국물의 OD600 흡 광도 측정 하 고 OD600 세균 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0.</li>
	<li>자리 하 고 확산 30 µ L 세균성 국물의 각 6 cm NGM 접시. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화. 참고: NGM 매체의 구성에 대 한 1.2 단계를 참조 하십시오.</li>
	<li>L1 웜 L4 단계에 성장 하는 날에 무작위로 선택 하 고 각 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 NGM 접시 50 웜 전송.</li>
	<li>분석 결과 완료 될 때까지 20 ° C에서 NGM 접시를 품 어.</li>
	<li>매일 때까지 마지막 벌레는 죽은 박테리아 및 수의 숫자, 죽은, 라이브 센서 웜 새로 준비 NGM 접시에 모든 살아있는 벌레를 전송 합니다. 참고: 전송 웜 신선한 준비 NGM 접시에 감염, 유지 관리를 위해 매일 살 균 벌레를 사용 하는 경우에 (예를 들어glp-4, 또는 FudR).</li>
	<li>매일 데이터 계산에 따라 생존 곡선을 플롯.</li>
</ol>4. 선 충 C. 액체 독성 분석 결과 Aeromonas7
참고: 오염 방지 하려면 단계 층 흐름 후드에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>L1 웜 확산 대장균 OP50 ENGM 플레이트에 시드 후 하루 4 Aeromonas 변종 대장균 OP50과의 문화 5 mL를 각각의 단일 식민지 파운드 국물 각 16 h 37 ° C에서 선택 합니다. 참고: 프로토콜을 다음 박테리아 긴장 사용 했다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.</li>
	<li>박테리아 국물의 OD600 흡 광도 측정 한다.</li>
	<li>3500 x g 파운드 국물 제거 하려면 15 분 동안에 세균성 국물 원심 박테리아를 resuspend 하 고 OD600 세균 국물 조정 = 3.0 S 매체. S 매체에 96 잘 접시의 적어도 8 우물 195 µ L 세균성 국물을 추가 합니다. 참고: 1.6 S 매체의 구성에 대 한 단계를 참조 하십시오.</li>
	<li>M9 매체를 사용 하 여 대장균 OP5와 ENGM 접시에 L4 벌레를 씻어. µ L 당 5 벌레의 농도에 웜 솔루션을 조정 하 고 웜 솔루션의 5 µ L 96 잘 접시의 각 음을 추가. 잘 당 약 25 벌레 인지 확인 합니다.</li>
	<li>25 ° c.에서 200 rpm에서 통에 96 잘 접시를 품 어</li>
	<li>다음 수식 사용 하 여 각의 생존 율을 계산 하는 24, 48, 및 72 h. 후 라이브 웜 및 죽은 벌레의 수를 계산: (라이브 웜/총 벌레) × 100%.</li>
	<li>매일 데이터 계산 분산형 플롯 그래프를 그립니다.</li>
</ol>5. 선 충 C. 근육 괴 사 분석 결과 Aeromonas6
참고: 오염을 방지 하려면 다음이 단계는 층 류 두건에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>L1 웜 대장균 OP50와 ENGM 확산에 시드는 하루에 4 개의 Aeromonas 긴장 및 대장균 OP50 및 문화 국물과 함께 2 mL 파운드 각 16 h 37 ° C에서의 각각의 단일 식민지를 선택 하십시오. 참고: 여기, 다음 박테리아 변종이 사용 되었다: 대장균 OP50, C. 선 충의 정상적인 음식 소스. A. dhakensis , AAK1는 첫 번째 완전 시퀀싱 병원 임상 A. dhakensis 분리. A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007, 그리고 A. caviae A2-9307121 국립 쳉 쿵 대학 병원에서 대표적으로 임상 분리 있습니다.</li>
	<li>박테리아 국물의 OD600 흡 광도 측정 하 고 OD600 박테리아 국물 조정 = 파운드 국물과 함께 2.0. 자리 고 30 µ L 세균성 국물 6 cm NGM 접시에의 확산. 하룻밤 실 온에서 격판덮개 문화.</li>
	<li>하루에 L1 웜 4 Aeromonas 긴장의 E. 콜라이 OP50 각 각 NGM 접시에 전송 50 웜 L4 단계에 성장. 20 ° c.에 NGM 번호판을 품 어 박테리아와 새로 준비 NGM 판 웜 모든 24 h를 전송 합니다.</li>
	<li>형광 현미경을 사용 하 여 근육 이미지를 가져가 라.<ol>
<li>임의로 슬라이드에 M9 매체에 2 %agarose 젤에 10 벌레를 선택 합니다. 벌레를 사용 하 여 1% 나트륨 아 지 드의 2 µ L agarose에 M9 중간에 5 분 미만 대 한 이미지를 복용 하기 전에 마비</li>
		<li>커버 슬립을 배치 하 고 전 하 결합 소자 카메라로 형광 현미경에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 필터를 사용 하 여 근육 이미지를 캡처하십시오. 24, 48, 및 72 h 포스트는 L4 단계에서 근육 이미지를 캡처하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 프로세싱 소프트웨어와 이미지 분석 및 그림 준비를 수행 합니다. 참고: 정의 점수와 근육 손상 레벨의 그림 3을 기준은 다음과 같이 나열 됩니다에 표시 됩니다: 3 포인트 누락 된 근육 섬유; 파열 또는 깨진 근육 섬유;에 대 한 2 점 구부러진된 근육 섬유;에 대 한 1 포인트 건강 한 근육 섬유에 대 한 0 점입니다.</li>
</ol>6. 통계 분석
<ol><li>수행 하지 모든 실험 최소 세 번 독립적으로 합니다.</li>
	<li>카 플 란-마이어 메서드를 사용 하 여 선 충 C. 생존 분석, 평가 하 고 생존 차이 분석 로그-순위 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.</li>
	<li>스튜던트 t-검정을 사용 하 여 두 개의 서로 다른 그룹에 대 한 선 충 C. 액체 독성 분석 실험의 통계 결과 분석. 한 독립 변수가 3 개 이상의 값 간의 차이 분석에서 일방통행 ANOVA 테스트를 사용 합니다. 0.05에서 통계적 의미를 설정 합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Parker, J. L., Shaw, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aeromonas+spp.+clinical+microbiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infection%22%5BJournal%5D)">Aeromonas spp. clinical microbiology and disease.</a> Journal of Infection. 62 (2), 109-118 (2011).</li>
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<li>Chen, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virulence+diversity+among+bacteremic+Aeromonas+isolates%3A+ex+vivo%2C+animal%2C+and+clinical+evidences%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Virulence diversity among bacteremic Aeromonas isolates: ex vivo, animal, and clinical evidences.</a> PLoS One. 9 (11), 111213(2014).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

C. 선 충 은 bacterivorous 선 충 류는 자연스럽 게 음식 섭취 박테리아의 진화 과정 동안 박테리아에 복잡 한 타고 난 면제를 개발 했다. 유지 하 고 면역을 지 원하는 주요 장기의 2 개는 표 피와 내장9,13. 표 피와 근육 C. 선 충 의 포유류와 인간6소프트-조직 구조를 유사합니다. 이러한 특성 때문에 C. 선 충 은 Aeromonas 감염의 병 인 연구 모델 생물으로 적용 됩니다.
여기, 우리는 임상 관찰74 Aeromonas 종 중 다양 한 독성의 대표 고 상관은 Aeromonas C. 선 충 감염을 조사 하기 위한 세 가지 방법 제시. 이러한 편리한 방법을...

인간 병원 체, Aeromonas, 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염1,2에 표시 되었습니다. 가장 관련 된 인간의 질병 관련 4 개의 세균성 종 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae 2,3 , 4 , 5. Aeromonas 전염병 중 소프트-조직 감염에에서 발생할 수 있습니다 심각한 병 적 상태와 사망률 인 간에. 메모의 근육 괴 사 연 조직 감염6의 가장 심한 형태입니다. 생존의 관찰 및 감염 후 꼬마 선 충 의 근육 괴 사 Aeromonas의 독성을 추측 하는 편리한 방법입니다.
과학자는 이미 수많은 모형 유기 체 공부 세균 감염을 개발 했다. 이전 학문에서는, 쥐, zebrafishes, 및 nematodes 사용 되었다 동물 모델로 pathogenesis Aeromonas6,,78의 독성을 공부 하 고. 모든 동물 모델의 ' 장점 및 응용 프로그램. 모델 유기 체, 꼬마 선 충, foodnaturally bacterivorous 선 충 류는 섭취 박테리아 이다. C. 선 충의 진화의 과정을 통해 세균 감염에 대 한 복잡 한 타고 난 면역 체계를 개발 했다. 세균 감염의 스트레스, 선 충 C. Aeromonas6,,79 와 다른 병원 체의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델 입증 되었습니다. 같은 균 류10 및 enterohaemorrhagic 대장균 O157:H711. 그러나, 여전히 모델 C. 선 충 을 사용 하 여 Aeromonas독성 연구 방법론에 초점을 맞춘 없습니다 게시가입니다.
여기, 우리가 공부 Aeromonas 감염 동물 모델로 서 C. 선 충 을 사용 하 여 3 개의 다른 실험 소개: 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴에 대 한 분석. 이 메서드는 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas의 pathogenesis의 이해를 개선 하는 편리한 방법을.

<table><tbody><tr><td>셰이커 인큐베이터</td><td>YIH DER</td><td>LM-570R</td><td>박테리아 배양</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021519455</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>J.T.Baker</td><td>3246-05</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>J.T.Baker</td><td>MP021914405</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>31434</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4</>SIGMA</td><td></td> <td>M7506</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>한천</td><td>Difco</td><td>214530</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SIGMA</td><td>C1016</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>SIGMA</td><td>C8503</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>SIGMA</td><td>32205</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>KOH</td><td>SIGMA</td><td>P5958</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>6cm 페트리 플레이트</td><td>ALPHA PLUS</td><td>46</td><td>한천 플레이트</td></tr><tr><td>준비 96-웰 플레이트</td><td>FALCON</td><td>353072</td><td>액체 분석</td></tr><tr><td>세균 펩톤</td><td>Affymetrix/USB</td><td>AAJ20048P2</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>SIGMA</td><td>92144</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>구연산 &황소; H2O</td><td>SIGMA</td><td>C1909</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>트리-포타슘 시트레이트&불; H2O</td><td>SIGMA</td><td>104956</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>퍼지R&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>1271008</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>디소듐 EDTA</td><td>SIGMA</td><td>E1644</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>FeSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>215422</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>MnCl2&bull; 4 H2O</td><td>SIGMA</td><td>221279</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>ZnSO4&bull; 7 H2O</td><td>SIGMA</td><td>204986</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>CuSO4&bull; 5 H2O</td><td>SIGMA</td><td>C8027</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>트립톤</td><td>SIGMA</td><td>16922</td><td>배양 배지 준비&nbsp;</td></tr><tr><td>현미경 시스템</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipase Ti 반전&nbsp;</td><td>현미경 이미징</td></tr><tr><td>과학적인 CCD 카메라</td><td>QImaging&nbsp;</td><td>Retiga-2000R 패스트 1394&nbsp;</td><td>현미경 이미징</td></tr></tbody></table>

꼬마 선 충 모델에서 aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

Evaluating Virulence and Pathogenesis of Aeromonas Infection in a Caenorhabditis elegans Model

인간 병원 체 Aeromonas 임상적으로 위장염, 상처 감염, 패 혈 증, 및 요로 감염 원인 표시 되었습니다. 대부분의 인간의 질병 4 종의 박테리아와 관련 된 것으로 보고 되었습니다: Aeromonas dhakensis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas veronii및 Aeromonas caviae. 모델 생물 꼬마 선 충 은 Aeromonas의 세균 병 인을 공부 하는 우수한 감염 모델을 제공 하는 bacterivore 이다. 여기, 생존, 액체 독성, 그리고 근육 괴 사 분석을 포함 하 여 선 충 C. 모델을 사용 하 여 Aeromonas 감염 연구 3 다양 한 실험을 소개 합니다. Aeromonas 의 독성을 결정 하는 세 가지 방법의 결과 일치 했다. A. dhakensis 는 4 주요 Aeromonas 종 임상 감염을 일으키는 가운데 가장 독성이 있을 표시 했다. 이러한 메서드 및 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하 고 Aeromonas 감염의 병 인에 대 한 우리의 이해에 기여 하는 편리한 방법이 되도록 표시 됩니다.

위에서 설명한 프로토콜에 따라, 4 개의 Aeromonas 긴장에서 독성 구분 하기 쉽습니다. C. 선 충 의 생존 분석 결과 그림 1에 표시 됩니다. C. 선 충 감염 Aeromonas 종, 낮은 높은 순서로 표시 된의 생존 율 했다: A. caviae, A. veronii, A. hydrophila 그리고 A. dhakensis. 독성 및 Aeromonas 종 내 면에서 다양성은, C. 선 충의 생존 율 평균, A. dhakensis감염 벌레 중 가장 높은 사망률을 보였다. A. hydrophila 의 독성은 A. dhakensis (p &lt; 0.01)의 열 등 한. A. dhakensis , A....

C. 선 충감염 Aeromonas 공부 하 세 다른 실험을 소개 합니다. 이러한 편리한 방법을 사용 하 여, 그것 중 고 Aeromonas 종 내에서 독성을 평가 하기 쉽습니다.

꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

The human pathogen Aeromonas has been clinically shown to cause gastroenteritis, wound infections, septicemia, and urinary tract infections. Most human ...

이 방법은 세균성 감염의 병원성 및 독성과 같은 숙주 병원체 상호 작용 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 에어로모나스 종 중 독성을 평가하고 Aeromonas 감염의 병인에 대한 우리의 이해에 기여할 수 있다는 것입니다. 약 2, 000 그라피드 성인용 벌레를 멸균 된 물로 씻기 시작합니다.벌레를 튜브 바닥에 두는 세척을 세 번 반복합니다. 원심 분리 후 벌레는 상체를 제거하고 제거 된 물의 3.5 밀리리터에 벌레를 유지합니다. 고가산나트륨 1밀리리터와 수산화칼륨 0.5 밀리리터를 튜브에 넣습니다.그런 다음 튜브를 6 분 동안 흔들어 웜 바디를 lyse하십시오. 계란이 방출된 후, 10 밀리리터의 탈온화된 물을 추가하여 리시스를 막습니다. 그런 다음 튜브를 원심 분리하여 계란을 끌어 내리고 가능한 한 많은 상체를 제거합니다.M9 배지 15밀리리터로 계란을 3회 이상 세척합니다. 달걀을 3.5센티미터 의 접시로 옮기고 하룻밤 동안 섭씨 20도에서 배양하십시오. 이 후 플레이트에서 L1 웜 및 M9 배지의 10 마이크로리터를 제거합니다.웜을 계산하고 M9 배지에서 L1 웜의 농도를 얻습니다. 파이펫을 사용하면 대장균 OP50 LB 국물의 0.5 밀리리터를 섭취하여 ENGM 플레이트에 퍼집니다. 그런 다음 16 ~18 시간 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.ENGM을 실온으로 냉각시하십시오. 그런 다음 E.coli OP50을 가진 ENGM 플레이트에 L1 웜을 배양했습니다. 웜이 L4 단계에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 배양합니다.먼저, 텍스트 프로토콜에 따라 4개의 Aeromonas 균주 각각의 단일 콜로니를 선택하고 배양합니다. 그런 다음 세균성 국물의 OD 600 흡광도를 측정하고 흡광도가 2.0과 같을 때까지 조정합니다. 다음 지점및 NGM 플레이트에 각 변형에서 세균 국물의 30 마이크로 리터를 확산.이전에 준비된 L4 웜을 에어로모나균으로 NGM 플레이트로 임의로 선택하고 전송합니다. 그런 다음 분석이 완료될 때까지 접시를 섭씨 20도에서 배양합니다. 매일 살아있는 벌레를 박테리아가 있는 새로운 NGM 플레이트로 옮기는다.마지막 벌레가 죽을 때까지 매일 살아있고 죽은 벌레와 센서 웜의 수를 계산합니다. Aeromonas 균주를 배양하고 이전에 설명한 대로 흡수도를 측정한 후 세균국을 3, 500g에서 15분 동안 원심분리합니다. S 배지로 세균국을 조정합니다.그리고 96 웰 플레이트의 8 개의 우물에 S 배지에 세균 국물의 195 마이크로 리터를 추가합니다. 그들에게 M9 매체와 ENGM 플레이트에서 벌레를 씻어. 그런 다음 웜 용액의 농도를 마이크로리터당 5개의 웜으로 조정합니다.96웰 플레이트의 각 웰에 웜 용액 5마이크로리터를 추가합니다. 셰이커에 접시를 배양하고 24, 48 및 72 시간에서 살아있는 벌레의 수를 계산합니다. Aeromonas 균주를 배양한 후 텍스트 프로토콜 지점에 따라 흡광도를 조정하고 NGM 플레이트에 세균 국물을 퍼뜨리는 것입니다.그 후, 각 NGM 플레이트에 50 L4 웜을 전송합니다. 24시간마다 웜을 신선한 NGM 플레이트로 옮길 수 있습니다. 무작위로 10 개의 웜을 선택하고 슬라이드에서 M9 배지에서 2 % 아가로즈 젤로 옮겨.마지막으로 젤에 커버슬립을 배치하고 카메라가 장착된 형광 현미경에 녹색 형광 단백질 필터로 근육 이미지를 캡처합니다. 이 프로토콜에서 4개의 Aeromonas 균주의 독성을 평가했습니다. Aeromonas 종에 감염된 C.elegans의 생존율은 A.caviae를 사용하여 애사에서 가장 높았으며 A.dhakensis를 사용하여 아세에서 가장 낮았습니다.액체 독성 분석분석에서 C.elegans의 생존은 A.dhakensis 또는 A.수성 구성증에 감염될 때 현저하게 감소했습니다. 근육 괴사 분석 에서 근육 손상의 정도는 에어로모나종 중 다양. A.caviae는 근육 손상을 가장 적게 일으켰고, A.dhakensis는 가장 근육 손상을 일으켰습니다.이 비디오에 설명된 방법은 에어로모나종 과 그 내의 독성 다양성을 차별화하는 편리한 방법을 제공합니다. 또한 병원균과 숙주 간의 상호 작용을 연구하는 신뢰할 수 있는 모델이기도 합니다.

evaluating-virulence-pathogenesis-aeromonas-infection-caenorhabditis

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Anderson, Q. L., et al. 고처리량, 고함량, 액체 기반 C. elegans 병리 시스템. J. Vis. 경험. (2018년)이 비디오는 유전자 변형 C. elegans 유충이 마이크로플레이트에서 병원성 박테리아에 노출되는 액체 기반 분석을 보여줍니다. 배지에 분비된 박테리아 독소는 숙주 스트레스와 사멸을 유도합니다. 형광 염료는 죽은 벌레를 염색하여 이미징 기반 사망률 정량화를 통해 유전적 감수성 또는 내성을 평가할 수 있습니다.

C. elegans 유충의 병원성 박테리아 유발 사망률 평가

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 C. elegans 를 이용한 생존 분석으로 에어 로모나스 병태를 모델링하며, 경구 섭취가 장내 감염과 사망률을 유발하여 살아있는 숙주 시스템에서 박테리아의 병원성을 정량적으로 평가할 수 있게 합니다.

생존 분석법을 이용한 C. elegans의 에어로모나스 병태 모델링

출처: 첸, Y. 외. Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 영양소가 제한된 액체 환경에서 벌레의 생존을 측정하여 박테리아 병원성을 평가하는 C . elegans 의 액상 독성 검사법인 Aeromonas를 시연합니다. 이 검사는 C. elegans에서 독소 유발 손상과 사망률의 정도를 바탕으로 균주별 특이적 병원성을 밝혀냅니다.

C. elegans 액체 독성 검사를 이용한 박테리아 병원성 평가

출처: Chen, Y. 외, Caenorhabditis elegans 모델에서 에어로모나스 감염의 병원성 및 병인기전 평가. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 병원성 Aeromonas 균주를 이용한 C. elegans(Caenorhabditis elegans)의 근육 괴사 검사를 시연합니다.  Aeromonas 씨앗 판에 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 벌레를 먹여 박테리아 감염을 모델링하고 형광 영상을 통해 조직 손상을 밝힙니다. 근육 구조와 GFP 신호의 점진적 손실은 아에로모나스에 의한 괴사 반응을 나타냅니다.

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꼬마 선 충 모델에서 Aeromonas 감염의 병 인 및 독성 평가

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