Name: 유전자 치료 DNA 종이 접기 Nanostructures의 보호를 위한 Polycation 코팅을 영감 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 배우세요 키토산과 LPEI를 이용한 폴리카티온 코팅 기법으로 DNA 오리가미 나노구조체를 효소적 분해로부터 보호하는 방법입니다. 이 기술은 세포 흡수를 증가시키고 유전자 치료 및 진단 응용을 위한 생체 내 안정성을 확보합니다.

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이 프로젝트는 부여 계약 번호 686647에서 유럽 연합의 지평선 2020 연구와 혁신 프로그램에서 자금을 받았다. 가장 이미지 Morgagni 80에서 운영 하는에 기록 되었다 kV EM 시설에서 비엔나 Biocenter 코어 시설 GmbH (VBCF는)의. 우리는 와이어 프레임 nanostructure 디자인 그래픽 디자인 및 Elisa 드 LIano에 Tadija Kekic 감사 하 고 싶습니다.

1. 준비 Polycation 재고 솔루션
<ol><li>LPEI 재고 솔루션<ol>
<li>LPEI의 포함 하는 유리 비 커에 10 mg을 추가 &lt; H2o.의 10 mL</li>
		<li>완전히 분해 LPEI, pH 2.0에 도달까지 HCl (32%)를 추가 합니다.</li>
		<li>NaOH (10 M)를 추가 하 여 7.0에 pH를 조정 합니다.</li>
		<li>1 mg/mL의 최종 농도에 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>LPEI 재고 솔루션 0.22 μ m 세포 막을 통해 여과.</li>
	</ol>
</li>
	<li>키토 산 재고 솔루션<ol>
<li>16.6 m g 키토 산 올리고 당 젖 산의 분해 (Mw </li></ol></li></ol><ol><li></li><li><li><li></li><li></ol><ol><li></li><li><li></li><li><li><li></ol><ol><li><li><li><li><li></ol><ol><li></li><li><li><li><li><li></li><li> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg"></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg"></li></ol><ol><li><li><li> </li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li></ol><ol><li><li><li> </li><li><li></li><li><li></li></ol><ol><li><li><li><li><li><li><li><li></li><li> </li></ol><ol><li><li></li><li></li><li></li><li><li><li><li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li><li><li><li></li><li></li></ol>

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<li>Grigsby, C. L., Leong, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+protection+and+release+of+DNA%3A+tools+to+address+a+bottleneck+of+non-viral+gene+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Royal+Society+Interface%22%5BJournal%5D)">Balancing protection and release of DNA: tools to address a bottleneck of non-viral gene delivery.</a> Journal of the Royal Society Interface. 7 (1), 67-82 (2010).</li>
<li>Li, T., Dong, S., Wang, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+aptamers+with+peroxidase-like+DNAzyme+functions%3A+which+is+the+best+and+how+does+it+work%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+-+An+Asian+Journal%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex aptamers with peroxidase-like DNAzyme functions: which is the best and how does it work.</a> Chemistry - An Asian Journal. 4 (6), 918-922 (2009).</li>
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</ol>

저자는이 보고서와 관련 된 관심 없음 충돌 선언 합니다.

에 자기 조립 DNA 종이 접기의 주식 물가 일반적으로 추가 5-10 초과 비율에 발판. 이러한 초과 주식 가닥도는 polycation 및 polyplexes monometer 범위에서 DNA 종이 접기 polyplexes에서 분리 하기가 더는 바인딩할. 따라서, polyplex 형성에 중요 한 단계는 초과 주식 가닥을 제거 하 고 잘 순화 된 DNA 종이 접기 nanostructures 사용입니다.
다른 방법은 통해 클릭 반응26DNA 가닥의 cyclization 같은 DNA nanostructures 안정화에 대 한 개발 되었습니다. 이 기술은 작은 nanostructures 같은 DNA catenane의 안정화에 대 한 제한 되며 그것은 쉽게 큰 DNA 종이 접기에 대 한 확장 가능한 주식 가닥 alkyne 아 지 드 수정 연동된 단일 가닥 링의 대형을 위한 필요는, 이 프로토콜에 사용 된 같은 구조. 최근, Gerling 동부 표준시는l.27 보고 DNA nanostructures 자외선 방사선 조사를 사용 하 여 내 이웃 thymidines 사이 화학식 cyclobutene pyrimidine 이합체 (일일) 채권을 만들기 위한 방법. 비록이 방법 사이트 선택 하 고 확장 가능한 DNA 종이 접기 보호의 효율은 polycation 코팅 보다 훨씬 낮은. 예를 들어 일일 비용 안정화 DNA 종이 접기 개체 견딜만 0.4 U/mL DNase 내가 1 시간 동안 polyplexes 안정 10 U/mL DNase 존재 나 적어도 하루에 대 한.
간단히, 유전자 치료 영감 키토 산 및 LPEI 코팅은 낮은-비용, 단계 및 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 장기 안정성을 해결 하기 위해 효율적인 방법. Polyplex 대형의 가역 다단계 진단 테스트 nucleolytic 저하 또는 소금 고갈에 대 한 DNA 접기의 보호 한 단계에서 매우 중요 하지만 다른 DNA 단계에서 문제가 발생할 수 있습니다에서 응용 프로그램을 용이 하 게 증폭입니다. 또한, polycation 코팅은 약물 전달 응용 프로그램28DNA 종이 접기 nanostructures의 세포질 통풍 관을 강화 하기 위한 잠재적인 접근 이다.

DNA는 자기 조립 나노 구조1의 프로그래밍에 대 한 다양 한 빌딩 블록 이다. DNA nanostructures를 만들기 위한 가장 인기 있는 방법은 DNA 종이 접기 기술에 근거 하는 자기 조립 긴 원형, 단일 좌초 된 DNA의 짧은 모양 결정 합성 스테이플의 수백의 도움으로 비 계2가닥. 오늘, 거의 모든 형상과 형태에서 DNA nanostructures의 생성은 쉽게 가능 합니다. DNA nanostructures 높은 정밀도3,4 site-specifically functionalized 수 고 allosteric 구조적 변화5,6을 프로그래밍할 수 있습니다. 따라서, DNA를 사용 하 여 건축 자재로 바이오 센 싱, 진단 및 약물 전달에 응용 프로그램, 프로그래밍 가능 하 고 반응이 맞춤형 nanostructures를 만드는 독특한 기회를 제공 합니다. 그러나, DNA nanostructures는 엑 소-및 엔도소화에 취약-nucleases, 및 격자 기반 3D DNA 종이 접기 nanostructures 일반적으로 높은 염 분 버퍼 필요 (예., 5-20 m m Mg+ 2)을 유지 하기 위해 그들의 무결성7,8.
Nucleases 혈액과 세포 외 매트릭스에 의해 DNA의 급속 한 저하 효율적인 vivo에서 납품에 유전자 제품의 셀9에 중요 한 장애 이다. 비 바이러스 성 유전자 전달에서이 제한을 극복 하기 위해 DNA는 정의 된 충전 N/P 비율 (DNA에서 인산 염을 polycation에 있는 아민의 비율)10에서 양이온 폴리머 혼합입니다. 양이온 중합체, polyplex로 알려진 DNA의 복합 nuclease 중재 저하에서 DNA를 보호 하 고 그것의 세포질 통풍 관11를 향상 시킵니다. 유전자 전달 발전, oligolysine12, oligolysine-폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 공중 합체13, 폴 리 (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)에 의해 영감-기반 고분자14및 바이러스 capsid 단백질15 DNA 종이 접기 nanostructures 안정화에 대 한 사용 되었습니다.
최근, 우리 DNA 종이 접기 nanostructures Mg 소진에 보호 하는 방법을 보고 하 고 천연 양이온 다 당 류 키토 산 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI)를 사용 하 여 nuclease 리치 미디어는 보고16. 이 문서는 우리의 이전 작품의 적응 이다 하 고 polyplexes, 그들의 특성, 낮은 소금 및 nuclease 리치 미디어에서 적나라 하 고 보호 nanostructures의 안정성 테스트 및 검사의 준비에 대 한 자세한 프로토콜에 설명 합니다는 polycation 코팅 시 효소 및 aptamer 기능성된 DNA 종이 접기 nanostructures의 접근성.

<table><tbody><tr><td>10&번; DNase I 반응 완충액</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS (2&prime;-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Amicon ultracentrifugation columns</td><td>Merck Millipore</td><td>UCF500308, UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>키토산 올리고당 젖산염 (Mn ~ 4000-6000, > 90% 탈아세틸화, 60%. 구성 올리고당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>디자인별 스테이플 가닥</td><td>통합 DNA 기술(IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염 나트륨 염(Mr ~ 4kDa)</td><td>시그마-알드리치</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 황산염 나트륨염(씨 ~ 40kDa)</td><td>시그마-알드리치</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>DNA 겔 로딩 염료(6&times;)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜-비스(2-아미노에틸에테르)-N,N,N&prime;-테트라아세트산(EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) BioUltra, 무수, &ge; 99% (적정)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA Gel Extraction Spin Columns</td><td>Biorad</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroixde slution (32 wt%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 샘플 환원제 (500 mM 디티오 트레이톨 (DTT))</td> <td>ThermoFischer sceintific</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 (PEG, M W ~ 8000 Da)</td> <td>Carl Roth</td><td>Ø263.1</td><td></td></tr><tr><td>폴리 에틸 렌 이민, 선형, 평균 Mn 10,000, PDI &le; 1.2</td><td>시그마-알드리치</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌이민, 선형, 평균 Mn 5,000, PDI &le; 1.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764582</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K 용액 (20 mg/ml)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-conjugated HRP</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER safe DNA gel stain</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 치료 dna 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 polycation 코팅을 영감

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA 종이 접기 nanostructures 생물학 및 의료 응용 프로그램에 사용할 수 있는 엄청난 잠재력을 보유. 그러나, 낮은 소금 조건과 생리 적 체액에서 nucleases 유도 자기 조립된 DNA nanostructures의 저하 및 변성. 비 바이러스 성 유전자 전달, DNA의 효소 저하 양이온 셸에서 부정 청구 DNA의 캡슐화에 의해 극복 이다. 여기, 유전자 배달 발전, 단순 하 고에 의해 영감을 한 단계 및 강력한 방법론은 제시한 DNA 종이 접기 nanostructures의 안정화에 대 한 chitosan와 선형 polyethyleneimine 코팅. Polycation 코팅 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures를 효율적으로 보호합니다. 이 메서드는 또한 DNA nanostructures의 효소 및 aptamer 기반 기능화의 전체 접근성을 유지합니다.

다른 구성의 3 개의 DNA 종이 접기 nanostructures 하이퍼 (NR), nanobottle (NB)와 (는 nanostructures의 3D 모델은 그림 2에 나와 있는) 와이어 프레임 nanostructure (WN)을 포함 하 여 설계 되었습니다. NR 및 주의 설계 된 광장과 벌집 격자에 따라 각각, Daedalus 소프트웨어18를 사용 하 여 만들어진 caDNAno17 WN을 사용 하 여. 포괄적인 프로토콜을 디자인 하 고 DNA nanostructures의 자기 조립 되었습니다 이미19,20,,2122출판. 모양 관련 주식 가닥 주문, 자기 조립 되었고 더 정화 스탈 외에 의해 설명 하는 프로토콜에 따라. 23 (2 단계)입니다.
Polyplexes 젤 지체 분석 결과 및 nsTEM 영상 특징 이었다. DNA 종이 접기는 polycations, 혼합 시 음극 쪽으로 벌 거 벗은 nanostructure 밴드에 변화 (그림 1A) 관찰 되었다. 이것은 인산 염 그룹에 바인딩 polycations 및 전체 크기에 따라 단지의 증가의 네거티브 차지의 상계를 지정할 수 있습니다. Dextran 황산 같은 polyanions의 추가 금액을 추가 하는 것은 polyplex 형성을 변경할 수 있습니다. 이 점에서 더 높은 분자량의 dextran 황산 (MW ~ 40 kDa) 더 낮은 분자량 dextran 황산 염에 비해 decomplexation에 대 한 효율적으로 보였다 (MW ~ 4 kDa) (그림 1B).
Uranyl 아세테이트 부정적인 얼룩 가장에 의해 LPEI polyplexes 이미징, 하는 동안 어떤 입자의 이미지를 어려웠다. 그것은 가설 되었다 그 LPEI DNA 종이 접기의 꽉 실드 때문에 인산 염 등뼈를 바인딩에서 uranyl 아세테이트를 방해할 수도 있습니다. 따라서, nsTEM 이미징, 이전 dextran 황산의 초과 금액은 LEPI polyplexes에 추가 되었습니다. Unraveled DNA 종이 접기 nanostructures 결함도 분해의 흔적을 보여주었다. 반대로, 키토 산 polyplexes polyanion 치료 (그림 2)에 대 한 필요와 함께 성공적으로 몇 군데 있었다.
NsTEM 영상에 의해 확인 (그들의 다른 구성)에 관계 없이 모든 벌 거 벗은 DNA nanostructures Mg 0 버퍼에서 37 ° C에 외피의 1 일 후 완전히 변성 했다. 대조적으로, LPEI 또는 N/P≥1에서 키토 산 코팅 nanostructures 그대로 남아. 마찬가지로, DNase I 적정 분석 실험 효소 소화도 보호 되지 않은 nanostructures의 민감성을 보여주었다. 알몸 nanostructures 했다 완전히 내가 2 h, LEPI 또는 키토 산 캡슐 DNA 종이 접기 후에 그대로 남아 1 U/mL DNase 존재 소화 하는 동안 밀리 그램-0 버퍼 보충 10 U/mL DNase 나 최소 1 일 (그림 2). Nucleolytic 소화도 높은 안정성은 polyplexes의 N/P 비율을 증가 하 여 달성 되었다. 또한, LPEI 보호 (그림 3A, 그림 3C), 키토 산에 비해 효율적으로 더 많은 DNA nanostructures 아마 LEPI, 그리고 이렇게, 더 높은 친화 력을 바인딩 DNA24 쪽으로 더 높은 충전 밀도 때문 . 다른 분자량의 LPEI를 사용 하는 동안 차이가 관찰 되었다 (그림3B).
폴리머 셸에서 캡슐화 후 DNA nanostructures의 기능적인 그룹의 접근성은 중요 한 기능입니다. 또한, 양 고추냉이 과산화 효소 효소 (HRP)와 hemin 바인딩 aptamers (HBA) 기능성된 DNA 종이 접기 polycation 코팅의 호환성 시험 되었다. 3 biotinylated 주식 가닥 NR의 표면에서 protruded 되었고 HRP 활용 streptavidin (3 효소 DNA 종이 접기 당)와 기능성. 촉매로 높은 활성 (Kd: 439 nM) HBA aptamer PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3')이 실험25에 대 한 선정 되었다. 24 주식 가닥까지 5 nm 길이 링커 함께 NR 표면에서 protruded 했다 (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3')는 p s 2에 의해 따라. M 시퀀스 (24 aptamers DNA 종이 접기 당). 효소의 놀라운 방해 없음 또는 aptamer 활동 HRP 또는 HBA 기능성된 DNA 종이 접기 LPEI와 변형 N/P 비율 (그림 4A-B)16에서 키토 산 코팅 시 관찰 되었다. 그러나, HRP 효소의 활동적인 극적으로 변경 되었습니다 바인딩을 DNA 종이 접기 (그림 4C) 후.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> 그림 1 : Polyplex 형성과 decapsulation의 대표 나이 이미지. (A) 키토 산 0.01-8의 N/P 비율에 혼합 주의 대 한 전기 이동 기동성 교대 분석 실험. 각 레인 1 nmol NB. 포함 첫 번째 차선은 NB. 참조 (B) Decapsulation polyanionic dextran 황산 (DS)에 의해 polyplexes의. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> 그림 2 : DNA 종이 접기 및 polyplexes의 부정적인 얼룩 TEM 현미경 사진. 벌 거 벗은 DNA 종이 접기 nanostructures (열 1과 2)의 3D 모델과 nsTEM 현미경. nsTEM LPEI polyplexes (후 decapsulation) 및 키토 산 polyplexes (열 3, 4)의 현미경 사진. nsTEM 이미지 벗고 보호 된 DNA 종이 접기 (polyplex)의 대상이 Mg 고갈 (열 5, 6 및 7), 효소 저하 (열 8, 9), 37 ° c.에 1 일에 대 한 혈 청 소화 (열 10, 11) LPEI-5 kDa는이 분석 결과에서 사용 되었다. 내가 1 U/mL DNase의 나이에 검출 넘어 벌 거 벗은 DNA nanostructures 타락 했다 또는 TB + 10%에서 37 ° c.에 외피의 2 시간 후 FBS 스케일 바: 100 nm. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> 그림 3 : DNase의 대표적인 결과 나 보호 분석 실험. (A) 는 DNase I LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa와 2, 4, 8 및 10의 N/P 비율로 준비 LPEI-25 kDa WN의 polyplexes에 대 한 분석 결과 보호. 샘플 10 U/mL DNase를 복종 되었다 37 ° c.에 24 h에 대 한 나 마지막 레인 WN 컨트롤입니다. polyplexes decapsulated 이전에 젤에 로딩 했다. (B) 다른 DNA origamis의 polyplexes에 대 한 정규화 된 뜻 밴드 강도 LPEI 나 이미지-.가 추출 Y 축 정규화 의미 밴드 강도를 나타냅니다. (C)는 DNase I 키토 산-WN polyplexes의 보호 시험 준비 N/P 1, 2, 4, 10, 20의 비율. 샘플 10 U/mL DNase를 복종 되었다 37 ° c.에 24 h에 대 한 나 레인 6 제어 polyplex (N/P 20) 이다. 마지막 레인 WN 컨트롤입니다. 모든 키토 산 polyplexes decapsulated 젤으로 사전 로드 했다. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> 그림 4: 대표 색도계 효소-및 aptamer-기능성된 DNA 종이 접기 분석 실험의 결과. (A) 효소 기능성된 nanostructures (HRP-NR) 키토 산 3.7 h 반응 시작 후 코팅의 색도계 분석 실험. Aptamer 기능성된 nanostructures (HBA-NR) 키토 산, 반응 개시 후 6 분 코팅의 색도계 분석 결과 (B) . Y 축은 정규화 된 흡 광도를 나타냅니다. (C) 시간이 지남에 HRP와 HRP-NR의 색도계 분석 결과 모니터링합니다. 이 그림은 이전에 게시 그림16에서 수정 되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>양이온 중합체</td>
			<td>키토 산</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>폴리머 (kDa)의 분자량</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위체 (g/mol)의 Molecualr 무게</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위체 당 아민의 수</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>폴리머 당 아민의 수</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1입니다. Polycation 당 아민 그룹의 수를 계산합니다.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Dextran 황산 (kDa)의 분자량</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위체 (g/mol)의 분자량</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>단위체 당 황산의 수</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>폴리머 당 황산의 수</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2입니다. Polyanion 당 황산 염 그룹의 수를 계산합니다.

여기, 키토 산 천연 양이온 다 당 류 및 합성 선형 polyethyleneimine (LPEI) 코팅을 사용 하 여 Mg 고갈 및 nuclease 리치 미디어에서 DNA 종이 접기 nanostructures의 보호를 위한 프로토콜 제공 됩니다.

유전자 치료 DNA 종이 접기 Nanostructures의 보호를 위한 Polycation 코팅을 영감

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

DNA 나노 구조의 생물학적 안정화는 표적 약물 전달과 같은 미래의 생체 내 응용 분야에 필수적입니다. 그러나, DNA는 각종 효소에 의해 바디에서 저하됩니다. 여기서 우리는 효소 분해로부터 DNA 나노 구조를 보호하는 코팅 기술을 제시합니다.주요 장점은 우리의 코팅은 이미 살아있는 유기체에서 이미 사용되는 비 독성 화합물을 포함하고 표면의 기능화가 가능하다는 것입니다. 이러한 기능화는 약물 화물 방출을 위한 표적 인식 및 스위치를 위한 분자 센서를 통합하는 것이 중요합니다. 다각화 코팅은 캡슐화된 DNA 종이 접기 구조의 세포 통풍구를 크게 증가시므로 이 방법은 진단 및 치료에서 DNA 오리가미스의 적용을 위한 문을 열 수 있습니다.세포 섭취는 DNA 나노 기술의 잠재적인 유전자 전달 응용 프로그램에도 요구됩니다. 나는 방법이 매우 간단하고 쉽게 마스터 할 수 있다고 생각합니다. 시작하려면 정제 된 DNA 종이 접기의 농도를 측정합니다.UV 분광광광계를 보정하기 위해 빈 칸으로 TB 버퍼의 두 마이크로 리터를 사용합니다. 그리고 260 나노미터에서 DNA 종이 접기 농도를 측정합니다. 그런 다음 원고에 설명된 바와 같이 수식 2를 사용하여 정제된 DNA 종이 접기 용액에서 인산염의 양을 계산합니다.희석을 위해 결핵 버퍼를 사용하여 인산염 의 나노몰 1개를 포함시킴으로써 DNA 종이 접기 구조의 15 마이크로리터를 준비합니다. 13.2 마이크로리터를 TB에 넣고 키토산 1.8 마이크로리터에 넣습니다. 그리고 DNA 종이 접기의 15 마이크로 리터에 키토산 용액의 15 마이크로 리터를 추가하여 8의 N /P 비율로 DNA 종이 접기 키토산 폴리 플렉스를 개발한다.원고에 설명된 것과 같은 계산을 사용하여 다른 N/P 비율의 폴리플렉스를 계속 준비합니다. 2% 아가로즈 젤에 대한 튜브의 80 밀리그램을 준비합니다. 2.5 개의 어금니 마그네슘 염화물 352 마이크로 리터를 추가한 다음 DNA 젤 얼룩 10 마이크로 리터로 미리 얼룩지게하십시오.젤 용액을 드라이 젤 상자에 붓습니다. 젤 전기 전구 빗을 삽입하고 15~30분 동안 실온에서 고형화하십시오. 한편 11 밀리모어 마그네슘 염화 마그네슘으로 실행 버퍼를 보완합니다.각 샘플의 10~20마이크로리터를 6X 로딩 버퍼의 20%와 혼합합니다. 알몸 DNA 종이 접기를 포함하여 아가로즈 젤 우물에 샘플을 적재합니다. 2시간 반에서 3시간 동안 실온에서 70볼트에서 젤을 실행합니다.그런 다음 UV 스캐너를 사용하여 젤을 시각화합니다. DNase I 보호 분석기를 수행하려면 서로 다른 N/P 비율에 비해 각 폴리플렉스의 마이크로리터 4개, 10X DNase I 버퍼의 1.5 마이크로리터, 8개의 TB 마이크로리터, DNase I의 1.5 마이크로리터를 별도의 2 밀리리터 PCR 튜브에 추가합니다. 그런 다음 24 시간 동안 열 순환기에서 섭씨 37도에서 동일한 배양합니다.DNase I를 소화하려면 밀리리터 단백질Ase K당 20 밀리그램의 마이크로리터 2개를 추가하고 열사이클러에서 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음, 핵심 DNA 나노 구조를 해명하기 위해 밀리리터 40 킬로달톤 더스톤 황산염당 50 밀리그램의 3.6 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 이러한 샘플과 신선한 DNA 종이 접기를 대조군으로 사용하여 이전에 설명한 바와 같이 아가로즈 젤 전기 포전을 수행합니다.젤에서 로드된 샘플에 해당하는 대역을 소비한다. DNA 종이 접기를 추출하려면 스퀴즈 동결 추출 열을 사용하고 제조업체의 지침을 따르고 원고에 설명된 바와 같이 부정적인 얼룩 전달 전자 현미경 이미징을 계속하십시오. 정제된 36 나노몰러 HRP-NR의 6.5 마이크로리터를 다양한 농도의 폴리시징 6.5 마이크로리터와 혼합합니다.1, 2, 4, 10 및 20의 N/P 비율로 폴리플렉스를 준비하기 위해 증류수 6.5 마이크로리터를 1, 2, 4, 10 및 20의 N/P 비율에 대응하는 다양한 농도의 폴리케이션6.5 마이크로리터를 혼합하여 빈 그룹을 준비한다. 그런 다음 이러한 준비된 각 솔루션 의 12.5 마이크로리터를 96 웰 플레이트의 별도의 웰에 추가합니다. 그런 다음 각 웰에 72.5 마이크로리터의 HEPES 버퍼를 추가하고 혼합합니다.15 밀리머 ABTS의 마이크로리터 10개, 과산화수소 12마이크로리터 5개를 각 웰에 넣고 위아래로 파이프를 섞어 섞습니다. 마지막으로 멀티 모드 플레이트 판독기를 사용하여 4시간 동안 421 나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 겔 지체 분석을 사용하여 폴리플렉스를 분석한 후, 음극을 향한 벌거벗은 나노구조의 변화가 있었는데, 이는 아마도 다각화에 결합할 때 인산염 군의 음전하의 균형을 맞추기 때문이며, 복합체의 크기가 증가했기 때문이다.덱엑스트라황산염과 같은 폴리아니온의 추가량이 첨가되었을 때, 폴리플렉스 형성이 반전되었다. 더 높은 분자량의 Dextran 황산염은 낮은 분자량에 비해 더 효율적인 것으로 나타났다. 음의 얼룩 전염 전자 현미경을 사용하여 폴리플렉스를 분석한 결과, 현미경 사진은 알몸 DNA 종이 접기 나노 구조, 선형 폴리에틸레니민 폴리플렉스, 키토산 폴리플렉스, 알몸 및 보호 된 DNA 종이 접기 의 이미지, 효소 분해 및 세루미를 실시하는 것을 보여 주었다.DNase I의 존재에서, 2 시간 후에, 벌거 벗은 나노 구조는 완전히 소화된 반면, 키토산 캡슐화 된 DNA 종이 접기의 선형 폴리에틸렌민 폴리 플렉스는 밀리리터 DNase I.Linear 폴리에틸레니민 폴리 플렉스가 DNA 나노 구조를 보다 효율적으로 보호하는 동안 그대로 머물렀다. 폴리플렉스의 N/P 비율이 증가하면 DNA 소화가 낮았습니다. 코팅 효소 후, 또는 더 기능화 된 DNA 종이 접기 후, 변이체 N /P 비율로 선형 폴리에틸렌성 폴리 플렉스 및 키토산을 사용하여 효소 활성에 대한 놀라운 간섭이 관찰되지 않았습니다.한편, HRP 효소의 운동은 DNA 종이 접기에 결합한 후 극적으로 변화하였다. 잘 정제 된 DNA 종이 접기 구조로 시작하는 것이 중요합니다. 다변화에도 결합할 수 있는 안정형 가닥이 존재합니다.그들은 DNA 종이 접기 폴리 플렉스에서 분리하기 어렵다. 우리의 코팅 분자는 또한 유전자 치료 응용 프로그램에서 사용됩니다. 이것은 DNA 나노 구조가 살아있는 유기체의 게놈을 바꾸기 위하여 미래에 이용될 수 있다는 것을 의미합니다.아가로즈 젤 염색의 경우, 일반적으로 분자는 DNA를 교제하고 잠재적으로 돌연변이작용을 하는 데 사용됩니다. DNA를 염색할 때 실험실의 안전 지침을 따르십시오.

gene-therapy-inspired-polycation-coating-for-protection-dna-origami

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

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