Name: 셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 배우세요 세균성 병원체가 숙주 세포에서 빠져나오는 유출 메커니즘을 분석하는 체외 및 체내 감염 분석법을. 이 방법은 다양한 병원체와 숙주 세포 모델에 적용 가능하며, 병원체 행동과 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

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마우스는 치료에 대 한 모든 적절 한 정부 지침에 따라 고통 없이 치료 했다 하 고 사용의 실험실의 동물 건강의 국가 학회 및 그들의 사용 마이애미 대학 기관 동물 관리가 전체 연구에 대 한 승인 했다 그리고 사용 위원회 (프로토콜 16-053).
1. 감염에 대 한 셀을 준비합니다.
<ol><li>마우스 대 식 세포와 같은 세포 선 RAW 264.7 DMEM 조직 문화 미디어 10% 태아 종 아리 혈 청 (이제부터 DMEM/FCS 라고도 함)와 보완에 전파 125 mL 플라스 크 및 37 °C/5% CO2에서 유지 관리 하는 조직 문화 인큐베이터를 사용 하 여.</li>
	<li>감염, 전날 확장 플라스 크에서 셀을 제거 하 고 15 mL 원뿔 튜브를 나사 모자에 수집을 셀 스 크레이 퍼를 사용 합니다. 800 x g 10 분에 세포를 원심, 상쾌한 가만히 따르다 (항생제) 없이 DMEM/FCS의 1 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 하 고 titer를 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 결정.</li>
	<li>
2 x 106 셀/ml titer를 조정 하 고 48-잘 조직 배양 접시의 우물을 0.10 mL (2 x 105 셀) 추가. 세포 현 탁 액 우물의 전체 표면을 커버를 확인 합니다.
	<ol>
<li>바른된 미디어의 최신 소스에 대 한 추가 스 판 셀. 또한 '더 셀 컨트롤'로 3 개의 추가 스 DMEM/FCS의 0.10 mL를 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 °C/5% CO2조직 문화 인큐베이터에서 밤새 품 어. 다음 날, 박테리아 inoculum 준비 하 고 사용할 준비가 될 때까지 인큐베이터에서 제거 하지 마십시오.</li>
</ol>2. 감염 Listeria monocytogenes (Lm) 준비
<ol><li>갓 줄무늬 천 배지에서 단일 식민지와 두뇌 심 혼 주입 (BHI)의 2 개 mL를 접종 (< 2 일) Lm 의 130 회전/분 떨고와 37 ° C에서 밤새 품 어 고.</li>
	<li>다음 날, 하룻밤 문화 2 mL를 0.10 mL 미리 BHI를 예 열 하 고 광학 밀도 (OD600)는 0.4 ~ 0.6까지 떨고와 37 ° C에서 배양을 계속 추가 합니다.</li>
	<li>대략적인 세균성 titer를 실험적으로 파생 된 변환 수식을 사용 하 여 결정 합니다. 우리 실험실에서 BHI에 기 하 급수적으로 성장 Lm 문화는 약 1.3 x 109 콜로 니 형성 단위 (CFU) /OD600. 세균성 문화는 실내 온도에 노출 되는 시간을 최소화 합니다.</li>
	<li>방금 전에 감염 titer 5 x 107 CFU/mL 희석 액으로 미리 데워 DMEM/FCS를 사용 하 여 조정 합니다.</li>
</ol>3입니다. 감염
<ol><li>20 µ L을 추가 신속 하 고 정확 하 게, 작업 (1 x 106 CFU, 감염, 나의 다양성 = 5)는 갓 Lm inoculum (2.4 위의 단계)으로 접시를 약간 기울이기 조심 스럽게 피펫으로 팁 overlying 미디어;에서 웰 스의 참고: 피펫으로 팁과 우물의 벽을 만지지 마십시오.</li>
	<li>부드럽게 피펫으로 되도록 각의 내용을 완료 혼합; 동요 하지 또는 우물의 벽에 Lm 를 확산 것이 접시를 크게 기울. 37 °C/5% CO2 배양 기에 세포 배양 접시를 반환 합니다.</li>
	<li>희석제로 감염 되지 않은 우물에서 바른된 미디어를 사용 하 여 10 µ g/mL gentamicin 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>30 분에 감염 (mpi) 게시물, 신중 하 게 37 °C/5% CO2 인큐베이터에 gentamicin 솔루션 (최종 농도 2.5 µ g/mL)와 부드럽게 피펫으로 30 µ L 뿐만 아니라 전에 반환 셀 문화 접시의 내용을 추가.</li>
	<li>(아래 섹션에서 설명한 대로 4 및 5, 각각) 60 mpi에서 CFU 분석 결과 (60 mpi 시간 포인트) 또는 FCM 분석에 대 한 적절 한 우물을 수확.</li>
	<li>나머지 우물에 대 한 다양 한 시간 그 후에 수확 셀 또는 전에, Lm 출현 분석 결과, 전적으로 우물에서 미디어를 제거 하 고 바른 미디어 gentamicin 무료 150 µ L를 바꿉니다.</li>
</ol>4. 샘플링 처리 및 CFU 분석 결과 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석
<ol><li>수확, 약간 기울기는 요리 하 고 우물에서 전체 미디어를 조심 스럽게 제거 합니다. 우물에 멸 균 증류수 (dsH2O) 0.50 mL를 추가 합니다. 30 후 s, lysate 결과 물 전송 (100) 1.5 mL microcentrifuge 튜브 및 10에 대 한 적극적으로 소용돌이 s.</li>
	<li>10-1 과 10-2 희석 및 추가 하 여도 4.5 µ L 또는 lysate dsH2O 450 µ L를 물 50 µ L 짧게 소용돌이 철저 하 게 혼합 되도록 준비 합니다.</li>
	<li>확산은 10의 50 µ L0, 10-1 / lysogeny (파운드) 국물 한 접시에 10-2 샘플.</li>
	<li>응급 Lm (단계 위의 3.6)에 대 한 분석 결과, 입히는 미디어의 10 µ L을 제거 하 고 두 5 µ L aliquots로 그것을 분할 하: 한 약 수에 5 µ L DMEM/FCS의와 두 번째 약 수를 포함 하는 5 µ g/mL gentamicin DMEM/FCS의 5 µ L 추가 추가. 후자의 제어 extracellular Lm (민감한 gentamicin)를 구분 하 고 세포내 Lm (gentamicin 저항) 후속 CFU에서 시험.</li>
	<li>실 온에서 5 분, 후 파운드 한 천 배지에서 dsH2O, 10 s에 대 한 적극적으로 소용돌이의 90 µ L 및 확산 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>Lm 식민지 파운드 한 천 배지는 37 ° c.에 외피의 2 일 다음에 열거</li>
</ol>5. 샘플링 처리 및 Cytometry (FCM)에 의해 세포내 및 응급 Lm 의 분석
<ol><li>1.1-4 단계에 설명 된 대로 RAW 264.7 세포를 준비 합니다. 1 x 106 셀/mL로 세포를 조정 하 고 6 잘 조직 배양 접시의 우물 1 mL (1 x 106 셀) 추가.</li>
	<li>2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 박테리아 inoculum을 준비 하 고 볼륨 inoculum 해당 50 (5 x 107 CFU)의 나 하의 세포를 감염.</li>
	<li>1.5 시간 게시물 감염 (hpi)에서 웰 스의 첫 번째 집합에서 미디어를 수집 하 고 모든 우물 처리 된 때까지 microcentrifuge 튜브 1.5 mL 500 µ L의 4 %paraformaldehyde (PFA)와 얼음에 장소에에서 장소.</li>
	<li>세포내 Lm를 수집 하려면 dsH2O의 1 mL에 추가 잘 60 후 s, 4%의 500 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브 lysate 결과 물 전송 PFA. 10 s와 모든 우물이 처리 될 때까지 얼음에 대 한 적극적으로 소용돌이. (샘플 처리 단계 5.8 아래에 설명 되어 있습니다.)</li>
	<li>나머지 우물에 대 한 미디어를 제거 하 고 extracellular Lm 를 죽 일 셀 인큐베이터에 즉시 반환을 5 µ g/mL gentamicin와 DMEM/FCS의 1 mL를 바꿉니다.</li>
	<li>30 분 (2 hpi) 후 미디어를 제거 하 고 gentamicin 없이 DMEM/FCS를 바꿉니다.</li>
	<li>2, 4 h (4 및 6 hpi) 후 두 번째 고 3 단계 5.3 및 5.4로 미디어와 lysates 수집 하 여 포인트를 시간.</li>
	<li>10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브 원심</li>
	<li>4%의 50 µ L의 칵테일을 얼룩에 각 펠 릿 중단 PFA와 phalloidin의 15 µ L. 20 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>부 화 후 각 튜브를 위아래를 섞어 피 펫 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>10000 x g 방해 펠 릿 없이 7 분 제거 상쾌한에 튜브를 회전 합니다.</li>
	<li>즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼의 400 µ L 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L 각 펠 릿을 중단 PFA 나중에 분석을 위해 저장 하는 경우.</li>
	<li>cytometry에 샘플을 실행 하 고 수집 된 데이터를 분석.</li>
</ol>6. 샘플링 처리 및 Lm 식민과에 호스트 응답의 분석
<ol><li>2.1-2.3 단계에서 설명한 대로 감염에 대 한 Lm 를 준비 합니다.</li>
	<li>3 x 106 CFU/mL의 원하는 titer에 대 한 2 차 배양의 필요한 금액을 계산 합니다.</li>
	<li>감염 직전 계산 된 박테리아와 미리 데워 진된 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 1 mL의 최종 볼륨에서의 양을 희석. 이것은 마우스에 주입 입력된 inoculum 이다.</li>
	<li>28 G½ 100U 인슐린 주사기를 사용 하 여 입력된 inoculum의 100 µ L (3 x 105 CFU) 그리고 어떤 눈에 보이는 기포를 제거.</li>
	<li>지주 구속으로 (스트레인 C57BL/6, 6, 12 주 오래 된 사이 남성) 마우스를 배치 하 고 따뜻한 물 (이상의 45 ° C)를 사용 하 여 꼬리 정 맥을 팽창 다음 입력된 inoculum을 정 맥에 주입.</li>
	<li>10-2 와 파운드 agar 10bcm 접시에 입력된 inoculum의 10-3 희석 하십시오 고 실제 입력된 복용량을 결정 하기 위해 37 ° C에서 밤새 품 어.</li>
	<li>18 hpi에서 고통 없이 안락사 마우스 (CO2 질 뒤에 자 궁 경부 전위)를 사용 하 여 멸 균가 위로 잘라 오픈 마우스 복 막의 내부와 외부에 대 한 별도 쌍의 핀셋과가 위를 사용 하 여 간 전 두 엽을 수집 마우스입니다. 간 6 cm 얼음에 페 트리 접시에에서 놓습니다.</li>
	<li>간 작은 조각으로 잘라 고 자기 저 어 바와 유리 병 합니다. 2 mg/mL 콜라 D FCS 없이 DMEM 재구성의 2 개 mL를 추가 합니다. 30−45 분 자력에 37 ° C에서 튜브를 품 어. 일단 조직 무 균 DMEM/FCS는 콜라를 비활성화 하려면 3 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>필요한 경우 더 많은 DMEM/FCS를 추가 원뿔 관으로 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 필터링 합니다.</li>
	<li>셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 붉은 혈액 세포를 lyse ACK 버퍼의 500 µ L에 셀 펠 릿을 중단 800 x g 에서 원심</li>
	<li>ACK 버퍼에 5 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어. DMEM/FCS의 1 mL에 셀을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>셀을 10 분 동안 4 ° C에 작은, 상쾌한 DMEM/FCS의 1 mL에 중단 800 x g 에서 원심 그런 다음는 hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브와 작은 스핀을 1 x 106 셀을 전송 합니다. DsH2O 및 세포를 lyse에 소용돌이의 1 mL에 다음 일시 중단 합니다. 타지에서 파운드 접시에 50 µ L와 10-2 희석 하십시오 그리고 Lm CFU 분석에 대 한 열거를 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>FACS 튜브 셀 개수에 따라 각 조직 샘플에 대 한 1 x 106 셀을 전송 및 FACS 버퍼의 1 mL로 씻어.</li>
	<li>10 분 동안 4 ° C에서 작은 고 상쾌한 제거 800 x g 에서 셀 원심</li>
	<li>각 항 체와 FACS 버퍼에 대 한 권장된 농도에 따라 관심의 항 체를 포함 하는 항 체 칵테일을 준비 합니다. 분석에 사용 하는 권장된 금액에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
	<li>항 체 칵테일의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 고 30 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 튜브를 품 어.</li>
	<li>부 화, 후 각 튜브를 FACS 버퍼의 2 개 mL를 추가 하 고 셀을 일시 중단.</li>
	<li>셀 4 ° C에서 펠 렛을 삭제는 상쾌한 800 x g 에서 원심 다음 400 µ L의 즉각적인 사용을 위해 FACS 버퍼 또는 FACS 버퍼의 200 µ L와 4%의 200 µ L에 펠 릿을 중단 PFA 나중을 위해 저장 하는 경우.</li>
	<li>Cytometry 세포 분석 (단계 5.13 참조).</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 프로그램 Lm 은 감염에 영향을 주는 세포 활동을 조사 하는 이상적인 병원 체. 호스트 요인의 수는 긍정적으로 또는 부정적으로 영향을 미칠 Lm 세포 감염11,12,,1314확인 되었습니다. 두 같은 Perforin 2와 헤 규제 억제제 우리의 실험실에서 특징 요소 호스트 (P2와 안녕), Lm 감염 프로세스의 고유 기능을 조절. 그림 3에서 보듯이 P2 결핍 세포는 Lm 에 매우 취약 그리고이 향상 된 민감도 또한 P2 녹아웃 쥐4의 사실 이다. 표현 하는 P2 및 P2 불충분 한 세포의 상세...

감염-기반 실험 모델은 호스트와 병원 체, 다양 한 병원 체 감염 전략, 그리고 병원 체 및 호스트-기반 프로세스를 할당의 어려움의 시작 상태 조건에 그들의 의존 때문에 본질적으로 도전 결과 기반으로 합니다. Listeria monocytogenes (Lm) 박테리아의 유전과 미생물의 추적성, 그것의 급속 하 고 processive 세포 감염 전략 및 상대적으로 분명 호스트 방어 응답을 이상적인 병원 체 되고있다 그것의 휴대 organismic-수준 감염 고기 사이의 관계. Lm 의 세포 감염 4 가지 단계1를 통해 진행: (i) 세포 침공 Lm 공포; 포함 되 고로 종결 (ii) Lm-공포 막의 해체 그리고 cytosol;에 Lm 의 릴리스 감독 (iii) intracytosolic 복제; 그리고 (iv)는 플라즈마 막 직접 인접 한 세포 (상피 시트 등)의 감염 또는, 독방 세포, extracellular 환경으로 Lm 의 출시의 물리적 침투. 이러한 단계의 각 특정 Lm에 의해 추진 됩니다-인코딩된 요소 ('독성 요인' 라고도 함), 삭제, 감염 결함 세포 및 동물 모델에서 발생할. 이 일반적인 감염 전략은 독립적으로 진화 되었습니다 아니라 소위 'cytosolic' 병원 체2의 숫자에 의해.
콜로 니 형성 단위 (CFU) 분석 실험 둘 다 생체 외에서 평가를 널리 고용 됩니다 (즉, 셀룰러) 뿐으로 vivo에서 (즉, organismic) 감염 결과. Vivo에서 감염에 대 한 특히 그들의 높은 감도 뿐만 아니라 분석 실험 CFU 병원 체 침입 및 세포내 생존/확산에 대 한 명확한 판독을 제공합니다. CFU 분석 광범위 하 게 영향을 미치는 감염 Lm 및 호스트 셀 결정 요인 분석에 사용 되었습니다. 이러한 사전 연구 분석 세포 침입과 intracytosolic 복제 하 왔다 유익한, CFU 분석 사용 되지 않은, 우리의 지식의 최선을 Lm 감염 과정의 4 단계를 추적 하: 셀룰러 탈출. 여기, 우리는 상대적으로 간단한 CFU 분석 결과 (물론 cytometry) ('출현' 라 함)는 어떻게 세포 탈출 수단을 모니터링할 수 있습니다 및 어떻게 두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요소의 표시 예 규제 Lm의이 단계 설명 감염 주기. 세포질 Lm 감염 사이클의 터미널 단계 분석 추가 병원 체 및 호스트 세포 감염 관련 요인 및 활동 파악 가능 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>ArC 아민 반응성 보상 비드&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) 국물</td><td>EMD Milipore 110493</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 70 &micro; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소 D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 미디어&nbsp;</td><td>기코&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - 열 비활성화&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>행크스 균형 잡힌 소금 용액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB 아가</td><td>그로우 셀 MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 옐로우 데드 셀 스테인 키트&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>로다민 팔로이딘&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 스펙트럼 분석기</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 28 G 1/2" 1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP 조직 배양 48 웰 플레이트&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP 조직 배양 6웰 플레이트&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>Antigen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = PE Cy5, 희석 = 1/100, 클론 = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = AF 647, 희석 = 1/100, 클론 = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = APC Cy7, 희석 = 1/100, 클론 = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = PE, 희석 = 1/100, 클론 = BM8</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>플루로크롬 = AmCyN, 희석 = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = PacBlue, 희석 = 1/200, 클론 = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = AF 700, 희석 = 1/200, 클론 = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>바이오레전</td><td></td>드 <td>플루로크롬 = BV 605, 희석 = 1/100, 클론 = PK136</td></tr></tbody></table>

셀룰러 및 organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

세균성 병원 체 생존 하 고 한 번 진 핵 세포 안에 증식 고용 전략의 다양 한이 있다. 소위 'cytosolic' 병원 균 (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensis, 그리고 리케차 종)에 의해 감염 된 세포 cytosol에 액세스 육체적으로 그리고 효소 저하 기본 vacuolar 막. 일단, cytosol에서이 균 모두 증식 뿐 아니라 새로운 세포를 감염 하기 위하여 주인 세포의 원형질 막에 침투 하는 충분 한 기계적인 힘을 생성. 여기, 우리 보여 어떻게 L. monocytogenes (Lm)의 세포 감염 주기의이 터미널 단계 식민지 형성 단위 분석 및 cytometry 양이 정해질 수 있다이 어떻게 모두 병원 체 및 호스트 인코딩된 요인 영향의 예를 들 프로세스입니다. 우리 또한 보여 쥐에서 파생 된 간 세포의 감염 및 배양된 세포의 Lm 감염 역학의 가까운 통신 감염 생체 외에서 vivo에서. 이러한 함수 기반 분석 실험은 상대적으로 간단 하 고 변조기의 진 핵 세포의 기능에 대 한 높은 처리 화면 검색 기반 쉽게 확장 될 수 있습니다.

병원 체와 세포 감염에 영향을 미치는 호스트 인코딩된 요인의 역할 평가 위에서 설명한 감염 조건 사용 하 여, 입력된 야생-타입 Lm 의 0.15%는 배양된 세포 (그림 1A)를 가진 공동 외피의 1.5 h 후 복구 됩니다. 공동 보육 (3 h 게시물 감염, hpi)의 후속 1.5 h에서 가능한 Lm 의 복구에 4-fold 증가 하 고 3 ~ 6 hpi 가능한 Lm의 복구에 추가 7.5-fold 증가 했다. 이후 셀 스며들 지 않는 항생제 gentamicin extracellular Lm제거 1 hpi에서 공동 문화에 추가 됩니다, 1.5와 6 hpi 사이 가능한 Lm 수준에 30-fold 증가 독점적으로 세포내 확산을 나타냅니다.
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우리 둘 다 생체 외에서 그리고 vivo에서 감염 분석 호스트 인코딩 요인의 활동을 분석 하는 데 사용할 수 있습니다 설명 합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

세포내를 복제하는 미생물 병원균은 결국 감염된 세포를 빠져나가야 합니다. 어느, 숙주 병원체 상호 작용의 다른 양상에 비교될 때 상대적으로 과소 평가됩니다. 여기서는 병원균 의 효능을 분석하는 기술을 설명합니다.우리는 어떻게 상대적으로 간단한 분석이 efflux 효율성을 평가하거나 포스트 efflux 병원체를 특성화하기 위하여 이용될 수 있는지 보여줍니다 특정 병원체 호스트 세포 모형이 운동, 복용량 및 가능한 독서에서 다를 수 있더라도 여기에서 기술된 일반적인 기술은 광범위하게 적용됩니다. 모든 실험 시스템을 설정하는 것과 마찬가지로, 실험 샘플이나 코호트에서 진정한 생물학적 과정이 관찰되도록 명확한 제어가 확립되는 것이 필수적입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 페토리아 게일입니다.감염 실험으로 시작하려면 파이펫을 사용하여 새로 준비된 Lm 접종소 20 마이크로리터를 우물에 추가하고 접시가 약간 기울어지고 파이펫 팁이 중앙 미디어에 조심스럽게 배치됩니다. 파이펫 끝으로 우물의 벽을 만지지 마십시오. 각 웰의 내용물들을 부드럽게 피펫하여 완전한 혼합을 보장합니다.우물의 벽에 LM이 퍼지는 것을 피하기 위해 접시를 흔들거나 크게 기울이지 마십시오. 세포 배양 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 인큐베이터5%로 되돌려 보겠습니다. 감염되지 않은 세포에서 조건된 미디어를 희석제로 사용하여 밀리리터 젠타미신 용액당 10 마이크로그램을 준비하십시오.감염 후 30분 만에 젠타미킨 용액 30마이크로리터를 접시에 넣고 밀리리터당 2점-5마이크로그램의 최종 농도에 도달합니다. 웰의 내용물의 내용을 부드럽게 피펫하여 세포 배양 접시를 인큐베이터에 섞어 반품합니다. 수확하려면 접시를 약간 기울이고 파이펫을 사용하여 전체 미디어를 우물에서 제거합니다.증류된 멸균 물의 포인트 파이브 밀리리터를 우물에 넣습니다. 30초 후, 생성된 물을 1점-5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮기고 10초 동안 적극적으로 소용돌이를 일으킵니다. 4점-5마이크로리터와 50마이크로리터의 소리터를 증류소, 멸균 수의 450마이크로리터에 추가하여 10배 의 희석제와 100배의 희석물을 준비합니다.철저한 혼합을 보장하기 위해 잠시 소용돌이. 원래 10배 의 마이크로리터 50개와 희석된 100배의 희석된 샘플을 리조제니 국물 한천 접시에 넣고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. 신흥 LM에 대한 분석하기 위해 접시에서 오버레이 미디어의 10 마이크로 리터를 추출하고 두 개의 5 마이크로 리터 알리 쿼트와 마이크로 원심 분리 튜브로 나눕니다.DMEM/FCS 5마이크로리터를 하나의 알리쿼트에 추가하고 두 번째 알리쿼트에 밀리리터 젠타미신당 5마이크로리터를 포함하는 DMEM/FCS의 5마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분 간 기다립니다. 각 알리쿼트에 증류살균물 90마이크로리터를 넣고 10초 동안 두 마리를 적극적으로 소용돌이치게 합니다.그런 다음 LB 한천 플레이트에 50 마이크로리터를 추가하고 플레이트 스프레더를 사용하여 확산합니다. Lm 식민지를 열거하기 전에 이틀 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 보관하십시오. 자동화된 세포 카운터를 사용하여, 제조된 2-6-4점-7세포를 1회 10-밀리리터당 10분의 농도로 조정한다.6웰 조직 배양 플레이트의 우물에 샘플 1 밀리리터를 추가합니다. 50의 감염의 복합성에 대응하는 준비된 Lm 접종으로 세포를 감염시. 감염 후 1점-5시간 동안, 4%의 PFA의 500 마이크로리터로 채워진 1점-5 밀리리터 마이크로센티어 유역에서 첫 번째 우물 세트에서 미디어를 수집하고 튜브를 얼음 위에 놓습니다.세포 내 Lm을 수집하려면 각 우물에 증류된 멸균 수1 밀리리터를 추가하십시오. 60초 후, 생성된 물을 4%의 PFA 500 마이크로리터가 있는 1점-5 밀리리터 미세원심분리기 튜브로 이송합니다. 튜브를 10초 동안 활발하게 소용돌이치며 얼음 위에 놓습니다.남아있는 우물의 경우, 미디어를 제거하고 세포 외 Lm을 죽일 밀리리터 젠타미신 당 5 마이크로 그램DMEM / FCS의 1 밀리 리터로 교체.즉시 인큐베이터에 접시를 반환합니다. 30분 후, 미디어를 제거하고 젠타미신없이 DMEM /FCS로 교체하십시오. 또 다른 2 시간 및 4 시간 후, 튜브에 두 번째와 세 번째 시간 포인트에 대한 lysates에서 미디어를 수집하고 차가운 얼음에 배치합니다.원심 분리기 튜브는 7 분 동안 10, 000 배 G에서. 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상퍼를 제거하십시오. 4%의 PFA 50 마이크로리터와 15마이크로리터의 페할로이드를 튜브에 넣고 혼합하여 각 펠릿을 중단합니다.어둠 속에서 튜브를 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후 각 튜브에 FACS 버퍼 1밀리리터를 추가하고 파이펫을 위아래로 섞어 넣습니다. 원심분리기에서 7분 동안 10, 000배 G로 튜브를 회전시합니다.펠릿을 방해하지 않고 상류체를 제거합니다. 즉시 사용, 각 펠릿을 일시 중단 400 FAX 버퍼의 마이크로 리터. 이후 분석을 위해 저장하는 경우, 200 마이크로리터의 FAX 버퍼와 4%의 PFA의 200 마이크로리터를 튜브에 넣고 혼합하여 중단합니다.항생제 젠타미신과의 짧은 치료에서 감염 조건을 사용하여 비내화 Lm을 제거하고, 야생형 Lm의 제로포인트-1-5%는 배양 된 대식세포와 1점-5시간 의 공동 배양 후에 회수된다. 후속 공동 인큐베이션에서, 독점적으로 세포 내 증식을 나타내는 실행 가능한 Lm의 복구에 있는 4배 및 7점-5배 증가가 있었습니다. 비교 프로파일은 초기 감염 시 초반성 prfA를 소유하는 Lm 균주에 대해 관찰되었지만 3~6개의 HPI 사이에는 관찰되지 않았다.PrfA가 Lm 균주에서 삭제되었을 때, 장기간의 공동 배양 후 변형의 회복이 후속감소된다. 겐타미신이 6개의 HPI에서 우물에서 제거될 때, 세포외 Lm은 야생형 및 초유리성 prfA 균주 모두에 대해 1시간 후에 검출될 수 있지만, prfA를 가진 균주에 대해는 삭제되지 않습니다. 감염되지 않은 대식세포와 감염된 대식세포에 겹쳐지는 매체에는 광산염, 박테리아 크기의 미립자 물질이 포함되어 있습니다.그러나 감염된 대식세포에서 나온 매체만이 크기 게이팅 내에서 GFP 양성 신호를 소유했다. 감염된 대식세포로 는 phalloidin 양성 Lm의 외관에 있는 시간 의존적인 증가가 관찰되었습니다. 48웰 조직 배양 접시에서 대식세포를 도금할 때 세포없이 우물을 남겨 둡니다.이러한 세포 없는 대조유는 실험 신호가 숙주 세포의 존재에 의존하도록 병원균, 항생제 등의 첨가와 관련하여 세포 함유 우물과 정확히 동일하게 처리된다. 수치 1 및 3에서 나타난 실험과 유사하게 병원체 또는 숙주 인자 및 소분자는 병원균 세포 에 대한 영향에 대해 테스트할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

에 초점을 세균성 병원체에 의해 호스트 세포의 침략의 연구를위한 일반적인...

세균성 병원체에 의해 인간의 세포의 침략

이 동영상은 콜로니 형성 단위 분석을 통해 대식세포의 리스테리아 모노사이토제네스 감염을 결정하기 위한 체외 정량화 기술을 보여줍니다. 한천 플레이트의 박테리아 군집은 숙주 방어 메커니즘을 벗어나 대식세포 내에서 생존하는 세포 내 박테리아 집단을 나타냅니다.

Colony-Forming Unit Assay에 의한 숙주 세포의 박테리아 감염 정량화

이 비디오는 혐기성 병원성 박테리아인  Porphyromonas gingivalis가 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에 부착하고 침입하는 능력을 평가하는 기술을 보여줍니다. 숙주 세포를 박테리아로 감염시킨 후, 숙주 세포를 용해시켜 부착된 박테리아와 내재화된 박테리아를 모두 방출합니다. 용해물이 적절한 배지에 도말링되면 콜로니의 존재는 박테리아-숙주 세포 상호 작용이 성공했음을 나타냅니다.

혐기성 박테리아-숙주 세포 상호 작용을 연구하기 위한 박테리아 감염 분석

이 기술은 이전 포유류의 세포의 감염에 대한 자연 protozoan 호스트 세포에 미리 재배되고 세균 병원균의 세포 성장을, 수확 정상화하고 계량화 할 수있는 방법을 제공합니다. 이 메소드는 프라이밍 단계뿐만 아니라 대상 셀 유형에 대한 호스트 세포의 다양한 수용하기 위해 수정할 수 있습니다.

Protozoan - 중이오 박테리아와 취급하기 쉬운 포유류의 세포 감염

이 문서에서는 호스트와 두 개의 직교 방법의 조합을 사용 병원균의 단백질 사이의 높은 자신감 상호 작용 집합의 식별에 초점을 맞추고 효모 두 하이브리드 HT-GPCA이라는 포유 동물 세포에서 높은 처리량의 상호 작용 분석에 의해 따랐다.

호스트 병원체 단백질 - 단백질 상호 작용의 풍경의 특성을 비교 접근

리스테리아 균은 자주 세포 내 기생의 연구를위한 주요 모델로 사용되는 그람 양성 세균 병원체이다. 후반 L. 이미징 소 간섭 RNA 화면의 문맥 내 감염 단계 모노 사이토 겐은 표적 숙주 세포의 세균 감염에 필요한 세포 경로의 글로벌 학습을 허용한다.

세균성 병원체에 의해 세포 감염을 조사하기 위해 InlC 분비 이미징<em&gt; 리스테리아</em

우리는 감염 중 병원체 유전자 발현 프로파일링을 위해 빠르고 민감하며 재현성이 있는 프로토콜을 개발했습니다.

디지털 바 코딩 플랫폼을 사용에 감염 미생물의 유전자 발현 프로파일 링

브루셀라 감염과 관련된 숙주 인자에 대한 현미경 기반 고처리량 스크리닝을 위한 두 가지 분석이 설명됩니다. 진입 분석은 Brucella 진입에 필요한 숙주 인자를 검출하고 종말점 분석은 세포 내 복제에 필요한 숙주 인자를 검출합니다. 대체 접근법에 적용할 수 있지만, HeLa 세포의 siRNA 스크리닝은 프로토콜을 설명하는 데 사용됩니다.

에 참여 호스트 요인의 높은 처리량 검사에 대한 현미경 기반 분석 실험<em&gt; 브루셀라</em&gt; HeLa 세포의 감염

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

자동 통계 분석 방법과 함께 고처리량 형광 라벨링 이미징을 사용하여 페노티픽 준수를 기반으로 숙주 세균 병원체 상호 작용을 감지하면 숙주 세포와의 잠재적 세균 상호 작용을 신속하게 평가할 수 있습니다.

호스트 세포에 세균 준수의 자동화된, 높은 처리량 검출

배우세요 세균성 병원체가 숙주 세포에서 빠져나오는 유출 메커니즘을 분석하는 체외 및 체내 감염 분석법을. 이 방법은 다양한 병원체와 숙주 세포 모델에 적용 가능하며, 병원체 행동과 숙주-병원체 상호작용 연구에 필수적인 통찰을 제공합니다.

셀룰러 및 Organismic 수준 호스트 응답 세균성 병원 체 프로브를 사용 하 여

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