형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

이 방법은 생물학적 샘플이 저강도 초음파 자극에 의해 생성된 기계적 힘에 어떻게 반응하는지와 같은 메카노생물학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험가가 비침습적으로 기계적 힘을 샘플에 적용하고 실시간으로 다양한 생물학적 경계를 측정할 수 있다는 것입니다. 먼저 수직 프레스 드릴을 사용하여 표준 35mm 배양 접시 바닥에 12mm 구멍을 천천히 드릴링합니다.

일단 드릴링되면, 블레이드를 사용하여 접시 의 바닥에 부착 된 플라스틱 조각을 제거하고 외부 측에 매끄러운 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시의 외부 바닥 표면에 해양 등급 에폭시 또는 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 접착제 위에 폴리에스테르의 2점-5미크론 두께의 필름을 단단히 눌러 접착제가 필름과 두꺼운 플라스틱 표면 사이에 균등하게 퍼지도록 합니다.

부드럽게 손가락으로 원심 방식으로 필름을 당겨 평평한 표면을 만듭니다. 접착제가 건조되면 폴리에스테르 바닥 접시를 95%에탄올로 간략하게 헹구습니다. 이어서, UV는 254나노미터 UV 흥분소기 공급원 아래에 배치하여 접시를 살균한다.

지속 시간과 강도를 조정하여 평방 센티미터당 약 330 밀리줄의 UV 용량을 제공합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 원하는 배양 배지와 시판적으로 이용 가능한 세포외 매트릭스 단백질 혼합물을 희석한다. 매트릭스 중합을 방지하기 위해 얼음에 작용하고, 신속하게 폴리 에스테르 필름에 중간 혼합물의 100 마이크로 리터를 적용합니다.

뚜껑을 접시에 다시 놓아 멸균을 유지합니다. 일단 덮여, 세포 배양에서 매트릭스 코팅, 폴리 에스테르 바닥 접시를 인큐베이션, 이산화탄소 완충 인큐베이터는 6 ~ 12 시간 동안 섭씨 37도에서. 인큐베이션 후, 과잉 배지를 흡인하고 원하는 밀도로 세포로 표면을 직접 시드한다.

수직 현미경의 목표 아래에 물 탱크를 놓습니다. 그런 다음, 시판적으로 이용 가능한 광구성 성분을 사용하여, 샘플 홀더를 목표와 트랜스듀서 사이에 배치한다. 이동 부품과 번역 단계의 액추에이터가 물 손상을 피하기 위해 탱크 외부 또는 물 선 위에 있는지 확인하십시오.

그런 다음, 침수 변환기를 활용하기 전에, 샘플 홀더의 수평 평면까지 탈이온 화 및 탈기 물로 탱크를 채웁니다. 비부식성, 시판되는 광섬유 성분을 사용하여 광학 경로와 관련하여 경사 위치에 있는 트랜스듀서가 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 반사된 파도가 샘플에서 멀리 이동되도록 합니다.

함수 생성기의 주파수를 트랜스듀서의 명목 피크 주파수로 조정합니다. 그런 다음 함수 발생기의 버스트 모드를 사용하여 원하는 지속 시간 및 반복 주파수의 부비동 전압 펄스를 만듭니다. 다음으로 피크-투-피크 전압을 원하는 값으로 조정합니다.

펄스 지속 시간이 두 개의 연속 펄스 사이의 경과 시간보다 짧은지 확인합니다. 함수 생성기의 출력을 오실로스코프의 입력에 연결합니다. 오실로스코프를 사용하여 파형이 원하는 신호에 해당하는지 확인합니다.

그런 다음, 제대로 크기의 RF 증폭기의 힘의 입력에 함수 생성기의 출력을 연결합니다. 초음파 트랜스듀서와 호환되는 주파수 범위와 음향 강도로 작동하는 하이드로폰 프로브를 사용하여 샘플 위치에서 목표 시야 내에서 프로브의 팁을 신중하게 집중시합니다. 프로브와 트랜스듀서가 수조에 침지되어 음향 축을 하이드로폰 프로브쪽으로 시각적으로 배치하여 트랜스듀서의 사전 정렬을 수행해야 합니다.

둘 사이의 거리가 트랜스듀서의 초점 거리와 일치하는지 확인합니다. 이 코팅을 변경하고 측정에 영향을 미치기 때문에, 물 이외의 물리적 개체와 하이드로폰의 끝을 범프하지 마십시오. 다음으로, 수중기 출력을 오실로스코프의 신호 입력 중 하나에 연결합니다.

그런 다음 함수 생성기에서 다른 오실로스코프 입력에 동기화 트리거를 연결합니다. 두 신호를 오실로스코프에서 동시에 시각화합니다. 다음으로, 프로브를 손상시키지 않도록 낮은 듀티 사이클과 낮은 진폭에서 초음파 사이클이 거의 없는 트랜스듀서를 운전합니다.

하이드로폰 팁이 손상되지 않도록 하이드로폰 제조업체의 안전한 작동 조건을 확인하십시오. 트랜스듀서 의 표면에서 하이드로폰까지 초음파의 이동 시간에 따라 S 부문 노브를 조정합니다. 동기화 트리거 후 오실로스코프에서 수중전화 신호를 찾습니다.

다음으로, 전동 또는 수동 XYZ 단계를 사용하여 트랜스듀서를 천천히 작동시합니다. 최대 수중전화 신호와 상관관계가 있는 위치에 트랜스듀서를 배치합니다. 빔이 정렬되면 오실로스코프에서 하이드로폰 출력의 피크-피크 진폭을 측정하여 트랜스듀서를 구동하는 다양한 전압을 측정합니다.

하이드로폰의 압력 제한을 초과하지 않도록 하십시오. 세포의 배양 배지를 플루오-4 AM과 같은 세포 퍼미디드 칼슘 에 민감한 염료의 5마이크로몰라를 포함하는 원하는 이미징 버퍼로 대체한다. 그런 다음 이산화탄소 완충 인큐베이터에서 1시간 동안 섭씨 37도의 배양 접시를 배양합니다. 인큐베이션에 따라 염료가 없는 동일한 버퍼로 셀을 조심스럽게 씻으실 수 있습니다.

그런 다음 접시를 샘플 홀더에 놓습니다. 490 나노미터에서 청색광 조명을 사용하여 세포를 흥분시킵니다. 과도한 표백이나 픽셀 채도를 피하기 위해 흥분 강도와 카메라 노출을 조정합니다.

더 나은 이미지 품질을 위해 긴 작업 거리로 몰입 목표를 사용하여 시간 경과 이미징을 수행하고 원치 않는 반사를 줄입니다. 여기서, 교모세포종 세포는 표준 배양 배지에서 세포외 매트릭스 코팅 폴리에스테르 필름에 도시된다. 이 세포는 칼슘에 민감한 형광 기자와 함께 배양되었습니다.

이 이미지에서 빨간색 점은 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 식별된 개별 형광 세포를 나타냅니다. 초음파로 10 초 동안 자극을 받으면 많은 관심 지역에서 강력한 칼슘 고도가 시각화되었습니다. 관심 있는 활성화된 영역의 수는 시간이 지남에 따라 여기에 표시됩니다.

초음파를 가진 10 초 활성화에 따라, 지역의 대략 70%는 사용자 정의 임계값 이상인 것으로 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 형광 측정을하기 전에 초음파 빔을 정렬하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.