Name: 형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 배우세요 저강도 펄스 초음파 자극(LIPUS)을 형광 현미경에 통합하여 세포에 비침습적 기계적 힘을 가하고 실시간으로 생물학적 반응을 측정하는 방법을. 이 기술은 기계생물학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

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우리 박사 미하일 샤 피로 니키타 Reznik 유익한 토론에 대 한 감사. 이 작품은 웨스턴 대학 보건 과학에서 시작 자금에 의해 지원 되었다 고 NIH R21NS101384를 부여 합니다.

1. 성장 어쿠스틱 투명 한 폴리에스터 필름에 셀
<ol><li>수직 프레스-드릴을 사용 하 여 표준 35mm 문화 접시의 하단에 12 m m 구멍 크기를 드릴. 드릴을 천천히 이동 하 고 눈 보호를 착용. (그림 2) 외부 면에 매끄러운 표면을 만들려고 블레이드를 사용 하 여 접시의 바닥에 연결 된 플라스틱의 조각을 제거 합니다.</li>
	<li>해양 학년 에폭시 또는 접시의 외부 바닥 표면에 접착제의 얇은 층을 적용 합니다.</li>
	<li>접시의 외부 바닥 표면에 대 한 폴 리 에스테 (2.5 µ m 두께)의 영화를 놓고 에폭시/접착제 필름과 두꺼운 플라스틱 표면 사이 균등 하 게 확산 되도록 단단히 누르십시오. 평평한 표면 (그림 2)를 만들 손가락으로 원심 방식으로 영화를 가볍게 당깁니다.</li>
	<li>에폭시/접착제는 건조 때 짧게 린스 드라이 폴리에스터-아래 95% 에탄올과 접시와 접시 및 내부 배치 하 여 소독 강한 254 nm 자외선 여기 소스 아래 그것의 뚜껑의 표면. 기간 및 약 330 mJ cm-2 미생물의 대부분의 종류의 완전 한 파괴에 대 한의 UV 복용량을 제공 하는 강도 조정 합니다. 이 에너지는 약 1000 µW cm-2 자외선 조명을 사용 하 여 5 분의 기간에 해당 합니다.</li>
	<li>Aliquot 상용 세포 외 기질 단백질 혼합물 (EMPM) 작은 튜브 (50-100 µ L)에 게 메 마른 조건에서 더 적은 또는-20 ° C에서 그들.</li>
	<li>(예를 들어, biosafety 캐비닛 안에) 무 균 환경에서 1: 100 원하는 문화 매체와 냉동된 EMPM 재고 희석. 실 온에서 EMPM 중 합을 방지 하기 위해 얼음에서 작동 합니다. 폴리에스터 필름에 중간 혼합물의 100 µ L는 신속 하 게 적용 됩니다. 불 임을 유지 하기 위해 접시에 다시 뚜껑을 놓습니다.</li>
	<li>셀 문화 공동2 인큐베이터에서 37 ° C에서 6-12 h EMPM 코팅 폴리에스터 하단 요리를 품 어.</li>
	<li>부 화, 이후 초과 중간 발음 하 고 직접 원하는 밀도에 세포 표면 씨앗. 불 임을 유지 하기 위해 무 균 조건 하에서 작동 합니다.</li>
</ol>2. LIPUS 구현
<ol><li>전송 경로에 큰 작업 볼륨 및 조명 하드웨어 없이 직 립 현미경의 목표 아래 물 탱크를 배치 합니다.</li>
	<li>상용 optomechanical 구성 요소를 사용 하 여 목표 아래 샘플 홀더 및 변환기 홀더 샘플 홀더 아래 놓습니다. 다음 샘플 검색 및 초음파 정렬에 대 한 번역 단계에서 이러한 두 홀더를 탑재 합니다.<ol>
<li>탱크 외부 또는 물 손상을 방지 하기 위해 물 라인 위에 움직이는 부품 및 액추에이터의 번역 단계를 놓습니다. 만 포장 되어 optomechanical 구성 요소에 대 한 양극 처리 한 알루미늄 또는 스테인레스 스틸 등 비 부식성 재료를 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>침수 변환기를 이용 하기 전에 이온 및 degassed 물으로 탱크를 채우십시오. 물 라인 샘플 홀더 (그림 3)의 수평 비행기와 일치 한다. 참고: 이온된 수 높은 전기 분야의 존재에 전기 연결을 방지합니다. 산란 그리고 청각 파의 변경 degassing 또한 막을 것 이다. 변환기의 위치 떨어지면 수 선 하는 펌프 나 밸브를 사용 하 여 각 실험 후 물 드레인. 또한, 교체 또는 자주 물을 필터와 청소 물 탱크 미생물의 성장을 방지 하는 데 필요한.</li>
</ol>3. 간접 음향 여기
<ol><li>상용 optomechanical 구성 요소를 사용 하 여 광학 경로 대해 비스듬한 위치에서 변환기를 방향을 정하십시오. 이렇게 하면 어떤 반영 파도 (그림 3 및 그림 4) 샘플에서 지시 될 것 이다.</li>
</ol>4. 드라이브 변환기
참고: 초음파 트랜스듀서 압 전 재료의 기계적 확장/수축으로 진동 전기 에너지를 변환합니다. 이 변환 열 에너지의 형태로 에너지 손실을 생성합니다. 따라서, 변환기는 피크 입력된 전압 제한 가지고지 않습니다, 하는 동안 그들은 또한 압 전 요소에 열 손상을 방지 하는 전력 제한 보유: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq1.jpg"> 의무 주기 전기 시뮬레이션, P (에서 와트) 전력의 시간의 상대적인 비율 Vrms 입력된 루트-의미-스퀘어 전압 (볼트)에 다른 전압 소스 및 Z 는 전기의 임피던스 (옴). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq2.jpg"> Vpp 변환기에 적용 피크 대 피크 입력된 전압으로
<ol><li>원하는 주파수, 펄스, 초당 사이클의 수를 포함 하는 사인파 형태로 만들고 상업 함수 발생기를 사용 하 여 반복 주파수 펄스. 그러나, 효과적으로 종종 표준 초음파 트랜스듀서를 구동 하는 데 필요한 상대적으로 높은 Vpp 함수 발생기의 출력 (즉, Vpp의 진폭 증가)를 증폭 하는 전력 증폭기의 추가 요구 한다. 참고: 예를 들어 변환기의 제조업체 나타냅니다 전력 제한 주어진된 트랜스듀서는 35 W. 것 이다 사인 곡선 피크-피크 입력 전압 (V에에서) 500 mV 의무에 50%의 고 50 dB를 통해 증폭/100 W 앰프가이 변환기의 전력 제한 내?<ol>
<li>이 질문에 대답 하려면 확대 후 전압을 계산 합니다. 무선 주파수 (RF) 전력 증폭기 증폭 요소 (dB)으로 정의 됩니다. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq3.jpg" style="opacity: 0.9;"> 따라서, 증폭된 전압 진폭 출력 Vpp 는 (Vpp 밖으로V =)의:<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq4.jpg"> 방정식 1과 2를 사용 하 고 전기 임피던스 50 Ω를 사용 하 여,이 전압에 의해 생성 된 해당 전원이입니다. <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq5.jpg"> 이 자극은 그러므로 제한 내에 전력 변환기의.</li>
		<li>위의 예제를 사용 하 여 해당 전원 및 전압 제한 변환기의 제조업체에서 제공 하는 파형 파라미터 (Vpp, 주파수, 펄스 기간 및 펄스 반복 주파수)를 계산 합니다. 변환기 및 다른 연결 된 계측기의 손상을 방지 하려면 이러한 한계를 존중 하는 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>초음파 트랜스듀서와 호환 되는 주파수 범위 내에서 작동 하는 함수 발생기를 선택 합니다. 공칭 피크 주파수 변환기의 함수 발생기의 주파수를 조정 합니다.</li>
	<li>원하는 기간 및 함수 발생기의 버스트 모드를 사용 하 여 반복 주파수의 정현파 전압 펄스를 만듭니다. 피크 대 피크 전압 원하는 값을 조정 합니다. 펄스 기간 보다 짧습니다 2 연속 펄스 사이의 경과 시간 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>파형을 오실로스코프의 입력 함수 발생기의 출력을 연결 하 여 원하는 신호에 해당 함을 확인 하십시오.</li>
	<li>함수 발생기의 출력 전력 RF 증폭기 (그림 4)의 입력에 연결 합니다. 자극 매개 변수 변환기의 제조 업체의 한계 내에 있는지 확인 합니다.</li>
</ol>5. 빔 정렬
<ol><li>초음파 변환기의 강도 주파수 범위와 음향 강도 주파수와 호환와 작동 하는 고래의 선택 하십시오.</li>
	<li>샘플 (그림 4)의 위치에 해당 위치에서 객관적인 시야 내에서 초점으로 고래의 프로브 팁을가지고 신중 하 게.</li>
	<li>프로브 및 변환기 이온 및 degassed 물에 몰입 하는 것을 확인 하십시오. 이 코팅을 변경 하 고 측정에 영향을 미칠 것입니다 물 이외의 어떤 물리적 개체와 고래의 끝을 범프 하지 않습니다.</li>
	<li>시각적으로 고래의 프로브 향해 음향 축을 배치 하 여 변환기의 총 사전 정렬을 수행 합니다. 변환기의 표면와 고래의 끝 사이 거리 약 변환기의 초점 거리에 해당 합니다.</li>
	<li>고래의 오실로스코프의 신호 입력 중 하나에 출력을 연결 합니다. 다른 오실로스코프 입력 함수 발생기에서 동기화 트리거를 연결 합니다. 오실로스코프에 동시에 두 신호를 시각화 합니다.</li>
	<li>드라이브는 낮은 듀티 사이클 및 프로브 손상을 방지 하려면 낮은 진폭에 몇 초음파 사이클 변환기. 고래의 팁의 손상을 방지 하려면 고래의 제조 업체 안전한 작업 조건을 확인 하십시오.</li>
	<li>S/부 손잡이에 고래의 초음파 변환기의 표면에서의 여행 시간에 따라 조정 합니다. 동기화 트리거 후 오실로스코프에 고래의 신호를 찾고 있습니다.</li>
	<li>천천히 작용 전동 또는 수동 XYZ 단계를 사용 하 여 변환기. 최대한 고래의 신호 (그림 4)와 연결 하는 위치에 변환기를 둡니다. 참고: 신호는 인식 가능 하다 음향 펄스의 강도 너무 낮은 또는 광속은 잘못 또는 개체에 의해 흩어져. 고래 및 변환기는 시각적으로 미리 정렬 하 고 거품 또는 물리적 개체는 폴리에스터 필름을 제외 하 고 경로 정기적으로 확인 합니다. 신호가 감지 되 면 여전히, 고래의 신호 진폭을 증가 하는 작은 금액으로 입력된 전압을 증가.</li>
</ol>6. 초음파 펄스 압력 및 강도 결정
<ol><li>빔 정렬와 함께 다양 한 전압 변환기 운전 오실로스코프에서 고래의의 피크-피크 진폭을 측정 합니다. 고래의 제조업체에서 권장 하는 압력 한계를 초과 하지 않도록 확인 합니다.</li>
	<li>이러한 측정 압력 및 고래의 제조업체에서 제공 하는 보정 메서드를 사용 하 여 음향 강도 값으로 변환 합니다. 참고: 음향 강도 수식을 사용 하 여 압력 그리고 반대에서 결정 될 수 있다: <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/58781/58781eq6.jpg"> 내가 (에 W m-2), 음향 압력으로 P (Pa)에서 음향 압력 자료 (1000 k g m-3 물에 대 한) 및 c 전파 매체에 소리의 속도 전파의 밀도 ρ (물, c = 1500 m s-1).</li>
	<li>이러한 측정을 사용 하 여 보정 곡선을 만듭니다. 참고: 압력 대 전압 및 강도 대 전압 곡선 선형과 포물선 모양, 각각 있다.</li>
	<li>해당 보정 곡선을 사용 하 여 원하는 운전 전압의 압력 또는 강도 값을 결정 합니다.</li>
</ol>7. 칼슘-민감한/LIPUS 라이브 셀 형광 이미징
<ol><li>셀 permeant 칼슘에 민감한 염료의 5 µ M를 포함 하는 원하는 이미지 버퍼에 셀의 문화 매체를 바꿉니다 (예를 들어, Fluo-4 오전). 1 시간에 대 한 37 ° C에서 CO2 인큐베이터에서 문화 접시를 품 어.</li>
	<li>신중 하 게 씻어 염료의 무료 동일한 버퍼와 셀.</li>
	<li>샘플 홀더에 접시를 놓습니다. 블루 빛 조명을 사용 하 여 셀을 자극 (490 nm) 여기 강도와 카메라 노출 과도 한 표백 또는 픽셀 채도 피하기 위해 조정.</li>
	<li>시간 경과 영상 원하는 이미지 수집 설정을 사용 하 여 수행 합니다. ( 그림 4참조) 원치 않는 반사를 줄이기 위해 집중 목표 더 나은 이미지 품질 및 긴 작동 거리와 함께 사용 합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

집중 된 초음파의 주요 장점은 비 접촉 spatio 시간적 고정밀 생물학 견본에 기계적 또는 열 에너지를 전달 하는 기능입니다. 기계적으로 자극 하기 위한 다른 기술을 일반적으로 고용 침략 물리적 프로브 (예를 들어, 셀 파고) 세포 또는 외국 개체 (예: 광학 족집게)와 높은 에너지 레이저 광선의 상호 작용을 요구 한다. 마그네틱 난방 생물 학적 샘플 내부 특정 공간 위치를 열 수 있습니다 하지만 외국 자성 나노 입자의 존재를 요구 한다. 다른 한편으로, 작은 샘플 (예를 들어, 셀 문화) 수성 매체에서의 정확한 비-침략 적 열 적외선을 사용 하 여 또는 여기17,,1819전자 레인지.
많은 biophysicists 그들의 특정 응용 프로그램<sup class="x...

많은 질병 침략 적 의료 개입의 일종이 필요합니다. 이 절차는 자주 비싼, 위험, 회복 기간을 필요로 하 고 따라서 의료 시스템에 부담을 추가 합니다. 비-침략 적 치료 modalities 기존의 수술을 안전 하 고 더 싼 대안을 제공 하 가능성이 있다. 그러나, 현재 비-침략 적 접근 pharmacotherapy 또는 transcranial 자석 자극 등 종종 조직 침투, spatiotemporal 해상도 및 원치 않는 오프 대상 효과 간에 의해 제한 됩니다. 이러한 맥락에서 집중 된 초음파 구성 하는 생물 학적 기능을 조작 하는 잠재력을 가진 유망한 비-침략 적 기술 제한 대상에서 효과 높은 spatiotemporal 정확도와 조직 깊숙한.
집중 된 초음파 자극 정확한 위치에서 음향 에너지를 제공 구성 생물 깊숙한. 음향 펄스 매개 변수에 따라이 에너지는 다양 한 의료 사용을 할 수 있습니다. 예를 들어, 식품 및 의약품 안전 청은의 사용을 승인 고 강도 집중 초음파 (장내) 전립선 종양, 뇌 영역 떨림 발생, 자 궁 fibroids 및 통증을 일으키는 뼈 전이1 신경 엔딩의 열 제거에 대 한 . 장내 중재 microbubble 현상 또한 체계적으로 관리 치료2의 대상된 배달에 대 한 혈액-뇌 장벽 정도 여는 데 사용 됩니다. 공간-피크 펄스 평균 강도 (내가sppa)와 공간-피크 시간 평균 강도 (내가spta) 장내 응용 프로그램은 일반적으로 몇 kW cm-2 위 및 펄스 압력 MPa의 몇몇 10의 생산에 사용. 이러한 강도 값은 멀리 위에 FDA 승인 난sppa 고spta 진단 초음파, 190 W c m-2 720 mW cm-2,3각각에 대 한 제한. 반면, 최근 연구 또는 진단 초음파 강도 한계 (LIPUS)의 범위에 가까운 수 수 효과적으로 그리고 안전 하 게 원격으로 조작 신경 발사4는 그 비 파괴적인 펄스 초음파 자극 5,6,7,8, 호르몬 분 비9,10 및 bioengineered 세포11. 그러나, 세포질이 고 분자 기계 장치는 셀 감지 및 초음파에 응답 유지 불분명, LIPUS의 임상 번역 제외. 따라서, 지난 몇 년 동안, 인공 막, 배양된 세포 및 동물 초음파 자극된의 연구 생물을 기세를 얻고 있다 및 생리 적 프로세스 LIPUS12,13, 변조 , 1415.
물리적 매체를 통해 전파 진동 소리에 의하여 이루어져 있다. 초음파는 이상 인간의 가청 범위 (즉, 20 k h z) 주파수를 가진 소리 이다. 실험실 환경에서 초음파 파도 일반적으로 특정 높은 주파수 대역폭에서 진동 전기 필드에 대 한 응답에서 진동 하는 물자를 포함 하는 압 전 트랜스듀서에 의해 생산 됩니다. 변환기의 두 가지 유형의 존재: 요소 변환기 및 변환기 배열. 단일 요소 압 전 트랜스듀서는 초점 렌즈 역할을 하며 따라서 음향 에너지를 집중 하 고 초점 영역 이라고 정의 된 지역으로 곡선된 표면 소유. 단일 요소 변환기는 훨씬 저렴 하 고 변환기 배열 보다 운영 하기가 있습니다. 이 문서는 단일 요소 변환기에 집중할 것 이다.
집중 된 단일 요소 변환기의 초점 영역의 크기에는 음향 주파수와 음향 렌즈의 기하학적 속성에 따라 달라 집니다. 단일 요소 변환기와 밀리미터 크기 초점 영역을 달성 하기 위해 초음파 주파수 MHz 범위에는 일반적으로 필요 합니다. 불행 하 게도, 같은 주파수에서 청각 파 공기 같은 얇은 매체에 전파 될 때 감쇠 매우 빠르게 있습니다. 따라서, MHz 초음파 파도 생성 하 고 물과 같은 농도 자료 샘플을 전파 해야 합니다. 이 구성 LIPUS 적임 현미경에 통합에 첫 도전 합니다.
두 번째 도전은 다른 음향 임피던스 (재료 밀도 및 음향 속도의 제품에는) 음향 경로 재료 사이의 물리적 인터페이스를 최소화 하는 것 이다. 이러한 인터페이스 수 반영, 굴절, 분산 하 고 샘플을 효과적으로 전달 하는 음향 에너지의 양을 계량 하 고 어려운 청각 파 흡수. 그들은 또한 원치 않는 기계 공예품을 만들 수 있습니다. 예를 들어, 반사 생산된 음향에 수직 불일치 임피던스 인터페이스는 backpropagating 파도 앞으로 전파 하는 것을 방해 하는 만듭니다. 간섭 경로 따라 파도 취소 서로 노드 및 안티 노드, 지역 교류에서 합계 라는 공간의 고정된 지역에서 소위 서 파도 (그림 1)를 만들어. 그것을 제어 하거나 이러한 실험적인 인터페이스 시험관 에 비보없을 수 있습니다 제거 수 experimentalist에 대 한 중요 하다.
형광 측정 광 기자 들의 투명 한 생물 학적 샘플 없이 실제 소요와 실시간으로 잘 알려진 방법입니다. 이 접근은 따라서 어떤 물리적 프로브 sonicated 지역에 기계적 유물 소개로 LIPUS 연구에 이상적입니다. 이 프로토콜 구현 및 상업 epi-형광 현미경 LIPUS의 운영에 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>작업량이 큰 직립 현미경</td><td>Thorlabs</td><td>CERNA</td><td></td></tr><tr><td>작업 볼륨이 큰 정립 현미경</td><td>Scientifica</td><td>SliceScope</td><td></td></tr><tr><td>광기계 구성 요소</td><td>Thorlabs</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>바늘 수중청음기</td><td>ONDA Corporation</td><td>HNP/C/R/A/T 시리즈 + AH/G 프리앰프</td><td></td></tr><tr><td>바늘 수중청음기</td><td>정밀 음향</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 수중청음기</td><td>ONDA Corporation</td><td>HFO 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>광섬유 수중청음기</td><td>해당 없음</td><td></td><td>오실로스코프</td></tr><tr><td></td><td>Keysight Technology</td><td>DSOX2004A(4채널 70MHz)</td><td></td></tr> <tr><td>함수 발생기</td><td>Keysight Technology</td><td>33500B(20MHz 단일 채널)</td><td></td></tr><tr><td>RF 전력 증폭기</td><td>전자 항행 산업 (ENI)</td><td>325LA, 525LA, 240L, 350L, A075, 2100L, 3100LA</td><td></td></tr><tr><td>RF 전력 증폭기</td><td>전자 및 혁신(E& I)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>침수 초음파 트랜스듀서</td><td>올림푸</td>스 <td>집속 침수 트랜스듀서</td> 침수 초음파 트랜스듀서 <td></td></tr><tr><td></td><td>저파 기기</td><td>HiFu 트랜스듀서 BII-76 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>침수 초음파 트랜스듀서</td><td>정밀 음향</td><td>피에조 세라믹 또는 HiFu 트랜스듀서</td><td></td></tr><tr><td>침수 초음파 트랜스듀서</td><td>초음파-S-lab</td>주문 제작 <td></td><td>HiFu 트랜스듀서</td></tr> 고밀도 <tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>VWR 80094-330</td><td></td></tr><tr><td>Mylar 필름 2.5 미크론</td><td>Chemplex</td><td>CAT.NO:107</td><td></td></tr></tbody></table>

형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

Multiplexing Focused Ultrasound Stimulation with Fluorescence Microscopy

집중 함으로써 부드러운 조직에 침투 하는 저 강도 초음파 펄스, LIPUS 원격으로 그리고 안전 하 게 신경 발포, 호르몬 분 비 및 유전으로 재설정 셀을 조작 하는 유망한 생물 의학 기술을 나타냅니다. 그러나,에 의해 의료 응용 프로그램에 대 한이 기술의 번역 방해 현재는 생물 메커니즘의 부족 및 대상 조직 감각 LIPUS에 응답. 이러한 메커니즘을 식별 하는 적당 한 접근 LIPUS와 함께에서 광학 바이오 센서를 사용 하 여 기본 신호 경로 결정 하는 것입니다. 그러나, LIPUS를 구현 하는 형광 현미경에 물리적 인터페이스를 반영 하 고, 흡수 하 고 청각 파의 굴절의 존재로 인해 원치 않는 기계적 유물을 발생할 수 있습니다. 이 문서 음향 경로 따라 물리적 인터페이스의 영향을 최소화 하면서 상용 직 립 피 형광 현미경에 LIPUS를 통합 하는 단계별 절차를 제공 합니다. 단일 요소 초음파 트랜스듀서를 운영 하 고 객관적인 초점으로 변환기의 초점 영역을가지고 간단한 절차를 설명 합니다. LIPUS 사용 하 여 칼슘 이미징 사용 하 여 측정 하는 교양된 인간 세포종 세포에서 칼슘 LIPUS 유도 과도의 예를 보여 줍니다.

그림 5 LIPUS 실험 칼슘 영상과 다중화의 예입니다. 세포종 세포 (A-172) 했다 EMPM 코팅 폴리에스터 필름에 (10% 세럼과 1% 항생제로 보충) 표준 문화 매체에 성장과 칼슘-민감한 형광 기자 Fluo-4와 incubated 오전. 셀은 10 배 집중 렌즈를 사용 하 여 백색 LED 광원으로 조명 그리고 몇 군데와 형광 빛 표준 GFP 필터 세트를 사용 하 여 수집 되었다. LIPUS 158 V 피크 대 피크 진폭, 0.1 ms 펄스 기간 및 10 ms 맥 박 반복 주파수 (즉, 1% 듀티 사이클)의 펄스 파형으로 4 MHz 트랜스듀서를 구동 하 여 수동으로 적용 되었다. 이러한 매개 변수를 해당sppa 88 승 cm-2 (190 W c m-2의 진단도) 아래와 난spta = = 877 mW...

낮은-강도 펄스 초음파 자극 (LIPUS)은 높은 공간 및 시간적 해상도 생 또는 조작 셀의 비-침략 적 기계적 자극에 대 한 양식 적임 이다. 이 문서는 피 형광 현미경 LIPUS를 구현 하는 방법 및 원치 않는 기계적 유물을 방지 하기 위해 초음파 경로 따라 음향 임피던스 불일치를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.

By focusing low-intensity ultrasound pulses that penetrate soft tissues, LIPUS represents a promising biomedical technology to remotely and safely ...

이 방법은 생물학적 샘플이 저강도 초음파 자극에 의해 생성된 기계적 힘에 어떻게 반응하는지와 같은 메카노생물학의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험가가 비침습적으로 기계적 힘을 샘플에 적용하고 실시간으로 다양한 생물학적 경계를 측정할 수 있다는 것입니다. 먼저 수직 프레스 드릴을 사용하여 표준 35mm 배양 접시 바닥에 12mm 구멍을 천천히 드릴링합니다.일단 드릴링되면, 블레이드를 사용하여 접시 의 바닥에 부착 된 플라스틱 조각을 제거하고 외부 측에 매끄러운 표면을 만듭니다. 다음으로, 접시의 외부 바닥 표면에 해양 등급 에폭시 또는 접착제의 얇은 층을 적용합니다. 접착제 위에 폴리에스테르의 2점-5미크론 두께의 필름을 단단히 눌러 접착제가 필름과 두꺼운 플라스틱 표면 사이에 균등하게 퍼지도록 합니다.부드럽게 손가락으로 원심 방식으로 필름을 당겨 평평한 표면을 만듭니다. 접착제가 건조되면 폴리에스테르 바닥 접시를 95%에탄올로 간략하게 헹구습니다. 이어서, UV는 254나노미터 UV 흥분소기 공급원 아래에 배치하여 접시를 살균한다.지속 시간과 강도를 조정하여 평방 센티미터당 약 330 밀리줄의 UV 용량을 제공합니다. 다음으로, 1 대 100의 비율로 원하는 배양 배지와 시판적으로 이용 가능한 세포외 매트릭스 단백질 혼합물을 희석한다. 매트릭스 중합을 방지하기 위해 얼음에 작용하고, 신속하게 폴리 에스테르 필름에 중간 혼합물의 100 마이크로 리터를 적용합니다.뚜껑을 접시에 다시 놓아 멸균을 유지합니다. 일단 덮여, 세포 배양에서 매트릭스 코팅, 폴리 에스테르 바닥 접시를 인큐베이션, 이산화탄소 완충 인큐베이터는 6 ~ 12 시간 동안 섭씨 37도에서. 인큐베이션 후, 과잉 배지를 흡인하고 원하는 밀도로 세포로 표면을 직접 시드한다.수직 현미경의 목표 아래에 물 탱크를 놓습니다. 그런 다음, 시판적으로 이용 가능한 광구성 성분을 사용하여, 샘플 홀더를 목표와 트랜스듀서 사이에 배치한다. 이동 부품과 번역 단계의 액추에이터가 물 손상을 피하기 위해 탱크 외부 또는 물 선 위에 있는지 확인하십시오.그런 다음, 침수 변환기를 활용하기 전에, 샘플 홀더의 수평 평면까지 탈이온 화 및 탈기 물로 탱크를 채웁니다. 비부식성, 시판되는 광섬유 성분을 사용하여 광학 경로와 관련하여 경사 위치에 있는 트랜스듀서가 있는지 확인하십시오. 이렇게 하면 반사된 파도가 샘플에서 멀리 이동되도

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

우리는 형광 광 활성화 국소화 현미경(FPALM)을 사용하여 세포 내에서 여러 유형의 형광 표지 분자를 동시에 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 설명된 기술은 단일 세포 내에서 수십 나노미터의 정밀도로 수천 개에서 수십만 개의 개별 형광 표지 단백질의 국소화를 산출합니다.

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy(형광 광활성화 국소화 현미경을 사용한 생물학적 구조의 동시 다색 이미징)

우리는 전체 세포 패치 - 클램프 및 마우스 뇌의 급성 조직 슬라이스에서 수상 돌기 및 해마 신경 세포의 쪽의 세포 내 나트륨 과도 다중 광자 이미징 신경 활성 화합물의 초점 UV 유도 된 사진 활성화의 조합을 설명합니다.

다중 광자 세포 내 나트륨 이미징 CA1 피라미드 뉴런의 글루타메이트의 UV 매개 초점 Uncaging과 결합

우리는 형광 표지 항체의 순차적 인 결합 및 용출을 사용하여 단일 분자 정밀도로 이질적인 나노 구조 내의 다중 분자를 이미지화하는 방법을 시연합니다.

madSTORM을 이용한 T 세포의 고해상도 이미징

여기에 우리가 현재 기존의 피 형광 이미징, 단일 분자 검출 기반 슈퍼 해상도 이미징, 및 다중 색상 단일 분자 검출 병합, 통합된 현미경 시스템 구축의 실용적인 가이드 포함 단일 분자 형광 공명 에너지 비용 효율적인 방법으로 하나의 설정으로 이미지를 전송 합니다.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

단단히 초점을 맞춘 펨토초 레이저는 공초점 현미경 검사법에 결합되어 세포에 정확한 자극을 전달하여 실시간 관찰 및 광자극을 가능하게 합니다. 광자극은 ERK 신호 통로 및 반응성 산소 종의 미토콘드리아 섬광을 포함한 세포 분자 이벤트를 활성화할 수 있습니다.

펨토초 레이저에 의한 광자극은 대상 세포에서 세포외 신호 조절 키나아제(ERK) 신호 또는 미토콘드리아 이벤트를 활성화합니다.

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

이 프로토콜은 혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중 된 초음파 및 마이크로 버블 치료 중에 설치류 뇌의 생체 내 다광 형광 이미징에서 실시간으로 가능하게하는 수술 및 기술적 절차를 설명합니다.

혈액-뇌 장벽 투과성을 높이기 위해 집중된 초음파 및 마이크로 버블 치료를 시각화하는 실시간 인트라바이탈 다광원 현미경 검사법

제시된 프로토콜은 그들의 활성화 기계장치 및 그들의 생체 효력을 포함하여 초음파 트리거한 약 납품 응용을 위해 디자인된 형광 표지마이크로버블의 반응을 특성화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 백서는 관련 길이및 시간대를 포착하기 위해 수행된 다양한 시험관 내 및 생체 내 현미경 기술을 다룹니다.

초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

수술 마진 분석을 위해 수술 중 조직학적 이미지를 제공할 수 있는 고속 및 개방형 자외선 광음향 현미경이 시스템 구성, 광학 정렬, 샘플 준비 및 실험 절차를 포함하여 시연됩니다.

딥 러닝의 지원을 받는 가상 염색을 통한 조직학적 이미징을 위한 고속 자외선 광음향 현미경 검사

이 프로토콜에는 자유롭게 움직이는 마우스에서 동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정의 전체 운영 워크플로우를 위한 변환기 제조, 파라미터 보고, 수술 절차 및 신호 기록이 포함됩니다.

동시 집속 초음파 신경 조절 및 광섬유 광도 측정(Free-Moving Mouse)의 기록

IBEX(Spectral Iterative Bleaching Extends Multiplexity)는 헤파린 차단을 추가하여 비특이적 결합을 최소화하고 스펙트럼 검출과 전산 혼합 해제를 활용하여 자가형광을 억제함으로써 기본 IBEX 기술을 기반으로 합니다. 이 접근 방식은 배경 소스를 줄이면서 이미지 획득을 가속화하여 강력한 다라운드, 고파라미터 공간 단백질체 분석을 가능하게 합니다.

비특이적 조직 형광을 최소화하기 위해 스펙트럼 공초점 현미경을 사용한 하이플렉스 이미징

배우세요 저강도 펄스 초음파 자극(LIPUS)을 형광 현미경에 통합하여 세포에 비침습적 기계적 힘을 가하고 실시간으로 생물학적 반응을 측정하는 방법을. 이 기술은 기계생물학 연구에 새로운 가능성을 열어줍니다.

형광 현미경과 초음파 자극에 초점을 맞춘 멀티플렉싱

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