Name: 자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 학습하세요 CAR T 세포가 3D 종양 스페로이드를 살상하는 세포독성을 실시간 영상으로 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 고급 이미징 기술과 면역 분석을 결합하여 면역 치료 효과를 동적으로 모니터링합니다.

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이 작품에서 보조금 #244388, #254817 그리고 #284983; 노르웨이 연구 위원회에 의해 지원 되었다 노르웨이 암 협회 (#6829007); 노르웨이 건강 지역 남쪽 동쪽 그랜트 #17/00264-6와 #2016006.

1. 대 장 암 세포 선에서 Spheroids의 생성
<ol><li>씻어 HCT 116 (클러스터 차별화 19 (CD19) 및 녹색 형광 단백질 (GFP)를 표현 하는 불리고 안정적) 셀 monolayers 인산 염과 식 염 수 (PBS, 25 cm2 또는 75 c m2 플라스 크에 10 mL 5 mL) 버퍼링. 트립 신 (0.5 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크 1 mL)을 추가 하 고 5 분 동안 37 ° C에 세포를 품 어.</li>
	<li>현미경으로 세포 분리를 확인 하 고 완전 한 로스웰 파크 기념 연구소 160 매체 (RPMI 1640)와 셀 분리 효소를 무력화 (RPMI 1640 + 10 %FCS + Gentamycin; 10 mL 25 c m2 에 대 한 또는 75 c m2 플라스 크에 대 한 20 mL).</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 5 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 5 x 103 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.</li>
	<li>메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 하단 플레이트 라운드 96 잘으로 200 µ L/잘 분배.</li>
	<li>접시 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치에 전송.</li>
	<li>수집 소프트웨어에 로그인, 일정 취득 선택 | 실행 선박 추가 | 일정 검색 | 배 만들기: 새로운.</li>
	<li>
선택 검사 유형: 회전 타원 체. 관심의 채널 선택: 단계 + 대물 (spheroids 성장 따르도록), 녹색 (종양 신호에 따라, 수집 속도 300 ms)와 레드 (apoptosis에 따라, 수집 속도 400 ms).
	<ol>
<li>선택 원하는 배율: 10 배.</li>
		<li>플레이트 모델과 서랍에 그것의 위치를 선택 하십시오. 이미지를 우물의 위치를 선택 합니다. 실험의 설명을 입력: 이름, 셀의 형식, 셀의 수.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분석 설정에 대 한 연기 분석까지 나중에 선택 합니다. 시간 표시 막대를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 4 h 고 의 총 24 h.에 설정 원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간).</li>
	<li>
이미징 소프트웨어에 로그인 하 여 spheroids의 성장에 대 한 일 마다 확인 합니다.
	<ol>
<li>보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 원하는 실험에는 두 번 클릭. 이미지 채널 패널에서 명시 를 선택 하 고는 spheroids의 직경을 측정 하는 측정 이미지 기능 도구 날짜를 사용 하 여. 원하는 크기에 도달 하는 회전 타원 체에 대 한 일: 0.5 m m 직경의. 하루 중 증발 효과 제한 하는 4에 잘 당 완전 한 RPMI 매체의 50 µ L를 추가 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2입니다. CD19 자동차 T 세포의 생성
<ol><li>
CD19 자동차 T 세포의 확장 참고: CD19 자동차 T 세포의 안정적인 식 앞에서 설명한16PBMCs 건강 한 기증자의 대량 retroviral 변환에 의해 인수 되었다. CD19 자동차 retroviral 구문을 코딩 하는 것은 2 세대 자동차와 fmc63 scFv 체인, CD8 경첩 및 막 횡단 도메인, 4-1BB co-stimulatory 도메인 및 마지막으로 CD3ζ 도메인의 구성.<ol>
<li>확장, 문화 transduced T 세포 안티-CD3/28 자석 구슬의 구슬 1: 1의 비율을 셀 10-11 일. 확장, 동안 세포는 완전 한 매체에는 (X-VIVO 15, 5% 혈 청 교체, 및 100 U/mL 재조합 인간 일리노이-2). 참고: 효율적인 확장에 대 한 이상적인 밀도 1 ~ 2 x 106 셀/mL입니다. 초기 번호에 따라 셀 셀 문화 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 플라스 크 (25 c m2 플라스 크 20 ml, 40 mL 전체 볼륨을 75 c m2 플라스 크)에 확장할 수 있습니다.</li>
		<li>다음 분석 실험에 대 한 부정적인 컨트롤 그룹으로 불리고 비 PBMCs (Mock으로 참조 될 것 이다) CD19 차 T 세포에 병렬 확장 프로토콜을 포함 합니다.</li>
		<li>당일 3 및 이후, 매일 신선한 매체를 추가 하 고 필요한 경우 더 많은 문화 플라스 크로 셀을 나눕니다.</li>
		<li>날 10-11, 5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포에 상쾌한 제거 하 고 모든 셀을 결합 하 여 하나의 50 mL 튜브에 resuspend ~ 30 ml 신선한 완전 한 미디어의 셀.</li>
		<li>장소 문화 매체에서 자석 구슬 분리 마그네틱 스탠드에 resuspended 셀을 포함 하는 50 mL 튜브.</li>
		<li>튜브 측에 수집을 구슬에 대 한 2-3 분까지 기다립니다.</li>
		<li>마그네틱 비드 컬렉션 영역을 건드리지 않고 피 펫과 새로운 튜브에 문화 매체를 제거 합니다.</li>
		<li>한 번 더 최종 문화 매체에서 구슬의 수를 제한 하는 비드 제거 (2.1.5–2.1.7)에 대 한 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>Resuspend는 셀의 개수, 1 완전 한 매체에서 2 x 106 셀/mL로 밀도 조정.</li>
		<li>적어도 하룻밤까지 h 4 셀 나머지. 그런 다음 직접-80 ° C에 아래로 그들을 멈추게 하 고 액체 질소 탱크 장기 저장에 대 한 다음 날에 튜브를 전송. 또는 한 연장할 수 있습니다 나머지 최대 하룻밤 즉각적인 사용을 위해.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
기본 T 세포에 CD19 자동차 식 제어
	<ol>
<li>야간 문화 또는 동결/동결 해제 후 적당히 숫자 약간 달라질 수 있습니다으로 확장 된 T 세포의 수를 계산 하 고</li>
		<li>5 x 10 두 CD19 자동차에서5 세포와 모의 기본 T 세포의 흐름 cytometry 튜브를 분리 전송.</li>
		<li>흐름 버퍼의 200 μ로 세포 세척 (2% FBS PBS에) 및 원심 분리기 문화 매체에 의해 발생 하는 모든 아티팩트를 제거 세척 단계를 반복 하는 500 x g 5 분에 튜브.</li>
		<li>1: 200 희석 흐름 버퍼에서 수행 하 여 1 차적인 항 체 (Biotin 염소 반대로 마우스 IgG, 조각 특정 F(ab') ₂)를 준비 합니다.</li>
		<li>튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체를 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.</li>
		<li>흐름 버퍼에서 1:400 희석으로 이차 항 체 (Streptavidin-PE)를 준비 합니다.</li>
		<li>튜브 당 항 체 혼합의 100 μ 셀 resuspend 그리고 15 분 이전 세척 단계 초과 항 체의 제거를 두 번 반복에 대 한 얼음에 품 어.</li>
		<li>셀의 흐름 버퍼 튜브 당 200 μ에 resuspend 및 교류 cytometer에서 분석.</li>
		<li>부정적이 고 긍정적인 게이트 설정 및 분석 CD19 자동차 사용 모의 T 세포 T 세포를 적절 하 게 불리고.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D 종양 회전 타원 체 살인 분석 결과
<ol><li>
6 일 또는 한 번 spheroids 후 원하는 크기에 도달, 인큐베이터에서 제거 하십시오. 회전 타원 체 격판덮개에서 완전 한 RMPI 1640 매체의 100 µ L/잘 제거 부드럽게 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여.
	<ol>
<li>이 단계에 대 한 내부 쪽으로 팁 각도 spheroids의 교란을 최소화 하기 위해 우물의 바닥 접촉을 피하고 96-웰 플레이트의 벽. 볼륨에 남은 약 100 µ L 이어야 한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>완전 한 RPMI 1640 매체의 9.95 mL와 빨간 Annexin V의 50 µ L를 혼합 하 여 Annexin V 빨강의 1: 200 솔루션을 준비 합니다.</li>
	<li>추가 1: 200 Annexin V 붉은 솔루션 100 µ L/잘.</li>
	<li>15 분 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5% CO2, 95% 습도)에 접시를 전송.</li>
	<li>수확 15 mL 튜브에 500 x g 5 분에서 상쾌한 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 여러 번 완전 한 RPM1 1640 매체의 2 mL와 함께 아래로 pipetting으로 resuspend 원심 분리기 transduced 자동차 CD19 T 세포.</li>
	<li>Trypan 블루 제외 호환 셀 카운터에 사용 하 여 셀을 계산 합니다.</li>
	<li>5 분에 대 한 500 x g 에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 표면에 뜨는 한 피 펫을 사용 하 여 제거 하 고 2 x 105 셀/mL를 RPMI 매체에서 resuspend.</li>
	<li>메 마른 저수지에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 회전 타원 체 바닥판 라운드 96 잘으로 100 µ L/잘 분배.</li>
	<li>(37 ° C, 5% CO2, 95% 습도) 인큐베이터 안에 자동된 이미징 장치 다시 접시를 전송.</li>
	<li>
수집 소프트웨어에 로깅합니다를 취득 일정을 선택 합니다.
	<ol>
<li>스캔 타임 라인에서 마우스 하 고 일정 편집을 선택 합니다. 검사 그룹에서 마우스 하 고 그것을 삭제 합니다. 타임 라인에서 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 선택 스캔 그룹 간격 설정 옵션을 선택 하 고 설정 검사를 추가 모든 를 1.5 h 의 총 24 h.</li>
		<li>원하는 시작 시간 (자동된 이미징 장치에 부 화 후 적어도 1 시간)을 설정 합니다. 일정 검색 저장을 선택 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 자동화 된 이미지 분석
<ol><li>수집에 로깅합니다, 그리고 보기 최근 검색 옵션을 선택 하 고 시작 분석 옵션을 선택. 새로운 분석 정의 만들기 선택 | 분석 유형: 회전 타원 체. 체크 이미지 채널 분석 (단계 + 대물, 녹색 및 빨강).</li>
	<li>적어도 10 대표 이미지 선택: 일반적으로, 조건 및 적어도 3 시간 포인트 (시작, 중간 및 취득의 끝) 1.</li>
	<li>미리 보기 기본 분석 전체 이미지 스택에 절차.</li>
	<li>대물 마스크에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 감도 10, 구멍 채우기 1000 µ m2분 지역 1000 µ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.</li>
	<li>녹색 마스크 (GFP)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 200 µ m와 임계값 3 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m2, 조정 크기-2 픽셀, 지역 분 3000 μ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.</li>
	<li>빨간 마스크 (Annexin V)에 대 한 매개 변수를 수정 합니다. 일반 매개 변수는: 반경 150 µ m와 임계값 2 모자 세분화 GCU, 가장자리 분리, 구멍 채우기 5000 µ m2, 조정 크기 0 픽셀, 지역 분 1000 µ m2. 전체 이미지 스택 미리 보기와 선택 된 매개 변수는 spheroids를 정확 하 게 감지 하는 확인 하십시오.</li>
	<li>
분석기를 시작 합니다.
	<ol>
<li>분석 완료 되 면, 관심의 측정을 추출 합니다. 분석 된 파일 그리고 그래프 통계 옵션을 선택 합니다. 관심, 검사 및 우물의 통계를 선택 합니다. 일반적으로, 대물 경계 내 총 빨강과 녹색 강도 spheroids 경계 명시 마스크 (그림 3)에 의해 결정 하는 형광 신호를 제한 하 여 가장 정확한 측정을 제공 합니다. "데이터 내보내기"를 클릭 하 여 여러 파일 형식에서 선택한 통계를 추출 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이미지 및 동영상의 추출 분석된 파일을 선택 하 여 이동 합니다 고 내보내기 이미지 및 동영상 옵션을 선택 합니다. 두 옵션 중 "으로 표시" 검색 이미지와 영화 중 하나 "로 저장" 타사 소프트웨어를 통해 외부 분석에 대 한 원시 데이터를 검색 하는 이미징 소프트웨어 (일반적으로 복합 이미지)에 사용할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
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<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 없다.

미래의 암 치료의 유효성을 검사 하는 혁신적인 도구 spheroids 사용 하 여 지난 몇 년 동안에서 성장 관심 분야 되고있다. Spheroids 클래식 2D 생체 외 분석과 생체 조건 평가 사이의 중간 단계를 나타냅니다. 추가 방법은 종양 미세 환경 유전자 프로 파일링7뿐만 아니라 흉내 낸 측면에서 그들의 힘에 관한 약속을 많이 보유 하고있다. 이 책에서 제시 하는 프로토콜은 Saheen에서 적응 Incucyte s 3 외.11 장 셀 라인에서 3D 종양 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 쉬운 방법을 나타냅니다. 높은 처리량 이미징 장치에 회전 타원 체 세대 커플링 안정적이 고 빠른 안티 종양 에이전트가의 광범위의 검열을 허용 하 고 종양 구조를 불안정 하 게 하는 상기 에이전트의 능력 모니터링.
이 프로토콜에 관한 고려 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 종...

입양 세포 이동 (ACT)는 다음 세대 암 치료를 나타냅니다. 그것은 환자에 효과 기 세포 (T-또는 NK-세포)의 주입에 사용합니다. 이 세포는 유전자 그들 그들의 목표는 종양을 안내 하 고 그것을 파괴 하는 수용 체와 함께 수정할 수 있습니다. 최근이 방법은 공상 항 원 수용 체 (차) B-세포 마커 CD19에 대 한 감독을 죽 일 자신의 암1환자 T 세포에 도입 되었다 때 가능한 것으로 표시 했다. 인공 수용 체 자동차의 경우 디자인 구성 특정 항 체 파편의 바인딩 도메인은 엔터티 지정 된 단일 체인 변수 조각 (scFv), 감소 하는 항 T-세포 신호 도메인에 연결. 여러 디자인을 확인 하 고는, 가장 일반적으로 사용 되는 버전 2 세대의 자동차 디자인으로 이루어져 TCR 신호에 대 한 CD3z 및 co-stimulatory 도메인 참조 (CD28, 4-1BB, OX40, 등.) 1 , 2. immunotherapy 필드 CD19 자동차-T 세포 efficaciously B 세포 악성 종양3,4수많은 환자를 치료 법의 새로운 형태에 그것의 주의의 대부분을 감독. 이 성공 연구원은 제한 된 성공 단단한 종양에 대 한 다른 epitopes를 대상으로 비슷한 디자인을 악용 하려고 합니다. 불행 하 게도, 종양 관련 항 원 및 자동차 T 렌더링 엄격한 종양 microenvironments의 부족 단단한 종양5쪽으로 더 적은 효과적인 세포.
현재, 가장 일반적으로 사용 된 생체 외에서 유효성 검사 전략만 이미 언급 한 고체 종양도 전에 조각 하는 2 차원 (2D) 시스템에 의존 합니다. 고전적인, 2D 생체 외에서 시스템 기능 및 이러한 효과 기 세포의 특이성을 평가 하기 위해 monolayers로 차 T 세포와 대상 암 세포 라인의 혼합물을 포함 한다. 이러한 전략은 연구의 중요 하 고 중요 한 부분, 하지만 그들은 복용 하지 마십시오 고려 사항으로 복잡 한 형태와 암 세포6의 3 차원 (3D) 구조. 3D 시스템, spheroids로 배양 암 세포 유전자 식 프로필7, 리디렉션된 effector 세포에 의해 인식에 영향을 줄 수 있는 변화를 통해 새로운 phenotypic 특성을 획득 합니다. Birgersdotter와 동료 Hodgkin 림프 종 (HL) 셀 라인 3D 문화 모델에만 성장 하는 때 유전자 식 프로필 기본 종양 샘플8유사한 취득 하는 것을 설명 했다. 따라서, spheroids 또는 유사한 3D 방법론 제공 표준 2D 시스템 반대로 체 외 모델에 더 많은 관련 문화. 이러한 체계는 또한 유사한 vivo에서 연구는 특정된 자동차의 유효성 검사 과정에서 마지막 단계로 볼 수 있습니다. 2D 시스템 암 클러스터의 형태를 모방 하지 고려 spheroids 제공 하기 전에 차 T 세포의 기능을 평가 하기 위해 비슷한 형성 vivo에서 모델. 한 연구, Pickl 외. 인간 표 피 성장 인자 수용 체 (HER2) 암 세포 overexpressing의 회전 타원 체 모델 vivo에서 모델9유사한 신호 프로필 증명 확인. 이 더 더 적절 하 고 주변에-에서 비보의 평가 차 T 세포를 제공 하는 spheroids을 지원 합니다. 또한, 자동차 T-셀 유효성 검사 spheroids에 대 한 그들의 효능을 좀 더 비판적으로 평가 하 고 vivo에서 연구 중간 이동에서 일부 디자인을 방지 도움이 될 수도10; 따라서, 적은 동물을 희생 하 여 윤리적으로 관련된 연구에 기여. 또한, spheroids를 사용 하 여 프로토콜 되지 않는 더 비싼 클래식 2D 시스템 보다 훨씬 더 빨리 클래식 vivo에서 학문에 비해. 함께 촬영 한 회전 타원 체 연구의 생체 외에서 그리고 vivo에서 학문을 연결 하는 표준 연습을 곧 될 것입니다 예측할 수 있습니다.
여기, 우리는 결 장 암 세포 선 HCT 116에서에서 spheroids의 준비를 제시. 이 셀 라인 CD19 자동차 T 세포에 민감한 렌더링 임상 검증된 차 구문을 사용 하 여 살인의 명확한 평가 제공 하 고 인간의 CD19 분자를 표현 하기 위해 수정 되었습니다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><td>로트 번호: RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 성장 영역 플라스크</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>로트 번호: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; 성장 영역 플라스크</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>로트 번호: 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>로트 번호: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutamin, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>로트 번호: 1926384</td></tr><tr><td>Fetal bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>로트 번호: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>로트 번호: 1904924A</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>로트 번호: 1886513</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트, 둥근 바닥</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td>로트 번호: 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 with Gentamicin L-Gln, Phenol Red, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>로트 번호: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS 면역 세포 혈청 교체</td><td>Thermo Fischer</td><td></td> <td>A2596102로트 번호: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>로트 번호: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>로트 번호: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>시약 저장소</td><td>VWR</td><td>89094-672<</td><td>strong>로트 번호: 89094-672</td></tr><tr><td>15 mL 튜브</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>로트 번호: 19317044</td></tr><tr><td>anti-human CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>로트 번호: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>비오틴-SP (긴 스페이서) AffiniPure F (ab ') 2 단편 염소 안티 마우스 IgG</td><td>잭슨 ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>로트 번호 : 129474 : RRID : AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>로트 번호 : 5191579 : RRID : </강력한> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 결장직장암 라인</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

자동차 t 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy는 다르게 untreatable 암와의 싸움에서 성장 관심 분야를 되었다. 모든 immunotherapeutic 방법 중 공상 항 원 수용 체 (자동차) T 세포 특히 소아 B 급성 림프 구성 백혈병 (B-모두)와 함께 가장 아름 다운 결과 얻은 리디렉션됩니다. 클래식 유효성 검사 메서드가 자동차 T 세포의 특이성의 사용 정지에서 및이 종이 식 모델에서 대상 셀에 대 한 자동차 T 세포의 기능 분석에 의존합니다. 불행 하 게도, 생체 외에서 관측은 종종 vivo에서 얻은 결과에서 분리 하 고 다른 단계를 추가 하 여 많은 노력 및 동물을 아끼지 수: 3D 문화를 사용 하 여. 그들은 동물 모델에 engrafted는 때 종양 세포의 3 차원 구조를 모방 하는 잠재적인 대상 셀에서 spheroids의 생산 이상적인 대안을 나타냅니다. 여기, 우리는 (여기 CD19 자동차 T 세포에 의해 exemplified) 입양 세포 치료에 대 한 유효성 검사 도구로 불리고 장 셀 라인에서 spheroids를 생산 하는 저렴 하 고 신뢰할 수 있는 쉬운 방법 보고. 이 메서드는 회전 타원 체 성장 따를 수 있는 고급 라이브 이미징 시스템으로 결합, 이펙터 세포 세포 독성 그리고 종양 세포 apoptosis.

그림 1에서 볼 수 있듯이 그것은 cytometry에 의해 T 세포 (그림 1A)에 CD19 자동차의 표현과 HCT116 종양 세포 라인 (그림 1B)에 CD19의 레벨의 수준을 확인 중요 합니다. 그림 2 는 전형적인 회전 타원 체 실험 결과 예로 보여주. 자동화 된 이미징 장치는 4 개의 다른 채널에서 사진을 찍는: 밝은 분야, 위상, 녹색과 적색 형광. 단계 채널 spheroids (회전 타원 체 형성의 표시에는) 근처 높은 대조 경계를 표시 하 여 spheroids의 형성을 주장 하는 데 사용 됩니다. 밝은 필드는 spheroids의 크기를 감지 하 여 상기 경계에 녹색 신호 (종양)과 빨간색 신호 (apoptosis)를 제한 분석 과정에서 사용 됩니다...

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

이 방법은 3D 구조 종양 세포에 대한 면역 세포 세포 독성의 평가에 대한 면역 요법 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법의 주요 장점은 간단하고 고급 이미징 기술과 민감한 면역 학적 분석법을 결합한다는 것입니다. PBS의 5 밀리리터로 관심있는 대장암 세포 라인을 세척하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 트립신의 0.5 밀리리터로 플라스크 바닥에서 세포를 제거합니다.현미경으로 분리를 확인한 후, 완전한 배지의 10 밀리리터로 세포 해리 효소를 중화시키고 원심분리에 의해 세포를 수집한다. 밀리리터 농도당 세 번째 세포에 1.5배 10회에서 세포를 재보일시 하여 셀을 계산하고 재중단하기 위해 5밀리리터의 신선한 완전 배지에서 펠릿을 다시 중단한다. 그런 다음 200 마이크로리터의 세포를 96웰 원형 바닥 플레이트의 각 우물로 시드하고 5%CO2 및 95%의 습도를 가진 37도 섭씨 인큐베이터 내부에 자동 이미징 장치에 플레이트를 배치합니다.장치의 인수 소프트웨어에 로그인하고 획득 할 일정을 선택, 선박 추가 를 시작, 일정에 스캔하고, 선박 새 만들기. 다음으로, 스캔 유형 Spheroid를 선택하고 관심의 적절한 밝은 필드 및 형광 채널을 선택합니다. 배율을 10배로 설정하고 이미징 장치 서랍 내에서 플레이트 모델 과 그 위치를 선택한다.이미지화할 우물의 위치를 선택하고 이름, 셀 유형 및 셀 수를 포함하는 실험의 설명을 입력합니다. 분석 설정의 경우 나중에 분석 연기를 선택하고 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 을 선택하고 스캔 추가를 4시간 마다 설정하고 총 24시간 동안 검색 추가를 설정합니다. 그런 다음 자동 이미징 장치에서 인큐베이션 후 적어도 1시간으로 시작 시간을 설정합니다.스페로이드 성장 진행 상황을 확인하려면 2일마다 이미징 소프트웨어에 로그인하여 최근 스캔 보기를 선택합니다. 관심 있는 실험을 두 번 클릭하고 이미지 채널 패널에서 브라이트필드를 선택합니다. 그런 다음 측정 이미지 특징 도구를 사용하여 스페로이드의 직경을 측정하고, 4일째에 50마이크로리터의 완전한 배지를 추가하여 중간 증발 효과를 제한합니다.스페로이드가 적절한 실험 크기에 도달하면 플레이트를 조심스럽게 각도로 조정하고 멀티 채널 파이펫을 사용하여 스페로이드를 방해하지 않고 각 우물에서 150 마이크로리터의 완전한 매체를 부드럽게 제거합니다. 다음으로, 버려진 배지를 1~200개의 부속서 V 레드용액의 50마이크로리터로 교체하고 15분 동안 세포 배양 배양배기에 플레이트를 배치한다. 원심분리기는 15밀리리터 원판 튜브에서 CAR CD19 T 세포를 변형시키고 완전한 배지의 2밀리리터로 펠릿을 재해석하였다.계산 후, 완전한 중간 농도의 밀리리터 당 다섯 번째 세포에 2 회 10으로 세포를 희석. 그런 다음 CAR CD19 T 셀 100마이크로리터를 각 스페로이드 함유에 잘 추가하고 플레이트를 자동화된 이미징 장치로 되돌려 놓습니다. 획득 소프트웨어에서 획득 일정을 선택하고 스캔 타임라인을 마우스 오른쪽 단추로 클릭합니다.타임라인 편집을 선택하고 스캔 그룹을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 삭제합니다. 타임라인을 다시 클릭하고 선택한 스캔 그룹 간격 집합을 선택하고 스캔 추가를 1 1/2시간, 총 24시간 동안 설정합니다. 그런 다음 이미징 시작 시간을 자동화된 이미징 장치에서 인큐베이션이 시작된 후 최소 1시간으로 설정하고 일정 스캔 저장을 선택합니다.자동화된 이미지 분석을 위해 스캔 소프트웨어에서 최근 검사 보기 및 시작 분석을 선택합니다. 새 분석 정의 및 분석 유형 Spheroid 만들기를 선택하고 분석할 이미지 채널을 설정합니다. 최소 10개의 대표 이미지를 선택하고 전체 이미지 스택에서 기본 분석 절차를 미리 봅타입니다.밝은 필드 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 녹색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다. 빨간색 마스크의 매개 변수를 수정하고 이미지 스택을 미리 보고 선택한 매개 변수가 스페로이드를 정확하게 감지하는지 확인합니다.특이성 비율에 비해 노이즈와 감도에 대한 최상의 신호를 달성하기 위해 주의해야 하며, 매 지점에서 모든 이벤트를 캡처할 수 있는 매개 변수 집합을 찾을 수 없습니다. 그런 다음 분석기를 시작합니다. 분석이 완료되면 관심 측정을 추출하고 분석된 파일 및 그래프 메트릭 옵션을 선택합니다.관심 있는 메트릭, 스캔 및 우물을 선택합니다. 데이터 내보내기를 클릭하여 선택한 메트릭을 여러 파일 형식으로 추출합니다. 그런 다음 이미지를 추출하려면 분석된 파일을 선택하고 이미지 및 영화 내보내기를 선택합니다.CD19 CAR 발현은 트랜스포메이트 된 대장암세포에 대한 트랜스포메이트 T 세포 및 CD19 발현을 유동 세포측정에 의해 확인할 수 있다. 여기서, 전형적인 스페로이드 실험의 결과를 관찰할 수 있다. 모의 T 세포와 달리, CD19 CAR T 세포는 특히 대장암 세포 세포 세포 유래 스페로이드를 죽일 수 있으며, 살아있는 종양 세포의 수를 크게 감소시다.시간이 지남에 따라 스페로이드 경계 내에서 전체 녹색 및 빨간색 신호의 진화를 추적하면 CD19 CAR T 세포 주입 직후, 세포 사멸 신호가 빠르게 증가함에 따라 스페로이드의 크기가 빠르게 축소된다는 것을 알 수 있습니다. 이 절차에 따라 독성 애세, 세포 이동 액세 또는 스페로이드 구조 측정과 같은 다른 방법은 약물 스크리닝, T 세포 운동성 또는 스페로이드 형성에 대한 추가 질문에 각각 답하기 위해 수행될 수 있다.

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

스페로이드는 2D 세포 배양 단층 모델에 비해 세포의 환경을 보다 정확하게 표현하는 데 사용되는 3D 세포 배양 모델의 한 유형입니다. 예시 프로토콜에서는 과학자들이 결장직장암 세포주에서 스페로이드를 생성하고 라이브 셀 이미징을 적용하여 스페로이드의 성장을 추적하는 것을 볼 수 있습니다.

세포주에서 스페로이드 생성: 3차원(3D) 세포 배양 방법

이 비디오에서는 종양 세포 부하가 높은 동안 CAR T 세포의 반복적인 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 반복 종양 챌린지 분석을 시연합니다. 또한, 유세포 분석을 사용하여 CAR T 세포를 분석하여 샘플에서 CAR T 세포의 다양한 하위 집단을 결정할 수 있습니다.

반복성 종양 챌린지 분석: 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포의 반복적 종양 사멸 가능성을 평가하기 위한 체외 배양 분석

이 비디오는 실시간 전기 임피던스 측정을 통해 암세포에 대한 CAR T 세포 활성을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 임피던스의 변화를 추적하면 암세포 세포 용해를 유도하는 CAR T 세포의 효과를 평가하여 세포 독성 능력에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

CAR T 세포의 효능을 평가하기 위한 실시간 체외 세포분해 분석

이 비디오는 형광 단백질을 발현하는 3D 종양 스페로이드에 대한 CAR T 세포의 세포 독성 효과를 평가하는 체외 분석을 보여줍니다. 이 평가는 CAR T 세포와 상호 작용한 후 세포사멸 암세포의 외부 소엽에 노출된 포스파티딜세린 잔기에 결합하는 Annexin V 적색 형광 프로브를 사용합니다. 프로브에서 방출되는 적색 형광은 이러한 세포를 녹색 형광을 방출하는 건강한 세포와 구별하는 데 도움이 됩니다.

종양 스페로이드에 대한 CAR T 세포 독성을 평가하기 위한 체외 분석

이 비디오는 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 활성을 검증하기 위한 체외 분석을 보여줍니다. CD19 항원을 발현하는 B세포 림프종 세포와 세포질 루시페라아제를 CD19 특이적 CAR T 세포와 공동 배양합니다. 종양의 CD19에 대한 CAR 결합은 CAR T 세포가 종양 세포 독성을 유발하는 사이토카인과 독소를 방출하도록 유도합니다. CAR T 세포 활성은 종양 세포에서 방출된 사이토카인과 감소된 루시페라제 매개 생물 발광을 정량화하여 평가합니다.

종양 특이적 CAR T 세포의 항종양 활성을 평가하기 위한 In vitro 분석

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

우리는 액체 및 고체 종양 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포의 효능을 평가하기 위해 시험관내 세포분석 시스템을 정량적으로 실시간으로 기술한다. 이 프로토콜은 다른 면역 이펙터 세포뿐만 아니라 조합 치료를 평가하기 위해 확장 될 수있다.

고체 및 혈액암 세포를 표적으로 하는 키메라 항원 수용체 T 세포를 위한 실시간 힘 분석

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

여기에서는 단일 세포 수준에서 세포 사멸을 조사하기 위해 하나의 T 세포와 암 표적 세포를 캡슐화하는 이중 에멀젼 방울을 만드는 방법을 설명합니다. 이 방법은 많은 T 세포 집단 내에서 세포독성 분자와 표적 세포 사멸을 모두 이중 정량화할 수 있습니다.

단일 세포 수준에서 키메라 항원 수용체 T 세포를 평가하기 위한 액적 기반 세포 독성 분석

학습하세요 CAR T 세포가 3D 종양 스페로이드를 살상하는 세포독성을 실시간 영상으로 평가하는 방법을. 이 프로토콜은 고급 이미징 기술과 면역 분석을 결합하여 면역 치료 효과를 동적으로 모니터링합니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

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