Name: Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 학습하세요 생쥐 급성 뇌 조각에서 미세아교세포의 방향성 운동성을 2광자 현미경으로 분석하는 방법을. ATP와 세로토닌 자극에 따른 세포 반응을 실시간 관찰하여 신경면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

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우리는 세포와 조직의 이미징 시설 인 뒤 Fer à 무 랑, 어디 모든 이미지 수집 및 분석 수행 되었습니다 감사 합니다. 이 작품 일부는 센터 국립 드 라 검색 사이언스 인 국립 드 라 건강에 의해 지원 되었습니다 동부 표준시 드 라 공 들인 Médicale, 소 르 본 대학교 과학 그리고 소 르 본 Universités-피에르에서 교부 금에 의해 외 마리 퀴리 대학 ( Emergence-UPMC 프로그램 2011/2014)는 Fondation 부 la Recherche 쉬르 르 Cerveau, Fondation 드 프랑스에서 Fondation 라 검색 Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", 연구 (직원 회 부 라 Recherche 프랑스 정부, ANR-17-CE16-0008 및 Investissements d'Avenir 프로그램 "바이오 싸이 Labex" ANR-11-IDEX-0004-02) 및 전산 신경 과학 프로그램, 연구를 위한 국립 과학 재단/프랑스 국가 기관에서에서 공동 연구 (번호: 1515686). 모든 저자는 연구 제휴는 파리 학교 신경 (ENP) 바이오 싸이 Labex의 구성원을 그룹화 합니다. F.E. 소 르 본 대학교, Collège 박사, F-75005 파리, 프랑스, 제휴 박사 학생 이며 바이오 싸이 Labex에 의해 자금이 다. V.M.은 박사 후 연구원 전산 신경 과학 프로그램, 국립 과학 재단/프랑스 국립 기관 연구에 대 한 공동 연구에 의해 투자 (번호: 1515686). 저자는 프로젝트의 개시에 참가 마르타 Kolodziejczak 감사 합니다.

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저자는 공개 없다.

유지, 달리에서 해리 또는 organotypic 슬라이스 문화, 구조적 무결성 제한 된 네트워크 조정, 급성 뇌 조각 허용 microglia 그들의 생리 적인 환경에서 공부 하는 연구자. 그러나, 주요 한계 중 하나는 조각화 절차 빠르게 특히 성인 두뇌에서에서 뉴런의 생존 능력을 손상 시킬 수 있는 부상 만듭니다 사실 이다. Microglia 특히 세포 손상에 반응으로, 그것은 가능한 그들의 생리 적인 상태에 가까운 microglia를 유지 하기 위해 신경 세포 죽음을 제한 하는 것이 중요. 이, 차례로, 통해 조각의 더 일반적인 조건에 덕 원 기여 한다.
이 문서에서 설명 하는 프로토콜 적용 전기 생리학 실험, 특히 성인 쥐에서에서 몇 시간 동안 조각의 더 나은 생존을 얻기 위한 문학에서 발견 하는 몇 가지 개선 됩니다. 슬라이스 생존 나이 관련 된 차이 극복 하기 위해 우리는 콜린과 나트륨을 대체 하 고 심장 관류, 슬라이스, 및 복구 단계이 콜린 실제 매체를...

Microglial 세포 두뇌의 주민 대 식 세포는 고 두 생리 및 병 적인 조건1,2에 역할. 그들은 높게 분기 형태와는 끊임없이 확장 있고 그들의 프로세스3,4를 제거. 이 "스캔" 문제가 관련 되며 그들의 주위에의 조사에 필요한 여겨진다. Microglia의 형태소가 소성 세 가지 모드에 표시 됩니다. 첫째, 일부 화합물 빠르게 microglial 형태학을 조절: ATP5,6 또는 급성 뇌 조각 입욕 하는 매체에 NMDA5,7 microglial 파급 효과의 복잡성 증가 반면 norepinephrine 그것6감소 한다. 이러한 효과 직접 (대 한 ATP 및 norepinephrine) microglial 수용 체에 의해 중재 하거나 신경 세포에서 ATP 릴리스 (NMDA)에 대 한 필요 합니다. 둘째, 운동 성 또는 "감시", microglial 프로세스의 성장과 수축 속도 extracellular 요인8, 항상성 중단9,10또는 돌연변이9에 의해 영향을 받을 수합니다 있습니다. 10,11. 셋째, 있을 뿐만 아니라 이러한 등방성의 형태와 운동 성 microglia ATP3,5,12, 를 제공 하는 피 펫으로 향해 그들의 프로세스를 확장 하는 수 용량이 있다 13 , 14, 급성 뇌 조각 또는 vivo에서, 또는 제공 5-HT 급성 뇌 조각15문화입니다. 방향 운동 성, 라고도 하는 microglial 프로세스의 이러한 지향된 성장 처음 로컬 레이저 병 변3,4에 대 한 응답으로 설명 했다. 따라서, 순수, 그것은 상해에 대 한 응답을 관련 되거나 시 냅 스를 향해 microglial 프로세스를 타겟팅에 필요한 또는 두뇌 지역 개발15,16, 동안 또는 생리17 가지 치기를 요구 ,,1819 또는 성인 기에 병 적인 상황9,18,,1920 . 세 가지 유형의 형태학 변화 다른 세포내 메커니즘11,,1320에 의존 하 고 한 주어진된 화합물 반드시 그들 (예를 들어, NMDA에 직접 역할을 하는 모두 변조 하지 않습니다. microglia, 형태에 영향을 하지만 방향 운동 성5,7을 유도 하지 않습니다). 따라서 때 microglia에 화합물, 돌연변이 또는 한 병 리의 효과 특성화를 목표로, 그들의 형태학 소성의 세 가지 구성 요소 특성 중요 하다. 여기, 우리는, 여기의 화합물, 로컬 소스, ATP 또는 5-HT microglial 프로세스의 방향 성장 연구 하는 방법을 설명 합니다.
일부의 모델이 microglia 프로세스 매력 공부: 3D 환경6,,1819, 급성 뇌 조각6,,1315, 그리고 vivo에서 주 문화 3,13이미지입니다. Vivo에서 접근 microglia의 생리 상태를 보존 하는 최고입니다. 그러나, 깊은 지역 intravital 이미징 필요 복잡 한 수술 과정 그리고, 그러므로, 그것은 종종 피상적 대뇌 피 질의 층으로 제한. Microglia 기본 문화권을 사용 하는 많은 동물의 제한 된 수를 가진 조건 테스트를 쉬운 기술입니다. 그럼에도 불구 하 고, 비보, 에서처럼 같은 셀 형태를 얻을 수는 없습니다 그리고 셀 손실 신경와 이다 그들의 생리 적인 상호 작용. 급성 뇌 조각이 두 가지 방법 사이 타협을 대표 한다. 이 모델 transcranial 현미경 검사 법은 주로 성인에서 수행 하는 반면 어려운 도달 vivo에서, 높은 해상도 이미지 하 고 신생아 단계에서 분할 영역을 조사 하는 뇌 구조를 연구 하는 연구자를 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 지역 마약 응용 프로그램의 효과 실시간으로 관찰 하 고 실험 동물의 제한 된 수를 사용 하 여 반복 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 급성 뇌 조각 문제는 제한 된 시간 (몇 시간) 동안 셀21,22에 2 주, 그리고 microglia 형태학의 잠재적인 변화 보다 더 오래 된 쥐에서 조각을 위해 특히 살아 남아 .
여기, 우리는 젊은이 성인 Cx3cr1의 급성 뇌 슬라이스를 준비 하는 프로토콜을 설명GFP / + 마우스를 2 개월, 몇 시간 동안 microglia 형태 및 운동 성의 보존. 우리, 그럼, ATP 또는 5-HT 같은 화합물으로 microglial 프로세스의 매력을이 분할 영역을 사용 하는 방법을 설명 합니다.

<table><tbody><tr><td>피펫 준비용</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0065</td><td>필라멘트가 없는 붕규산 얇은 벽, 1.5 mm OD, 1.17 mm ID, 75 mm L, Pkg. 225</td></tr><tr><td>DMZ Universal Puller</td><td>Zeitz Instrumente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>카탈로그 번호</td><td>코멘트</strong</td></tr><tr><td>>솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride dihydrate (CaCl2)</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>염화콜린</td><td>Sigma</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 용액 1 M (MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨 SigmaUltra >99.0% (KCl)</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)Sigma</td><td></td> <td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr>모든 솔루션에 대한 <tr><td>인산 나트륨 일염기</td>성 <td>시그마</td><td>S5011</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>시그마</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>초순수</td><td>MilliQ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>카탈로그 번호<</td><td>strong>Comments</td></tr><tr><td>for 슬라이스 준비</강력></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x 200 mL 결정화 접시</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>80 mL 파이렉스 비커</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C 디지털 연동 펌프</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td><td>마우스 관류 및 2-광자 챔버 관류(aCSF)</td></tr><tr><td>용 탄화물 5% CO2/95% O2</td><td>Air Liquide France Industrie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dolethal</td><td>Vetoquinol</td><td>Dolethal 50 mg/mL</td><td></td></tr><tr><td>여과지 (Whatman)</td><td>Sigma</td><td>WHA1001042</td><td>Whatman 품질 여과지, 등급 1 (기공 크기: 11&micro; M)</td></tr><tr><td>Fine Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-60</td><td></td></tr><tr><td>식품 상자 직경 10cm, 높이</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8cm 접착제(에틸 시아노아크릴레이트)</td><td>록타이</td>트 <td>슈퍼 접착제 3 파워 플렉스</td><td></td></tr><tr><td>해마 도구(주걱)</td><td>Fine Science Tools</td><td>10099-15</td><td>가장 큰 말단은 90°C로 기울어져야 합니다.</td></tr><tr><td>아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아이리스 겸자 (곡선)</td><td>Moria</td><td>MC31</td><td></td></tr><tr><td>렌즈 청소 티</td><td>슈 THOR LABS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬 여과</td><td></td><td></td>기 <td>직경 7cm</td></tr><tr><td>면도날</td><td>전자 현미경 과학</td><td>72000</td><td>슬라이서</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 인터페이스 홀더</td><td></td><td></td><td>집에서 만든 3D 프린팅 파일은 Supplemental</td></tr><tr><td>Material Surgical Scissors - Sharp</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Vibrating slicer</td><td>Thermo Scientific</td><td>720-2709</td><td>모델: HM 650V (진동 블레이드 마이크로톰)</td></tr><tr><td>수조</td><td></td><td></td><td>세트 32°C; C (첫 번째 회복 단계)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>for slice imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&times; 25 0.95 NA 수침 대물</td>렌즈 <td>Leica Microsystems (독일)</td><td>HCX Irapo</td><td></td></tr><tr><td>공진 스캐너(8kHz)와 2개의 HyD 하이브리드 검출기가 있는 2광자 MP5 정립 현미경</td><td>Leica Microsystems(독일)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antlia-3C 디지털 연동 펌프</td><td>DD Biolab</td><td>178961</td> aCSF Carbogen 5% CO2/95% O2Air Liquide France Industrie <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>I1501L50R2A001</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra2 Ti를 사용한 2광자 챔버 관류용: 사파이어 레이저</td><td>Coherent (독일)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>일회용 전사 피펫, 넓은 입</td><td>ThermoFischer</td><td>과학 예 : 232-11</td><td>5.8 mL 핀 팁, 그러나</td></tr> 525/50 방출 필터와 560 이색성 필터 (형광 수집 용)를 포함하는 4mm 직경의 입 <tr><td>방출 필터 SP680</td><td>Leica Microsystems (독일)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>형광 큐브</td>를 갖도록 절단 (약 7cm)<td>Leica Microsystems (독일)</td><td></td><td></td></tr> <tr>슬라이스<td></td><td></td><td></td><td>의 일정한 관류를 유지하기 위한 50mL의 ACSF가 있는 유리 비커</td></tr><tr><td>가열 시스템</td><td>Warner Instrument Corporation</td><td>자동 히터 컨트롤러 TC-324B</td><td>는 관류 용액을 32°도로 유지합니다. C</td></tr><tr><td>관류 챔버</td><td></td><td></td><td>집에서 만든, 3D 프린팅 용 파일은 집에서 만든 보충 재료</td></tr><tr><td>슬라이스 홀더 ( "하프")</td><td></td><td></td>로 제공됩니다 <td>: 평행 한 나일론 실로 결합 된 두 개의 지점이있는 백금으로 만든 머리핀</td></tr> <tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td> 코멘트</td></tr><tr><td>for slice stimulation </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&prime;-triphosphate disodium salt hydrate (ATP)</td><td>Sigma</td><td>A-26209</td> to <td>be ex-temporaneously : 1 mg/mL (3 mM) 원액을 실험 당일에 준비하여 4°C로 유지했습니다. C (몇 시간) 사용 직전에 희석</td></tr><tr><td>Fluorescein (선택 사항)</td> <td>Sigma</td><td>F-6377</td><td>1 &micro에서 사용; M 최종</td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Luigs 및 Neumann</td><td>SM7</td><td></td></tr>은 <tr><td>전기 생리학</td><td></td> Serotonin hydrochloride Sigma H-9523 H20의 50mM 스톡 용액의 분취량과 동일한 마이크로 피펫 홀더 <td></td><td></td></tr> 에 연결되었으며 <tr><td></td><td></td><td></td><td>-20°C에서 유지되었습니다. 500 &마이크로; M solution은 실험 당일을 준비했습니다.</td></tr><tr><td>주사기 5 mL (바늘 제외)</td> <td>Terumo 의료 제품</td><td>SS + 05S1</td><td></td></tr><tr><td>투명 튜브</td><td>Fischer Scientific</td><td>11750105</td><td>Saint Gobain Performance Plastics &trade; 타이곤&트레이드; E-3603 Non-DEHP Tubing</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</strong</td></tr><tr><td>>for image analysis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td></td><td>https://fiji.sc</td><td>Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038</td></tr><tr><td>Icy</td><td>Institut Pasteur</td><td>http://icy.bioimageanalysis.org</td><td>de Chaumont, F. et al. Nat. Methods (2012)</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>카탈로그 번호</td><td>Comments</td></tr><tr><td>mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CX3CR1-GFP 마우스</td><td>Jung et al, 2000</td><td></td><td>수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 129SV 배경에서 이 마우스를 역교배했습니다.</td></tr><tr><td>CX3CR1creER-YFP 마우스</td><td>Parkhurst et al 2013</td><td></td><td>수컷 또는 암컷, P3에서 2개월; 우리는 이 마우스를 129sv 배경에서 역교배했습니다.</td></tr></tbody></table>

microglial 프로세스 매력 atp 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial 세포는 상주 타고 난 면역 세포는 뇌의 지속적으로 그들의 긴 프로세스와 그들의 환경을 스캔 하 고, 항상성 장애 시 빠른 형태학 상 변화를 받 다. 예를 들어 레이저 병 변 몇 분에 상해의 사이트를 향해 "방향 운동" 라고도 하는 microglial 프로세스의 중심된 성장을 유도 합니다. 로컬 ATP 또는 세로토닌 (5-hydroxytryptamine [5-HT])를 제공 하 여 비슷한 효과 얻을 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 프로토콜 ATP 또는 5-젊은 성인 쥐의 급성 뇌 조각에 HT의 로컬 응용 프로그램으로 microglial 프로세스의 방향 성장을 유도 하 고 시간이 지남에 따라이 매력 multiphoton 현미경 검사 법에 의해 이미지를 설명 합니다. 무료 및 오픈 소스 이미지 분석 소프트웨어와 정량화의 간단한 방법을 제안 했다. 여전히 급성 뇌 조각 특징 도전은 감소 하는 세포 생리 상태에 남아 나이 제한 된 시간 이다. 이 프로토콜, 따라서, 특히 성인 쥐에서 조각에에서 몇 시간 동안 microglial 세포의 생존 능력을 최적화 겨냥 한 몇 가지 기술적인 개선 (중간, 공기-액체 인터페이스 챔버, 이중 관류와 챔버 이미징) 하이라이트.

이 프로토콜 유도, 관찰, 및 로컬로 적용된 화합물 향해 microglial 프로세스의 중심된 성장 계량 하는 방법에 설명 합니다, 예를 들어 ATP 또는 5-HT, 급성 뇌에 영 또는 성인에서 조각 (적어도 까지의 2 개월) 쥐. 몇 시간 동안 건강 한 상태에서 성인 동물에서 뇌 조각을 유지에 기여 하는 요인 들 중 프로토콜의 2 단계에서 세포 생존을 최적화 하도록 설계 된 두 개의 도구를 사용 하 여가 이다. 첫째, 인터페이스 조각 소유자 인터페이스 챔버 (그림 1)에서 절단 후 조각의 보존을 향상 시킵니다. 둘째, 녹음 실 (그림 2) 제도가 관류 이미징 동안 맨 한 조각의 하단에 실행 실제 수 있습니다. 여기 사용 녹음 실 치수 (62 m m 외부 직경으로), 클래식 목욕 챔버 삽입 비슷합니다 하지만 그들의 모델은 보충 자료다운...

Microglia, 두뇌의 거주 면역 세포 그들의 환경의 수정에 형태학 변화 신속 하 게 응답. 이 프로토콜 2 광자 현미경을 사용 하 여 쥐의 급성 뇌 조각에서 세로토닌 또는 ATP microglial 프로세스의 매력을 공부 하는 방법을 설명 합니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

미세 글리 아 표현 형을 완전히 특성화 하려면 기저 및 방향 운동 성을 모두 해결 하는 것이 중요 합니다. 이 프로토콜은 맞춤형 3D 인쇄 인터페이스 및 관류 챔버를 사용하여 마우스 뇌 슬라이스에서 2 광자 이미징에 의해 microglia의 방향 운동성을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 패니 에티엔느, 박사 과정 학생, 그리고 빈센조 마스트리아, 박사 후 연구원, 모두 우리의 실험실에서 될 것입니다.해부 30분 전에 는 70밀리리터의 콜린 인공 뇌척수액 또는 콜린 aCSF를 얼음 위에 부글끓기 시작합니다. 카보겐과 함께 32도에 콜린 aCSF 150 밀리리터를 추가합니다. 200 밀리리터 결정화 접시에 바 자석을 밀봉된 푸드 박스에 넣고 200밀리리터의 aCSF를 접시에 넣습니다.3D 인쇄 인터페이스 슬라이스 홀더를 접시 위에 놓고 인터페이스 슬라이드 홀더의 메쉬를 덮는 용액의 박막만 남아있을 때까지 결정화 접시에서 과도한 유체를 제거합니다. 음식 상자 의 바닥에 aCSF의 몇 밀리미터를 추가하고 카르보겐으로 유체를 버블링 시작합니다. 그런 다음, 밀봉 된 상자를 닫으면서 지속적인 육습을 유지하면서 가습, 95 %의 산소, 5 %의 이산화탄소가 풍부한 인터페이스 챔버를 만듭니다.수확 후, aCSF에 젖은 필터 용지의 조각에 뇌를 배치하고 슬라이스의 바람직한 각도에 따라 관심의 영역을 해부. 관상 동맥의 경우, 뇌의 소달 면을 진동 슬라이서의 절단 블록에 부착된 10센티미터 페트리 접시에 배치하고, 얼음으로 채워진 큰 챔버 내에서 진동 슬라이서의 저수지 챔버에 블록을 배치합니다. 차가운 콜린 aCSF로 접시를 채우고 슬라이스를 사용하여 300 마이크로 미터 두께의 뇌 조각을 얻을 수 있으며 블레이드의 모든 패스 후 4 밀리미터 직경의 일회용 이송 파이펫을 사용하여 각 슬라이스를 수집합니다.각 슬라이스는 32도 콜린 aCSF에서 약 10 분 동안 회복한 후, 슬라이스를 렌즈 클리닝 용지에 옮기고 콜린 aCSF 한 방울을 얹어 놓습니다. 그런 다음 여분의 콜린 aCSF를 흡습하고 주걱을 사용하여 슬라이스를 인터페이스 챔버의 메시로 전송하여 슬라이스가 이 환경에서 적어도 30 분 동안 복구 할 수 있게합니다. 레코딩을 시작하기 30분 전에, 조직 조각의 산소화 및 생존가능성을 최적화하기 위해 상하 관류와 함께 맞춤형 녹음 챔버에 연동 펌프를 연결하고, 50밀리리터의 초순수수로 전체 관류 시스템을 청소한다.세정 사이클의 끝에서, 일정한 카보징 하에서 유리 비커에 aCSF의 50 밀리리터와 녹음 챔버의 관류를 시작하고, 일회용, 넓은 입 전달 파이펫을 사용하여 렌즈 종이를 제거하기 위해 비커에 이미지될 첫 번째 슬라이스를 전송한다. 단면이 비커의 바닥으로 침몰하면, 섹션을 기록 챔버로 옮기고 슬라이스 홀더를 슬라이스에 배치하여 관류 흐름에 의해 유도된 움직임을 최소화한다. 밝은 필드 조명을 사용하여 5 ~ 10 배율에서 관심있는 뇌 영역을 대상으로합니다.그런 다음 0.35배의 수분 침수 렌즈를 사용하여 25배 의 목표를 사용하여 시야의 위치를 조정합니다. 형광 조명을 사용하여 형광 마이크로글리아 세포를 찾고 최종 농도에서 관심 화합물을 포함하는 10 마이크로 리터의 aCSF로 파이펫을 백필하십시오. 팁에 갇힌 기포를 제거하고 5밀리리터 주사기에 연결된 파이펫 홀더에 채워진 파이펫 홀더에 장착하고 플런저를 5밀리리터 위치에 배치하고 3축 마이크로 조작기에 장착하여 팁을 부드럽게 흔들어 아래쪽으로 가리킵니다.파이펫 끝이 슬라이스 표면에 가볍게 닿을 때까지 파이펫을 슬라이스쪽으로 부드럽게 내리고 목표를 동시에 제어하고 조정합니다. 이제 레이저를 조정하고 현미경을 다광 모드로 전환합니다. 챔버가 모든 광원에서 스크리닝되고 비디캔디검출기를 켜는지 확인하십시오.게인을 설정하고 이미지의 픽셀을 포화하지 않도록 색상으로 구분된 상한이 있는 조회 테이블을 사용합니다. 그런 다음, 적어도 30분의 총 지속 시간 동안 레코딩을 시작하여 5분 후 5초 동안 주사기 플런저를 5분에서 1밀리리터 위치로 천천히 우울하여 단면에 화합물을 적용한다. 이미지 분석을 위해 먼저 관심 파일에 ImageJ를 통해 z 프로젝션 및 드리프트 보정을 수행합니다.그런 다음, 얼음에서 수정된 파일을 열고 사출 부위를 중심으로 35마이크로미터 직경의 관심 영역을 그립니다. ROI로 영화를 다시 실행하여 위치가 잘 되었는지 확인합니다. 그런 다음 관심 강도 의 영역을 사용하여 관심 지역에서 시간이 지남에 따라 평균 강도를 측정하고 결과를 XLs 파일로 저장합니다.이 프로토콜은 ATP 또는 세로토닌과 같은 다른 화합물에 의해 유도된 반응을 측정할 수 있게 합니다. ATP의 주사는 형광의 증가를 유도하지만, 대부분의 ATP 주사 후, 몇 분 후에 돌아오는 조직 왜곡으로 인해 형광의 즉각적이고 약간의 감소가 있습니다. 경위를 증가시켜 실험 중 가변성을 감소시키고 검출된 반응의 정확도와 크기를 감소시키기 때문에 관심 영역의 크기도 정량화에 영향을 미칩니다.특정 시점에서 마이크로글리아 반응의 평가는 상이한 화합물의 통계적 비교에 유용할 수 있으며, 관류 용액에 추가된 특정 길항제의 효과를 테스트하는 데 유용할 수 있다. 3차원으로 운동성을 정량화하려면 분석 요구 사항에 맞게 z 단계 간격과 수집의 샘플링 속도를 변경해야 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 반복 murine microglia를 시각화하고 monocytes 순환하는 방법을...

만성 두 광자를위한 박막 해골 창 기법 생체내에서</emNeuroinflammation의 모델 Murine Microglia의> 이미징

출처: Etienne, F. et al. 급성 뇌 절편에서 ATP 또는 세로토닌에 대한 미세아교세포 과정의 인력에 대한 이광자 이미징. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 이광자 현미경을 사용하여 뇌 절편에 주입된 화합물에 대한 미세아교세포의 인력을 연구하는 방법을 보여줍니다. 쥐의 뇌 절편을 준비하고, 화학유인제 테스트 화합물을 주입하고, 형광 표지된 미세아교세포를 이미징하여 반응을 시각화하는 방법에 대한 개요를 제공합니다.

쥐 뇌 절편의 화합물에 대한 미세아교세포 돌기 인력을 연구하기 위한 이광자 현미경

출처: Maruoka, H., et. al. 깨어 있는 쥐의 미세아교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징.J. Vis. Exp. (2022) 이 비디오는 시각적 자극 중 깨어 있는 쥐의 신경 활동과 미세아교세포 역학을 이미징하기 위한 이광자 현미경 절차를 보여주며 칼슘 과도 및 세포 상호 작용을 강조합니다.

깨어 있는 쥐에서 미세아교세포의 역학과 신경 활동의 동시 이미징(Simultaneous Imaging of Microglial Dynamics and Neuronal Activity in an Awake Mouse)

급성 뇌 손상은 날짜에 더 적절한 치료가없는 심각한 부상입니다. 다 광자 현미경은 길이 방향으로 급성 뇌 손상 개발의 과정을 공부하고 설치류에 치료 적 전략을 프로빙 할 수 있습니다. 두뇌의 생체 내 두 광자 이미징 연구 급성 뇌 손상의 두 가지 모델이 프로토콜에 설명되어 있습니다.

세로 두 광자 이미징 다음 마우스의 급성 뇌 외상

우리는 성인 마우스에서 급성 조각에 단일 코르티코스트 리아 탈 글루타마티터지시냅스에서 글루타메이트 방출과 클리어런스 사이의 균형을 평가하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 글루타메이트 검출을 위해 형광 센서 iGluu, 신호 수집을 위한 sCMOS 카메라 및 초점 레이저 조명장치를 사용합니다.

정상 및 헌팅턴 마우스의 급성 뇌 슬라이스에서 글루타메이트 방출 및 섭취량의 단일 시냅스 지표

우리는 마우스 전뇌의 오르노티픽 슬라이스 배양에서 유전자 로 코딩된 FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK의 세포 형 특이적 발현에 대한 프로토콜을 기술한다. 또한, 우리는 뉴런과 성상 세포에서 세포 ATP 수준의 동적 이미징을 위해이 센서를 사용하는 방법을 보여줍니다.

FRET 기반 센서 ATeam1.03YEMK를 사용하여 마우스 뇌의 오르가노티픽 조직 슬라이스에서 세포 내 ATP 이미징

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

이 논문은 정밀하게 제어된 수술과 이광자 현미경을 사용하여 마우스 해마 CA1에서 휴식 미세아교세포를 만성적으로 생체 내에서 관찰하는 방법을 설명합니다.

생체 내 마우스 해마에서 미세아교세포의 만성 이광자 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

연속 이광자 단층촬영(STPT) 이미징은 이광자 이미징과 자동 스테이지 제어 및 마이크로톰 슬라이싱을 결합하여 조직 덩어리를 3차원 형태로 이미징하는 기술입니다. 여기에서는 마모셋 뇌가 구조적 특징을 더 잘 이해할 수 있도록 이를 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

신경 해부학적 분석을 위한 전체 마모셋 뇌의 연속 이광자 단층촬영(Serial Two-Photon Tomography of the whole Marmoset Brain)

학습하세요 생쥐 급성 뇌 조각에서 미세아교세포의 방향성 운동성을 2광자 현미경으로 분석하는 방법을. ATP와 세로토닌 자극에 따른 세포 반응을 실시간 관찰하여 신경면역학 연구에 활용할 수 있습니다.

Microglial 프로세스 매력 ATP 또는 급성 뇌 조각에 세로토닌의 2 광자 영상

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