Name: Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 학습하세요 살아있는 암 세포에서 단일 텔로미어에서 발현하는 TERRA RNA를 시각화하는 방법을. AGS 세포에 MS2 시퀀스 태그를 도입하고 공초점 현미경으로 실시간 관찰하여 텔로미어 역학과 암 생물학을 연구합니다.

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우리는 Trento의 대학에 CIBIO의 고급 이미징 시설 및 비엔나에서 BioOptics 빛 현미경 시설 최대 F. Perutz 실험실 (MFPL)에서 직원에 게 감사. 이러한 결과 연구는 기금을 받았다 Mahlke Obermann 재단 및 연구, 기술 개발 및 실증에 대 한 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램에서 부여 계약 없음 609431 적에 EC는 이탈리아 정부 대학 교육 및 연구 (MIUR)에서 리 타 레비 Montalcini 친교에 의해 지원 됩니다.

1입니다. 네오 마이 신 내성 클론의 선택
<ol><li>햄의 F-12_K (Kaighn) 매체와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 37 ° C, 5% CO2보충에 AGS 세포 성장. SgRNA/Cas9 벡터와 MS2 카세트 1시 10분에 표현 된 50-60% 합류에 셀 transfect 어 금 니 비율21. 참고: 병렬 실험에서 GFP 표현 벡터 (즉, Cas9-GFP 벡터) transfecting 여 transfection 효율을 확인 합니다. 적어도 60-70 %transfection 효율을 달성 한다.</li>
	<li>다음 날, 0.7 µ g/mL 최종 농도 (선택적 매체)에서 네오 마이 신을 포함 하는 매체 자란 매체를 바꿉니다. 참고: 셀 분할 하 고 그들을 시드 선택적인 매체에 다음날 transfection 선택 프로세스 속도가 향상 됩니다. 모든 비 페 셀 즉시 죽을 것 이다. Transfection 6 잘 플레이트에서 수행 하는 경우이 경우는 60%에서 각 잘 합류 포함 약 0.7 x 106 셀, 셀 10 cm 접시 포함 하 선택적인 매체에 단일 우물에서 분할 될 수 있습니다 다음 날 됩니다.</li>
	<li>계속 셀 선택적인 매체에 7-10 일에 대 한 변화 하는 매체 마다 하나 또는 이틀, 단일 복제 될 때까지 표시 됩니다.</li>
	<li>세포 클론의 따기<ol>
<li>포함 하는 각 음에 0.25 %trypsin 10 µ L 96 잘 접시를 준비 합니다. 참고: 두 준비 96 잘 접시 경우에 이상의 96 클론 선택 될 것으로 예상 된다.</li>
		<li>현미경의 사용으로 표시 각 클론의 위치 표시 10 cm 접시에는 마커를 사용 하 여 접시의 바닥에 점 여. 각 점 하 식민지에 대응 됩니다.</li>
		<li>대체 자란 매체와 충분 한 인산 염 버퍼 염 분 (PBS) 클론에 액체의 얇은 필름을 형성 하 여 세포 복제 따기 동안 건조 하 게 하지.</li>
		<li>10 µ L 피 펫을 사용 하 여 단일 식민지를 선택 하십시오. 트립 신 식민지의 5 µ L을 포함 하는 팁을 부착 하 고 천천히 식민지에 지역화 된 유지 trypsin 출시. 1 분에 대 한 셀을 분리 다음 팁과 식민지를 긁 고 팁으로 그것을 빨을 트립 신을 수 있습니다. 참고:이 절차 동안 내리고 한쪽에 약간 접시 포착 되 고 식민지 주위 PBS의 볼륨을 감소 도움이 될 것입니다 따기 프로세스 식민지 주위 trypsin diluting 피하 여 그래서. 클론 링을 사용 하 여 또한 단일 클론을 따기 도움이 수 있습니다.</li>
		<li>0.25 %trypsin 10 µ L을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에는 식민지에서 세포를 놓습니다.</li>
		<li>실 온에서 5 분을 품 어 다음 선택적 매체 (햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 보충과 네오 마이 신에 포함 된의 150 µ L 잘 채워 0.7 µ g/mL의 농도입니다. 참고: 보육 시간 동안 다른 클론 선택 수 있습니다. 가능한 많은 클론을 선택 하는 것이 좋습니다. 더 많은 클론 선택 가능성이 높은 긍정적인 것 들을 식별 될 것입니다.</li>
		<li>일단 모든 클론 선택 96 잘 접시에 전송, 허용 선택적 매체 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (0.2 µ g mL 당 보충 햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간에에서 몇 일 동안 성장 하는 세포 매체)의 90%의 합류를 도달할 때까지 37 ° C, 5% CO2, 0.7 µ g/mL의 농도에서 네오 마이 신을 포함 하 고.</li>
	</ol>
</li>
	<li>클론의 분<ol>
<li>3 준비 96 잘 접시 잘, 당 젤라틴의 추가 100 µ L에 의해 젤라틴 코팅 실 온에서 30 분 동안 품 어 후 PBS로 두 번 씻어. 이 번호판 DNA 추출 (DNA 플레이트)과 냉동 (냉동 번호판) 복제에 사용 됩니다. 참고: 젤라틴 첨부 파일의 세포와 DNA의 우물을 추진 하겠습니다. 특히, 젤라틴 코팅 DNA DNA 추출 하는 동안 우물의 바닥에 막대기 및 절차 (아래 설명)을 씻어 수 있습니다. 복제 분할 절차 동안에 그것은 멀티 채널 피 펫을 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
		<li>클론 90% 합류에 도달, 96 잘 접시의 각 우물에서 매체를 발음, PBS로 세척, 잘, 당 0.25 %trypsin 30 µ L을 추가 하 고 37 ° c.에 5 분 동안 품 어 참고: 클론은 클론 당 선택 하는 셀의 수에 따라 달라 집니다 것입니다 또한 다른 속도로 성장할 것입니다. 따라서,이 단계는 다른 클론 90% 합류를 도달 하는 때 몇 일 동안 수행 됩니다.</li>
		<li>잘 당 선택적인 매체의 70 µ L을 추가, 웰 스, 내부를 위아래로 pipetting으로 세포 덩어리를 중단 다음 gelatinized 냉동 번호판 prefilled 재치를 잘 하 고 30 µ L 당 선택적인 매체의 120 µ L로 prefilled gelatinized DNA 접시를 100 µ L의 30 µ L를 전송 (선택) 없이 h 50 µ L 미디어.</li>
		<li>인큐베이터에서 DNA 접시를 놓고 90% 합류까지 37 ° C, 5% CO2 에서 성장 하는 세포를 허용 합니다.</li>
		<li>냉동 접시의 각 음에 얼음의 80 µ L 갓 만든 동결 매체 (80 %FBS 20% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)) x 2를 추가, parafilm (70% 에탄올 뿌리) 각 잘 밀봉, 뚜껑 위에 놓고 포장 알루미늄 호 일 접시에 이렇게 접시 위에 추가. -80 ° c.에 냉동 번호판을 배치</li>
		<li>분할 된 PCR 검사 결과까지 문화에서 그것을 유지 하는 클론을 포함 하는 원래 96 잘 접시를 잘 당 선택적인 매체의 90 µ L를 추가 합니다. 이 접시는 백업 접시로 사용 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 네오 마이 신 내성 클론의 심사
<ol><li>96 잘 DNA 접시에서 DNA 추출입니다.<ol>
<li>클론 DNA 접시에 배양 도달 90% 합류, PBS, 2 회 세척 후 50 µ L 세포의 용 해 버퍼 (10 mM Tris pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 mM NaCl, 0.5 %SDS, 고 1 mg/mL 가수분해 K) lyse. Parafilm으로 플레이트 커버, 뚜껑을 넣어 각 잘 밀봉, 포장지로 커버 하 고 37 ° C에서 밤새 껏 두기 위하여.</li>
		<li>추가 냉 에탄올 (동부 표준시-OH)의 100 µ L/NaCl 솔루션 (100% 에탄올에 0.75 M NaCl) 각 잘 6 h 또는 하룻밤 실 온에서 침전. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
		<li>접시를 반전 하 여 동부 표준시-오/NaCl 솔루션을 제거 하 고 잘 당 70% 에탄올의 200 µ L로 3 번 세척.</li>
		<li>증류수에 RNAse A 솔루션의 25 µ L을 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.</li>
	</ol></li>
	<li>게놈 DNA의 3 µ L를 사용 하 여 PCR 증폭에 대 한. 네오 마이 신 저항 유전자와 subtelomere 15q 단련 하는 뇌관을 사용 하 여 선택 된 클론의 PCR 검사를 수행 합니다. PCR 확대 표준 중 합 효소 효소와 PCR 프로토콜21을 사용 하 여 수행 됩니다. 참고: PCR MS2 뇌관 (MS2-subtel15q-뇌관-S와 MS2 입문서로)과 클릭률 뇌관 (클릭률 프라임 S 및 클릭률 뇌관으로)에 대 한 조건은 다음: 20 98 ° C의 변성 단계 및 98 ° C 10 s, 58 ° C 20 s, 72 ° C 15 s 34 주기 다음으로 25 µ L에서 중 합 효소 효소를 사용 하 여 반응 혼합 ( 재료의 표참조). 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다.</li>
	<li>Agarose 젤에 PCR 반응을 실행 하 고 표준 젤 추출 절차 (젤 추출 시 약에 대 한 재료의 표 참조)를 사용 하 여 긍정적인 클론에서 얻은 PCR 밴드를 추출.</li>
	<li>MS2 시퀀스21의 존재의 확인을 위해 젤 추출 PCR 제품의 DNA 연속 분석을 수행 합니다. 참고: 시퀀싱 분석 수행할 수 있습니다 PCR 검사에 사용 되는 뇌관을 사용 하 여.</li>
	<li>PCR 긍정적인 클론의 남쪽 오 점 심사<ol>
<li>클론 PCR 및 시퀀싱 심사 원래 96 잘 접시 (백업 플레이트)에서 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (0.2 µ g 당으로 보충 하는 햄의 F-12 K (Kaighn 의) 중간에 6 잘 플레이트를 긍정적인 성장 매체의 mL) 37 ° C 5% CO2에서 0.7 µ g/mL의 농도에서 네오 마이 신을 포함 하 고. 참고: 또는, 있다면 이러한 일부 손실, 해 동 냉동 번호판 (프로토콜 2.6 참조) 중 하나에서 그들.</li>
		<li>클론에 90% 합류에 일단 6 잘 플레이트, PBS로 세포 세척 하 고 잘 당 0.5 µ g 가수분해 K를 포함 하는 세포의 용 해 버퍼의 250 µ L을 추가.</li>
		<li>셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 긁 고 lysate 1.5 mL 튜브에 전송.</li>
		<li>16 h 37 ° C에서 품 어.</li>
		<li>100% 에탄올의 1 mL를 추가 하 고, 적극적으로, 악수 2 시간 이상 침전 또는-20 ° c.에서 하룻밤 DNA를 허용 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
		<li>10 분 동안 4 ° C에서 13,400 x g에서 회전 시키십시오, 상쾌한, 삭제 하 고 70% 에탄올과 펠 릿을 세척. 산 탄 어 실 온에서 건조 하 게. 또는, 진공 집중 장치를 사용 하 여.</li>
		<li>RNAse A를 포함 하는 증류수 50 µ L에서 DNA 알갱이 resuspend 하 고 37 ° c.에 1 시간에 대 한 품 어</li>
		<li>밤새 소화 반응 37 ° C에서 배양 하 여 100 µ L 반응 볼륨에서 NcoI 및 BamHI 제한 효소 (2 개의 독립적인 소화)를 사용 하 여 게놈 DNA의 5-10 µ g을 소화.</li>
		<li>완전 한 소화 확인 agarose 젤 (agarose 0.8%)에 소화의 4 µ L를 실행 합니다.</li>
		<li>100% 에탄올의 나트륨 아세테이트 3 M 솔루션 pH 5.2와 2 볼륨의 1/10 볼륨 제한 소화 반응에 추가 적어도 2 시간을 품 어 또는 DNA를 침전에-20 ° C에서 하룻밤. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
		<li>13,400 x g 20 분 동안 4 ° C에에 centrifuge supernatants, 삭제 하 고, 70% 에탄올과 펠 릿을 세척. 실내 온도에 공기를 펠 릿 건조 수 있습니다. 또는, 진공 집중 장치를 사용 하 여.</li>
		<li>20 µ L의 증류수에 펠 릿을 resuspend 하 고 0.8 %agarose 젤에 소화 DNA를 로드 합니다. 참고: 소화 DNA의 더 나은 해결을 위해 긴 젤 최소 15 cm를 준비 하 고 낮은 전압 (̴30 볼트)에서 밤새 껏 달린다. 전기 이동 법 설정 최적화 되어야 합니다.</li>
		<li>다음 날, 실 온에서 30 분 동안 1 µ L/10 mL 최종 농도에 ethidium 평범한 사람 같은 DNA 라벨 에이전트와 젤을 얼룩이 고 악기 이미징 젤에 젤 가까운 통치자와 사진의 찍을.</li>
		<li>나일론 막에 DNA의 전송을 설정 하 고 막 교 잡 MS2 시퀀스 관련 프로브21표준 절차 사용 하 여 수행.</li>
		<li>녹여 PCR, DNA 시퀀싱 및 남부에서 긍정적인 클론 (다음 단계 참조) 두 개의 냉동 접시 중 하나에서 오 점.</li>
	</ol></li>
	<li>클론의 해빙<ol>
<li>5 mL의 미리 데워 진된 햄의 F-12 K를 포함 한 15 mL 튜브 준비와 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 페니실린 (매체의 mL 당 0.5 단위), 스 (중간의 mL 당 0.2 µ g) 해 동 수를 각 복제에 대 한 보충 (Kaighn 의) 중간.</li>
		<li>-80 °에서 냉동 접시 중 하나를 제거 하 고 필요에 잘 포함 하는 동 수를 긍정적인 클론을 미리 데워 F12K 완전 한 매체의 100 µ L를 추가. 참고:이 절차는 신속 하 게 수행 되어야 합니다 고 냉동 남아 다른 클론을 허용 하기 위하여 각 복제 해 동 후에 드라이 아이스에 96 잘 접시 배치 한다. 이것은 여러 클론 같은 96 잘 접시에서 해 동을 해야 하는 경우에 특히 중요 하다입니다.</li>
		<li>매체와 실 온에서 5 분 동안 800 x g에서 원심 분리기의 5 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 세포를 전송 합니다.</li>
		<li>매체를 발음 하 고 미리 예 열된 완료 F12K 매체의 500 µ L에 셀 resuspend 12 잘 플레이트의 단일 잘 각 복제 전송.</li>
	</ol></li>
	<li>Subtelomere 15q MS2 카세트에서 네오 마이 신 저항 유전자의 제거 통합.<ol>
<li>클론 완전 F12K 매체에서 10 cm 접시 12 잘 접시에서 성장 하는 것을 허용 한다. 참고: 네오 마이 신 안 포함 되어야 합니다는 매체에 명시 되지 않는 한.</li>
		<li>Cre 표현 아 데 노비 루스 10 mL 전체 F12K 매체의 합류 점 70%에서 10 cm 접시에 교양된 있는 셀에 추가 합니다. 참고: Cre GFP 표현 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 100% 접근 해야 감염의 효율성의 평가 허용할 것 이다. 아 데 노비 루스 복제 결함 문화에 몇 구절 후 손실 됩니다.</li>
		<li>3 10 cm 요리에서 셀 분할 감염 후 48 시간. 두 요리 사용할 네오 마이 신 유전자 제거의 확인에 대 한 부정적인 선택, 네오 마이 신을 포함 하는 셀을 성장 매체 (첫 번째 접시), 남부 여 (두 번째 접시) 되 리.</li>
		<li>문화 셀 및 RNA 추출에 대 한 복제를 포함 하는 세 번째 접시.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 실시간 정량 Pcr에 의해 테라 MS2 대 본 식의 확인
<ol><li>네오 마이 신 유전자 제거의 확인, 시 총 RNA 추출에서 테라 MS2 클론 유기 용 제 (페 놀 및 guanidine isothiocynate 솔루션)21을 사용 하 여 수행 합니다.<ol>
<li>Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물 100 µ L에 10 cm 접시에서 추출한 RNA resuspend</li>
		<li>농도 및 RNA의 무결성을 확인 하려면 denaturating (1% 포름알데히드-포함) 1 x 3-(N-Morpholino) propanesulfonic 산 (MOPS) 젤에 RNA의 3 µ L를 실행 합니다. 또한 RNA 농도 분 광 광도 계를 사용 하 여 분석.</li>
		<li>DNAse와 RNA의 3 µ g 나 DNAse의 1 단위를 사용 하 여 치료 나 60 µ L 최종 반응에에서 효소.</li>
		<li>품 어 1 h 37 ° c.에 대 한 반응</li>
	</ol>
</li>
	<li>반전 녹음 방송 반응 및 정량 분석<ol>
<li>Nuclease 무료 microcentrifuge 관에는 다음 구성 요소 추가: 1 µ M 테라 특정 뇌관, dNTPs 믹스 (10 mM 각)의 1 µ L, DNAse I 치료 RNA (̴300ng RNA에 해당)의 6 µ L의 2 µ L. DEPC 물 4 µ L로 13 µ L 볼륨을 조정 합니다. 참고: 각 RNA 분석에 대 한 동일한 시 약 하지만 테라 특정 뇌관 대신 참조 특정 뇌관, 포함 된 두 번째 튜브 준비 되어야 한다.</li>
		<li>5 분 동안 65 ° C에 혼합물을가 열 하 고 적어도 1 분 동안 얼음에서 품 어.</li>
		<li>간단히 원심 분리 하 여 튜브의 콘텐츠를 수집 하 고 5 X RT 효소 버퍼, 1 µ L 0.1 m M dithiothreitol (DTT), 1 µ L의 RNAse 억제제 (4 단위) 및 역전사의 1 µ L의 4 µ L 추가 ( 재료의 표참조).</li>
		<li>60 분 동안 42 ° C에서 샘플을 품 어 다음 정량 분석에 대 한 RT 반응의 2 µ L을 사용 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정량 Pcr 반응 혼합 2 x qPCR 마스터 믹스, cDNA 템플릿의 2 µ L, 앞으로 뇌관 (10 µ M), 1 µ L의 역방향 뇌관 (10 µ M), 그리고 물 6 µ L의 1 µ L 10 µ L의 구성 20 µ L의 최종 볼륨에서을 준비 합니다.</li>
	<li>정량 Pcr 반응 thermocycler21표준 프로토콜 사용 하 여 수행 합니다.</li>
</ol>4. MS2 GFP 표현 레트로 바이러스의 생산
<ol><li>레트로 바이러스 벡터 (pBabe-MS2-GFP 순수 하지 않아)와 4: 1의 몰 비를 사용 하 여 (예: pCMV-VSVG) 벡터를 표현 하는 환경 을 유전자 MS2 GFP 융해 단백질 80 %confluent 피닉스 포장 셀 MS2 GFP 표현 레트로 바이러스를 생성 하려면 transfect 두 벡터 스</li>
	<li>다음 날, 신선한 중간 포함 10 m m 나트륨 낙 산 염 (DMEM 보충 10 %FBS, 2 m L-글루타민 m와 펜/Strep) 자란 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>37 ° c, 5% CO2, 8 h incubate 다음 신선한 자란 매체에서 바이러스 수집 될 것입니다 매체를 바꿉니다.</li>
	<li>48 h 후 피닉스 셀에서 레트로 바이러스를 포함 하는 매체를 제거 합니다. 이 매체 테라 MS2 클론의 감염에 대 한 직접 사용할 수 있습니다, 어떤 경우에 필터 매체 0.45 μ m 필터를 통해, polybrene (30 µ g/mL 최종 농도) 추가 및 셀 (이 경우 5 단계에서 계속 되는 프로토콜)에 그것을 추가. 또는 레트로 바이러스 50% 말뚝-8000/900 m m NaCl 솔루션의 1/5번째 볼륨을 추가 하 고 회전 바퀴에 4 ° C에서 하룻밤 배양 여 50ml 팔 콘 튜브에 침전 될 수 있습니다.</li>
	<li>다음 날, 30 분 2000 x g에서 원심 분리에 의해 펠 레트로 바이러스 입자에 상쾌한, 제거 하 고 혈 청 하지 않고 F12K 매체에 펠 릿을 resuspend. 참고: 바이러스 입자는 원래 표면에 뜨는 볼륨의 1/100번째 에 resuspended 수 있습니다. 감염 테스트를 효율적으로 세포를 감염 하는 데 필요한 레트로 바이러스의 최소 볼륨을 확인 하기 위하여 수행 되어야 한다.</li>
</ol>5. 살아있는 세포에서 테라 MS2 성적표의 시각화
<ol><li>판 테라-MS2 클론 고 유리 바닥 요리에서 WT AGS 셀. 감염의 날, 매체 (30 µ g/mL 최종 농도) 및 MS2 GFP 표현 레트로 바이러스 polybrene을 추가 합니다.</li>
	<li>24 시간 후, 바이러스가 포함 된 매체를 삭제 하 고 페 놀 레드 없이 신선한 매체를 추가 합니다.</li>
	<li>적절 한 현미경 설정을 사용 하는 거꾸로 한 현미경에서 세포를 분석 합니다. 100 X 셀 또는 큰 숫자 조리개 (1.4 X)와 민감한 카메라 (EMCCD)를 사용 하 여 60 X 목표 이미지. 환경 제어 시스템을 사용 하 여 이미징 동안 37 ° C, 5% CO2 샘플을 유지.</li>
</ol>

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</ol>

저자 아무 경쟁 금융 관심 선언

이 문서에서 우리는 subtelomere 15q 통합 MS2 시퀀스를 포함 하는 인간의 암 세포 클론을 생성 하는 방법을 제시. 이러한 클론을 사용 하 여, subtelomere 15q에서에서 복사할 MS2 태그 테라 분자 MS2 GFP 융해 단백질의 공동 식으로 형광 현미경 검사 법에 의해 검색 됩니다. 이 방법은 단일에서 표현 하는 테라의 역학을 공부 하는 연구자 수 생활에서 telomere21세포. 이 프로토콜에서 테라 MS2 클론 AGS 셀 라인, 테라, 테라 식 이기 때문에 인간의 위 암 샘플24upregulated 공부 하는 재미 있는 모델 시스템을 나타내는 선택 됩니다. 그러나, 여기에 설명 된 프로토콜은 다른 셀 라인에서 테라 MS2 클론 선택 적용할 수 있습니다. MS2 시퀀스의 통합 원리에 홍보하실 수 있습니다 subtelomere 다른 telomere 15q에 특정 MS2 카세트 및 CRISPR 전략을 사용 하 여. 여기에 ...

긴 noncoding RNA 테라 염색체의 subtelomeric 지역에서 복사할 및 그것의 녹음 방송 종료 telomeric 반복로1,2내 염색체 끝을 향해. 이러한 이유로, 테라 사본 그들의 5' 끝에 subtelomeric 파생 시퀀스의 구성 하 고 telomeric 반복 (척추 동물에 UUAGGG)3종료. 역할 제안 되었습니다 테라,7,8 끝 telomeres4,5, DNA 복제6, 염색체 가운데 동종 재결합을 추진에서 섬으로 형성을 포함 하 여 중요 한 , 9, telomere 구조10및 telomere 길이 항상성2,11,,1213통제. 또한, 테라 성적표 마우스 배아 줄기 (ES) 세포14에 광범위 한 유전자 발현 조절에 수많은 extratelomeric 사이트와 상호 작용 합니다. 이 맞춰 증거, RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 테라 성적 하위 집합 나타났습니다 telomeres1,,215에서 지역화 합니다. 또한, 테라 폼 핵 집계 마우스 세포2,16에서 X와 Y 염색체에서 지역화를 보고 되었습니다. 이러한 연구 결과 테라 성적표는 핵 내에서 복잡 한 역학 받아야 나타냅니다. 테라 분자의 역학을 이해 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다.
MS2 GFP 시스템은 다양 한 유기 체17,18에서 살아있는 세포에서 RNA 분자를 시각화 하기 위해 널리 사용 되었습니다. 이 시스템은 이전 태그를 S. cerevisiae12,19에서 단일 telomere 테라 분자 시각화 사용 되었습니다. 이 시스템을 사용 하 여, 최근에 보였다는 효 모 테라 성적표 지역화 세포질 내 게시물-diauxic 이동 단계 동안 테라 extranuclear 기능20발휘 수 있습니다 제안. 최근 암 세포21단일 telomere 테라 성적표 공부 MS2 GFP 시스템을 사용 했습니다. 이 목표를 우리 MS2 시퀀스는 단일 telomere (telomere 15q,이 하 Tel15q)에 통합 하는 CRISPR/Cas9 게놈 편집 도구를 고용 하 고 얻은 MS2 태그 내 생 Tel15q 테라 (테라 MS2 클론)을 표현 하는 클론. 인식 하 고 생활에 단일 telomere 테라 성적 MS2 RNA 시퀀스 수 시각화를 바인딩합니다 MS2 RNA 바인딩 GFP 융합 단백질 (MS2-GFP)의 공동 식21세포. 여기 설명 하는 프로토콜의 목적은 테라 MS2 클론의 생성에 필요한 단계를 자세히 설명 하는 것입니다.
테라 MS2 클론을 생성 하려면 MS2 카세트 telomere 15q의 subtelomeric 지역 통합은 테라 발기인 지역 및 전사 시작 사이트의 다운스트림. MS2 카세트 lox p 사이트에 의해 형벌 네오 마이 신 저항 유전자를 포함 하 고 subtelomere 15q에의 통합 CRISPR/Cas9 시스템22를 사용 하 여 수행 됩니다. 카세트, 단일 클론 MS2의 transfection 선택 후 카세트의 subtelomeric 통합 PCR에 의해 확인 된다 DNA 시퀀싱 및 남쪽 오 점. 긍정적인 복제품만 MS2 시퀀스 및 subtelomere 15q에 단일 lox p 사이트는 카세트에 선택 표시를 제거 하려면 Cre 표현 아 데 노 바이러스와 감염 됩니다. Tel15q에서 MS2 태그 테라 성적 표현의 실시간 정량 Pcr에 의해 확인 됩니다. 마지막으로, MS2 GFP 융해 단백질은 표현 형광 현미경 검사 법에 의해 MS2 테라 성적표를 시각화 하기 위해 retroviral 감염을 통해 테라 MS2 클론에. 테라 성적표 RNA 물고기에 의해 쉽게 검출 될 수 있다 고 반복 전용 telomeric를 사용 하 여 라이브 셀 이미징 프로브1,2,,1523. 이러한 접근에는 단일 셀 해상도에서 테라 분자의 전체 인구의 지역화에 대 한 중요 한 정보가 나와 있습니다. 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스를 포함 하는 클론의 세대에는 단일 telomere 테라 성적 기능과 테라의 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다 살아있는 세포에서의 역학을 공부 하는 연구자 수 있게 된다.

<table><tbody><tr><td>AGS 세포</td><td>-</td><td>-</td><td>Christian Baron(Universit&eacute; de Montr&eacute; al)을 사용합니다.</td></tr><tr><td>F12K 너트 믹스 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>AGS 세포</td></tr><tr><td>L-글루타민용 배양 배지&nbsp;</td><td>코닝</td><td>MT25005CI</td><td>세포 배양 배지의 구성 요소</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신 용액</td><td>CORNING</td><td>30-002-CI</td><td>세포 배양 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2442</td><td>세포 배양 배지의 구성</td></tr> 요소 <tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>피닉스 세포</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> 용 21068028 배양 배지 <td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>피닉스 세포 형질주입에 사용됨</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마 알드리치</td><td>H3375</td>, <td>피닉스 세포 형질주입에 사용됨(HBS 용액),</td></tr> <tr><td>KCl</td><td>시그마, 알드리치</td><td>P9333</td>, <td>피닉스 세포 형질주입(HBS 용액)에 사용됨,</td></tr> <tr><td>포도당,</td><td>시그마, 알드리치</td><td>D9434</td>, <td>피닉스 세포 형질주입(HBS 용액)에 사용됨,</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>시그마, 알드리치</td><td>S7653</td><td>피닉스 세포 형질주입(HBS 용액) 및 레트로바이러스 침전에 사용됨</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td>, <td>피닉스 세포 형질주입에 사용됨(HBS 용액),</td></tr> <tr><td>TRYPSIN EDTA SOLUTION, 세포</td><td>분할에 사용되는</td>1X <td>CORNING</td><td>59430C</td></tr><tr>,<td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>Dulbecco의 인산염 완충 식염수</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>세포 동결 매체의 구성 요소 (80% FBB 및 20% DMSO)</td></tr><tr><td>G-418 디설페이트</td><td>Formedium</td><td>G4185</td><td>선택 약물 for&nbsp;</td></tr><tr><td>젤라틴 용액 생물 시약</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>96 웰 DNA 플레이트 및 냉동 플레이트의 코팅</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>10376743</td><td>게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2546</td><td>게놈 DNA 추출을 위한 세포 용해 완충액의 구성 요소</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Fisher</td><td>DNA</td><td>추출 중 RNA 분해</td></tr><tr><td>12091021 Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>DNA 겔 준비</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>아가로스 젤</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 바이오시약</td><td>BP28184</td><td>DNA 침전</td></tr>성 <tr><td>나트륨 아세테이트에서</td> DNA와 RNA 샘플을 감지하는 데 사용되는 염색 시약;<td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>3M 농도에서 DNA 침전에 사용 pH5.2</td></tr><tr><td>Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>네오마이신 양성 클론의 PCR 스크리닝 중 아가로스 겔에서 PCR 단편 추출</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>RNA 추출에 사용되는 유기 용매</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>89836</td><td>RNA에서 게놈 DNA의 분해&nbsp;</td></tr><tr><td>dNTP는</td><td>RT 및 PCR 반응에 사용되는</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td> 혼합,</tr><tr><td>RT 반응에 사용되는</td><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td>,</tr><tr><td>디에틸 피로탄산염</td>, <td>Sigma Aldrich</td>, <td>D5758</td>, <td>물에서 RNAs를 비활성화하는 데 사용됨(1:1000 희석),</td></tr> <tr><td>Ribolock</td>, <td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td>, <td>RNase 억제제</td></tr>, <tr><td>MOPS</td>, <td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>RNA 겔</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>준비 전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td>변성 RNA 겔 준비(1x MOPS에 1% PFA)</td></tr><tr><td>위 첨자 III 역전사 효소</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>역전사 반응</td></tr><tr><td>Pfu DNA 중합효소(재조합)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0501</td><td>PCR 반응</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCR BIOSYSTEMS</td><td>PB 20.14</td><td>qPCR 반응</td></tr><tr><td>Cre-GFP 아데노바이러스</td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td><td>1174-HT</td>는 피닉스 세포에서 레트로바이러스 입자 생성을 촉진하는 데 사용되는 Neomycn 유전자 Sodium Butyrate Sigma Aldrich B5887을 <td>제거하기 위해 TERRA-MS2 클론을 감염시키는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>레트로바이러스 입자의 침전</td></tr><tr><td>35&micro;-Dish Glass Bottom</td><td>Ibidi</td><td>81158</td>은 <td>TERRA-MS2 클론의 라이브 셀 이미징 분석에 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

telomeric 반복 포함 된 rna 테라에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

Telomeres는 복사할 수, 반복 포함 하는 긴 noncoding RNAs (테라), telomeric를 야 기한는 telomere 생물학, telomere 길이 항상성 섬으로 형성 등 중요 한 역할을 제안 되었습니다. 최근 연구 결과 밝혀 테라 분자도 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 유전자 발현을 조절 하기 위해 내부 염색체 영역 상호 작용. 이 증거에 따라 RNA 형광 제자리에서 교 잡 (RNA-물고기) 분석만 하위 집합으로 나타났습니다 테라의 성적표는 염색체 끝에 지역화. 테라 분자의 역학의 더 나은 이해는 그들의 기능 및 행동의 메커니즘을 정의 하는 데 도움이 됩니다. 여기, 우리 고 MS2 GFP 시스템을 사용 하 여 암 세포에서 단일 telomere 테라 성적표를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 목표에 선물이 안정적인 클론을 생성 하는 프로토콜 MS2 시퀀스에서 단일 subtelomere 통합을 포함 하 AGS 인간 위 암 세포 라인을 사용 하 여. MS2 태그 telomere에서 테라의 전사 (MS2-GFP) GFP 융합 MS2 RNA 의무적인 단백질의 공동 식 시 라이브 세포 형광 현미경 검사 법에 의해 시각 MS2 태그 테라 분자의 표현을 결과입니다. 이 방법은 수 연구원은 암 세포에서 단일 telomere 테라 분자의 역학을 공부 하 고 다른 셀 라인에 적용 될 수 있습니다.

그림 1 실험적인 전략의 개요를 나타냅니다. 프로토콜 및 AGS 셀에서 테라 MS2 클론의 세대를 위한 나타내는 타임 라인의 주요 단계 (그림 1A) 표시 됩니다. 1 일에서 6 잘 플레이트의 여러 우물 MS2 카세트와 sgRNA/Cas9 (참조 그림 1B) 벡터 표현 페는. 2 개의 다른 subtelomere 15q 전용 가이드 RNA 순서 Cas9 nickase 표현에서 복제는 pX335 벡터, 공동 transfected MS2 카세트는 2 개의 sgRNA pX335 벡터를 생성. 접시의 한 잘 transfection 효율을 확인 하기 위해 벡터를 표현 하는 GFP와 페 수 있습니다. 2 일에 셀 trypsinized 이며 ...

여기, 선물이 단일 subtelomere에서 MS2 시퀀스 태그를 포함 하는 암 세포 클론을 생성 하는 프로토콜. MS2 GFP 시스템에 의존 하는이 방법은 생 성적표의 telomeric 반복 포함 된 RNA (테라)에서 살아있는 세포에서 단일 telomere 표현의 시각화 수 있습니다.

Telomeric 반복 포함 된 RNA 테라에서 살아있는 세포에서 단일 Telomere 표현 시각화 하 암 세포 클론의 세대

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

이 방법은 효모 텔로머 비코딩 RNA TERRA 국소화와 같은 텔로미어에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며, 나는 그것이 기원 또는 트랜스의 텔로미어라고 주장 할 수 있습니다, 다른 cromes-mants이 기술의 주요 장점은 연구원이 살아있는 세포에서 단일 텔로미어에서 표현 테라 분자를 시각화 할 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 클라우디오 오스 페고라와 니콜 베틴, 내 실험실에서 두 대학원생이 될 것입니다. 텍스트 프로토콜에 따라 AGS 셀을 성장하기 시작합니다.그런 다음 세포가 50~ 60%에 도달하면 sgRNA Cas9 발현 벡터 및 MS2 카세트로 변환합니다. 다음 날 배양 매체를 네오마이신을 함유한 매체로 대체한다. 이 후 추가 10 마이크로 리터 0.25% 96 잘 플레이트의 각 우물에 Tripsyn.현미경과 마커를 사용하여 접시에 보이는 각 클론의 위치를 표시합니다. 네오마이신 배양 매체를 충분한 PBS로 교체하여 클론에 액체의 박막을 형성한다. 트립신의 5 마이크로 리터를 포함하는 10 마이크로 리터 파이펫을 사용하여 천천히 식민지에 트립신을 해제합니다.트립신이 세포를 1분 동안 분리하도록 허용합니다. 끝으로 식민지를 긁어, 끝에 빨아. 이 후, 콜로니에서 세포를 96 웰 플레이트의 우물로 옮킨다.상온에서 5분간 접시를 배양합니다. 그런 다음 선택적 매체의 150 마이크로 리터로 우물을 채웁니다. 다음으로, 3개의 96개의 웰 플레이트의 각 웰에 100마이크로리터의 젤라틴을 추가합니다.플레이트를 실온에서 30분 동안 배양하고 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다. 클론이 90 %에 도달 한 후, 접시의 각 우물에서 매체를 흡인하고 PBS로 접시를 씻습니다. 그런 다음 트립신 의 마이크로 리터 30 마이크로 리터를 각 우물에 추가하고 5 분 동안 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다.다음으로 각 웰에 70마이크로리터의 선택적 배지를 추가합니다. 위아래로 파이프를 통해 세포를 방해. 120 마이크로리터를 포함하는 젤라틴화된 DNA 플레이트의 웰에 혼합물의 30마이크로리터를 전달한다.그런 다음 혼합물의 마이크로리터 30을 50 마이크로리터를 포함하는 젤라틴 냉동 플레이트로 전달한다. 인큐베이터에 DNA를 놓고, 세포가 90%의 합류에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 자랄 수 있도록 합니다. 그 후, 얼음 냉기 냉동 매체 80 마이크로리터를 동결 판의 각 웰에 추가합니다.접시를 파라필름으로 밀봉하고 뚜껑을 교체하고 판을 알루미늄 호일로 감쌉니다. 그런 다음 냉동 판을 섭씨 80도에서 유지하십시오. DNA 플레이트의 클론이 90%에 도달하면 PBS로 플레이트를 두 번 세척합니다.그런 다음 Lysis 버퍼의 50 마이크로 리터로 세포를 lyse. 접시를 파라필름으로 덮고 뚜껑을 교체하고 접시를 사란 랩으로 감쌉니다. 그 후 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오.다음 날 각 우물에 100 마이크로리터의 염화나트륨 용액을 추가하고 실온에서 6시간 또는 하룻밤 동안 DNA 강수량을 허용합니다. 그런 다음 접시를 반전하고 잘 당 70 %의 200 마이크로 리터로 세 번 세척하십시오. 접시의 각 웰에 RNase A 용액 20 마이크로 리터를 추가하고 1 시간 동안 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.그 후 PCR 증폭을 위해 게놈 DNA 3마이크로리터를 사용하고 PCR 기계를 설치합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 6개의 웰 플레이트에서 PCR 양성 클론을 성장시다. 클론이 90%에 도달하면 PBS로 세포를 세척하고, 각 웰에 Proteinase K로 250 마이크로리터를 추가합니다.세포 스크레이퍼를 사용하여 세포를 긁어내고 Lysate를 1.5 밀리리터 튜브로 옮기십시오. 16시간 동안 섭씨 37도에서 Lysate를 배양합니다. Lysate에 에탄올 1 밀리리터를 넣고 힘차게 흔들어 줍니다.텍스트 프로토콜에 따라 F-12K 배지에서 클론을 성장시킬 수 있습니다. 그런 다음 70%의 합류에 도달하면 세포에 Cre-expressing 아데노바이러스를 추가합니다. 감염 후 48시간 후에 세포를 3개의 10센티미터 요리로 나눕습니다.그런 다음 세포 동결 및 RNA 추출을 위한 세 번째 접시를 배양합니다. 먼저, 테라-MS2 클론과 야생형 AGS 세포를 유리 바닥 접시에 접시에 담는다. 그런 다음 폴리브레인과 바이러스 를 발현하는 MS2-GFP를 배지에 추가합니다.24시간 후에 레트로바이러스를 함유하는 배지를 버리고, 페놀 레드 없이 신선한 배지를 세포에 첨가한다. 마지막으로, 반전된 현미경과 민감한 카메라 영상을 사용하여 적절한 목표와 조리개를 가진 세포를 이미지하게 됩니다. 단일 서브텔로미어에서 MS2 서열 태그를 포함하는 이 프로토콜암 세포 클론이 생성되고 이미지화되었다.네오마이신 내성 클론은 PCR을 사용하여 스크리니징되었다. 양성 클론은 게놈 DNA 추출 및 남부 얼룩 분석을 위해 lysed에서 배양되었습니다. PCR 및 남부 블롯 분석에 양성클론은 MS2 카세트에 존재하는 네오마이신 유전자를 제거하기 위해 아데노바이러스를 발현하는 CRE-GFP에 감염되었다.네오마이신 저항 유전자의 제거가 확인되면, 클론으로부터 추출된 RNA는 테라-MS2 전사체의 발현을 위해 시험되었다. 공초점 현미경검사법에 의한 살아있는 세포에서 테라-MS2 전사체를 시각화하기 위해, 선택된 클론은 MS2-GFP 융합 단백질을 발현하는 레트로바이러스에 감염되었다. TERRA-MS2 전사체와 텔로미어는 선택된 클론에서 MS2-GFP 융합 단백질과 mCherry 융합 텔로미어 결합 단백질인 TRF2를 공동 발현함으로써 공초점 현미경 검사를 통해 살아있는 세포에서 동시에 시각화되었다.이 절차를 시도할 때 클론의 혼합 된 인구 대신 단일 클론을 선택하기 위해 모든 노력을 기울이는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라 염색체 스프레드에 대한 DNA FISH와 같은 다른 방법은 고정 된 세포에서 MS2 카세트의 통합을 시각화하기 위해 사용될 수 있습니다. 개발 후, 이 기술은 텔로미어 분야의 연구원들이 살아있는 인간 세포에서 단일 텔로미어 테라 분자의 세포 국소화를 탐구하는 길을 열 수 있습니다.바이러스 벡터 및 방사성 물질로 작업하는 것은 매우 불확실 할 수 있다는 것을 잊지 마십시오. 그리고 실험실 코트, 장갑 착용 및 방사선을 최소화하기 위해 플렉시 유리 방패를 사용하는 것과 같은 예방 조치는이 절차를 수행 할 때 항상 취해야합니다.

generation-cancer-cell-clones-to-visualize-telomeric-repeat

Research

연구

JoVE Journal

Genetics

유전학

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