Name: S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 이용한 히 르 츠 스프링 병의 진단 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: 학습하세요 직장 흡입 생검 면역염색법을 이용한 히르쉬스프룽병 진단 방법을. S100, PGP9.5, 칼레티닌 마커로 신경절 세포를 검출하여 높은 민감도와 특이도를 확보하는 이 기술은 소아외과 연구에 필수적입니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

저자는 촬영 실험실을 제공 하는 그의 큰 도움에 대 한 Weibing 당나라 감사 합니다. 이 문서는 공공 복지 연구에 의해 지원 되 고, 특별 기금은 중국의 국민 건강 및 가족 계획에서 받았다 (보조금 201402007).

이 의정서는 과학 기술의 화홍 대학 연합 병원의 연구 윤리 위원회에 의해 승인 되었다.
1. 직장 흡입 생 검
<ol><li>잘 훈련 된 소아 외과 의사 및 보호자 로부터 정보에 근거한 동의를 얻은 후 Rbi2 흡입 직장 생 검 시스템을 사용 하 여 직장 흡입 생 검을 수행 하십시오.<ol>
<li>다음과 같은 징후가 있는 환자에서 rsb를 수행 하십시오. 유아에 있는 검거나을 통과 하는 무 능력 또는 아이 들에 있는 변 비 없이 장기 팽만 감; 배변을 완료 하기 위해 파라핀 오일이 필요한 장기 변 비를 가진 아이 들; 장 폐색을 겪고 있는 아이 들에 있는 불명 한 이유를 가진 장의 방해 또는 장 천공. 참고: RSB에 대 한 금기 사항은 다음과 같습니다. 심한 증상이 있거나, 신체적 상태가 좋지 않거나, RSB에 내성을 갖지 못하는 어린이; 급성 단계 장 염을 가진 아이 들; 완전 한 치유 없이 장 문 합을 겪고 있는 어린이.</li>
	</ol>
</li>
	<li>창 자 준비 36 h로 정상적인 생리 식 염 수 유지 관장을 수행 하 고 점 막의 대변을 느슨하게 하 고 과도 한 부 종을 피하는 절차 전에. 어린이가 심한 변 비를 하는 경우 황산 마그네슘 용액을 첨가 하십시오. 신생아에 게 비타민 K (1mg/kg)를 투여 하십시오. 참고: 수술 전 혈액 검사를 수행 하거나 항생제를 투여 하지 마십시오, 그들은 필요 하지 않습니다.</li>
	<li>환자를 쇄 석 절제술 위치에 둡니다. 파라핀 오일을 사용 하 여 튜브 표면을 코팅 합니다. 뒤 또는 측면 벽을 향한 측면 구멍이 있는 직장에 둔 부 관 4-7 cm을 삽입 하십시오.</li>
	<li>튜브에 부드러운 압력을가 하 여 직장 벽에 대 한 측면 구멍의 적절 한 접착을 촉진 합니다. 트리거를 누르고 즉시 도구를 철회 하십시오.</li>
	<li>생 검 기기를 사용 하 여 3cm의 지름과 치과 라인에서 6cm, 그리고 전후 면의 후방에 있는 4 개의 흡입 바이오를 얻습니다. 바늘을 사용 하 여 염 수로 적신 거 즈에 표본을 놓습니다.</li>
	<li>수술 후 2 시간까지 환자를 관찰 하 여 직장 출혈을 배제 하십시오. RSB 이후 처음 24 시간 내에 더 많은 직장 및 항문 조작을 피하십시오.</li>
</ol>2. RSB 섹션의 준비
<ol><li>직장 흡입 생 검을 6 시간 동안 4% 파라 포름알데히드에 넣고 조직을 고정 시킵니다. 고정 볼륨은 조직 부피 보다 5 배 이상 사용 하십시오.</li>
	<li>11 시간 동안 병리학 적 조직 탈수 기를 사용 하 여 조직을 탈수. 전체 프로그래밍 된 프로세스는 다음 5 단계로 구성 됩니다.<ol>
<li>포 름 알 데히드에 티슈를 넣고 1 시간 동안 고정 합니다.</li>
		<li>4 시간 동안 75% 에탄올에 조직을 놓습니다.</li>
		<li>티슈를 절대 에탄올에 넣습니다 (각각 1 시간, 2 개의 변화).</li>
		<li>티슈를 절대 에탄올 (각각 30 분)에 놓습니다.</li>
		<li>조직을 자일 렌 (각각 1 시간)에 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>파라핀 왁 스 (58-60 ° c)에 조직을 배치 하 고 (각각 1 시간 마다 3 개의 변화). RSB 조직을 파라핀 블록에 포함 시킵니다.</li>
	<li>조직이 완전 한 단면 평면으로 완전히 노출 될 때까지 마이크로 톰을 사용 하 여 파라핀 블록을 자릅니다.</li>
	<li>마이크로 톰을 사용 하 여 블록을 0.4 μ m 섹션으로 자릅니다.</li>
	<li>섹션이 평평한 판으로 퍼질 수 있도록 몇 초간 45-50 ° c의 물에 섹션을 배치 합니다.</li>
	<li>파라핀 섹션을 슬라이드에 옮겨 놓습니다.</li>
	<li>3-5 시간 동안 60 ° c 오븐에 슬라이드를 구워. 항 원의 손실로 이어질 수 있는 너무 오래 베이킹 하지 마십시오.</li>
	<li>Deparaffinized 슬라이드를 자일 렌에 넣습니다 (각각 15 분).</li>
	<li>슬라이드를 절대 에탄올 95%, 80% 및 75% 에탄올에 각각 5 분간 수화물 합니다. 그 다음, 역삼 투 (RO) 정제 수를 다른 5 분 동안 헹 궈 냅니다.</li>
</ol>3. 항 원 검색
<ol><li>4 mL의 EDTA 항 원 회수 완충 액을 RO 정제 수 200 mL와 혼합 하 여 추출 물에 대 한 작업 희석을 수행 합니다. S100 및 PGP 9.5 회수에 대 한 작업 희석을 수행 합니다. 구 연산 나트륨 시트 레이트 완충 액 (100 배) 1 mL을 RO 정제 수 99 mL와 혼합 하 여 추출 합니다. 참고: 칼 레 티 너는 EDTA 회수 용액에 의해 우선적으로 검색 될 수 있다. 그러나 구 연산 나트륨 시트 레이트 완충 제는 S100 및 PGP 9.5의 검색에 더 적합 하다.</li>
	<li>슬라이드를 coplin 염색 항아리에 넣습니다. 항아리를 검색 용액으로 채우고 예 열 된 끓는 수조에 넣습니다. 20 분 동안 끓인 후, 항아리를 수조에서 꺼내 실 온으로 식혀 주세요. 냉각 과정은 약 10 분 정도 걸립니다. 슬라이드를 제거 하 고 인산 완충 식 염 수 (PBS)로 부드럽게 헹 궈 냅니다.</li>
	<li>마커 펜으로 원을 그려 조직 주위에 다음 절차에 대 한 젖은 상자를 준비 합니다.</li>
</ol>4. 차단
<ol><li>RO 정제 수 27ml을 사용 하 여 30% H2o2의 3 ml을 혼합 하 여 작업 희석을 수행 합니다.</li>
	<li>3%의 2 또는 3 방울을 추가하 여 조직에 적가를 차단 합니다. H2O2 솔루션을 즉시 추가 하 여 솔루션이 원에서 오버플로되지 않도록 합니다. 20 분 동안 37 ° c 인큐베이터에서 과산화 산화의 차단을 수행 합니다.</li>
	<li>PBS로 슬라이드를 부드럽게 헹 구 십시오 (세 개의 세척, 각각 5 분).</li>
	<li>5% 소 혈 청 알 부 민으로 37 ° c에서 20 분 동안 슬라이드를 차단 하 고, bsa 분말을 30Ml의 RO 정제 수와 함께 1.5 g을 혼합 하 여 제조 하였다. 참고: 3% H2o로 차단하면 비 특이성 염색의 95%를 방지 할 수 있으며 5% BSA로 차단 하면 비 특이성 염색의 다른 5%를 예방할 수 있습니다. 두 가지 방법을 결합 하 여 신뢰할 수 있는 결과를 얻습니다.</li>
</ol>5. 항 원 항 체 반응
<ol><li>5% BSA를 제거 하 고 1 차 항 체 (cal망막, S100 또는 PGP 9.5)의 50 μ l를 슬라이드에 추가 합니다. 4°c에서 밤새 배양 한다.</li>
	<li>PBS로 슬라이드를 세척 합니다 (각각 3 분).</li>
	<li>중합체 증강 제 (시 약 A; 물질 표참조)의 50 μ l를 첨가 하 고 37 ° c 인큐베이터에서 20 분간 배양 한다. 그런 다음 PBS로 슬라이드를 세척 하십시오 (각각 3 분).</li>
	<li>2 차 항 체 B (염소 반 토끼/쥐 IgG 이차 항 체)의 50 μ l를 첨가 하 여 37 ° c 인큐베이터에서 30 분간 배양 한다. PBS로 섹션을 세척 합니다 (각각 5 분).</li>
</ol>6.3, 3 산물이 및 헤 마 톡 실린 염색
<ol><li>RO 정제 수 850 μ l를 1.5 mL 튜브에 첨가 하 고 염색 시 약 ( 재료 표참조)을 순서 a, B 및 50 C에 추가 하 여 총 1ml의 3 산물이 (DAB) 작업 용액을 얻었다. 침전 물이 있는 경우 여과 후 용액을 사용 하십시오.</li>
	<li>티슈 섹션에 DAB 작업 용액 한 방울을 추가 하 고 얼룩을 3-10 분. 갈색 얼룩이 검출 될 때까지 실 온에서 DAB에서 슬라이드를 배양 합니다. 명시 야 현미경을 사용 하 여 주의 깊게 모니터링 하십시오. DAB 작업 용액을 빛에서 멀리 하십시오. 그런 다음 5 분 동안 PBS로 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	<li>약 1 분 동안 핵을 반대 염색 하는 헤 마 톡 실린을 추가 합니다. 그런 다음, coplin 항아리를 잡고 여분의 염료가 제거 될 때까지 약 30-40 초 동안 물로 씻 습니다. 티슈 부분이 손상 되지 않도록 주의 하십시오.</li>
	<li>25-30 s에 대 한 PBS를 포함 하는 coplin 항아리에 RSB 슬라이드를 담가. 그런 다음 10 초 동안 1% 염 산 에탄올로 분화 하십시오. 1 분 동안 PBS로 슬라이드를 씻으십시오.</li>
	<li>수 화 반대 순서로 슬라이드를 탈수: 75%, 80%, 95% 및 절대 에탄올 (각각 5 분).</li>
	<li>슬라이드를 자일 렌에 노출 시킵니다 (각각 5 분).</li>
	<li>초소형 장착을 사용 하 여 커버 슬립을 장착 합니다. 현미경을 사용 하 여 슬라이드를 시각화 하기 전에 건조 할 수 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Tam, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hirschsprung%27s+disease%3A+A+bridge+for+science+and+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Hirschsprung's disease: A bridge for science and surgery.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (1), 18-22 (2016).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteric+nervous+system+development+and+Hirschsprung%27s+disease%3A+advances+in+genetic+and+stem+cell+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enteric nervous system development and Hirschsprung's disease: advances in genetic and stem cell studies.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 466-479 (2007).</li>
<li>Setiadi, J. A., Dwihantoro, A., Iskandar, K., Heriyanto, D. S., Gunadi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+the+hematoxylin+and+eosin+staining+in+patients+with+suspected+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Surgery%22%5BJournal%5D)">The utility of the hematoxylin and eosin staining in patients with suspected Hirschsprung disease.</a> BMC Surgery. 17 (1), 71(2017).</li>
<li>Agrawal, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+histochemistry+%28AChE%29+-+A+helpful+technique+in+the+diagnosis+and+in+aiding+the+operative+procedures+of+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase histochemistry (AChE) - A helpful technique in the diagnosis and in aiding the operative procedures of Hirschsprung disease.</a> Diagnostic Pathology. 10 (1), 208(2015).</li>
<li>Kacar, A., Arikok, A. T., Azili, M. N., Ekberli Agirbas, G., Tiryaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry+in+Hirschsprung%27s+disease%3A+An+adjunct+to+formalin-based+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Turkish+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry in Hirschsprung's disease: An adjunct to formalin-based diagnosis.</a> The Turkish Journal of Gastroenterology. 23 (3), 226-233 (2012).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Jiang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S100+and+protein+gene+product+9.5+immunostaining+of+rectal+suction+biopsies+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">S100 and protein gene product 9.5 immunostaining of rectal suction biopsies in the diagnosis of Hirschsprung' disease.</a> American Journal of Translational Research. 8 (7), 3159(2016).</li>
<li>Takawira, C., D'Agostini, S., Shenouda, S., Persad, R., Sergi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+procedures+update+on+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+%26+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Laboratory procedures update on Hirschsprung disease.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology & Nutrition. 60 (5), 598(2015).</li>
<li>Meier-Ruge, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylcholinesterase+activity+in+suction+biopsies+of+the+rectum+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Acetylcholinesterase activity in suction biopsies of the rectum in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pediatric Surgery. 7 (1), 11-17 (1972).</li>
<li>Barshack, I., Fridman, E., Goldberg, I., Chowers, Y., Kopolovic, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+calretinin+expression+indicates+aganglionosis+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The loss of calretinin expression indicates aganglionosis in Hirschsprung's disease.</a> Journal of Clinical Pathology. 57 (7), 712-716 (2004).</li>
<li>Kapur, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+We+Stop+Looking%3F+Immunohistochemistry+and+the+Diagnosis+of+Hirschsprung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Can We Stop Looking? Immunohistochemistry and the Diagnosis of Hirschsprung Disease.</a> American Journal of Clinical Pathology. 126 (1), 9-12 (2006).</li>
<li>Guinardsamuel, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calretinin+immunohistochemistry%3A+a+simple+and+efficient+tool+to+diagnose+Hirschsprung+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%22%5BJournal%5D)">Calretinin immunohistochemistry: a simple and efficient tool to diagnose Hirschsprung disease.</a> Modern Pathology. 22 (10), 1379-1384 (2009).</li>
<li>Robey, S. S., Kuhajda, F. P., Yardley, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoperoxidase+stains+of+ganglion+cells+and+abnormal+mucosal+nerve+proliferations+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Pathology%22%5BJournal%5D)">Immunoperoxidase stains of ganglion cells and abnormal mucosal nerve proliferations in Hirschsprung's disease.</a> Human Pathology. 19 (4), 432-437 (1988).</li>
<li>Monforte-Muñoz, H., Gonzalez-Gomez, I., Rowland, J. M., Landing, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+submucosal+nerve+trunk+caliber+in+aganglionosis%3A+a+%26%2334%3Bpositive%26%2334%3B+and+objective+finding+in+suction+biopsies+and+segmental+resections+in+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Increased submucosal nerve trunk caliber in aganglionosis: a &#34;positive&#34; and objective finding in suction biopsies and segmental resections in Hirschsprung's disease.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 122 (8), 721-725 (1998).</li>
<li>Bachmann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+panel+for+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease+using+antibodies+to+MAP2%2C+calretinin%2C+GLUT1+and+S100%5BTitle%5D)+AND+%22Histopathology%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical panel for the diagnosis of Hirschsprung's disease using antibodies to MAP2, calretinin, GLUT1 and S100.</a> Histopathology. 66 (6), 824-835 (2015).</li>
<li>Sams, V. R., Bobrow, L. G., Happerfield, L., Keeling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+PGP9.5+in+the+diagnosis+of+Hirschsprung%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of PGP9.5 in the diagnosis of Hirschsprung's disease.</a> Journal of Pathology. 168 (1), 55(1992).</li>
<li>Huang, Y., Anupama, B., Zheng, S., Xiao, X., Chen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+enteric+nerve+markers+and+nerve+innervation+in+total+colonic+aganglionosis%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">The expression of enteric nerve markers and nerve innervation in total colonic aganglionosis.</a> International Journal of Surgical Pathology. 19 (3), 303(2011).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기서 우리는 HD의 진단을 위해 RBS 부분을 염색 하기 위해 세 가지 다른 면역 조직 화학 항 체를 사용 하는 절차를 설명 했습니다. 우리의 진단 프로토콜의 민감도는 96.49% (95% ci, 0.88)이 고 특이성은 100 95% 0.97 이었다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 RSB 및 항 원 항 체 반응입니다. 생 검의 크기는 염색의 정확도를 결정 합니다. 작은 생 검 정확한 진단을 만들기 위해 충분 한 조직을 제공 하지 않습니다., 큰 생 검 출혈의 높은 위험에 이르게 하는 동안. 경험의 문제로, 직경이 2mm의 생 검은 최적의 크기입니다. 항 원 항 체 반응의 경우 항 체의 적절 한 보존은 무시할 수 없습니다. 단계에 의해 프로토콜 단계를 따라 부드럽게 작업이 필요 합니다. 역삼 투-정제 수는 관찰을 위한 명확한 필드를 산출 하 고 병리학 자가 정확한 진단을 만드는 것을 더 쉽게 만드는 모든 단계에서 추천 됩니다.
<p class="jove_content"...

히 르 츠 스프링의 질병 (HD)은 말단 장관1의 다른 세그먼트에 신경 절 세포의 부족을 특징으로하는 일반적인 선 천 성 장 질환입니다. 인간 장 용 성 신 경계는 배아 신경 세포의 침 윤이 완료 될 때 형성 된다. 과정의 교란이 있고 침공이 완료 되지 못하면 신생아의 말단 장은 aganglionic2가 됩니다. 이 잠재적으로 치명적인 상태는 허쉬 스프링의 질병 이라고. 증식, 운동 성 및 창 자 성장은 성공적인 식민지 화에 대 한 세 가지 주요 구성 요소입니다.
전통적인 헤 마 톡 실린 및에 오신 (H & E) 염색은 제한 된 점 막 생 검으로 서 수술 로부터 얻어진 전체 두께 조직의 H & E 염색으로 서의 만족 스러운 결과를 달성할 수 없다. 추가적으로, 직장 흡입 조직의 아 세 틸 콜린 (AChE) 염색은 91%의 부적절 한 민감도와 동결 된 섹션3의 복잡 한 처리로 인해 이론적으로 어렵습니다. 포 르 말린 고정 및 파라핀이 포함 된 표본에서 염색 될 수 있는 신경 절 세포 들의 몇몇 그밖 면역 조직 화학 마커는 점차적으로 주류 HD 진단이 되 고 있습니다. 칼 레 티 인은 헌팅턴 병에 영향을 받는 세그먼트5의 장 용 성 및 점 막 신경 총에서 발현 되지 않는 비타민 D 의존성 칼슘 결합 단백질 이다. S100 단백질은 신경에 유래 된 세포에서 발현 되며,이는 종종 헌팅턴 병에 영향을 받는 세그먼트6의 점 막 조직에서 신경 비 대를 제시 하는 신경과 세포와 같은 신경을 섬유 이다. 단백질 유전자 생성물 9.5 (PGP 9.5) 신경 섬유와 신경 절 세포를 확실 하 게 얼룩; PGP 9.5 염색은 특히 분리 된 hypoganglionosis의 경우 염색에 대 한 보충으로 작용 합니다. S100 및 PGP 9.5 이중 염색은 거짓 음의 속도를 감소 시키고 민감도를 증가 시킬 수 있다. 전제 조건으로 서, 현재 연구는이 새로운 진단 방법의 적당 한 특이성 그리고 높은 감도를 지키기 위한 것을 작정입니다. 우리의 새로운 프로토콜은 aganglionic 소장과 비 대 신경 섬유의 차별에 대 한 세 가지 마커를 모두 사용. 318 어린이의 예비 연구는 우리의 실험실에 의해 수행 하 고 이전에 상세한 프로토콜 없이 출판7. 자세한 프로토콜 및 주의 사항은이 문서에서 설명 합니다. 출생 또는 그밖 일반적인 질병을 제외 하 고 만성 변 비를 가진 아이 들 때문에 가혹한 배변 문제로 고통 받은 신생아는 직장 흡입 생 검 (RSB)를 위한 잠재적인 후보자입니다. 당사의 새로운 프로토콜은 RSBs 뿐만 아니라 전체 두께의 생 검 또는 수술 시 편을 염색 하 여 최종 진단을 내리는 데 적합 합니다.

<table><tbody><tr><td>calretinin 항체</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MAB-0716 170416405c</td><td>항체: 1차 항체</td></tr><tr><td>S-100 항체</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>Kit-0007</td><td>항체: 1차 항체</td></tr><tr><td>PGP9.5 항체</td><td>Shanghai long island antibody Co. Ltd</td><td>R-0457-03</td><td>항체: 1차 항체</td></tr><tr><td>인핸서 시약</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-A 170416405a</td><td>항체: 2차 항체 A</td></tr><tr><td>염소 항토끼/마우스 IgG 2차 항체</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>KIT-9902-B</td><td>항체: 2차 항체 B</td></tr><tr><td>DAB 염색 키트(시약 A, B 및 C 포함)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>DAB-0031</td><td>염색 키트</td></tr><tr><td>열 인큐베이터</td><td>Shanghai yiheng instrument Co. Ltd</td><td>DHP-9082</td><td>기기</td></tr><tr><td>Rbi2 흡입 직장 생검 시스템</td><td>Aus Systems Pty Ltd, South Australia, Australia</td><td>CP1200 HP1000 SS1000</td><td>기기</td></tr><tr><td>마이크로톰</td><td>Leica Leica</td><td>RM2016</td><td>기기</td></tr><tr><td>구연산 나트륨 구연산염 완충액(100X)</td><td>MXB Biotechnologies</td><td>MVS-0101</td><td>항원 회수 완충액</td></tr><tr><td>병리학적 조직 탈수기</td><td>wuhan junjie electronic Co. Ltd</td><td>JT-12F</td><td>기기</td></tr></tbody></table>

s100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 이용한 히 르 츠 스프링 병의 진단

Diagnosis of Hirschsprung's Disease by Immunostaining Rectal Suction Biopsies for Calretinin, S100 Protein and Protein Gene Product 9.5

히 르 츠 스프링의 질병 (HD)는 유아에서 검거나을 전달 하는 무 능력 또는 어린이 장기 변 비로 임상적으로 나타나는 선 천 성 장 질환. 신경 절 세포 및 신경 비 대의 부재를 결정 하는 직장 흡입 생 검 (RSB)은 현재 헌팅턴 병 진단을 위한 가장 정확한 시험 이다. 전통적인 헤 마 톡 실린-에 오신 염색은 감도와 특이성을 결여 한다. 아 세 틸 콜린에 테라 제 염색은 복잡 한 과정으로 인해 널리 사용 될 수 없다. RSBs에서 실시 한, S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5 (PGP 9.5)에 대 한 면역 염색의 새로운 프로토콜은 96.49%의 높은 민감도와 특이성 비율 (95% 신뢰 구간, 0.88) 및 100% (95% 신뢰)를 나타냅니다. 간격, 0.97) 각각. 헌팅턴 병에 영향을 받는 분절은 종종 비 점 막 조직에서 신경 대의 마커가 되는 칼 레 티 인, S100 단백질 및 PGP 9.5의 발현의 부재로 서 존재 한다. 이 프로토콜은이 새로운 진단 방법의 자세한 운영 프로세스를 설명 합니다.

총, 318 환자는 우리의 연구에 등록 했다. 모든 환자 들은 RSB를 시행 하 고, 조직은 칼 레 티 인, S100 및 PGP 9.5에 대해 염색 되었다. 우리의 새로운 프로토콜을 기반으로 하는 진단은 97 케이스, 213의 경우 hd가 아닌 경우 8 건에서 hd로 의심 되는 hd 였습니다. 132 수술 환자 중, 99 환자는 수술 후 전체 두께 표본의 면역 염색에 의해 헌팅턴 병으로 진단 되었다. S100 및 PGP 9.5 염색은 99 환자의 92% 및 93%가 각각 신경 트렁크를 비 대 했다는 것을 보여주었다. 다른 83의 186 환자는 전체 두께의 생 검을 시행 하 고 신경 절 세포를 보여주었습니다. 총 103 명의 환자가 보수적 치료에 의해 임상적으로 치료 되었고, HD는 배제 되었다. HD가 의심 되는 8 명의 환자 중 3 명의 환자가 짧은 세그먼트 HD로 분류 되 고 다른 5 명의 환자는 비 HD로 분류 되었습니다.
<p class="jove_cont...

이 프로토콜은 cal망막, S100 단백질 및 단백질 유전자 생성물 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 하는 과정을 기술 한다. 히 르 츠 스프링의 질병에 대 한이 새로운 보조 제 진단 방법은 민감성 및 특이성 비율이 바람직하다.

S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 이용한 히 르 츠 스프링 병의 진단

Hirschsprung&#39;s disease (HD) is a congenital intestinal disease that is clinically manifested as an inability to pass meconium in infants or as ...

이 방법은 허쉬스프룽병 진단에 대한 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있다. 프로토콜을 따르는 경우 이 기술의 방법과 기능은 높은 감도 및 동시에 처리하는 특이성 비율을 나타낸다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 기술자 인 Mijing Fang이 될 것입니다.실온에서 6시간 동안 4%의 파라포름알데히드에서 조직의 5배 의 부피로 직장 흡입 생검을 고정하는 것으로 시작한다. 병리학 적 조직 탈수기에서 고정 된 조직을 11 시간 동안 탈수하고 파라핀 블록에 처리 된 직장 흡입 생검 조직을 포함시게하십시오. 조직의 전체 단면 평면이 노출 될 때까지 마이크로 토메의 블록을 다듬습니다.그런 다음 마이크로토메를 사용하여 내장된 조직의 0.4 마이크로미터 섹션을 얻습니다. 섹션이 평평한 계획으로 확산 될 수 있도록 섭씨 45 ~ 50도의 물에 놓습니다. 평평한 부분을 유리 슬라이드에 옮기고 섭씨 60도 오븐에서 3~5시간 동안 굽습니다.탈파보정 된 슬라이드를 자일렌의 두 가지 15 분 변경 사항으로 두 다음 순차적으로 5 분 에탄올 몰입에 수분을 넣습니다. 그런 다음 슬라이드를 역 삼투압 정제 수로 헹구면 추가로 5분간 헹구십시오. 항원 회수의 경우, 슬라이드를 코플린 염색 용액의 코플린 염색 항아리에 넣고 항아리를 끓는 물의 예열된 목욕에 넣습니다.20분 후, 항아리가 실온에서 약 10분 동안 식히고 PBS로 슬라이드를 부드럽게 헹구십시오. 그런 다음 소수성 마커를 사용하여 각 조직 섹션을 둘러싸고 슬라이드를 젖은 상자에 넣습니다. 과산화물을 차단하려면 각 조직에 과산화수소 용액의 2~3방울을 넣고 슬라이드를 섭씨 37도에서 20분 동안 배치합니다.인큐베이션이 끝나면 5분 PBS 세정3개로 슬라이드를 헹구고 섭씨 37도에서 20분 동안 5%의 소 세럼 알부민을 블로킹합니다. 다음으로, 여분의 소 혈청 알부민을 버리고 하룻밤 사이에 관심있는 1 차 항체의 50 마이크로 리터로 세포를 라벨. 다음 날 아침, PBS에서 3분 동안 세 번의 세정으로 슬라이드를 헹구고 각 슬라이드에 50 마이크로리터의 폴리머 인핸서를 추가합니다.섭씨 37도에서 20분 후, PBS에서 슬라이드를 세 번 세척하고 각 조직 섹션에 이차 항체 B의 50 마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 30분 후 PBS에서 5분간 세번 의 세정으로 섹션을 헹구고 각 슬라이드에 갓 준비된 DAB 작업 용액한 한 방울을 추가합니다. 가벼운 현미경 검사법에 의해 적절한 수준의 갈색 염색이 감지되면 PBS에서 슬라이드를 5 분 동안 헹구고 1 분 동안 헤마톡시린 한 방울로 핵을 염색합니다.약 30~40초 동안 물 방울 아래에서 과도한 얼룩을 제거하고 신선한 PBS에서 25~30초 세척합니다. 1%의 염산 에탄올로 10초 간 조직을 구별한 다음 1분 PBS 세척을 합니다. 수분 공급의 역순으로 5분 짜리 몰입으로 슬라이드를 탈수하고 슬라이드를 자일렌의 5분 교체 2개에 노출시합니다.그런 다음 매우 깨끗한 마운팅을 사용하여 커버 슬립을 장착하고 가벼운 현미경에서 시각화하기 전에 슬라이드가 건조할 수 있도록 합니다. 318명의 직장 단면도 생검 환자를 위한 이 대표적인 연구 결과에서는, 99명의 환자는 처음에 직장 단면도 생검에 의해 진단되었습니다. 칼레티닌을 표현하는 많은 신경절 세포는 일반적인 조직 생검에서 관찰되었습니다.그러나, Hirschsprung의 질병 세그먼트에서 조직의 어떤 영역에서 신경절 세포도 검출되지 않았습니다. S-100 및 PGP9.5 면역염색은 일반적으로 내면화된 장에서 관찰되는 몇몇 작은 신경 나뭇가지의 단지 과립적인 얼룩을 가진 병인 조직의 병은 조직에 있는 비대 신경 트렁크를 밝혔습니다. 이 절차를 시도하는 동안, 직장 흡입 생검의 크기와 섹션의 두께와 같은 세부 사항에주의를 기울이는 것을 기억하는 것이 중요합니다.그것은 조각 모음 후, 이 기술은 허쉬 스프룽의 질병의 진단을 지원하기 위해 소아 수술 분야에서 연구를위한 길을 열 것입니다.

diagnosis-hirschsprung-s-disease-immunostaining-rectal-suction

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 마우스 결장 조직의 면역조직화학적 염색을 통한 화학적 유발 대장염의 평가를 보여줍니다. 염색된 조직 절편에서 손상된 조직에 많은 수의 면역 반응 세포가 존재한다는 것은 대장염 중 면역 세포의 침투를 나타냅니다.

결장 조직 절편의 면역조직화학적 분석을 통한 화학적 유발 대장염 평가

이 비디오는 직장 흡입 생검 절편에서 S-100 단백질의 면역조직화학적 염색을 보여줍니다. 항원 채취 절편을 차단하고 1차 항체로 치료한 후 히르슈스프룽병의 지표인 S-100에 대한 2차 항체를 투여합니다. 발색 기질(chromogenic substrate)을 첨가하여 표적 세포를 염색합니다. 샘플은 현미경으로 시각화하기 전에 탈수 및 장착됩니다.

인간 직장 흡입 생검 절편에서 S-100 단백질의 면역조직화학적 염색

출처: Ear, P. H., et. al. 소장 신경내분비종양 스페로이드의 확립 및 특성화. J. Vis. Exp. (2019)이 비디오는 소장 신경내분비 종양 스페로이드의 면역 형광 염색을 보여줍니다. 스페로이드는 고정, 투과화 및 차단된 다음 1차 및 2차 항체와 함께 배양됩니다. 형광 현미경으로 핵을 장착하고 시각화하기 전에 염색하기 위해 염료를 첨가합니다.

면역형광을 이용한 소장 신경내분비종양 스페로이드의 특성화

우리는 다양한 성장 인자의 존재 하에서 장용성 신경 능선 세포 이동 전위의 정확한 정량을 허용 생체 세포 이동 분석을 제시한다.

쥐과 장내 신경 전구 세포에 대한 양이 세포 이동의 분석

장 신경계는 장에서 증식하고 이동하고 군체화하는 신경능선세포에 의해 형성됩니다. 신경능선세포(neural crest cell)는 신경전달물질 표현형에 특이적인 마커를 가진 뉴런으로 분화합니다. 이 프로토콜은 장 신경계 신경전달물질 발현을 시각화하기 위해 쥐 배아 위장관을 해부, 고정 및 면역 염색하는 기술을 설명합니다.

쥐 장내 신경 시스템 개발을 시각화하는 면역 염색

우리는 생쥐를 잠재적인 DNA 손상 물질에 노출시킨 후 체세포 결장 줄기 세포 돌연변이의 재현 가능한 측정에 대해 상당한 개선을 보고했습니다.

대장 줄기 세포 돌연변이의 정량화

이 프로토콜은 낭염의 쥐 모델을 확립하는 방법을 설명합니다. 회장낭 모델은 미세수술 기법을 사용하여 회장낭-항문 문합(IPAA) 수술을 수행하여 만들어졌습니다. 수술 후, 쥐는 4 일 동안 4 % 덱스트란 설페이트 나트륨 (DSS)으로 치료되었습니다.

덱스트란 설페이트 나트륨을 사용한 직장결장절제술 및 회장낭-항문 문합술 후 낭염의 쥐 모델

Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides...

아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택

신생아 설치류 척추 코드의 el​​ectrophysiological 녹음을 측정하는 데 사용되는 세포 흡입 전극의 제조 및 사용의...

척수 전기 생리학 II : 세포 흡입 전극 제작

여기에 직접 마우스 피질의 microregional 조직 hypoxia을 시각화하는 방법을...

내생 NADH 형광의 2 광자 이미징에 의한 마우스 대뇌 피질의 Microregional Hypoxia의 탐지

학습하세요 직장 흡입 생검 면역염색법을 이용한 히르쉬스프룽병 진단 방법을. S100, PGP9.5, 칼레티닌 마커로 신경절 세포를 검출하여 높은 민감도와 특이도를 확보하는 이 기술은 소아외과 연구에 필수적입니다.

S100 단백질 및 단백질 유전자 제품 9.5에 대 한 면역 염색 직장 흡입 생 검을 이용한 히 르 츠 스프링 병의 진단

더 많은 동영상 탐색