Name: 무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 배우세요 다양한 박테리아 종에서 무기 폴리인산을 빠르고 민감하게 정량화하는 방법을. 이 기술은 그람음성균, 그람양성균, 마이코박테리아에 적용 가능하며 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

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이 프로젝트는 알라바 마의 대학 버밍엄과 미생물학의 시동 자금 및 NIH 부여 R35GM124590 (MJG), 및 NIH 부여 R01AI121364 (FW)에 지원 됩니다.

1. 정화 효 모 Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>대장균 단백질 overexpression 스트레인 플라스 미드 pScPPX26 BL21(DE3)31 electroporation32 또는33화학 변환 의해 변환.</li>
	<li>Lysogeny 국물 (파운드) 100 µ g mL-1 암 피 실린 포함 하는 pScPPX2 BL21(DE3)의 단일 식민지와 2 L unbaffled 플라스 크에 포함 된의 1 L를 접종 하 고 하룻밤 없이 떨고, 600에서 흡 광도를 37 ° C에서 품 어 nm (600)의 약 0.3, 한 분 광 광도 계에서 측정 된</li>
	<li>(180 rpm)를 동요 하는 문화를 시작 하 고 어느 시간 동안 셀 A600 0.4-의 성장 37 ° C에서 30 분 동안 품 어 0.5.</li>
	<li>1mm 및는 추가 100 µ g mL-1 암 피 실린의 최종 농도에 이소프로필 β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)를 추가한 다음 180 rpm에서 떨고와 37 ℃에서 4 h에 대 한 품 어. 참고:이 overexpression 프로토콜 녹는 ScPPX의 큰 금액을 생성합니다. 그러나, ScPPX overexpression은 아주 용 서, 그리고 다양 한 다른 일반적인 단백질 overexpression 프로토콜 성공적으로 ScPPX 정화에 사용 되었습니다.</li>
	<li>1 L 원심 분리기 병 셀 전송 및 4 ° c.에 5000 x g에서 20 분 동안 centrifuging 여 수확 상쾌한을 제거 하 고 셀 펠 렛 50 mL 원뿔 튜브에 전송. 참고: 셀 펠 릿에 저장 될 수 무기한-80 ° c.</li>
	<li>얼음에 펠 릿을 녹여 다음 50 mm HEPES 9 mL, 0.5 M NaCl 및 5mm 이미 (pH 8) 약 10 ml 전체 볼륨에 대 한 resuspend.</li>
	<li>(최종 농도) 1 mg mL-1 lysozyme, 2 mM MgCl2및 RNA 및 DNA 저하 endonuclease의 50 단위 mL-1 추가 ( 재료의 표참조)와 얼음에 30 분 동안 품 어. 참고: ScPPX 묶는 핵 산 (데이터 표시 되지 않음), 그래서 nuclease 치료 정화 동안 필수적 이다.</li>
	<li>sonicator는 microtip 사용 ( 재료의 표참조), 50% 전력, 펄스 5에서 얼음에 쥡니다의 2 주기에 의해 세포를 lyse s 주기 사이 2 분 나머지와 함께, 및 5 s. 참고: 적절 한 청력 보호 쥡니다 동안 사용 합니다. 마찬가지로 overexpression의 경우, 세포 세포의 용 해 방법의 다양 한 ScPPX 정화에 대 한 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>20000 x g 4 ° c.에 20 분에 대 한 lysate centrifuging 여 불용 성 파편을 제거 0.8 µ m 기 공 크기 셀 루 로스 아세테이트 주사기 필터를 통해 결과 상쾌한 (약 10ml)를 필터링 합니다.</li>
	<li>킬레이트 화 열 니켈 충전 5 mL에 lysate 로드 ( 재료의 표참조) 연동 펌프 또는 큰 주사기를 사용 하 여.</li>
	<li>50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 5mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.</li>
	<li>50 mL 50 mM HEPES, 0.5 M NaCl, 20mm 이미 (pH 8)의 열을 씻어.</li>
	<li>ScPPX 50 mm HEPES, 0.5 M NaCl, 그리고 0.5 M 이미 (pH 8) 수집 15 1 mL 분수 elute. 테스트 콘텐츠 Bradford 단백질 분석 결과34 와 단백질에 대 한 이러한 차입 분수 ( 재료의 표참조) SDS 페이지 젤35 는 분수 포함 순화 ScPPX 확인을 실행 하 고 (분자량 = 45 kDa).</li>
	<li>순수한 ScPPX를 포함 하는 분수를 풀 고 50 mm HEPES 약 2 mg mL-1 을 0.5 M NaCl 풀링된 단백질의 농도 조정 합니다. 높은 단백질 농도 다음 단계에서 침전 수 있습니다.</li>
	<li>투 석 정화 ScPPX 저장소 버퍼 (20 mM Tris HCl [pH 7.5], 50 m m KCl, 10% [v] 글리세롤)으로 교환 합니다. 12000-14000 다 분자량 컷오프 투 석 막 튜브 ( 재료의 표참조)의 봉인된 길이에 풀링된 ScPPX 분수를 놓고 연속 교 반 4 ° C에서 최소한 4 h. 신선한와 함께이 단계를 반복 하는 동안 저장소 버퍼의 1 L에 일시 중단 3 버퍼 변경의 총 저장소 버퍼입니다.</li>
	<li>원심 분리기 튜브 또는 튜브와 모든 불용 성 집계 제거 하 4 ° C에서 20000 x g에서 20 분 동안 원심 분리기를 순화, dialyzed 단백질을 전송 합니다. 조심 스럽게 깨끗 한 15 mL 원뿔 튜브는 상쾌한 전송.</li>
	<li>1 mg mL-1 저장 버퍼를 순화 ScPPX의 농도 조정, 0.1% (w/v) 추가 protease 무료 소 혈 청 알 부 민 (BSA; 최종 농도), 및 4 ° c.에서 최대 6 개월까지 저장 참고: ScPPX 때 냉동된13에 그것의 활동의 90% 이상 잃는다.</li>
</ol>2. Polyphosphate 추출에 대 한 샘플 채취
<ol><li>폴립 콘텐츠 결정에 대 한 관심의 조건 하에서 박테리아 성장. 이 프로토콜에 대 한 유산 균 reuteri36 37 ° C에서 하룻밤 malic 효소 유도 (메이) 중간37 시스테인 (메이-C) 없이 떨고 없이 성장 합니다.</li>
	<li>1.5 mL microcentrifuge 튜브 총 세포질 단백질의 50-100 µ g를 원심 분리 하 여 충분 한 세포를 수확 (3 단계 참조). 대장균이 0.2-A600 에서 로그 단계 문화 1 mL는 0.4. L. reuteri, 하룻밤 문화의 1 mL입니다. 관심의 다른 종에 대 한 필요에 따라 조정 합니다.</li>
	<li>셀 펠 릿에서는 상쾌한을 완전히 제거 합니다.</li>
	<li>GITC 세포의 용 해 버퍼 (4m guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris HCl, pH 7)의 250 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend와 10 분-80 ° c.에 게 lysates 95 ° C에 외피에 의해 lyse 참고: 수 세포의 용 해 시간, 일치 때문에 고온에서 장시간된 보육 가수분해38에 의해 폴립의 저하에서 될 수 있습니다. Lysates-80 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다 주의: Guanidine isothiocyanate chaotropic 소금 및 장갑 처리와 있어야 유해 폐기물로 폐기 합니다.</li>
</ol>3. 세포 Lysates의 단백질 함량을 측정
<ol><li>BSA 기준 0, 0.1, 0.2, 그리고 GITC 세포의 용 해 버퍼에 BSA의 0.4 mg mL-1 을 준비 합니다. 참고: GITC 색상 개발 Bradford 분석 실험의 영향 때문에 GITC, BSA 기준 수 있도록 중요 하다. BSA 기준-20 ° c.에 무기한으로 저장 될 수 있다</li>
	<li>Aliquot 5 µ L, 잘 혼합 해 동 세포 lysates의와 명확한 96 잘 접시에 우물을 BSA 기준의.</li>
	<li>각 잘을 Bradford 시 약34 의 195 µ L을 추가 하 고 595에서 흡 광도 측정 플레이트 리더에서 nm (595) ( 재료의 표참조).</li>
	<li>수식 y를 사용 하 여 BSA 표준 곡선을 비교 하 여 각 우물에서 단백질의 양을 계산 = mx + b, 어디 y는595x는 BSA의 µ g, m은 표준 곡선의 기울기 이며, b는 표준 곡선의 y 절편. 0.05 각 샘플에 있는 단백질의 총 mg를 결정 하 여 결과 값을 곱하면 됩니다.</li>
</ol>4. 추출 Polyphosphate
<ol><li>각 GITC lysed 샘플 및 혼합 소용돌이를 95% 에탄올의 250 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실리 카 막 스핀 열 및 30에 대 한 원심 분리기에 그 혼합 적용 16,100 x g에서 s.</li>
	<li>흐름을 통해 삭제 후 추가 750 µ L 5 mM Tris HCl의 (pH 7.5), 50 m m NaCl, 5 mM EDTA, 50% 에탄올과 30 대 분리기 16,100 x g에서 s.</li>
	<li>흐름을 통해 및 16,100 x g에서 2 분 동안 원심 분리기를 삭제 합니다.</li>
	<li>깨끗 한 1.5 mL microfuge 관에서 열을 놓고 50 mM Tris HCl (pH 8)의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>5 분 동안 실내 온도에 incubate 다음 8000 x g에서 2 분 동안 centrifuging 여 폴립을 elute. 참고: 원하는 경우는 있다 저장할 수 있습니다-20 ° C에 적어도 1 주 동안.</li>
</ol>5. 소화 Polyphosphate
<ol><li>0, 5, 50, 또는 50 mm Tris HCl (pH 8) 200 µ M 칼륨 인산 염을 포함 하는 표준 준비. 참고: 칼륨 인산 염 표준 실 온에서 무기한으로 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>Aliquot 100 µ L 각 인산 염 표준의 명확한 96 잘 접시의 별도 우물으로 폴립 샘플을 추출.</li>
	<li>(샘플) 당 포함 하는 마스터 믹스 준비: 5 x ScPPX 반응 버퍼 (100 mM Tris HCl, 25 m m MgCl2, 250 m m 염화 아세테이트, pH 7.5)1330 µ L, H2O, 19 µ L 및 순화 된 ScPPX (1 mg mL-1)의 1 µ L.</li>
	<li>96 잘 접시의 각 음을 마스터 믹스의 50 µ L를 추가 합니다. 37 ° c.에 15 분 동안 품 어 참고: 원하는 경우, 소화 용 종 샘플 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 무기한.</li>
</ol>6. 검색 무료 인산24
<ol><li>그래서 4 N H2의 150 mL을 추가 물 200 mL에 안티모니 칼륨 주석산의 0.185 g을 용 해 하 여 탐지 솔루션 기본 준비4, 암모늄 heptamolybdate의 1.49 g 추가. 해산 하 고 그 후 456 mL의 최종 볼륨을가지고 저 어. 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호 솔루션 입자를 제거 하 고 저장을 필터링 합니다.</li>
	<li>1 M 의약품의 재고 솔루션을 준비 합니다. 상점 최대 1 개월 4 ° C에서 빛 으로부터 보호.</li>
	<li>매일 1 M 의약품의 0.88 mL와 탐지 솔루션 베이스의 9.12 mL를 혼합 하 여 탐지 솔루션의 신선한 작업 재고를 준비 합니다. 사용 하기 전에 실내 온도에 서 검색 솔루션을 수 있습니다.</li>
	<li>각 샘플을 표준 96 잘 접시에 탐지 솔루션의 50 µ L을 추가 하 고 색상 개발을 허용 하도록 약 2 분 동안 실 온에서 품 어.</li>
	<li>882에서 흡 광도 측정 플레이트 리더 nm 칼륨 인산 염 표준 곡선을 비교 하 여 각 샘플의 인산 염 농도 계산 하 고. 주의: 탐지 솔루션 독성 염 및 강한 산을 포함 한다. 장갑을 착용 하 고 독성 폐기물 초과 솔루션 취급.</li>
</ol>7. 계산 셀룰러 Polyphosphate 콘텐츠
<ol><li>각 전체 셀 다음 공식에 따라 lysate에 폴립 파생 인산 nanomoles 6.5 단계에서 결정 하는 인산 염 농도 변환: nmol 폴립 = 1.5 x (µ M 인산 / 10) 참고: 6 단계에서 표준 곡선 기반 메서드는 각 100 µ L 폴립 샘플 단계 5.2에서에서 aliquoted (µ M)에서 인산 염의 농도를 결정합니다. 변환 하려면이 농도 nmol의 수, 100 µ L 나눈 10 L에 볼륨을 주고6 농도 (µmol L-1)을 곱한 다음 곱한 1000 (nmol에는 µmol 수). 이 10에 나누어 농도를 감소 시킨다. 총 추출 볼륨 4 단계에서 준비 150 µ L 이므로 1.5 전체 추출 물에 있는 인산 염의 nmol 계산 하 여 결과 값을 번 식 해야 합니다.</li>
	<li>3.4 단계에서 결정 하는 각 샘플에 mg 총 단백질 nmol 폴립 나누어 총 세포질 단백질을 세포 폴립 콘텐츠를 정상화. 폴립 수준의 개별 폴립 파생 무료 인산 염의 농도 관점에서 표현 됩니다. 참고: 경우에 따라 샘플에 폴립 파생 인산의 양을 인산 염 표준 곡선 (단계 6.5)의 선형 범위 밖에 빠지다 수 있습니다. 폴립의 수준이 매우 높은 경우에, 단계 4.6에서에서 초과 폴립 포함 eluate 희석된 1시 10분 또는 1: 100, 필요에 따라 수 하 고 5-7 단계에 설명 된 대로 다시 측정.</li>
</ol>

저자는 공개 없다.

여기에 설명 된 프로토콜 간소화 되 고 완전히 처리 약 1.5 h 복용 24 샘플의 전형적인 세트와 함께 다양 한 박테리아에서 폴립 레벨의 정량화를 가속 한다. 이 샘플의 신속한 심사 및 돌연변이 라이브러리의 분석을 허용 하 고 운동 실험 시간이 지남에 폴립의 축적을 측정을 단순화 합니다. 우리는 프로토콜 대표자 3 다른 문의에 효과적으로 작동 증명: proteobacteria firmicutes, 그리고 actinobacteria, 그들의 탄력에 대 한 악명을 lyse 세포 벽49어렵다.
ScPPX와 소화에 의해 폴립의 탐지 더 구체적이 고 형광 탐지 DAPI와 함께 보다 더 민감한 이며 저렴 하 고 ppk 모델을 사용 하 여 ATP 폴립의 전환 보다 더 기술적으로 간단. ScPPX DNA와 RNA12에 의해 저해입니다, 하지만 우리는 6000 이상 nmol 폴립 mg-1 ...

무기 polyphosphate (폴립)은 인생1,2,3의 모든 도메인에 있는 phosphoanhydride 연결 인산 염 단위의 선형 biopolymer 이다. 다양 한 박테리아에서 폴립 스트레스 반응, 운동 성, biofilm 형성, 세포 주기 제어, 항생제 내성, 및 독성4,,56,7,8이 필수적입니다. ,9,,1011. 박테리아 물질 대사 폴립의 연구는 따라서 질병의 원인이 다양 한 환경에서 번 창 하는 박테리아의 기능에 대 한 근본적인 통찰력을 얻을 수가 있다. 그러나 많은 경우에,, 세균성 세포 측정 폴립에 대 한 사용할 수 있는 방법 이러한 연구에 제한 요인이 있습니다.
현재 생물학 물자에서 폴립 수준을 측정 하는 데 사용 하는 여러 방법이 있다. 이러한 메서드는 일반적으로 두 가지 단계를 포함: 폴립을 추출 하 고는 폴립 측정 그 추출 물에 존재. Bru와 동료12, DNA 및 RNA 페 놀을 사용 하 여 추출 폴립 효 모 Saccharomyces cerevisiae 에 대 한 개발 현재 골드 표준 방법 및 클로 프롬, 에탄올 강수량, 치료 뒤 deoxyribonuclease (DNase) 및 ribonuclease (RNase), 그리고는 S. cerevisiae 폴립 저하 효소 exopolyphosphatase (ScPPX)13 를 사용 하 여 계량 다음은 자유로운 인산 염, 결과 순화 된 폴립의 소화는 말라 카이트 그린 기반 색도계 분석 결과입니다. 이 절차는 매우 양적 하지만 단일 실험에서 처리할 수 있는 세균성 샘플에 대 한 최적화 되지 않은 샘플의 수를 제한 하는 노동 집약. 다른 다양 한 세포와 실리 카 비즈 (이 하 "glassmilk") 또는 실리 카 막 열6,14,15,,1617를 사용 하 여 조직에서에서 폴립을 추출 보고 있다 18. 이 방법을 할 효율적으로 추출 하지 짧은 체인 폴립 (60 인산 염 단위)12,,1415, 비록이 일반적으로 생각 되 고 주로 합성 박테리아에 대 한 더 적은 관심 긴 체인 용 종3. 강한 산19,20 를 사용 하 여 폴립 추출의 이전 방법 더 이상 널리 사용 폴립12산 성 조건 안정 되어 있기 때문.
또한 측정 폴립에 대 한 보고 방법의 다양 한이 있다. 가장 일반적인 가운데 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), 더 일반적으로 DNA를 얼룩 사용 형광 성 염료 이다. DAPI 폴립 단지 DAPI DNA 단지21,22, 보다 다른 형광 여기 및 방출 맥시 마 하지만 상당한 간섭 RNA, 뉴클레오티드, 이노 시 톨 등 다른 세포질 분 대에서 인산 염12,15,,1623, 특이성 및이 메서드를 사용 하 여 만든 폴립 측정의 감도 감소. 폴립과 아데노신 diphosphate (ADP)를 아데노신 3 인산 염 (ATP) 사용 하 여 순화 된 대장균 으로 변환할 수 또는 폴립 키 (ppk 모델)와 luciferase14,17 사용 하 여 계량 결과 ATP ,18. 이 매우 적은 양의 폴립, 탐지를 허용 하지만 두 효소 반응 단계와 소와 매우 순수한 ADP, 비싼 시 약입니다. ScPPX로 특별히 다이제스트 폴립 무료 인산 염6,12,13,24, 간단 방법, 하지만 ScPPX을 사용 하 여 감지 될 수 있는 DNA와 RNA12, 저해 포함 하는 폴립의 필요로 DNase 및 RNase 처리를 추출합니다. Ppk 모델도 ScPPX 상업적으로 사용할 수 있으며 ppk 권총 정화는 상대적으로 복잡 한25,26.
있으 나 세포 lysates 또는 추출에 폴립 DAPI 부정적인 얼룩27,,2829,30, 체인 길이의 평가 허용지 않습니다 하지만 하는 방법에 의해 polyacrylamide 젤에도 구상 될 수 있다 낮은 처리량 그리고 저조한 양적.
우리는 이제 다양 한 세균성 종의 수준 폴립의 급속 한 정량화를 허용 하는 빠르고, 저렴 한, 중간 처리량 폴립 분석 결과 보고 합니다. 이 메서드는 셀룰러 가수분해, 여러 샘플의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 다음 비활성화를 4m guanidine isothiocyanate (GITC)14 에서 95 ° C에서 세균성 세포를 lysing 여 시작 합니다. 결과 폴립 포함 된 추출 다음 DNase 및 RNase 처리를 위한 필요를 제거 하는 ScPPX의 큰 과잉을 가진 소화 된다. 우리는 ScPPX 밀리 그램 양의 간단 니켈 친 화력 정화에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 마지막으로, 무료 인산 폴립 파생 된 간단 하 고, 민감한, ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과24 정량 이며 총 세포질 단백질에 정규화. 이 메서드 세균성 세포에 폴립의 측정을 간소화 하 고 우리 그람 음성 세균, 그람 양성 세균 및 mycobacteria의 대표 종으로 그것의 사용을 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>E. coli BL21(DE3)</td><td>Millipore Sigma</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>학술 및 기타 비영리 기관에서 사용 가능</td></tr><tr><td>LB broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli 성장 배지</td></tr><tr><td>암피실린</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>골드 생명공학</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>골드 생명공학</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨(KOH)</td><td>HEPES 완충 용액의 pH 조정을 위한</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P250500</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>Fisher Scientific</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘(MgCl2)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Universal Nuclease</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI88700</td><td>Benzonase(Sigma-Aldrich cat. # E1014)는 허용 가능한 대체품입니다</td></tr>. 모델 <tr><td>120 음파 분석기</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-120</td><td>다른 세포 용해 방법(예: French Press)도 효과적일 수 있으며</td></tr>, <tr><td>5mL HiTrap 킬레이트 HP 컬럼</td><td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>모든 니켈 친화성 크로마토그래피 컬럼 또는 수지로 치환될 수 있으며,</td></tr><tr>HiTrap 컬럼 <td></td> 0.8 &micro<td>를 충전하기 위해</td><td>니켈(II) 황산염 육수화물</td><td>Fisher Scientific</td> AC415611000</tr>로 대체할 수 있습니다<tr><td>. m 기공 크기 셀룰로오스 아세테이트 주사기 필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 시약</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris 버퍼</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>스펙트럼&nbsp; Spectra/Por 4 RC 투석막 튜빙 12,000 - 14,000 Dalton MWCO</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667B</td><td>MWCO < 30,000 Da의 기타 투석막도 작동해야 합니다</td></tr><tr><td>.</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td>는 <td>트리스 완충 용액의 pH 조절을 위해</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS 매체 혼합물</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td>E. 대장균 성장 매체</td></tr><tr><td>포도당</td><td>Fisher Scientific</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>일염기성 인산칼륨(KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>이염기성 인산칼륨(K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>탈수 효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-50</td><td></td></tr><tr><td>황산망간 일수화물</td><td>Fisher Scientific</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>구아니딘 이소티오시아네이</td>트 <td>Fisher Scientific</td><td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(프로테아제 없음)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>투명 평면 바닥 96웰 플레이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0812-100EA</td><td>투명 96웰 플레이트가 작동합니다</td></tr><tr><td>Tecan M1000 Infinite 플레이트 리더</td><td>Tecan, Inc.</td><td>해당 사항 없음</td><td>595 및 882 nm에서 흡광도를 측정할 수 있는 모든 플레이트 리더는</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>실리카 멤브레인 스핀 컬럼</td><td>Epoch Life Science</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로퓨지 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄</td><td>Fisher Scientific</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>안티몬 주석산 칼</td>륨 <td>Fisher Scientific</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N 황산 (H2SO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>암모늄 헵타몰리브덴산</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>아스코르브산</td><td>Fisher 과학</td><td>AC401471000</td><td></td></tr></tbody></table>

무기 polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

무기 polyphosphate (폴립) 셀 생활의 모든 도메인에 있는 생물학 고분자 이며 독성 및 많은 박테리아에 스트레스 반응. 많은 노동 집약 하거나 구분 하지 않습니다, 그들의 유용성을 제한 하는 생물 자료에 측량 용 종에 대 한 방법의 다양 한이 있다. 선물이 여기 박테리아, 부 량 폴립에 대 한 효율적인된 방안을 여러 샘플, 폴립 전용 exopolyphosphatase ScPPX와 폴립의 소화 및 감지의 신속한 처리를 위해 최적화 된 실리 카 막 열 추출 사용 하는 결과 민감한 ascorbic 산 기반 색도계 분석 결과 함께 무료 인산 염. 이 절차 간단, 저렴, 이며 다양 한 세균성 종에 신뢰할 수 있는 폴립 정량화를 수 있습니다. 그램 음성 박테리아 (대장균), 그람 양성 젖 산 박테리아 (유산 균 reuteri), 및 mycobacterial 종 (진 균 smegmatis)에서 대표적인 폴립 정량화 선물이. 우리는 또한 어떤은 현재 상업적으로 사용할 수 밀리 그램 양의 ScPPX, 니켈 친 화력 정화에 대 한 간단한 프로토콜 포함.

프로토콜의 주요 단계는 diagrammed 그림 1에서 단순화 된 형태에서.
그램 음성 박테리아, 야생-타입 E. 콜라 이 프로토콜의 사용을 MG165539 파운드에서 37 ° C (200 rpm) 떨고 풍부한 매체에 중간 로그 단계로 성장, 다음 씻어 서 되었고에 추가 2 h에 대 한 인 큐베이 팅 morpholinopropanesulfonate 버퍼 (MOPS) 최소한의 중간40 4 g L-1 포도 당 및 0.1 m m K2HPO4, 폴립14,29</sup...

그람 양성, 그람 음성, mycobacterial 종 등 다양 한 박테리아에 무기 polyphosphate의 급속 한 정량화를 위한 간단한 방법을 설명 합니다.

무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

무기 성포염은 세균성 스트레스 반응의 핵심 요소입니다. 그러나 박테리아에서 폴리P를 추출하고 측정하는 오래된 방법은 복잡하고 노동 집약적입니다. 이 기술의 주요 장점은 다양한 다른 세균성 종에서 폴리P 수준의 빠르고 민감하며 저렴한 정량화를 허용한다는 것입니다.절차는 아리아 Pokhrel에 의해 입증될 것입니다, 내 실험실에서 학부 학생. 시작하려면, 동요없이 하룻밤 37섭씨에서 cystine없이 영양 효소 유도 매체에서 유산 균 재자궁 을 성장. 원심분리기 1밀리리터는 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 이 야간 배양의 밀리리터로, 세포 단백질의 총 50~100마이크로그램을 산출하기에 충분한 세포를 수확합니다.셀 펠릿에서 상체를 완전히 제거한 다음 250개의 마이크로리터 GITC 리시스 버퍼를 추가하고 소용돌이에 의해 다시 중단합니다. 세포를 lyse 하는 10 분 동안 섭씨 95도에서 배양. lysate를 섭씨 80도에 보관하십시오.먼저 GITC 리시스 버퍼에서 BSA 밀리리터당 0, 1, 2 및 4 밀리그램을 포함하는 BSA 표준을 준비합니다. Aliquot 5 마이크로 리터의 해동, 잘 혼합 된 세포 lysates 및 BSA 표준의 5 마이크로 리터 는 명확한 96 웰 플레이트에 우물을 분리합니다. 각 웰에 브래드포드 시약 195 마이크로리터를 추가하고 플레이트 리더의 595 나노미터에서 흡광도를 측정합니다.원고에 설명된 바와 같이 BSA 표준 곡선과 비교하여 각 우물의 단백질 양을 계산합니다. 각 샘플에서 단백질의 총 양을 결정하기 위해 결과 값을 05로 곱합니다. 폴리인산염 추출을 시작하려면 각 GITC 용해 시료에 95%에탄올의 250마이크로리터를 추가하고 소용돌이를 혼합합니다.파이펫이 혼합물은 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 배치된 실리카 멤브레인 스핀 컬럼에 배치됩니다. 원심분리기 는 16, 30초 동안 100g. 흐름을 버리고 삼염산염, 염화나트륨, EDTA 및 에탄올 혼합물의 750 마이크로리터를 추가합니다.원심분리기는 16, 100 gs에서 30초 동안. 흐름을 버리고 스핀 컬럼을 16, 100 gs에서 2분 동안 원심분리합니다. 깨끗한 1.5 밀리리터 마이크로퍼지 튜브에 컬럼을 놓습니다.50 밀리머 pH 8 개의 트리스 염산염의 150 마이크로 리터를 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. Elute 폴리P는 2 분 동안 8, 000g에서 원심 분리에 의해. 먼저 50 밀리머 pH 8 개의 트리스 염산염에서 0, 5, 50 또는 200 마이크로 몰러 칼륨 칼륨을 포함하는 표준을 준비하여 시작합니다.각 인산염 표준의 100 마이크로리터와 추출된 폴리P 샘플 100마이크로리터를 투명한 96웰 플레이트의 별도 우물로 추출했습니다. 샘플당 5X ScPPX 반응 버퍼 30마이크로리터, 19마이크로리터 물, 정제된 ScPPX의 마이크로리터 1개를 함유한 마스터 믹스를 준비합니다.그리고 섭씨 37도에서 15 분 동안 배양하십시오. 검출 당일, 검출 용액 의 9.12 밀리리터에 1개의 어금니 아스코르브산 88밀리리터를 혼합하여 검출 용액의 신선한 작업 재고를 준비하고 사용하기 전에 실온에 도달할 수 있도록 합니다. 96 웰 플레이트의 각 샘플 및 표준에 50 마이크로리터의 검출 솔루션을 추가합니다.색상 개발을 허용하려면 실온에서 플레이트를 약 2분 동안 배양합니다. 플레이트 판독기를 사용하여 882 나노미터에서 흡광도를 측정하고 칼륨 인산염 표준 곡선에 비해 각 시료의 인산염 농도를 계산합니다. 그런 다음 각 세포에서 폴리P 유래 인산염의 나노몰로 인산염 농도를 변환하고 원고에 설명된 바와 같이 세포 폴리P 함량을 총 세포 단백질로 정상화한다.LB에서 자란 그람 음성 박테리아인 야생형 대장균은 폴리P를 생산하지 않았습니다. 그러나 MOPS에서 재배 될 때, 총 단백질의 밀리그램 당 약 192 나노 몰 폴리P를 생산. 폴리P 키나아제가 부족한 대장균 델타 ppk 돌연변이는 어느 매체에서도 폴리P를 생산하지 않았다.외후포인파아제가 부족한 델타 ppx 돌연변이체는 야생형과 거의 동일한 양의 폴리P를 생산했습니다. 그리고 인산염 수송에 결함이 있는 델타 포B 돌연변이체는 야생형보다 훨씬 적은 폴리P를 생산했다. 야생형 L.reuteri는 MEIC 배지에서 하룻밤 사이에 재배된 그램 양성 박테리아로, 총 단백질의 밀리그램당 약 51나노몰 폴리P를 축적하였다.폴리P 키나아제가 부족한 L.reuteri ppk1 null 돌연변이에는 이 금액의 절반 미만이 포함되어 있습니다. ppk1 null 돌연변이체에서 폴리P의 이러한 존재는 아마도 두 번째 폴리P 키나아제를 포함하는 L.reuteri 때문일 것이다. 진균 세균염 균주 SMR 5, 총 단백질의 밀리그램 당 약 141 나노몰폴리P 축적에 에탄올의 부재에 하트만드 본트 배지에서 재배.에탄올 치료는 세 배 증가를 초래했다. 이 절차에 따라 아크릴아미드 젤 전기포광은 폴리P 사슬 길이의 차이를 평가하기 위해 수행될 수 있다. 이 절차를 시도하는 동안 일반적인 실수를 피하십시오.마이크로티터 플레이트 우물에서 거품이 발생하지 않도록 하고 컬럼에서 미세후포 튜브로 전환할 때 샘플을 적절한 튜브로 옮기는 것을 피하십시오. GITC와 강한 산으로 작업하는 것은 위험할 수 있으며, 적절한 보호 장비는 항상 이 절차를 수행하는 동안 착용해야 한다는 것을 잊지 마십시오.

assaying-for-inorganic-polyphosphate-in-bacteria

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 프로토콜은 측정하고 분류 P monoesters, P의 diesters 및 무기 P. 같은 토양 인을 최대 96 샘플에 대한 표준 실험실에서 한 번에 측정할 수에 microplate 리더를 활용하여 효소 가수 분해의 높은 처리량 방법을 설명합니다.

환경 샘플에서 유기 P의 높은 처리량 측정 및 분류

이노시톨 pyrophosphates 인간 pathologies에 중요한 역할 등 암, 당뇨병과 비만을 재생할 수 있지만, 행동의 정확한 메커니즘은 분쟁의 문제입니다. 상용 이노시톨 pyrophosphates의 부족 상세한 연구는 렌더링 문제. 여기 이노시톨 pyrophosphates의 밀리그램을 생산하고 격리하는 간단한 프로토콜을 설명합니다.

품질 이노시톨 Pyrophosphates의 준비

출처: Pokhrel, A., et al. 박테리아의 무기 폴리인산염 분석. J. Vis. 경험. (2019).이 비디오는 박테리아 샘플에서 무기 폴리인산염(polyP)을 측정하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 절차에는 폴리P를 유리 인산염으로 효소적으로 전환한 다음 몰리브덴산염 및 아스코르브산과 반응하여 파란색 복합체를 생성하는 과정이 포함됩니다. 이 복합체의 흡광도를 알려진 인산염 농도의 표준 곡선과 비교함으로써 박테리아 샘플의 polyP 함량을 정확하게 정량화할 수 있습니다.

박테리아에서 무기 폴리인산염의 정량화를 위한 분석

출처: Vidilaseris, K., et al. Thermotoga maritima 막 결합 피로포스파타제 억제제에 대한 스크리닝. J. Vis. 경험. (2019년)이 비디오는 오르토인산염 방출을 정량화하여 박테리아 막 결합 피로포스파타제(mPPase)의 억제제를 스크리닝하기 위한 비색 분석을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 잠재적인 항균 약물 표적인 Thermotoga maritima에서 mPPase를 억제하는 화합물을 식별할 수 있습니다.

비색 분석을 이용한 박테리아 막 결합 피로포스파타제의 스크리닝 억제제 

철 분 포함 된 필터 재료에 phosphonates의 흡착을 조사 하는 절차를 소개 하는이 종이 작은 노력과 높은 신뢰성과 특히 세분화 된 제 2 철 수산화. 버퍼 솔루션에는 phosphonate는 회전자를 사용 하 여 흡착 제에 접촉으로 가져 이며 다음 소형된 인 결정 방법을 통해 분석.

소형 인 결정 방법을 사용 하 여 세분화 된 제 2 철 수산화에 Phosphonates의 흡착을 결정 하기 위한 최적화 된 절차

여기, 히스티딘 태그 pyrophosphokinase 효소 정화 및 radiolabelled 기질 그리고 효소 활동 체 외에 대 한 분석 결과를 제품의 얇은 층 크로마토그래피를 이용 하는 방법을 설명 합니다. 효소 활동 분석 결과 모든 키, 뉴클레오티드 있고, 또는 인광 체 전송 반응의 메커니즘 포함 뉴클레오티드 3 인산 염 가수분해에 광범위 하 게 적용 됩니다.

정화 및 체 외에서 활동 분석 결과 (p) ppGpp Clostridium 남과 어울리지 않 는에서 합성에 대 한

이 원고에서 우리 96-잘 조직 배양 플레이트에서 미 균 biofilm 문화에서 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 계량 하는 높은 처리량 방법...

색도계 분석의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동 S. 구 균 Biofilm에서

마이크로티터 접시에 방사성 표지된 세균 배양물의 성장은 (p)ppGpp를 포함하여 뉴클레오티드 풀 풍부의 다중 기술적 및 생물학적 복제 측정을 허용하는 높은 처리량 샘플링을 용이하게 합니다. 생리 적 스트레스의 소스에 의해 자극 성장 전환의 효과 뿐만 아니라 스트레스에서 복구 모니터링할 수 있습니다.

대장균 (p)ppGpp의 여러 생체 내 측정을위한 마이크로 티터 접시 방사성 라벨링 사용 및 얇은 층 크로마토그래피

여기에서 우리는 96 웰 플레이트 포맷에서 몰리브덴 청색 반응에 기초한 막 결합 된 열광파타제 (Thermotoga maritima에서)억제제에 대한 스크리닝 방법을 제시한다.

써모토가 마리티마 멤브레인 경계 파이로포스파타제 억제제 스크리닝

이 프로토콜은 작은 DNA와 RNA 기판에 폴리 뉴클레오티드 키나아제 (PNKs)의 키나아제 활성을 측정하는 비 방사성 분석기를 설명합니다.

작은 뉴클레오티드 기판의 폴리뉴클레오티드 인산화를 측정하는 비방사성 분석

포유류 세포 추출물로부터 이노시톨 피로포스페이트의 절대 정량을 위한 모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법을 위한 절차가 설명된다.

모세관 전기영동 전기분무 이온화 질량분석법에 의한 이노시톨 피로인산염의 절대 정량

배우세요 다양한 박테리아 종에서 무기 폴리인산을 빠르고 민감하게 정량화하는 방법을. 이 기술은 그람음성균, 그람양성균, 마이코박테리아에 적용 가능하며 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

무기 Polyphosphate 박테리아에 대 한 시 금

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