Name: 구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 학습하세요 원자 힘 현미경을 이용해 뉴클레오솜의 구조와 역학을 단일 분자 수준에서 정량 분석하는 방법을. CENP-A 중심체 뉴클레오솜의 독특한 특성을 시각화하여 염색질 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

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기여 저자: YLL MSD 디자인 프로젝트; MSD nucleosomes를 조립. MSD와 ZS AFM 실험 및 데이터 분석을 수행합니다. 모든 저자 쓴와 원고를 편집.

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

위에서 설명한 프로토콜은 오히려 간단 하 고 재현성 높은 결과 제공 하는 몇 가지 중요 한 문제를 강조 수 있습니다. 기능성된 APS-운 모는 안정적이 고 재현 가능한 결과 얻기를 위한 주요 기판. APS-운 모의 높은 안정성 이미징 기판 사용 준비 중인 후 2 주 이상 사용할 수 있는 사전에 준비를 한이 기판의 중요 한 기능 중 하나입니다. 59 , 그러나 61 , 표면 수 있습니다 손상 될 접착제의 증기에 의해 운 모는 금속 퍽에 장착에 사용 됩니다. 따라서, 운 모 프로토콜 (2 절)에 설명 된 대로 장착에 대 한 두 배 지팡이 테이프를 사용 하는 것이 좋습니다. 경우에 접착제의 사용이 필요한 경우 예를 들어 이미징 액체, 금속 디스크에 돌비 늘의 설치를 위한 접착제를 사용 하는 일부 사용자 섹션 6.1.3 HS AFM 이미징 위한 샘플 준비에에서 설명 된에서 수정 다음 절차는 권장 . 운 모는 금속 디스크 또는 다른 ...

진 핵 세포에서 DNA는 매우 압축 하 고 염색체에 조직. 1 염색체 내 DNA 조직의 첫 번째 수준은 147에서 nucleosomes의 어셈블리는 DNA의 혈압은 단단히 히스톤 octamer 코어 주위에 싸여. 2 , 3 높은 소형 염색체 단위 형성 될 때까지 다음 구성 하는 chromatin 배열을 형성 하는 긴 DNA 분자에 nucleosome 입자 조립. 4 chromatin의 해체를 DNA 유전자 전사 및 게놈 복제와 같은 중요 한 세포질 과정에 필요한 제안 하는 chromatin는 매우 동적 시스템을 무료로 액세스를 제공 합니다. 5 , 6 , 7 elucidating 어디 실수 세포 죽음 또는 암과 같은 질병의 발전으로 이어질 수 있습니다 분자 수준에 유전 과정에 대 한 중요성은 다양 한 염색 질 수준에서 DNA의 동적 속성을 이해. 8 매우 중요 chromatin 속성은 nucleosomes의 역학. 9 , 10 , 11 , 12 이 입자의 높은 안정성 구조적 특성에 대 한 결정학 기술을 허용 했다. 2 어떤 이러한 연구 부족은 DNA의 메커니즘 등 nucleosomes의 동적 내용을 풀기 히스톤 코어;에서 동적 경로 녹음 방송 및 복제 프로세스에 대 한 필요 합니다. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 또한, 개장 요소 라고 하는 특별 한 단백질을 보여왔다 nucleosomal 입자17;의 분해를 촉진 그러나, nucleosomes의 기본 역학 전체 분해 과정에 기여 하는이 과정에서 중요 한 요소 이다. 14 , 16 , 18 , 19
단일 분자 형광19,,2021, 광학 트래핑 (핀셋)13,18,,2223 AFM 등 단일-분자 기법 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 nucleosomes의 역학을 이해 하는 수단이 되었습니다. 이러한 방법 중에서 AFM는 몇 가지 독특하고 매력적인 기능에서 혜택. AFM는 시각화 하 고 개별 nucleosomes 뿐만 아니라 더 긴 배열27특징 하나를 수 있습니다. AFM 이미지에서 nucleosome 구조 DNA는 히스톤 코어 주위에 싸여의 길이 등의 중요 한 특성 측정된 10,14,,2628; 수 있습니다. 매개 변수는 nucleosome unwrapping 역학의 특성화 중심입니다. AFM 과거 연구 매우 동적 시스템 및 DNA 수 히스톤 코어14에서 자발적으로 풀 다 nucleosomes를 계시 했다. Nucleosomes에서 DNA의 자발적인 풀기 AFM는 이미징 수성 솔루션 14,,2629끝나면 시간 경과 모드로 작동 하 여 직접 시각화 했다.
저속 고속 AFM (HS-AFM) 계측의 출현 밀리초 시간 단위 14,,1524nucleosome unwrapping 프로세스를 시각화 하 가능 하 게. Centromere 특정 nucleosomes의 최근 HS AFM 16,30 연구 정식 형식에 비해 nucleosomes의 여러 가지 새로운 기능을 공개 했다. Centromere nucleosomes는 centromere, 염색체 분리31에 대 한 비판적으로 중요 한 염색체의 작은 부분을의 구성 한다. 대량 chromatin에서 정식 nucleosomes 달리 centromere nucleosomes의 히스톤 코어 히스톤 H332,33대신 CENP A 히스톤을 포함합니다. 이 히스톤 대체 centromere nucleosomes 줄 바꿈 DNA는 ~ 120 ~ 147 대신 bp bp 정식 nucleosomes;에 대 한 centromere 정식 nucleosomes의 명료한 형태학으로 이어질 수 있는 차이34, 그 centromere chromatin 겪 습 하나 부피에 비해 높은 역학 제안 배열입니다. Centromere nucleosomes HS AFM16,30 연구에 의해 표시 하는 새로운 역학 예증 기회가 단일 분자 기술에 의해 제공의 구조와 동적 속성을 직접 시각화 nucleosomes입니다. 이러한 기능의 예로 간단히 논의 하 합니다 종이의 끝에 그림. 이 진행 nucleosomes의 AFM 이미지 뿐만 아니라 기존 방법의 수정에 대 한 새로운 프로토콜의 개발으로 인해 되었다. 여기에 설명 된 프로토콜의 목표 chromatin 조사에서 이러한 기법을 활용 하고자 하는 사람에 게 액세스할 수 있는 단일 분자 AFM nucleosome 연구에 이러한 흥미로운 진보를 만드는 것입니다. 많은 설명 넘어 nucleosomes의 연구 문제에 적용 되며 다른 단백질 및 DNA 시스템 관심의 수사를 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 응용 프로그램의 몇 가지 예는 간행물35,36,,3738,39,40,41에서 찾을 수 있습니다. 42,43,44,45,,4647,48,49 과 AFM 연구의 전망 다양 한 바이오 시스템 주어진29,50,51,,5354리뷰.

<table><tbody><tr><td>Plasmid pGEM3Z-601</td><td>Addgene, Cambridge, MA</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primers</td><td>IDT, Coralville, IA</td><td>Custom Order</td><td>(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq</td></tr> <tr><td>polymerase</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>EP0701</td><td>카탈로그 번호 200 units</td></tr><tr><td>PCR purification kit</td><td>Qiagen, Hilden, Germany&nbsp;</td><td>28104</td><td>50 단위</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>10708976001</td><td>카탈로그 번호 250 g</td></tr><tr><td></td><td>EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>15576028</td><td>카탈로그 번호 500 g</td></tr><tr><td>(CENP-A/H4)2, 재조합 human</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0010</td><td>카탈로그 번호 50 ug</td></tr><tr><td>H2A/H2B, 재조합 human</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>15-0311</td><td>카탈로그 번호 50 ug</td></tr><tr><td>H3 Octamer, recombinant human</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0001</td><td>카탈로그 번호 50 ug</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI 투석 장치 키트, 10K MWCO, 0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>69574</td><td>카탈로그 번호 10 장치</td></tr><tr><td>카탈로그 번호 Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9888-500G</td><td>카탈로그 번호 500 mg</td></tr><tr><td>아미콘 울트라-0.5&nbsp; mL 원심 필터&nbsp;</td><td>Millipore-sigma, Burlington, MO</td><td>UFC501008</td><td>8개 장치의 카탈로그 번호</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>258148-25ML</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T0377-25G</td><td>카탈로그 번호 25 g</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>11667289001</td><td>카탈로그 번호 1 kg</td></tr><tr><td>과황산 암모늄 (AmmPS)&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610700</td><td>카탈로그 번호 10 g</td></tr><tr><td>30% 아크릴아미드/비스 용액, 37.5:1</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610158</td><td>카탈로그 번호 500 mL</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610800</td> 카탈로그 <td>번호 5 mL</td></tr><tr><td>4x Laemmli 단백질 시료 버퍼 SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610747</td><td>카탈로그 번호 10 mL</td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M6250-10ML</td><td>카탈로그 번호 10</td></tr><tr><td>mL ageRuler Prestained Protein Ladder&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>26616</td><td>카탈로그 번호 500 uL</td></tr><tr><td>Bio-Safe&trade; Coomassie</td><td>Stain Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610786</td><td>1 L</td></tr><tr><td>부직포 클린룸 와이프의 카탈로그 번호: TX604 TechniCloth&nbsp;</td><td>TexWipe, Kernersvile, NC</td><td>TX604</td><td></td></tr><tr><td>Muscovite Block Mica</td><td>AshevilleMica, Newport News, VA</td><td>Grade-1</td><td></td></tr><tr><td>Aminopropyl silatrane (APS)</td><td>22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>H4034-25G</td><td>카탈로그 번호 25g</td></tr><tr><td>스카치 테이프</td><td>Scotch-3M, St. Paul, MN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TESPA-V2 afm 프로브(정적 이미징용)</td><td>Bruker AFM 프로브, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSNL-10 afm 프로브(표준 타임랩스 이미지용)</td><td>Bruker AFM 프로브, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td><td>Toagosei America, West Jefferson, OH</td><td>AA480</td><td>카탈로그 번호 2g 튜브</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M8266-100G</td><td>카탈로그 번호 100g</td></tr><tr><td>Millex-GP 필터, 0.22&nbsp; &마이크로; m</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>SLGP05010</td><td>10개 장치에 대한 카탈로그 번호</td></tr><tr><td>BL-AC10DS-A2 afm 프로브 (HS-AFM용)</td><td>Olympus, Japan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound FG-3020C-20&nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화합물 FS-1010S135-0.5&nbsp;</td><td>FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiMode Atomic Force Microscope</td><td>Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td><td>Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 nucleosomes의 역학 조사

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

nucleosome subunits의 긴 사슬, chromatin DNA 복제 그리고 녹음을 진 핵 세포 에서도 이러한 중요 프로세스에 대 한 수 동적 시스템입니다. Nucleosomes의 역학 복제 및 전사 기계에 의해 DNA에 액세스를 제공 하 고 비판적으로 기본 chromatin 기능 분자 메커니즘에 기여. 단일 분자 연구 원자 힘 현미경 (AFM) 같은 이미징 nucleosome 구조 역학의 역할의 우리의 현재 이해에 크게 기여 했다. 현재 프로토콜 고해상도 AFM 이미징 기술을 공부 nucleosomes의 구조와 동적 속성을 사용 하는 단계를 설명 합니다. 프로토콜은 H3 히스톤의 대응 centromere 단백질 (CENP A)으로 대체 됩니다 centromere nucleosomes에 대 한 AFM 데이터 표시 되어 있습니다. 프로토콜의 모노 nucleosomes 연속 희석 방법을 사용 하 여 어셈블리와 함께 시작 합니다. 기능성된 nucleosome 이미징에 사용 되는 aminopropyl silatrane (APS-운 모)와 운 모 기판의 준비 nucleosomes 설명의 AFM 시각화에 대 한 중요 한 이며 기판 준비 하는 절차를 제공 합니다. Nucleosomes APS-운 모 표면에 입금 됩니다 먼저 nucleosome 인구의 스냅샷을 캡처 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. 이러한 이미지의 분석에서 DNA는 nucleosomes 감싸의 크기 같은 매개 변수 측정 될 수 있다 고이 과정은 또한 상세. 액체의 절차 이미징 시간 경과 AFM 몇 프레임을 캡처할 수 있는 고속 저속 AFM에 대 한 설명의 초당 nucleosome 역학. 마지막으로, 동적 프로세스의 정량적 특성을 사용 하는 nucleosome 역학 분석 설명 이며 그림.

모노-nucleosomes 처음 실험 연속 희석 조립 방법 (그림 1)를 사용 하 여 이미징 AFM 준비 했다. 준비 nucleosomes 다음 불연속 SDS 페이지 (그림 2)를 사용 하 여 확인 했다. 운 모 표면은 다음 기능성 APS, 고해상도 이미징 (그림 3)에 대 한 부드러운 배경을 유지 하면서 표면에 nucleosomes를 캡처를 사용 하 여. Nucleosomes는 APS-운 모에 예금 되었다 고 이후 정적 AFM 이미지를 사용 하 여 몇 군데 있었다. 어셈블리 및 증 착에 대 한 컨트롤, H3 모노 nucleosomes 준비 했다 하 고 정적 AFM을 사용 하 여 몇 군데. H3 모노 nucleosomes (그림 4A)의 이미지 nucleosomes 성공적으로 조립 되었다 확인 하는 증 착 전에 순간 ...

여기, 우리는 프로토콜 nucleosome 정적 및 시간 경과 원자 힘 현미경 (AFM) 이미징 기술을 사용 하 여 단일 분자 수준에서 입자의 특성을 제시. 설명 된 표면 기능화 방법 구조의 캡처 및에 nucleosomes의 역학에 대 한 수는 nanoscale에 고해상도.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

이 프로토콜은 AFM의 모든 주요 기능을 활용, 다른 단일 분자 기술에 비 준수. 그 결과, 우리는 나노 규모에서 뉴클레오소종의 구조를 해결할 수 있다. 중요한 것은, 뉴클레오좀의 직접적인 시각화는 생리학적 조건에서 이루어졌다.우리의 AFM 기술을 사용하여, 우리는 최근에 전체 센트로메트어의 기능에 역할을 할 수있는 중계 뉴클레오종의 독특한 특성을 공개했다. 표시되는 방법은 현재 아밀로이드 골재의 형성과 관련된 단백질의 자기 조립을 조사하기 위해 실험실에서 적용됩니다. 이 단백질 집계는 알츠하이머병과 파킨슨병과 같은 치명적인 질병의 발달을 유발하여 몇 가지 이름을 지정합니다.간단한 준비 방법은 DNA 복제 기계와 같은 대형 시스템을 포함하여 그밖 단백질 DNA 복합체에도 적용됩니다. 일부 수정이 필요하지만. 정적 및 시간 경과 원자력 현미경을 사용하여 단일 분자 수준에서 뉴클레오소성 입자를 특성화하기 위해, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 뉴클레오좀을 정화, 조립 및 검증하는 것으로 시작한다.다음으로, 정적 AFM 이미징을 위해 운하 표면을 준비합니다. 이렇게 하려면 먼저 50 밀리머 APS 스톡 솔루션을 탈온수로 준비하십시오. 필요할 때까지 이 솔루션의 1밀리리터 알리쿼트1개를 섭씨 4도에 저장합니다.스톡 솔루션에서 증류제 증분 수의 15 밀리리터에 50 마이크로몰라 APS 재고의 50 마이크로리터를 용해하여 현미경 수정을 위한 작동 APS 솔루션을 준비하십시오. 솔루션을 혼합한 다음 큐벳을 솔루션으로 채웁니다. 다음으로, 고품질 의 운마 시트에서 운구의 3 센티미터 스트립을 하나씩 잘라.큐벳에 대각선으로 배치할 때 조각이 맞는지 확인하십시오. 그런 다음, 양면이 갓 갈라지고 조각이 0.1 밀리미터만큼 얇을 때까지 운모의 층을 갈라주세요. 즉시 APS 채워진 큐벳에 마우스 조각을 놓고 30 분 동안 운하를 배양.미카 조각을 증류수로 채워진 큐벳으로 옮기고 30초 동안 담가 둡니다. 그런 다음 ARgon을 사용하여 APS 운하 스트립의 양쪽을 완전히 건조시십시오. 여러 개의 마그네틱 퍽에 두 개의 얼굴 접착제 테이프를 적용하고 측면에 배치합니다.그런 다음 APS 운모 기판을 1센티미터로 1센티미터로 자르고 깨끗한 페트리 접시에 덮습니다. 다음으로, 7.5의 PH에서 10 밀리머 헤페와 4밀리머 마그네슘염화물을 함유한 0.22 미크론 여과 버퍼를 사용하여 조립된 뉴클레오좀의 3개의 희석을 준비한다. 뉴클레오좀의 손실을 제한하기 위해, 낮은 최종 농도에서, 희석은 APS 운모에 증착 직전에 한 번에 하나씩 수행해야한다.APS 마우스 조각의 중심에 각 뉴클레오소성 샘플의 5~10마이크로리터를 보관하고 2분 동안 배양하게 하십시오. 그런 다음, 부드럽게 버퍼 구성 요소를 제거하기 위해 증류 된 탈온 된 물의 2 ~ 3 밀리리터로 샘플을 헹구십시오. 그리고 아르곤의 가벼운 흐름하에서 증착된 샘플을 건조시.먼저 AFM 설정의 팁 홀더에 팁을 장착합니다. 그런 다음 AFM 단계에 첫 번째 샘플을 장착하여 샘플 표면에 접촉하지 않도록 주의하십시오. 합계가 최대화될 때까지 캔틸레버 위에 레이저를 배치하고 수직 및 측면 편향 값을 거의 0으로 조정합니다.그런 다음 AFM 프로브를 조정하여 공진 주파수를 찾고, 드라이브 진폭을 조정하고, 이미지 크기를 100 x 100 나노미터로 설정합니다. 설정이 완료되면 참여 버튼을 클릭하여 접근 방식을 시작합니다. 접근방식이 완료되면 샘플 표면이 명확하게 보일 때까지 진폭 세트점을 점진적으로 최적화합니다.이어서, 스캔 크기를 1미크론으로 늘리고 512x512픽셀로 분해능을 늘립니다. 마지막으로 캡처 버튼을 클릭하여 이미지 수집을 시작합니다. 유리 막대 스캐너 접착제를 사용하여 AFM 스캐너 단계에 유리 막대를 부착합니다.이 것을 최소 10분 동안 건조시키십시오. 한편, 더 큰 운하 시트에서 펀치하여 직경 1.5 밀리미터의 0.1 밀리미터 두께의 원형 조각을 만듭니다. 고속 AFM 운하 유리 막대 접착제를 사용하여 이 운하 조각을 고속 AFM의 유리 막대에 부착하고 건조하는 동안 최소 10 분 동안 그대로 유지하십시오.그런 다음, 테이프에 잘 갈라진 층이 보일 때까지 압력 민감 테이프를 사용하여 마이크에서 층을 갈라. 다음으로, 증류제 의 99 마이크로 리터에 50 밀리머 APS 재고의 하나의 마이크로 리터를 희석500 마이크로 몰러 APS 솔루션을 만들기 위해. 갓 갈라진 운하 표면에 용액의 2.5 마이크로리터를 보관하고 표면이 30분 동안 기능하게 합니다.인큐베이션에 따라 3개의 마이크로리터 헹구기를 적용하여 증류된 탈이온화된 물로 여러 번 헹구는 다. 미혼수 닦아서 각 헹구는 물에 완전히 따라 물을 제거합니다. 마지막 헹구기 후에는 증류된 탈온화된 물 3편을 표면에 놓고 최소 5분간 앉아서 특별히 결합되지 않은 APS를 제거합니다.다음으로, 프로브를 고속 AFM 홀더에 놓고 팁이 위로 향하여 AFM 스테이지에 홀더를 배치합니다. 증류된 탈이온수 100마이크로리터를 사용하여 홀더를 헹구고, 그 다음으로 0.22 미크론 여과뉴클레오성 이미징 버퍼의 100마이크로리터 헹구기. 헹구는 것으로 챔버를 100마이크로리터의 뉴클레오성 이미징 버퍼로 채우고 팁을 가라앉힙니다.레이저에 맞을 때까지 캔틸레버 위치를 조정합니다. 그런 다음, 여과된 뉴클레오소성 이미징 버퍼로 APS 운하를 5회 헹구고 헹구기 당 4개의 마이크로리터를 사용한다. 뉴클레오소성 조립 주식의 1마이크로리터를 여과된 뉴클레오소성 이미징 버퍼 250마이크로리터로 희석하여 1나노몰러의 최종 뉴클레오소성 농도를 한다.표면에 이 희석제 2.5 마이크로리터를 보관하고 2분 동안 놓습니다. 포획을 피하기 위해 뉴클레오성 이미징 버퍼의 4 마이크로 리터로 표면을 두 번 헹구는다. 마지막 헹기 후에는 이미징 버퍼로 덮인 표면을 둡니다.스캐너와 샘플을 팁 홀더 위에 올려 놓고 샘플이 아래로 향하도록 합니다. 접근 방식을 시작하려면 무료 진동 진폭에 가까운 세트 점 진폭으로 자동 접근 함수를 사용합니다. 서피스가 잘 추적될 때까지 세트점을 조정합니다.그런 다음 이미징 프레임당 약 300밀리초의 데이터 수집 률로 약 150 x 150 나노미터에서 200 나노미터로 200 나노미터로 이미지 영역을 설정합니다. 조립 및 증착을 위한 제어로서, H3 단핵구는 정적 AFM을 사용하여 제조및 이미지화되었다. 이 이미지는 뉴클레오소모티드 집단의 스냅샷을 제공하며, 증착 직전에 존재하여 nucelosomes가 성공적으로 조립되었다는 것을 확인합니다.H3 대조군 어셈블리가 성공하면, 제시된 방법은 CENP-A 뉴클레오좀의 연구에 다음에 적용되었다. 이 샘플의 정적 AFM 이미징은 어셈블리가 성공적이었다고 밝혔습니다. 정적 AFM 이미지에서 모노뉴클레오종의 높이와 회전 수를 특성화할 수 있습니다.자유 DNA 무기와 자유 DNA 무기의 길이 사이의 각도는 모두 개별 뉴클레오종의 DNA 회전 수를 결정하는 데 사용됩니다. 대조적으로, 뉴클레오좀의 시간 경과 AFM 이미징은 뉴클레오좀의 전반적인 자발적인 포장 해제 거동을 시각화하는 데 사용될 수 있다. 뉴클레오종의 회전 수가 감소함에 따라 뉴클레오뉴매성 코어 부피의 상응하는 감소도 관찰된다.일반 시간 경과 이미징 외에도, 고속 경과 AFM은 표준 시간 경과 이미징을 사용하여 놓친 더 복잡한 뉴클레오성 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 능력은 1200프레임 동안 포획된 CENP-A 뉴클레오성 코어의 장거리 전좌를 시각화하는 데 필수적이었다. 이 기술은 또한 한 DNA 기판에서 다른 한 DNA 기판에서 CENP-A 뉴클레오소성 코어의 희소한 전송을 포착하는 데 중요했습니다.빠른 이미지 캡처 속도는 이 동적 이벤트를 시각화할 수 있게 해주었으며, 이를 완료하는 데 몇 프레임만 걸렸습니다. 넓은 크로마틴 분야에서는 리거 히스톤의 역할과 크로마틴 역학의 히스톤 배율과 관련된 중요한 질문이 있습니다. 이 모든 질문은 우리의 기술을 사용하여 대답 할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오에서는 조립된 뉴클레오솜을 시각화하기 위한 정적 원자력 현미경을 시연합니다. 이 고해상도 이미징 기술을 통해 뉴클레오솜 구조를 연구할 수 있습니다.

조립된 뉴클레오솜을 시각화하고 특성화하기 위한 정적 원자력 현미경 검사

이 비디오에서는 뉴클레오솜 복합체의 역학을 연구하기 위한 고속 저속 원자력 현미경, AFM, 이미징 기술을 시연합니다. AFM 팁은 뉴클레오솜 표면을 스캔하면서 뉴클레오솜 높이의 변화를 감지하고 시간이 지남에 따라 DNA가 풀리는 것을 기록합니다.

뉴클레오솜 역학을 포착하기 위한 고속 타임랩스 원자력 현미경

이 논문에서는 원자력 현미경(AFM)을 사용하여 단백질 광수용체의 구조를 조사하는 방법을 설명합니다. PeakForce 정량적 나노기계적 특성 매핑(PF-QNM)은 운모 표면에서 손상되지 않은 단백질 이량체를 보여줍니다.

PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경

이 프로토콜에서 우리가 직접 살아있는 세포에서 핵을 제어 힘을 적용 하는 micropipette 방법을 설명 합니다. 이 분석 결과 생활, 부착 세포에서 핵 기계적 특성의 심문 수 있습니다.

핵과 골격 사이 기계적인 통합을 측정 하기 위한 직접적인 힘 프로브

여기서, 우리는 광학 트랩에 의한 직접 힘 측정을 통해 3차원 감금에서 격리된 배아 제브라피쉬 세포의 세포내 기계적 특성을 조사하는 프로토콜을 제시한다.

광학 핀셋을 사용하여 감금된 세포 전 역학의 직접 힘 측정

여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.

High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

우리는 유크로마틴, 헤테로크로마틴, RNAP II의 재현 가능한 지도화를 가능하게 하는 3색 염색질 단분자 위치 현미경(SMLM) 염색 및 분석 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 크로마틴 관련 표적을 포함한 고밀도 핵 환경에서 효율적인 다색 라벨링을 가능하게 하여 신뢰할 수 있는 동시 검출을 가능하게 합니다.

밀집된 핵 환경에서 크로마틴 연구를 위한 다중 표지 단일 분자 위치 현미경 프로토콜

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

Bio3D-web을 이용한 단백질 서열 - 구조 - 역학 관계에 대한 온라인 조사 프로토콜을 제시한다.

Bio3D-web을 이용한 단백질 염기 서열 구조 역학 관계 조사

학습하세요 원자 힘 현미경을 이용해 뉴클레오솜의 구조와 역학을 단일 분자 수준에서 정량 분석하는 방법을. CENP-A 중심체 뉴클레오솜의 독특한 특성을 시각화하여 염색질 생물학 연구에 활용할 수 있습니다.

구조와 원자 힘 현미경 이미징 사용 하 여 Nucleosomes의 역학 조사

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