Name: 형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 19 min 23 s
Description: 학습하세요 형광 단백질 융합 기반 프로테아제 분석 플랫폼을 HIV-1 프로테아제를 이용한 고효율 스크리닝에 적용하는 방법을. 이 기술은 약물 발견 연구에 활용됩니다.

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이 작품 GINOP-2.3.2-15-2016-00044 "PHARMPROT 팀" 프로젝트에 의해 부분적으로 지원 되었고, 또한,의 프레임 워크 내에서 고 등 교육 기관 우수 프로그램의 부의 인간 수 용량, 헝가리에 의해 융자는 데브레첸 대학의 생명 공학 주제 프로그램입니다. 저자는 실험실의 Retroviral 생화학 분석 결과 개발 하는 동안 그들의 과학적인 도움 및 또한 (특히 하 Norbert Kassay에 Joóné Matúz Vanda 톨디, 분석 결과 촬영 하는 동안 그들의 인내심에 대 한 구성원에 대 한 감사 누가 게재 동영상의 배경에서). 저자 또한 특별 감사 Gedeon 리히터 Plc., 생화학의 부 고 손님 연구원으로 분자 생물학의 Beáta Bozóki의 작동 허용을 위한 박사 졸탄 Urbányi 특히 말을 싶습니다. 저자 또한 오디오 및 비디오에 전문적인 도움을 위한 멀티미디어 및 데브레첸의 대학교의 E-러닝 기술 센터에서 죄르지 Zsadányi, Balázs Tőgyi, Balázs Pöstényi, 및 졸탄 Király 그들의 감사 하 고 싶습니다. 생산입니다.

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저자는 공개 없다.

분해 효소의 집중 산업 및 학술 조사 및 급속 하 고 저렴 한 HTS 호환 효소 분석 플랫폼에 대 한 일정 한 수요 적절 하 게, 우리가 개발한 자석 구슬-기반 형광 효소 분석 결과입니다. 분석 결과 널리 활용된 합성 펩 티 드 기질에 새로운 대안이 될 수 있는 재조합 융합 단백질의 사용을 기반으로 합니다.
개발된 시험 형식에서 융합 단백질 기판은 Ni 킬레이트 코팅 자석 agarose 구슬의 표면에 움직일 수 있습니다. 기판 첨부 파일 그의6 선호도 태그 직접 접는 촉진 하 고 기판13의 물 가용성을 향상 MBP 태그 융합은 융합 단백질의 N 맨끝에 의해 제공 됩니다. MBP은 TEV PR의 분열 사이트와 관심의 효소에 선행 된다. 전 수 역할 분석 결과에서 제어 분열 사이트 조사를 효소에 의해 처리 될 수 있습니다 후자의. 분열이 사이트는 상호 교환; 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 짧은 dsDNA 시퀀스는 결 찰에 의해 식 플라스 미드의 유연한 '복제 카세트'에 삽입할 수 있습니다. 재조합 융합 단백질 효소 해방, 형광 C 터미널 분열 제품 분해 분열 ( 따라 발표의 끝점 검출을 가능 하 게 C 터미널, 매우 안정적인, 단위체 형광 단백질 태그 포함 그림 1A). 다른 버퍼에 해결 정화 형광 그대로 기판 기판 및 분열 제품의 어 금 니 농도 평가 하기 위해 교정도 사용 됩니다. 또한, fluorimetry, 후 분석 결과 구성 요소 분석할 수 있습니다 SDS 페이지 뿐만 아니라. 두 기본 (nondenatured)와 변성된 형광 성 단백질 구상 될 수 있다는 젤에는 전기 이동 법 후 즉시 또는 다음에 젤 renaturation 후 각각. 이 추가 절차에 함께 한 기존의 Coomassie 화려한 블루 얼룩-5 월 시험 결과 (그림 1B)의 확인에 대 한 효율적으로 사용할 수 있습니다.
높은 처리량 자동 환경에 완전히 적응 될 수 있는 한 낮은 볼륨 형식 간단 하 고 쉬운-을-실행 단계 분석 결과 절차에 의하여 이루어져 있다. 그러나, 독립적으로 수동으로 또는 자동화 시스템 분석 결과 수행, 분석 결과의 다음과 같은 부분으로 간주 됩니다 하지 중요 되며 절차를 수행 하는 동안 특별 한 주의 필요로. i) 자석 구슬 솔루션의. 균질 자석 구슬 솔루션 분석 결과, 모두 정화와 세척 단계에 걸쳐 사용 되어야 한다. 특히, 효소 분석 실험의 안정성 강하게에 따라 제대로 aliquoting 기판 부착 자석 구슬 (SAMB) 재고 솔루션. 서 스 펜 션 및 분산의 효과 증가 하기 위하여 2%와 10% (v/v) 사이의 구슬 농도 설정 하는 것이 좋습니다. 샘플 준비, 사용 하는 동안 버퍼 (예: 트라이 톤 X-100 또는 트윈 20) 비 세제까지 보충의 2%도 플라스틱 표면에 자석 구슬의 부착 저하 될 수 있습니다. 샘플 튜브의 벽에 구슬의 부착 구슬 정지 샘플 튜브의 벽에 대신에 튜브의 바닥을 신중 하 게 적용 되는 경우에 피할 수 있습니다. 효소 반응 동안 자석 구슬의 동질성 또한 중요 하 고 지속적으로 부 화 시 600 rpm에서 샘플을 떨고에 의해 지켜질 수 있다. V-하단 튜브의 사용 권장 하지 않습니다 동안 비즈는 제대로 둥근 또는 플랫 플라스틱 그릇에 분산 됩니다. 부적 절 한 비드 균질으로 인 한 차선의 결과 그림 4B에서 표시 됩니다. 2) 반응 샘플의 해지입니다.  방법의 또 다른 이점은 이다 효소 반응 열 변성 치료 또는 어떤 잠재적으로 방해 화학15의 사용 없이 종료 될 수 있습니다. 종료 자석 구슬 기존의 마그네틱 입자 집중 장치를 사용 하 여 반응 혼합물에서 분리 하 여 수행할 수 있습니다. 제거 반응 버퍼에 포함 되어 있는 활성 효소 생성 된 C 터미널 형광 분열 제품 uncleaved 기판 구슬에 연결 된 남아 있다. 반응 버퍼에 활성 효소의 존재로 인해 분리 절차를 신뢰할 수 있는 끝점 검출을 위한 신중 하 게 수행 해야 합니다. 집중 장치에 샘플 튜브를 배치 하기 전에 짧은 회전 원심 분리를 적용 하는 것이 좋습니다. 집중 장치에 튜브를 삽입 후 적어도 15 제공 수집 구슬에 대 한 s. 뒤로-및-앞뒤 구분의 약간의 운동 구슬의 수집을 용이 하 게 수 있습니다. 분리를 수동으로 수행된 하는 동안 종료 일반적으로 더 많은 시간이 걸립니다 보다는 반응의 개시 하는 것을 고려 하시기 바랍니다. 따라서, 약 2 분 등록 지연이 좋습니다는 식 이라고 사이 동일한 보육 시간 모든 샘플에 적용 하는 경우.
설명된 분해 분석 결과의 원리는 비교적 간단 하다; 그러나, 시스템의 유연 하 고 안정적인 기판 구조 보장 합니다. 분석 결과의 개별 최적화 선호도 구슬의 적용된 조건, 시 약, 첨가제와의 호환성만 제한 될 수 있습니다. 계약 제조 업체의 프로토콜, 우리 또한 그 Ni NTA 구슬 표면에 기판의 선호도 바인딩 실질적으로 약화 pH ≤에 6.515발견. 따라서 기판 빈 샘플 반응 견본을 병렬을 적용 하는 것이 좋습니다 그리고 자발적인 기판 분리의 속도 결과의 평가 도중 고려 될 필요가 있다.
어디 자기 구슬-기반 분석 구슬-호환 되지 않는 구성 요소 또는 낮은 산도의 사용으로 인해 수행할 수 없습니다, 이러한 경우에 순화 된 재조합 형 기판의 솔루션에 소화도 적용할 수 있습니다. 이러한 경우에 반응 혼합물은 전기 이동 법에 의해 분석 될 수 있다 고 설명된 프로토콜에 따라 젤에 단백질을 구상 될 수 있다. 분해 활동을 조사, 솔루션에서 소화 및 단백질의 젤에서 검출 될 수 있습니다 fluorimetry의 대체 도구. 설계 기판 시스템의 참신은 SDS 페이지를 변성 시키기 후에 젤 renaturation 단계의 응용 이다. 네이티브 (nondenatured) 형광 단백질 전기 이동 법 동안 그들의 형광을 유지 하는 동안 변성 (그림 7B) 시 형광 속성은 폐지 됩니다. 그러나, 변성된 단백질의 형광 젤에서 SDS의 제거에 의해 부분적으로 복구할 수 있습니다. 따라서, 변성 조건을 사용 하 여 반응 컴포넌트의 분리 가능 하 게 형광 기반 뿐만 아니라 분자 무게-기반 식별. Coomassie 스테인드 젤의 분석에 비해 형광에서 젤 탐지의 또 다른 장점은 이다 (네이티브 또는 renatured) 형광 단백질은 쉽게 그들의 형광에 따라 젤에 확인할 수 있습니다 ( 그림 7참조). 분열 반응 nonfluorescent 오염 물질을 포함 하는 샘플에서 수행 하는 경우 또는 매우 닮은 서로 분자 무게 단백질이 중요 한 수 있습니다.
효소 분석 실험을 사용 하 여 유사 하 게 설계 된 기판에 이미 출판 이전8,,910, 그리고 비록 이러한 경우에 대 한 관심의 분열이 사이트는 또한 선호도 태그 사이 형광 단백질, 제시 하는 분석 결과 시스템 여기 뿐만 아니라 기술된 아이디어를 반복 하지만 이전 플랫폼의 다른 장점 결합 한 고도 더 개선 완료: i) MBP 융합 파트너의 활용 ii)는 TEV 홍보 제어 분열 사이트, iii의 존재) 새로 설계 된 단위체 FPs, 및 iv를 사용 하 여) 독특한 기판 교정 절차의 응용 프로그램. 자체 분석 결과 특히 효소 특이성 및 운동 연구, 비싼 계측에 대 한 필요 없이 시간 및 비용 효율적인 방법으로 안전에 유용 하도록 설계 되었습니다. 메서드는 두 산업 및 학술 연구 목적 적합 하 고 저렴 한 도구 될 목적 이다. '복제 카세트' 식 플라스 미드의 유연성으로 인해 시스템 재조합 기판 라이브러리의 신속 하 고 저렴 한 세대에 대 한 적합 한 수 있습니다. 여기 설명된 분석 결과 기질 특이성, 효소 mutagenesis의 구현에 대 한 가능한 도구 이며, 억제 연구 하 고, 또한, 효소 활동을 수행 하는 다른 도구를 제공. (운동 매개 변수의 결심에 세균성 세포 파쇄)에서 분석 결과 플랫폼 HTS 및 자동화 기반 환경에 적응 시킬 수 있다 하 고, 산업 protease 억제제 검사 및 항 바이러스 약물에 잠재적으로, 적용 될 수 있습니다. 개발입니다. 또한, 경쟁력 있는 베이스에 대 한 분석 결과의 적응은 또한 우리의 실험실의 범위 미래에. 같은 경쟁 분석 결과, 다른 C 터미널 형광 태그-는 조사는 연구의 기본 설정 같은 분열 반응에 동시에 사용할 수를 융합 두 다른 기판 각 포함 하는 다른 분열 사이트 주어진된 대상 시퀀스에 대 한 효소입니다. 또한, 96 잘 접시 적응 분석 결과 양식 (그림 8)의 사용은 또한 되 고 최적화 돌연변이 검사 수정된 분열 사이트 시퀀스 시스테인 프로 테아 제 경우 기판의 시리즈를 사용 하 여.

분해 효소는 대사 경로 및 산업 어플리케이션에 그들의 중요성 때문에 가장 집중적으로 조사 효소 그룹에 속한다. 바이러스 성 질병에 그들의 중요 한 역할, 혈액 응고, 암의 규칙 및 심장 혈관 및 신경 퇴행 성 질환 약물 발견의 분야에서 저명한 대상 프로 테아 제를 만드는. 따라서, 기질 특이성의 상세한 특성 및 관심의 프로 테아 제 (PR)의 프로 파일링 억제제 중추 이며 선호, 비용 효율, 빠르고 강력한 생 화 확 적인 분석 실험1,2,에 의해 수행 됩니다. 3.
요즘, 복합 프로 파일링에 대 한 신약의 분야에 적용 하는 체 외 효소 분석 실험의 대부분은 균질, 형광 펩타이드 기반 및 높은 처리량 검열 (HTS)-호환 플랫폼4. 또한, 레이블이 지정 된 펩 티 드만 라이브러리 심사, 적합 하지 않습니다 하지만 그들은 또한 선택 된 기판에 운동 매개 변수 효소의 결정에 대 한 훌륭한 도구를 제공. 다른 경우에, 어디는 기판의 라벨은 불가능, 분리 기반 분석 분해 반응3의 운동 특성을 평가 하기 위해 가능한 솔루션을 제공할 수 있습니다.
일반적으로, 체 외 효소 분석 실험 기반 기판의 두 종류의 사용: 짧은 펩 티 드 또는 전체 단백질. 어디 짧은 펩 티 드 순서의 분열 분열 속성을 충분히 반영, 이러한 경우에 다음과 같은 표준 방법을 적용 됩니다: (i) 테스트 산화 된 인슐린 B-체인, (ii) 같은 표준 단백질 기질 검사 조합 화학, 또는 (iv)에 의해 만들어진 합성 하 고 붙일 레이블 펩타이드 라이브러리 심사 다른 프로 테아 제, (iii)의 상용 기판 유전자 방법을 사용 하 여, 예를 들면, 생물학 표시 기술5, 6. 기존의 분류 외 다른 새로운 플랫폼도 있습니다 기판 생성 (예를 들어, 대형 프로테옴 파생 된 펩타이드 라이브러리7 또는 재조합 융합 같은 유전 방법의 특별 한 하위의 단백질 기반 기판8,9,10,,1112).
위에서 언급 한 기판 형식 및 분석 실험의 모두 그들의 자신의 이점 및 한계, 그리고 분석 결과 형식 결합 또는 알려진된 플랫폼의 장점을 향상의 개발은 여전히 수요. 여기 우리는 재조합 형 기질을 이용 하는 형광 효소 분리 기반 분석 결과 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 그의6 과 MBP 태그 TEV 홍보, 뒤에의 C-터미널 형광 단백질 (FP) (그림 1A)에 직접 연결 된 기판 시퀀스의 제어 분열 사이트에 융합이 융해 단백질에 의하여 이루어져 있다. 복제는 '복제 카세트'로 관심의 분열 사이트에 대 한 코딩 DNA 순서의 이전 금지 endonucleases 여 선형화 된 식 플라스 미드에 단일 결 찰 반응에 의해 수행할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig1.jpg"> 그림 1: 형광 효소 분석 실험의 원리. 프로 테아 제 (A) 형광 기판 및 인간 면역 결핍 바이러스 1 형에 의해 그것의 분열의 도식 표현 (HIV-1) 표시 됩니다. 에이즈-1 효소의 매트릭스/capsid 분열 사이트 시퀀스 내에서 분열 위치를 표시 하는 화살표 (VSQNY * PIVQ). (B)는 형광 기판 분석 하 효소 반응 Ni-NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 의해 polyacrylamide 젤 전기 이동 법에 의해 뿐만 아니라, 워크플로 다이어그램에서와 같이 사용할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
분해 분석 실험 기판-포함 하는 선호도 태그, 분해 분열 사이트 및 형광 단백질이 이미 유사한 재조합 단백질을 사용 하 여 설명 하 고 있지만8,,910, 시스템 제시 여기 통합 하 고이 방법의 장점에 개선 계획 이다. 중요 한 차이점은이 분석 결과 플랫폼 융합 단백질 기질 단백질 용 해도13 강화 TEV PRs에 대 한 제어 분열 사이트를 포함 하는 MBP 갖추고 있습니다. 또한,는 기판 새로운 세대 형광 단백질, 매우 안정 되 고 기판 집계 방지 단위체 양식을 포함 합니다. MTurquoise2 및 mApple 융합 형태14의 이전 게시 된 응용 프로그램, 게다가 여기 우리 또한 표시는 단위체를 포함 하는 재조합 형 기판의 사용에 의해 주어진 결과 향상 노란 형광 성 단백질 (mEYFP) 형광 태그. 이로써 우리 다른 형광 단백질 시스템의 호환성을 보여 하 고 몇 가지 일반적인 유형의 효소 분석 실험에 의해 취득 될 수 있는 결과 나타냅니다.
재조합 융합 단백질 대장균 BL21(DE3) 세포에 표현 되 고 니켈 nitrilotriacetic 산 (Ni-NTA) 분석 결과 대 한 기판으로 사용 되는-자기-agarose-구슬-첨부 양식 코팅. C 터미널 분열 제품 관심의 효소에 의해 분열 시 상쾌한에 구슬 표면에서 해방 됩니다. 자석 구슬에서 (포함 하는 효소 분열 제품) 상쾌한 분리 후 형광 효소의 분열 속성 확인을 측정할 수 있습니다. 앞에서 설명한 방법을 달리 여기, 시스템에 기판 및 C 터미널 분열 제품의 양은 유일 하 게 정량 상세한 기판 교정 절차에 따라. 분석 결과 시스템 분석 결과 샘플;의 SDS 페이지 분석에 의해 지원 될 수 있습니다. 후속 형광에 젤 시각화는 전기 이동 법 또는 nondenatured 및 변성 형광 구성 요소, 각각14-젤 renaturation 즉시 적용할 수 있습니다.
유연성과 구조 '복제 카세트'의 다양 한 구성으로 시퀀스의 시간 및 비용 효율적인 삽입을 허용 하 고, 따라서 기판 라이브러리의 생성을 촉진. 모든 분석 결과 단계는 자동화 및 HTS 호환, 이후 시스템 매력적 일 수 있다 특히, 예를 들어, 효소 특이성 측정 및 mutagenesis 연구, 또는 그것은 또한 활용 될 수 있습니다 효과적으로 산업 protease 억제제 심사에 대 한 및/또는 항 바이러스 약물 개발입니다.
효소 활동적인 매개 변수 (k고양이, Km) 개발된 분리 기반 분석 결과;에 의해 결정 될 수 있다 따라서, 그것은 적당 한 시간 코스, 기판에 따라 다릅니다, 그리고 억제 연구 등 개별 효소 활동적인 측정을 수행 수 있습니다. 이 자주 활용된 합성 펩타이드 기판에 대 한 좋은 대안을 제공 하는 재조합 융합 단백질 기질 때문에 높은 유사성에 대 한 그들의 polyprotein 기판에, 그들은 자연스럽 게 발생 대표 증명 효소-기질 상호 작용 더 정확 하 게.

<table><tbody><tr><td>10K Amicon 튜브</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC501096</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol (&beta;-ME)</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>40% 아크릴아미드/Bis 용액 37.5:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>아세트산&nbsp;</td><td>Merck</td><td>100063</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SERVA</td><td>11404.04</td><td></td></tr><tr><td>Alpha Imager HP gel documentation system</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter Allegra X-22 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>392185</td><td></td></tr><tr><td>Black half-area plates</td><td>Greiner bio-One</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>B0126</td><td></td></tr><tr><td>CutSmart 버퍼 (10x)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td>플라스미드 선형화용 (단계 1.1.1)</td></tr><tr><td>Dark Reader transilluminator</td><td>Clare Chemical Research</td><td>DR-45M</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>뉴잉글랜드 바이오랩스</td><td>M0303L</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2&nbsp; 자성 입자&nbsp; 집중 장치</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21(DE3) 관능 세포&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>C600003</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Merc-Millipore</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산&nbsp; (에디타)</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td></td><td></td>798681</tr><tr><td>젤 로딩 염료, 보라색 (6X)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>머크</td><td>356350</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>고속 플라스미드 미니 키트</td><td>GeneAid</td><td>PD300</td><td></td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치 (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>56750</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>Thermo Fischer Scientific (Invitrogen)</td><td>AM9464</td><td></td></tr><tr><td>Jouan CR 412 원심분리기</td><td>Jouan</td><td>CR412</td><td></td></tr><tr><td>Labinco LD-76 Rotator&nbsp;</td><td>Labinco</td><td>7600</td><td></td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) 국물</td><td>Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>라이소자임&nbsp;</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>Scharlau</td><td>MA0036</td><td></td></tr><tr><td>MERCK eurolab 초음파 수조</td><td>MERCK</td><td>USR54H</td><td></td></tr><tr><td>Millifuge Eppendorf 스핀 원심분리기</td><td>Millipore</td><td>CT10</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 전기영동 세포</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED)</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England Biolabs</td><td>R3131L</td><td></td></tr><tr><td>니켈(II) 황산염 (NiSO4)</td><td>Sigma-Aldrich (미국 세인트루이스, 미주리주)&nbsp;</td><td></td><td></td>656895</tr><tr><td>Ni-NTA 자석 아가로스 비즈&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>36113</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>Biosan</td><td>OS-20</td><td></td></tr><tr><td>PacI 제한 엔도뉴클레아제</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547L</td><td></td></tr><tr><td>PageBlue 단백질 염색 솔루션&nbsp;</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>24620</td><td></td></tr><tr><td>페닐메탄설포닐플루오라이드(PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein Lobind 마이크로 원심분리기 튜브&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>22431102</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel 추출 키트</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Snijders Press-to-Mix 쉐이커&nbsp;</td><td>Gemini</td><td>34524</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-아세테이트 삼수화물</td><td>Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨&nbsp;</td><td>시그마-알드리치(미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I 핵산 겔 스테인</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>S7563</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>Promega</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>써모 쉐이커</td><td>Biosan</td><td>TS-100</td><td>with SC-24 accessory block</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA)&nbsp;</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich (미국 미주리주 세인트루이스)&nbsp;</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>WALLAC VICTOR2 1420 멀티라벨 카운터</td><td>Wallac Oy, 투르쿠, 핀란드</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Use of Recombinant Fusion Proteins in a Fluorescent Protease Assay Platform and Their In-gel Renaturation

프로 테아 제는 생명체의 여러 생물 학적 경로 병 인; 그들의 필수적인 역할 때문에 집중적으로 공부 효소 따라서, 그들은 중요 한 약 대상입니다. 우리는 재조합 융합 단백질 기판의 사용에 따라 분해 활동의 수사에 대 한 분석 결과 자기 agarose 구슬-기반 플랫폼을 개발 했습니다. 이 분석 결과 시스템의 사용을 설명 하기 위해 한 프로토콜은 1 (hiv-1) 효소 인간 면역 결핍 바이러스 종류의 예제에 제공 됩니다. 도입된 분석 결과 플랫폼 프로 테아 제, mutagenesis, 운동, 금지, 또는 구체적 연구, 효소 활동 측정 등의 생 화 확 적인 특성에 효율적으로 이용 될 수 있다 그리고 그것은 높은 처리량에 적합 있을 수 있습니다. 기판 검사 또는 다른 분해 효소에 적용할 수 있습니다.
이 분석 결과 시스템에 적용 된 기판 포함 N 맨끝 hexahistidine (그6)과 맥 아당 의무적인 단백질 (MBP) 태그, 담배에 대 한 분열 사이트 엣지 바이러스 (TEV)와 에이즈-1 프로 테아 제, C 터미널 형광 단백질. 기판 대장균 세포에 효율적으로 일어날 수 있다 그리고 니켈 (Ni)-킬레이트-코팅된 비즈를 사용 하 여 쉽게 정화. 분석 결과, 동안 비드 연결 된 기판의 분해 절단 fluorimetry에 의해 측정 될 수 있는 형광 분열 파편의 석방을 이끌어 낸다. 또한, 분열 반응 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 의해 분석할 수 있습니다. 에 젤 renaturation 분석 결과 구성 요소에 대 한 프로토콜 부분 renaturation 형광 단백질의 분자량 및 형광에 따라 그들의 감지 하면 설명도 되어 있습니다.

그림 1A 는 특정 분열 사이트 시퀀스에서 에이즈-1 홍보에서 처리할 수 있는 대표적인 형광 재조합 단백질 기판의 도식 구조를 보여 줍니다. 그림 1B 는 기판 생산 및 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 및/또는 페이지를 포함 하 여 효소 분석 실험에 있는 그들의 가능한 응용 프로그램을 나타냅니다.
Fluorimetry에 의해 신뢰할 수 있는 데이터를 얻으려면, 교정 절차는 형광 기판 및 분열 제품 수량을 결정 하는 데 필요한. 이 위해 다른 버퍼 조건에서 다른 기판의 형광 강도 값 측정 될 필요가 있고 분석 농도 범위 (그림 3)에 그들의 농도에 상관 될 필요가. 기판 및 분석 결과 샘플에서 분열 제품의 금액을 결정 하기 위해 보정 곡선의 기울기 값을 적용할 수 있습니다. 보정 곡선의 (표 11) 기판에 삽입 하는 분열 사이트 시퀀스의 독립 이며 잠재적으로 일련의 동일한 유형의 형광 단백질을 융합 하는 기판에 사용할 수 있습니다. 확대/축소 그래프 (그림 3) 뿐만 아니라 낮은 농도 범위를 확대 하려면 모든 선형 재발에 대 한 표시 됩니다. 그것은 보정 데이터 포인트의 적절 한 분배는 믿을 수 있는 교정에 대 한 필요 하기 때문에 신중 하 게 수행 해야 하는 것이 중요. 이러한 이유로 두 가지 직렬 희석 적용 됩니다 교정, 샘플 준비 하 R2 값은 형광 단백질의 농도 형광 경우에 충분 한 수의 데이터 요소 사이 좋은 상관 관계를 나타냅니다 때문에 가 전체 농도 범위를 커버 하는 데 사용 되었습니다. 또한, 실험 오류 높은 영향을 미칠 수; 교정의 정확성 따라서, 회귀 선의 그래픽 평가 할 수 있습니다 또한.
효소 분석 결과, 반응 속도 (그림 4A)에 기질 농도의 효력의 검사를 포함 하 여 다양 한 효소 측정을 수행할 수 있습니다. 비선형 회귀에 의해 데이터 효소 활동적인 매개 변수 (예: v최대 및 Km)를 확인 하기 위해 사용할 수 있습니다. 부족 한 비드 현 탁 액 및 분산 및 부적 절 한 반응 종료 차선의 결과 (그림 4B), 신뢰할 수 있는 효소 운동 값을 계산 하는 데 적합 하지 않습니다 발생할 수 있습니다.
시간에 제품 대형의 의존 (예를 들면, 동안에 분열 반응 매개 변수 최적화) 분석 결과 (그림 5A)에 의해 확인할 수 있습니다. 효소 활성 억제제 존재 수도 있습니다 (그림 5B)는 활성 효소 농도 및 억제 상수에 대 한 조사. 동일한 방법론을 사용 하 여, 다른 억제제의 효과 수 있습니다 또한 상영 분석 결과 의해.
효소 분석 실험은 효소 활동에 pH의 효과 조사할 때 유용 합니다. 그림 6A TEV 홍보, 넓은 최적의 pH 범위 (pH 6-9)의 예 의해 pH 의존을 효소 활동의 나타냅니다. PH 의존 효소 활동의 공부 (또는 데 산 성 pH 최적 효소 측정 될 필요가) 경우는 구슬에 재조합 형 기판의 선호도 바인딩 약간 산 성 pH에서 제한 될 수 있습니다 고려 하는 데 필요한. 구슬 (그림 6B)에서 기판의 높은 분리 시험 결과의 왜곡을 일으킬 수 있습니다. 구슬에서 자발적인 기판 분리를 고려, 반응 샘플 측정 값 그 B 샘플 수정 해야 합니다.
그림 7 (그림 7A) 블루 빛 transillumination를 사용 하 여 nondenatured 형광 단백질 그들의 색깔에 따라 젤에 분화 될 수 있다 보여준다. 기판/분열 파편의 분자 무게의 결정은 필요한 경우, 조건을 변성 시키기 사용할 수 있습니다 또한 샘플 준비, 형광 단백질 부분적으로 젤에 renatured 수 있습니다 자외선 조명에 의해 검출 될 수 있기 때문에 (그림 7B) 또는 Coomassie 얼룩 (그림 ℃). R 샘플 분석, C 터미널 분열 제품 있다면 표시 (그림 ℃), N 맨끝 분열 파편 및 uncleaved 기판 구슬에 부착 된 유지. 때때로, 단백질 nondenaturing 조건 (그림 ℃)를 사용 하 여에 불구 하 고 부분적으로 변성 될 수 있습니다 그리고 nondenatured 단백질 더 풍부한 동안, 변성된 형태도 샘플에서 감지. 이 현상은 분해 분열의 검출에 영향을 주지 않습니다 하지만 양적 densitometry nondenatured 샘플의 경우 고려 되어야.
자세한 설명은 2 mL 튜브-기반 분석 결과 대해서만 표시 됩니다, 분석 결과 96 잘 접시 기반 시스템 (그림 8), (표시 되지 않음) 본 연구실에서 이미 성공적으로 테스트 되었습니다에 대 한 적응 될 수 있습니다. 96 잘 접시 적응 형식 fluorimetric와 전기 이동 분석, 뿐만 아니라, 완벽 하 게 호환 이며, 획득된 데이터 또한 평가 될 수 있습니다이 문서에서 설명 하는 방법에 따라.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig3.jpg"> 그림 3 : 교정 곡선. 대표 기판 보정 곡선을 다른 C 터미널 형광 태그를 융합 하는 두 개의 재조합 기판의 예제와 함께 보여 줍니다: (A 와 B) 그의6-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 및 (C 와 D ) 그의6-MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP. 확대/축소 숫자도 0-0.005에서 데이터 포인트의 선형 회귀를 나타내는 표시 됩니다 m m 기질 농도 범위. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig4.jpg"> 그림 4 : 효소 활동적인 매개 변수 결정. 기판 종속 운동 측정 했다 HIV-1 홍보 수행 (41.2의 마지막 활성 농도에 nM). 초기 속도 값 기질 농도 대 한 표시 했다 그리고 Michaelis Menten 비선형 회귀 분석을 수행 했다. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). (A) A 대표 최적의 결과 그의6-MBP-VSQNY의 예제와 함께 표시 됩니다 * PIVQ mApple 퓨전 단백질 기질. (B) A 대표 차선의 결과 그에 대 한 표시 됩니다6-MBP-KARVL * AEAM mTurquoise2 기판, 적절 한 기질 농도의 설정은 SAMB 재고 솔루션의 부족 한 균질 때문에 문제 상대적으로 높은 오류 부적 절 한 반응 종료 인해 발생 하는 동안. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig5.jpg"> 그림 5 : 시간-코스와 억제 연구. (A) 그의 6-MBP-VSQNY * PIVQ-mEYFP (0.00326 m m의 최종 농도)에서 재조합 융합 단백질 기판 했다 HIV-1 홍보에 의해 죽 습 (41.2의 마지막 활성 농도에 nM), 및 형광 성 PIVQ-mEYFP 분해 파편의 릴리스를 측정 했다 시간-과정 분석을 수행 합니다. 측정은 포인트 5 다른 시간에 실행 되었다. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). (B) 그의6-MBP-VSQNY * PIVQ mEYFP 에이즈-1 홍보 활동에 amprenavir의 억제 효과 확인 하려면 (0.0015 m m)에서 기판으로 사용 되었다 (163.8의 총 농도에 nM). 데이터를 절반 최대한 억제 농도 (IC50) 평가 될 수 있는 플롯과 활성 효소 농도 의해 (41.2의 마지막 활성 농도 nM) 적용된 HIV-1 PR의 수 또한 계산 저해 곡선에. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig6.jpg"> 그림 6 : 효소 활동 및 자발적인 기판 분리 박사에의 의존을 공부 (A)는 그의6-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 기판 (0.033 m m)에 TEV PR의 효소 활동 측정 하는 데 사용 되었다 (91.42의 마지막 총 농도에서 nM) 분열 버퍼 다른 pH 6.5-8.5의 범위를 설정. 오차 막대를 나타내는 SD (n = 2). 그려진된 데이터 되었습니다 이전14출판. (B) 기판 빈 샘플는 그의 자발적인 분리의 상대 형광 강도 값에 따라6-MBP-VSQNY * PIVQ mTurquoise2 기판 (0.033 m m) 자석 구슬에서 분열 버퍼를 사용 하 여 공부 했다 과 다른 산도, 6.0 8.5 사이. 그려진된 데이터 되었습니다 이전14출판. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig7.jpg"> 그림 7 : 다른 방법으로는 젤에 단백질을 감지. (A) Uncleaved 및 nondenaturing 샘플 준비 후 HIV-1 홍보 소화 퓨전 단백질 기판 SDS 페이지 후 블루 빛 transillumination에 의해 시각화 했다. 분열 반응 솔루션에 소화에 의해 수행 되었다. (B) 페이지, 직후만 nondenatured 단백질에서에서 검출 될 수 젤 UV 조명, SDS의 제거 후에 의해 이전 변성된 형광 단백질 되었다 renatured 부분적으로 감지 하 고. 샘플의 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 supernatants에서 준비 되었다. (C) Coomassie 얼룩도 사용할 수 있습니다-젤 renaturation 후 단백질 검출. 젤-5 월에 SDS 현재 네이티브 단백질의 부분 변성 하지만 네이티브 샘플, nondenatured 형태는 더 풍부. 샘플의 Ni NTA 자석 구슬-기반 분석 결과 supernatants에서 준비 되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58824/58824fig8.jpg"> 그림 8 : 분석 결과 플랫폼의 96 잘 접시 기반 적응. (A) 분석 결과 2 mL 튜브 뿐만 아니라 또한 96 잘 접시의 우물에서 수행할 수 있습니다. 여기에 우리가 야생-타입 (wt) 또는 돌연변이 (mut-1 mut-4)을 포함할 수 있는 형광 기판의 시리즈를 사용 하 여 가상 효소의 특이성을 연구 분석 결과의 응용 프로그램에 대 한 도식 적인 표현을 표시 분열 사이트 시퀀스. 자석 구슬 처리, 96-잘 호환 자성 입자 집중 (MPC)는 실험에 사용 될 것입니다. 모든 표시 된 볼륨은 단일 잘 관련이 있습니다. 다른 기판의 절단 효율성 비교를 기판 변환 관련의 기판 빈 수정 RFU 값을 고려 하 고 반응 샘플의 기판 빈 수정 RFU 값의 비율에서 평가 될 수 있다 100으로 기판 제어 샘플입니다. (B) 후 직접 또는 nondenaturing 및 변성 샘플의 경우에 젤 renaturation 후 fluorimetry, 분리 supernatants의 샘플 페이지, 및 형광 단백질 구성 요소 또한 분석할 수 분석 결과 분석할 수 준비, 각각. 세 가지 분석 결과 샘플 종류 또한 각 그림에 설명 된: C 기판 제어, B = = 기판 빈, 그리고 R = 반응. 기판 제어 샘플 기판 빈 동안 차입 버퍼에 있고 반응 샘플 분열 버퍼에 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58824/58824fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a> 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>버퍼</td>
			<td>형광 단백질</td>
			<td>슬로프 (%)의 CV %</td>
		</tr>
<tr>
<td>차입</td>
			<td rowspan="2">mTurquoise2</td>
			<td>6.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>분열</td>
			<td>9.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>차입</td>
			<td rowspan="2">mApple</td>
			<td>10.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>분열</td>
			<td>12.68</td>
		</tr>
</tbody></table>표 11: 기판 교정 곡선의 차이 (%CV) 값의 계수. 재조합 형 단백질 기판의 형광 삽입된 분열 사이트에 따라 달라 집니다 여부를 테스트 하려면 교정 mApple mTurquoise2 융합 기판 (6 변종, 각 포함 하는 다른 분열 사이트의 시리즈에 의해 수행 되었다 에이즈-1 효소의 시퀀스), 차입 및 분열 버퍼에서 둘 다. 우리는 슬로프의 CV % 값은 단일 기판 교정 기판 변형 같은 형광 태그를 포함 하 여 수행 하는 다른 측정의 평가 위해 이용 될 수 있다 의미는 모든 경우에, 15% 미만 발견.

여기, 우리 N 터미널 hexahistidine/맥 아당 의무적인 단백질 및 형광 단백질 융합 재조합 기판 니켈 nitrilotriacetic의 표면에 부착 된 최근에 개발한 효소 분석 플랫폼의 상세한 절차를 제시 산 자기 agarose 구슬입니다. 나트륨 라우릴 황산 polyacrylamide 젤 전기 이동 법으로 분리 분석 결과 샘플의 후속에 젤 분석 또한 제공 됩니다.

형광 효소 분석 결과 플랫폼에 그들의에서 젤 Renaturation 재조합 융합 단백질의 사용

Proteases are intensively studied enzymes due to their essential roles in several biological pathways of living organisms and in pathogenesis; therefore, ...

프로테아제는 학술 및 산업 연구에서 생체 분자 지원의 가장 조사 된 그룹 중 하나입니다. 몇몇 생리적이고 병리학적인 프로세스에 있는 그들의 강력한 역할은 그(것)들을 또한 약 발견의 분야에서 눈에 띄는 표적으로 만듭니다. 그들의 집중적인 연구에 관해서는, 시간 및 비용 절감 고처리량 검열 호환 형광 프로테시 플랫폼의 개발에 대한 크고 지속적인 수요가 있다.여기서, 우리는 mTurquoise2-mApple 융합 재조합 융합 프로테아제 기판을 모두 사용하여 분리 계 고처리량 스크리닝 호환 형광 분석 플랫폼의 적용을 위한 프로토콜을 소개하고 싶습니다. 또한, SDS-PAGE를 폐기한 후 분석 시료의 기판 및 분열 단편의 인겔 레아처링에 대한 방법을 시연하고자 한다. 모든 실험은 HIV-1 바이러스 프로테아제의 예에서 수행됩니다.발현 플라스미드는 육각형 히스타딘 친화성 태그와 말토스 결합 융합 단백질의 코딩 서열을 전달한 다음 담배 에칭 바이러스 프로테아제, 복제 카세트 및 C-말단 형광 단백질의 제어 분열 부위를 전달한다. PacI 및 NheI 제한 엔도니슬리스를 통해 표현식 플라스미드를 선형화합니다. 앞으로 최적화된 대장균 코돈의 어닐링을 수행하고 PacI 및 NheI 응집력 끝에 의해 관심과 측면의 기판 시퀀스에 대한 코드 올리고뉴클레오티드 프라이머를 역으로 한다.선형식 플라스미드에 어닐프라이머를 삽입하여 결찰한다. 단백질 발현을 위해, 결찰 혼합물에 의해 BL21(DE3)유능한 세포를 변환한다. 형광 단백질은 성공적인 결찰 후에만 N 단말 융합 태그와 동일한 개방 판독 프레임에 있을 것입니다.변형 후 며칠 후, 접촉된 분열 부위를 코딩하는 발현 플라스미드를 함유한 콜로니는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터를 사용하지 않고도 눈에 보이는 형광을 표시한다. 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 5밀리리터 LB 배지에 관심 있는 5밀리리터 LB 배지에 관심 있는 분단 부위 시퀀스를 위해 발현 플라스미드 코딩을 운반하는 BL21(DE3) 세포의 10개의 마이크로리터 글리세롤 스톡을 첨가한다. 서스펜션을 15시간 동안 37도에서 배양하여 끊임없이 흔들어 보시고 있습니다.밀리리터 암피실린 당 100 마이크로그램을 함유한 5밀리리터 신선한 LB 배지에 5밀리리터 세균 배양을 전달합니다. 600 나노미터 파장에서 세포를 37도에서 0.6 ~0.8로 성장시다. 이 시점에서, IPTG의 첨가에 의한 단백질 발현을 유도한다.이후 37도에서 3시간 동안 문화를 배양하면서 지속적으로 흔들리고 있습니다. 인큐베이션 후, 배양25밀리리터를 깨끗한 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 원심분리에 의해 세포를 수확한다. 상체를 버리고 세균성 세포 펠릿을 영하 70도에서 적어도 한 시간 동안 보관하십시오.성공적으로 발현된 형광 단백질을 함유한 세포 펠릿은 다크 리더 블루 트랜실루미나이터를 사용하지 않고도 형광을 명확하게 보여준다. 얼어붙은 셀 펠릿을 얼음 위에 놓고 15분 동안 해동합니다. 펠릿에 2밀리리터 리시스 버퍼를 추가하고 세포를 일시 중단합니다.그 후, 프로테아제 억제제를 추가하고, 리조지메와 DNase에 의한 현탁액을 해제하고, 세포를 일시 중단하고, 15분 동안 얼음에 현탁액을 배양한다. 1밀리리터 서스펜션을 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브로 옮기고 10초의 초음파 처리 와 5초 의 휴식으로 3분 동안 서스펜션을 초음파 처리합니다. 실온에서 20분 동안 10g, 000g의 원심분리기.어세서의 형광기기류를 함유한 클리어된 세균성 세포 용해는 다크 리더 블루 트랜실루미나이터의 유무에 관계없이 눈에 보이는 형광을 보여준다. 개발 된 프로테아제 분석의 절차는 분석 샘플의 준비로 시작됩니다. 첫째, 재조합 기판은 궁합 자기 구슬과 배양되고, SAMB로 약어된 기판 부착 자성 구슬이 형성된다.SAMB는 여러 번 세척되고, 마지막으로 SAMB 재고 용액은 분석 샘플이 생성되는 알리쿼팅에 의해 제조됩니다. 반응은 프로테아제용액의 첨가에 의해 초기화된다. 프로테아제에 의한 분열시, 프로테오리스틱 파편은 상체로 방출된다.반응은 형광 분열 제품 및 효소를 포함하는 반응 버퍼로부터 자기 구슬의 분리에 의해 종료된다. 초월제는 마이크로티터 플레이트의 우물에 적용되고 형광은 형광에 의해 결정된다. 교정 곡선은 각 분석 버퍼에서 해결된 정제형 형광 기판을 사용하여 생성됩니다.C-말단 형광 분열 제품의 농도와 또한 분석 샘플에 적용된 기판의 농도는 교정 곡선의 경사에 기초하여 결정된다. 새로운 또는 재활용 니켈-NPA 자기 아가로즈 구슬을 포함하는 튜브를 자기 입자 농축기에 놓습니다. 구슬은 마이크로 센심 분리기 튜브의 벽 및 / 또는 뚜껑에 붙어있을 수 있습니다.따라서 모든 구슬이 수집되는지 확인하기 위해 농축기를 모든 방향으로 거꾸로 설정합니다. 상체를 제거하고 폐기합니다. 구슬에 1.8 밀리리터 리시스 버퍼를 추가하고 농축기에서 닫힌 튜브를 제거합니다.구슬이 완전히 균일할 때까지 튜브를 흔들거나 거꾸로 돌리거나 튜브의 구슬을 중단합니다. 튜브를 농축기에 다시 놓고 모든 구슬이 수집되는지 확인하기 위해 모든 방향으로 거꾸로 놓습니다. 튜브를 열고 상체를 폐기합니다.관심기판이 함유된 클리어드 박테리아 멸균 용재를 추가하고 농축기에서 폐쇄된 튜브를 제거합니다. 구슬이 완전히 균일할 때까지 튜브를 거꾸로 돌리고 30 분 동안 실온에서 천천히 회전기에 의해 튜브를 회전시 회전합니다. SAMBs는 다크 리더 블루 트랜일루미나이터의 사용 없이도 눈에 보이는 형광을 보여줍니다.SAMB를 1.8 밀리리터 1%Tween 20, 세척 버퍼 및 골짜기 버퍼로 세 번 세척합니다. 세척된 SAMB에 골짜기 버퍼를 추가하여 SAMB 스톡 솔루션을 만듭니다. 2밀리리터 단백질-저결합 마이크로센심분리기 튜브를 사용하는 경우, 적용된 골짜기 버퍼의 부피는 최대 1.9 밀리리터이다.버퍼를 추가한 후 튜브를 흔들거나 거꾸로 돌리지 마십시오. 튜브를 닫고 농축기에서 제거합니다. 분석 샘플을 위해 2 밀리리터 단백질-저결합 미세원심분리기 튜브를 준비합니다.SAMB 스톡 솔루션을 완전히 균일해질 때까지 중단하고 SAMB 주식 용액을 즉시 샘플 바이알로 전송하여 반응에서 분석할 기판의 양을 측정합니다. 전송할 SAMB 스톡 솔루션의 부피는 25~300마이크로리터로 권장되지만 개별 실험 설계에 따라 설정되어야 한다. 알리인용 SAMB 현탁액을 포함하는 샘플 튜브를 농축기에 배치합니다.신중하게 SAMBs에서 상체를 제거하고 폐기. 농축기에서 튜브를 제거하고 SAMB에 반응 버퍼를 조심스럽게 추가합니다. 추가된 반응 버퍼의 부피는 개별 실험 설계에 따라 계산되어야 하지만, 2밀리리터 튜브를 사용하는 경우 50~150 마이크로리터 사이의 반응 혼합물의 최종 부피를 설정하는 것이 좋습니다.튜브의 뚜껑을 닫습니다. 이제 샘플이 초기화될 준비가 되었습니다. 효소 용액을 반응 샘플에 추가합니다.튜브를 부드럽게 움직여 구슬을 조심스럽게 저어내고 튜브를 이미 흔들리는 열셰이커에 즉시 넣습니다. 기판 빈 샘플 및 기판 제어 샘플의 경우, 각각 골짜기 버퍼 및 용출 버퍼를 추가합니다. 인큐베이션이 끝나기 30초 전에 열셰이커에서 샘플을 꺼내 서즉시 회전합니다.튜브를 농축기 위에 놓고 튜브가 15초 동안 방치하십시오. SAMBs의 컬렉션은 농축기를 앞뒤로 약간 이동시킴으로써 촉진될 수 있다. 뚜껑을 열고 상체를 조심스럽게 접시 나 새 튜브로 옮기십시오.파이펫 의 끝에 의해 농축 구슬을 만지지 마십시오. 기판 대조군 샘플및 높은 수준의 분열로 반응 시료의 수집된 상체는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터를 사용하지 않고도 눈에 보이는 형광을 나타낼 수 있다. 분리된 시료 수퍼나티의 2회 30마이크로리터를 검은 반면적 마이크로플레이트로 옮긴다.적용된 형광 단백질에 따라 적절한 필터를 사용하여 형광계에 의한 형광을 측정한다. 형광 기판의 정제를 위해, 이전에 설명한 것과 동일한 용액을 준비하고, 상판을 폐기한다. 400~600마이크로리터 용출 버퍼를 SAMB에 추가하고 실온에서 회전기로 튜브를 5분간 천천히 회전합니다.용액을 새로운 단백질 저결합 미세 원심 분리튜브로 전달합니다. 다크 리더 블루 트랜일루미나이터의 유무에 관계없이 명확하게 보이는 형광을 보여줍니다. 정제, 완충 교환 및 단백질 함량의 측정 후, 용출 버퍼-및 골짜기 버퍼-해결 기판 용액으로부터 적어도 8단계로 2배 연속 희석을 준비하여 각각 희석또는 분열 버퍼를 이용하여 한다.각 희석 점의 마이크로리터 30개를 검은 반면적 마이크로플레이트로 옮긴다. 분석 시 초월제의 측정에 적용된 것과 동일한 설정을 사용하여 형광계에 의한 형광을 측정한다. 데이터 처리를 위한 예로, HIV-1 프로테아제의 기판 의존적 운동 측정은 천연 갭 단백질 전구체에서 매트릭스와 캡시드 단백질 사이의 분열 부위를 코딩하는 재조합 기판의 mTurquoise2-융합 형태로 수행되었다.정제된 기판의 어금니 농도에 대해 보정된 상대형형광 강도 값을 플롯하고, 분열 또는 용출 버퍼를 해결하고, 선형 회귀를 수행한다. 분열 버퍼 계 교정 곡선의 경사를 이용하여 반응 샘플에서 C 단말 분열 제품의 어금니 농도를 계산한다. 또한 용출 버퍼 계 교정 곡선의 경사를 이용하여 기판 제어 샘플에서 용출기의 용출 된 기판의 어금니 농도를 기반으로 반응 샘플에서 적용 된 기판 농도를 계산합니다.초기 속도 값은 C-단말 분열 단편의 양으로부터 계산된 다음 적용된 기판 농도에 대해 플롯하였다. 또한 운동 매개 변수는 Michaelis-Menten 비선형 회귀 분석에 의해 결정되었다. 니켈-NTA 자기 비드 계 분석체를 수행한 후, 분석 수퍼나티는 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의해 분석될 수 있다.그러나, 분석 시료의 분석 외에도, 용액 소화 후 정제형 형광기및/또는 분열 단편을 분석할 수도 있다. 용액 소화를 위해, 1.5 밀리리터 미세센심분리기 튜브로 분열 완충체에 용해된 소화되는 정제형 형광 기판을 알리옴표하고, 효소 용액을 샘플에 첨가한다. 실험 설계에 따라 샘플을 배양하고 PAGE에 대한 샘플 준비 절차에 의해 반응을 종료합니다.비자연적 샘플 제제의 경우, 분석할 시료를 감소 에이전트를 포함하지 않는 비덴토 샘플 적재 버퍼와 혼합합니다. 변성 시료 제제의 경우, 시료를 분해시 로딩 버퍼와 분석하여 샘플을 혼합하고 샘플을 95도에서 10분 동안 열처리에 노출시킵니다. SDS 폴리아크라이알라미드 젤의 우물에 비변성 및 변성 샘플을 적용하고 전기 포뇌를 수행합니다.러닝 모듈에서 젤 카세트를 제거합니다. 비변성 샘플은 육안으로도 또는 다크 리더 블루 트랜실루미네이터에서도 젤에서 이미 볼 수 있습니다. 트랜스유미나이터상 변성 시료의 형광 성분을 검출하기 위해, 젤로부터 SDS를 세척하여 인겔 레나티션을 수행한다.100 밀리리터 증류수를 젤에 넣고 적어도 30분 동안 헹구습니다. 다크 리더 블루 트랜실루미에이터에 얼룩이 없는 젤을 배치하여 형광 단백질을 시각화합니다. 재조합 형광 융합 단백질은 프로테오리스틱 분석기의 기판으로 사용되도록 설계되었다.특정 분열 부위에서 프로테아제에 의한 분열시, C-말단 형광 분열 단편이 방출되고 그 형광이 검출될 수 있다. 니켈-NTA 자기 비드 기반 분석 및 PAGE 분석에 의한 형광 검출에 대한 사용이 HIV-1 프로테아제(HIV-1 protease)를 사용하여 최적화되었습니다. 그러나, 개발된 분석 플랫폼은 다른 프로테아제에도 적합할 수 있다.골짜기 또는 용출 완충제로 해결된 정제기의 교정 곡선은 천연 HIV 무반향 단백질의 매트릭스와 캡시드 단백질 사이의 분열 면을 코딩하는 재조합 기판의 mTurquoise2-mEYFP-융합 형태의 예를 예시한다. 니켈-NTA 자기 비드 계 분석은 반응 속도에 기판 농도의 효과를 검사하기 위한 유용한 도구이며, 따라서 또한 Vmax 및 Km과 같은 효소 운동 파라미터의 결정을 가능하게 한다. 다이어그램 A는 mApple 융합 기판에서 기판 의존 활성을 성공적으로 수행한 후 얻은 최적의 결과를 보여줍니다.대조적으로, 다이어그램 B는 SAMB 스톡 솔루션의 불균성 화가 적절한 기판 농도를 설정하는 데 문제를 야기하는 최적 결과를 제시하며 반응 샘플의 부적절한 종료로 인해 상대적으로 높은 오류가 발생합니다. 분석은 또한 시간 과정 및 억제 연구를 수행하기위한 적절한 도구를 제공합니다. 다이어그램 A는 mEYFP-융합 기판에 대한 HIV-1 프로테아제의 프로테오리틱 분열의 시간 의존성을 나타내고, 도면 B는 절단 반응에 대한 암프로나비르의 억제 효과를 나타낸다.억제 연구에 의해 얻어진 데이터로부터, 활성 효소 농도 와 억제 상수를 모두 결정할 수 있다. 분석은 또한 pH에 효소 활동의 의존성을 연구하도록 최적화될 수 있으며, 담배 에칭 바이러스 프로테아제의 예에 대한 다이어그램 A로 표현되기 때문입니다. 다이어그램 B는 pH에 의한 분석법의 한계를 나타내며 중성 또는 약간 알칼리 pH가 측정과 완전히 호환된다는 것을 보여주며, 산성 pH는 자기 구슬 표면으로부터 기판의 자발적인 해리를 용이하게 한다.본 수치는 HIV-1 프로테아제에 의한 용액 소화에 의해 생성된 정제된 형광기, 형광 C 단자 분열 단편을 나타낸다. 형광 성분은 시료 제조 중에 비데스팅 조건이 적용된 경우 전기전경 직후 청색광 과균에 의해 SDS 함유 폴리아크라일아미드 겔에서 검출될 수 있다. 다른 형광 단백질은 그들의 색깔에 따라 분화될 수 있습니다.자기 비드 기반 분석 후, 샘플 수퍼나티제내의 비변성 형광 단백질도 UV 조명에 의해 겔에서 검출될 수 있다. 대조적으로, 시료 제조 중에 변성 된 단백질을 분해하는 조건이 적용되는 경우, SDS PAGE 직후에 젤에서 변성 단백질을 검출할 수 없다. 그러나, 변성 형광 단백질은 젤로부터 SDS를 제거함으로써 부분적으로 재변될 수 있고 검출될 수 있다.따라서, SDS PAGE는 인겔 레처화 절차뒤에 선행된다. 형광 단백질의 레나톤 능력은 형광에 기초한 뿐만 아니라 분자량에 기초하여 그들의 확인을 가능하게 합니다. 여기에서 우리는 최근에 개발 된 자기 비드 기반 형광 프로테아제 분석 플랫폼의 사용을위한 프로토콜을 시연했습니다.우리는 HIV-1 protease에 효소 운동 연구의 예에 이 시스템의 사용을 입증했습니다. 우리는 프로테아제의 분열 부위 서열을 포함하는 재조합 분석 기판의 mTurquoise 및 mApple 융합 형태를 사용했습니다. 형광 분석 외에도 분석 샘플도 SDS PAGE에 의해 분석되었습니다.우리는 변성 형광 단백질이 기판과 프로테오리스틱 단편의 형광 및 분자량 기반 식별을 모두 제공하는 SDS PAGE 후에 젤에서 부분적으로 재성화될 수 있음을 입증했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

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