Name: 생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 배우세요 비소가 피부 세포 마이그레이션에 미치는 영향을 스크래치 어세이로 분석하는 방법을. 이 기법은 상처 치유 메커니즘 연구와 임상 치료 전략 개발에 활용됩니다.

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이 간행물에서 보고 된 연구는 소수 보건 및 보건 불균형의 보너스 번호 U54MD012388에서 건강의 국가 학회에 국가 학회에 의해 지원 되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다.

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</ol>

저자는 공개 없다.

이 분석 결과의 응용 프로그램 셀룰러 이동의 높은 처리량 및 적절 한 평가 제공 하 고 복잡 한 생리 시스템5,,67직접 번역할 수 있습니다. 이런 이유로 제안 된 벤치 탑 모델 조정 되어과 상처 치유6에 다양 한 치료제 및 환경 독 소의 효과 평가 하기 위해 연습. 현재 연구에 사용 된 비소의 농도의 알려진된 노출 수준, 광범위 한 문학 검색을 통해 환경 관련 지었다 그리고 다양 한 데이터의 회고전 검토에서 기초14,15, 16,17,,1819,,2021. 이 생체 외에서 스크래치 분석 결과의 사용 시연 내 환경 관련 범위 하지만 높은 비소 농도에 노출, 지연 상처 폐쇄 (셀룰러 마이그레이션).
이 벤치 톱 모델 또한 격리 하 고 더욱 구와 마이그레이션 상처 치유 결과에 기여 하는 방법을 이해 하는 개별 셀 라인 (fibroblast) 공부 고용 되었다. 또한, 분석을 방해할 수 있는 복잡 한 생체 내에서 시스템에서 다른 많은 세포와 조직 현재 개별 셀 라인의 기능을 공부 하기 어렵습니다. 또한, 분석 결과 반 양적 % 상처 폐쇄 데이터 대상으로 특정 세포 메커니즘을 통해 화합물 영향을 미칠 수 상처 치유 하는 데 사용할 수를 달성 하는 수단을 제공 합니다. 예를 들어 스크래치 시험에 사용 되는 셀 수집 및 저장 원하는 시에 하 수 유전자 발현에 사용 (신호 mRNA) 또는 단백질 표정 분석 실험22. 그들은 어떤 신호 또는 단백질 대부분에 기여 수 있습니다 다양 한 트리 트 먼 트 (즉, 비소)22존재 세포질 마이그레이션에 변화 이해를 추구 하는 경우이 정보 조사에 유용 수 있습니다.
인간의 신생아 피부 섬유 아 세포는 상처 치유에 있는 그들의 저명한 역할에 따라이 작품에 대 한 선정 됐다. 그러나,이 스크래치 시험 프로토콜 구현 되었습니다 사용 하 여 다양 한 세포 유형 및 다양 한 연구 목적에 대 한. 예를 들어 스크래치 분석 결과 마이그레이션 억제 화학요법 약23;의 공부에 대 한 종양학 분야에 채택 되었습니다. 골격 근육 세포 이동, 확산, 고 확산24; 세포질 마이그레이션25;에 식물 추출 물의 효과 연구 하 그리고 이해를 어떻게 keratinocyte 마이그레이션 및 확산에 기여할 상처 치유9. 또한, 핀 토 외 에 의해 이전 종이 스크래치 분석 결과6을 사용 하 여 hDFn 마이그레이션에 우라늄 (U) 및 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 효과 평가 합니다. 이 작품의 목적은 정도는이 분석 결과 속도 셀룰러 마이그레이션 (PRP)를 생각 하는 에이전트 및 셀룰러 마이그레이션 (U), 천천히 생각 하는 에이전트의 효과 테스트할 수를 이해 하는 것 이었다. 앞서 언급 한 작품에서 볼 수 있듯이 고 다른 수 사관, 스크래치 분석 결과의 응용 연구 잠재력이 높은 사용에 대 한 다양 한 실험 모델26에. 메서드 내에서 제공 하는 세부 사항에도 불구 하 고 조사와 실험 사이 차이 예상 한다. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 속도 사용, 독특한 셀 형식에 필요한 필수 미 량 영양소 뿐만 아니라 셀 라인에 따라 변동 가능성이 것입니다. 셀 생산량 및 생존에 도움이 중요 한 관측의 많은이 프로토콜을 통해 노트 로 표시 됩니다. 그러나, 조사 일반 셀 문화 작품 보충 지시로이 메서드를 사용 하 고 최적의 성장 조건에 대 한 제조업체의 권장 사항을 따라 하는 것이 좋습니다.
스크래치 분석 결과 세포 활동의 연구에 대 한 매우 다양 한 뜻하지 않은 편견 측정 기술에서 발생할 수 있습니다. 예를 들어 ImageJ를 사용 하 여 수동으로 셀 마이그레이션 전선 추적을 변형 정확도 및 대표 데이터 수집을 제한할 수 있는 사용자 간에 존재할 수 있습니다. 또한는 마이그레이션 전선 읽어야 장 님 사용자 바이어스를 최소화 하기 위해 치료에 주목 한다. 또한, 수동으로 마이그레이션 전선 식별 pseudopod 형성으로 인해 세포와 그들의 능력을 시각적으로 오해의 소지가 될 수 있는 형태 초점 유착에 밖으로 도달 하 여 여행 평균 거리의 오산 발생할 수 있습니다. 방식 처럼, 세포 표면에 형광 "셀 추적기"를 사용 하 여 염료 또는 마이그레이션 감지 하 핵 단백질 실수로 시간이 지남에 셀룰러 마이그레이션 측정할 때 부정확의 결과로 세포를 해결할 수 있습니다. 적절 한 긍정적인 또는 부정적인 컨트롤 완전히 엉덩이를 실험에 내에서 등록 하는 것이 좋습니다 셀 라인에 치료의 효과. 이 분석 결과의 실천의 한계 인식 완료 되어야 합니다. 이 분석 결과 체 외 실험에서 얻은 세포 마이그레이션 결과 vivo에서 결과. 을 직접 번역 것입니다 보장 하지 않습니다. 복잡 한 생활 시스템에서 상처 치료 및 세포 마이그레이션 포함 다양 한 세포 유형 및 분자 신호; 각각의 치료 응답에 영향을 미칠 가능성이 있다.
요약 하자면, 스크래치 분석 결과 환경6,25변화 하는 응답에 세포질 이동의 높은 처리량 검열 제공 발견 되었습니다. 우리는 특히 성공적으로 다양 한 환경 관련 복용량에서 비소 노출의 결과로 세포 마이그레이션에 변화를 감지 하이 프로토콜 활용. 이러한 데이터를 사용 하 여 스크래치 분석 결과 연구를 추가 하 고이 분석 결과에 이러한 경로 비소 노출에 의해 변경 되는 방법을 세포 이동의 기계적 경로 평가 정당화 제공.

상처 치유 단계를 포함 하는 다양 한 세포 유형, 신호 분자 및 세포 외 매트릭스 구성 요소1중복의 복잡 한 일련의 구성 됩니다. 함께, 이러한 구성 요소는 상처 해상도 또는 외상1의 정도 따라 보호 fibrotic 흉터의 형성에 이르게 궁극적으로 복구를 달성 하기 위해 콘서트에서 작동. 개별 프로세스와 상처의 기능을 하나의 실험에서 치유 어렵습니다; 상처 치유 과정에서 각 단계 확인을 별도로 테스트 해야 합니다. 상처 치유의 여러 단계 중 세포 마이그레이션 프로세스 간주 되었습니다 중요 한 치유 속도2를 평가할 때. 세포질 마이그레이션 상처 치유의 모든 단계에서 관찰 될 수 있다 하 고 따라서 더 셀 마이그레이션 변경 상처 폐쇄 영향을 미칠 수 어떻게의 이해를 필요로. 예를 들어 셀룰러 마이그레이션 모두 초기 및 늦은 단계 염증, 상처 사이트3에서 혈액 응고와 혈소판 집합에에서 표시 됩니다. 이 이벤트는 조직3없는 부 상자 영역을 채우기 위해 임시 방해를 형성 하 여 과도 한 혈액 손실 방지. 순환에서 혈소판 합성 하 고 분 비 혈 요인, 마이그레이션용 염증 성 백혈구 (백혈구)에 대 한 상처 조직에는 함께 신호 수리4함께 vasoactive 중재자. 다시 epithelialization 조직 부상의 시간 이내 발생 하 고 취재 활동 및 더 오염을 방지 하기 위하여 상피 keratinocytes의 마이그레이션 또는 상처 사이트2외국 입자의 침공을 통해 상처 사이트 포함. 이러한 예제는 많은 셀 마이그레이션 기능 관련 된 몇 가지 상처 치유만 캡처.
스크래치 분석 결과 설명 되었고 셀 마이그레이션 및 상처 치유5,6에 그것의 많은 역할을 더 잘 이해 하는 데 사용. 이 분석 결과 단순한 것으로 간주 됩니다, 높은 처리량을 제공 하 고 대표 셀 마이그레이션 데이터를 수집 조사 수 있습니다. 마이그레이션 분석 실험은 특정 화합물 가속 수 있습니다 또는 셀룰러 마이그레이션6의 속도 느리게에 성공적으로 설명 했다. 또한, 이러한 분석 결과 농도, vivo에서 실험 전에 관심의 유전자를 주입 하는 대상 치료를 공식화 하는 데 사용할 수 있는 변환 생리 정보를 제공 합니다. 분석 결과 기본적인 세포 문화 기술 및 용품, 선택, 및 이미징 기술을 운동 시간이 나 운동 치료에 대 한 응답에서을 통해 캡처의 셀 라인 필요 합니다.
분석 결과 쉽게 조작 하거나 탐정의 요구에 맞게 맞춤 될 수 있습니다. 그러나, 실험 하기 전에 고려해 야 할 4 개의 기본적인 질문 있습니다. 어떤 일반 또는 특정 질문은 /는 외관이 대답 하려고? 이 연구를 주도 대부분 가설에 대 한 진정한 보유 하 그러나,이 분석 결과에 중요 한 때문에 이다 그것은 결정할 것입니다 많은 매개 변수에 정확 하 게 하는 데 필요한 완전히는 질문 대답 무슨 선 세포 또는 (해당 되는 경우 여러) 라인 셀 공부 되 고 생리 시스템을 표현 하기 위해 사용 해야 합니까? 예를 들어 치유 연구, 피부 섬유 아 세포5,,67,8, 줄기 세포 피부에 상처 또는 표 피 keratinocyte9 일반적으로 발견 되는 세포 인구를 대표 하는으로 간주 될 수도 에 피부 조직10에서 풍부. 또는, 호 중구, 대 식 세포 또는 다른 염증 세포 수 평가 셀 마이그레이션 상처 치유 피부 조직10의 다른 구성 요소를 나타내는 데이 시스템. 또한,는 시 약은 세포 신진 대사 활동을 촉진 하는 데 사용할 최적의 식별 하는 데 도움이 됩니다 평가 특정 셀 라인을 식별. 어떻게 셀 이동 추적/몇 군데 있을 것인가? 셀 마이그레이션 접시 또는 플라스 크 내에서 관찰 하는 데 사용 하는 기술도 많습니다. 염색 또는 붙일 셀 태그를 사용 하 여 형광 또는 confocal 이미징 셀 추적 세포 대 세포 비 위치 및 세포질 운동11 명확 하 게 정의 하는 탐정을 수 있는 강한 대조를 제공 하는 예를 들어 . 이 연구에서 설명 하는 또 다른 일반적인 기술은 위상 대비6,7거꾸로 가벼운 현미경의 사용 이다. 셀 염료 및 형광이이 대안 말기 이미징 이전 셀을 수정 하지 않고 트랙 셀 사는 사용자 허용 하 고 개별 우물 시간 지점에서 셀의 부상된 monolayers를 포함 하는 동일의 이미지를 캡처 수 있습니다. 어떤 결과 측정 하는 것은 분석에 사용할 수 것입니다? 연구를 통해 모여 이미지를 사용 하 여 셀룰러 마이그레이션 속도 변화를 이해할 수 있는 데이터를 생성할 수 있습니다. 우리 실험실에서 현미경 이미지 반전된 가벼운 현미경에서 캡처한 이미지 분석 소프트웨어를 업로드 하 고 백분율 상처 폐쇄 및 곡선 (AUC) 아래 요약된 영역 계산 됩니다.
우리는 알려진된 환경 오염 물질, 비소의 피부 섬유 마이그레이션 변경 내용을 명료 하이 분석 결과의 구체적인 사용 강조 표시 됩니다. 비소는 자연스럽 게 발생 준금속 지구의 표면에서 발견. 다양 한 위치 비소, 이러한 위치 근처에 사는 개인에 게 위험이 높은 수준의 발견 되었습니다. 결과적으로, 음식과 물 소스 비소 오염, 비소에 노출 되는 개인에 대 한 가능성을 증가의 레벨을 증가 표시 되었습니다. 환경 비소 노출 위 또는 심지어 아래 현재 미국 환경 보호 기구 (USEPA) 최대 오염 물질 수준 (MCL) 10 ppb (10 µ g/L)12, 의 인구에 장기 건강 결과가지고 표시 되었습니다. 13.이 제한을 초과 하는 비소 농도 USEPA는이 MCL을 설정 하 고 그것을 마시는 한계에 대 한 안전한 것으로 간주, 비록 전세계 물 소스에 흔히 되지 않습니다. 남서 미국에 수많은 지 하 수, 우물 물, 그리고 스프링 비소14의 수준에 관한 포함 하도록 문서화 되었습니다. 예를 들어 베르데 밸리, AZ, 몬테 주 마 잘 비소15의 210 µ g/L를 포함합니다. 베르데 강, AZ 주위 지 하 수는 1.3 mg/L15,16를 도달 하는 피크 값 평균, 비소의 16 µ g/L를 포함 합니다. 특히, 베르데 강 물 창 고에 많은 스에서 비소 농도 초과 50 µ g/L15,16. 이 지식으로, 환경 관련 비소 농도 했다 10 µ M (750 ppb) 현재에에 MCL 위에 연구14,,1516 MCL 0.1 µ M (7.5 ppb)에 그 범위를 선정 , 17 , 18 , 19 , 20 .
이 실험에서 수집한 정보 비소로 오염 된 셀룰러 마이그레이션 속도는 비보에 상처에서 잠재적인 변화의 초기 표시기로 사용 됩니다. 그 후, 상처 치유와 세포 이동 촉진의 역할에 따라 신호 분자를 선택할 수 있습니다. 그리고 미래의 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량) 기반 유전자 식 실험 전류에의 완료에 따라 설정할 수 있습니다. 연구입니다. 이 분석 결과에서 마이그레이션 속도 변경 비소의 존재, 특정 유전자 목표 세포 마이그레이션에 관련 된 비소의 해로운 효과 대 한 대상 수 있으며 따라서 장애의 메커니즘을 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>클래스 II A/B3 생물 안전 캐비닛</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>니트릴 장갑</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>정밀</td><td>모델 182</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Leica</td><td>Q080318</td><td></td></tr><tr><td>CPR 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td>분석 저울</td><td>오하우스</td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>가중치 용지</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 위험 백</td><td>Fisherbran</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>자동 피펫</td><td>드러먼</td>드 <td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 피펫</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>분모</td><td>Fisher Scientific</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>T75 조직 플라스크</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원뿔형 튜브</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원뿔형 튜브</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>조직 마커</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>와이프</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% 에탄올</td><td>Fisher</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>비필터 피펫 팁</td><td>Fisherbrand</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>표백제</td><td>Great Value</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96-well</td><td>Falcon</td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial Rack</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>Hemacyometer</td><td>Gizmo Supply</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브 랙</td><td>n/a</td> 해당 <td>없음</td><td></td></tr><tr><td>12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>폐기물 비커</td><td>해당 없음</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 에지 눈금</td>자 <td>n/ a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>인간 신생아 진피 섬유아세포(hDFn)</td><td>lot: 1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio 통계 소프트웨어</td><td></td><td>버전: 3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>이미지 J</td><td>NIH</td><td>버전: 1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

상처 치유의 생리 적인 메커니즘을 이해 몇 년 동안 지속적인 연구의 초점 되었습니다. 이 연구는 직접 임상 표준 상처 치료 및 환자에 대 한 병 적 상태와 사망률 감소에 대 한 사용에 변화를 변환 합니다. 상처 치유 전략적 세포 및 조직 상호 작용 및 기능을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 상처 치료의 많은 매우 중요 한 기능 중 하나는 개인 및 집단 셀룰러 마이그레이션입니다. 부상 시 빠르게 연결, 그리고 상피 조직 주변 혈액에서 다양 한 세포 화학 및 물리적 자극을 통해 상처 사이트에 마이그레이션합니다. 이 마이그레이션 응답 결과 상처를 치유의 성공에 크게 지시 수 있습니다. 이 특정 세포 기능을 이해 하는 것은 변환 약 치료 결과 향상 된 상처로 이어질 수 있는 중요 합니다. 여기, 우리는 상처 치유, 그리고 어떻게 세포 환경에 변경 내용을 크게이 과정을 변경에 관련 된 세포 마이그레이션 이해 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 예제에서는 연구, 피부 섬유 아 세포 단층 문화 조직 배양 플라스 크에로 미디어 소 태아 혈 청 (FBS)와 보충에서 성장 했다. 셀 aseptically 취급 하는 조직 문화 12-잘 접시로 전송 되었고 100% 합류로 성장. 합류에 도달, p200 피펫으로 팁을 사용 하 여 셀은 단층에 긁힌 수직으로 했다. 비소 문화 미디어 FBS와 보완에 희석에 추가 되었습니다 개별 우물에서 환경 관련 복용량 0.1-10 M. 이미지까지 거꾸로 가벼운 현미경 관찰 셀룰러 마이그레이션 (상처를 사용 하 여 24 시간 기간 동안 모든 4 시간 (h)를 점령 했다 폐쇄)입니다. 이미지, 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 개별적으로 되었다 및 % 상처 폐쇄 계산 했다. 결과 비소 상처 치유 감속 하는 방법을 보여 줍니다. 이 기술은 상처 치유에 오염 물질의 효과의 평가 대 한 신속 하 고 저렴 한 첫 번째 화면을 제공합니다.

모든 치료 그룹에 대 한 샘플 크기 (n)은 n = 28. 셀 했다 성공적으로 경작된 다음과 같은 무 균 기술 및 실험실 프로토콜 (그림 1). 균일 한 흠집 의미 스크래치 폭 0.8 m m 0.4 m m (그림 2)를 측정 모든 치료 그룹에서 관찰 되었다. 제어 그룹 했다 1,355.83;의 커브 값에서 평균 요약된 영역 치료 그룹으로 0.01 µ M 평균 했다 1,366.21; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 치료 그룹으로 0.1 µ M 평균 1,326.24의 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 했다, 치료 그룹으로 1.0 µ M 평균 했다 1,295.10; 곡선 값 아래에 있는 영역을 표현 그리고 마지막으로 10 µ M 치료 그룹 했다 통계적으로 낮은 535.12의 커브 값에서 평균 총계 지역에 비해 다른 모든 그룹 (p &lt; 0.05) (그림 3). 통계 분석 연구-프로그램 치료 그룹 (p &lt; 0.05) 간의 통계적 차이 확인 하려면 Tukey 특별 게시 조정 일방통행 ANOVA를 실행 사용 되었다.
<img alt="비소 노출 하에서의 세포 성장; 현미경 결과; 대조군, 1.0 μM 및 10 μM As 20시간 이상." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 20 h 기간 동안 대표 스크래치 시험의 이미지. 이미지 A-D 대표 세포 이동 제어 셀; 이미지 E H 대표; 1.0 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션 이미지 L로 10 µ M으로 오염 하는 세포의 세포질 마이그레이션을 나타냅니다. 이 이미지에서 셀룰러 마이그레이션 비소의 둔화는 분명 하다.입니다. 다른 두 처리로 서 그룹 하지 "치유 했다" 하는 동안 컨트롤 이미지 20 h 후 완전히 "치유" 스크래치를 표시 합니다. 치료로 10 µ M 저해 완전 한 폐쇄 후 24 h. 전부 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="비소 용량 반응을 보여주는 막대 차트; 다양한 농도에서 합산된 AUC; 실험 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 비소 스크래치 분석 결과에서 셀룰러 이동 속도가 느려집니다. 이미지 관찰 셀룰러 마이그레이션 속도 비소의 다양 한 농도의 변화를 24 시간 동안 체포 했다. Raw 이미지는 자동화 된 소프트웨어 (예를 들면, MATLAB에서), 어떤 처음 측정된 상처 폭 계산 % 폐쇄 그리고 마지막으로 (AUC) 곡선 아래의 영역을 사용 하 여 분석 되었다. 오차 막대는 뜻의 표준 오류를 나타냅니다. 치료 그룹으로 10 µ M는 통계적으로 인간 피부 섬유 아 세포 신생아 (hDFn) Tukey 특별 게시 조정 (p 일방통행 ANOVA를 사용 하 여 다른 모든 치료 그룹에 비해 통계적으로 낮은 AUC 값 표시의 셀룰러 이동 둔화 &lt; 0.05). 통계적 인 차이 편지 "A"와 "B", R 프로그램에서 사용할 수 있는 소형 문자 표시 방법을 사용 하 여 통해 가져온으로 표시 됩니다. 일반적인 편지를 공유 하지 않는 치료는 서로에서 통계적으로 유의 한 (p &lt; 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

이 연구는 상처 치유 (스크래치 분석 결과의) 메커니즘으로 비소 영향 세포 마이그레이션 등 어떻게 환경 오염 물질을 결정 하기 위한 생체 외에서 모델에 중점을 둡니다. 결과이 체 외 분석 결과 제공 신속 하 고 초기 징후 vivo에서 실험 전에 셀룰러 마이그레이션에 대 한 변경 하는 방법을 보여 줍니다.

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

세포 이동은 치유 상처의 결과를 크게 바꿀 수있는 중요한 상처 치유 과정입니다. 이 프로토콜은 연구원이 상처 치유 도중 세포 이동에 각종 화합물의 효력을 더 잘 이해할 수 있게 합니다. 종종 임상 의학에 대 한 대상된 치료 전략으로 이어질 수 있습니다.스크래치 분석법은 생체 내에서 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요되는 결과전에 의미 있는 상처 치유 데이터를 생성하는 비용 효율적이고 높은 처리량 접근법입니다. 스크래치 분석법은 특히 상처 치유 응용 분야에서 관련이 있습니다. 가장 구체적으로, 피부.그러나, 분석은 실제로 마이그레이션 분석이고, 세포의 이동이 측정하거나 포착하기 위하여 관심 있는 모든 세포 모형에 적용될 수 있었습니다. 고전적인 세포 및 조직 배양과 유사, 표준 수술 절차, 훈련, 기술, 연습, 연습. 이는 스크래치 분석과 함께 성공의 열쇠입니다.절차를 시연하는 것은 석사 과정 학생인 네이선 크루즈와 학부 연구원인 오스카 루잔(Oscar Lujan)이 될 것입니다. 이 절차를 시작하려면 70%의 이소프로필 수성 용액을 사용하여 생체 안전 II 캐비닛을 준비하여 후면 벽과 측면 벽에서 시작하여 베이스 플레이트로 작업하는 위생 물티슈를 수행합니다. 또한 캐비닛에 넣기 전에 분석에 사용되는 모든 재료를 닦아냅니다.다음으로, 원하는 냉동 보존 세포수를 포함하는 바이알을 얻고, 해동하기 위해 섭씨 37도에서 1센티미터 깊이의 수조에 1개를 놓습니다. T75 조직 배양 플라스크에 10%의 FBS로 보충된 10밀리리터의 매체를 추가합니다. 셀 스톡이 포함된 바이알을 열고 용액을 조심스럽게 흡인시합니다.그런 다음 세포를 T75 플라스크로 옮킨다. 플라스크에서 1밀리리터의 미디어를 제거하고 바이알로 다시 옮은 다음 플라스크로 다시 전송하여 유리병으로부터 세포 수율을 최대화합니다. 플라스크의 캡을 조이고 부드럽게 흔들어 전체 표면에 걸쳐 현탁액의 세포를 균일하게 분산시합니다.그런 다음 플라스크에 표시된 정보를 라벨로 표시하고 72시간 동안 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 가습된 인큐베이터에 놓습니다. 먼저, 인큐베이터로부터 조직 배양 플라스크를 회수하고, 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 부착된 세포를 관찰한다. 플라스크에서 전체 양의 미디어를 흡인하여 폐기물 용기로 옮기습니다.플라스크에 균형 잡힌 소금 용액 5밀리리터를 넣고 부드럽게 흔들어 과도한 매체, 죽은 세포 또는 폐기물을 헹구십시오. 그런 다음 플라스크에서 소금 용액의 전체 볼륨을 제거하고 폐기물 용기에 버려십시오. 다음으로, 플라스크에 트립신 의 두 밀리리터를 추가하고 부드럽게 흔들어 부착 된 세포에 효소를 분산시.부착 된 표면이 완전히 포화되었는지 확인하고 조직 플라스크를 인큐베이터에 2 ~ 3 분 동안 배치하십시오. 그 후 플라스크 의 측면을 3~5회 가볍게 탭하여 세포 분리를 용이하게 합니다. 플라스크를 70% 알코올로 닦아 생물 안전 캐비닛에 놓습니다.효소 기판 반응을 중지 하는 조직 플라스크에 스톡 미디어의 5 밀리 리터를 추가 합니다. 플라스크에서 전체 양의 액체를 흡인하고 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기십시오. 원심분리기는 200배, 섭씨 25도에서 5분간.그런 다음 70%의 알코올을 사용하여 펠릿 세포를 포함하는 튜브를 닦아 생물 안전 캐비닛 내부에 놓습니다. 파이펫은 세포 펠릿을 가진 액체의 대략 250 마이크로리터를 남겨두고, 매체에서 떨어져 둡트합니다. 마이크로센심분리기 튜브 랙의 유리병에 걸쳐 원적 튜브의 바닥을 실행하여 신속한 진동을 일으키고 세포 펠릿을 방해하고 재보펜합니다.올바르게 완료되면 새 셀 용액이 남은 펠릿이 없는 흐린 혼합물로 나타납니다. 셀 리서스펜션에 2밀리리터의 미디어를 추가합니다. 튜브의 측면을 부드럽게 위아래로 피펫하여 덩어리를 분해합니다.그리고 총 셀 서스펜션 볼륨을 기록한다. 다음으로 멸균 파이펫을 사용하여 96웰 플레이트의 빈 우물에 트라이판 블루 스톡 20 마이크로리터를 추가합니다. 멸균 파이펫 팁을 사용하여 15 밀리리터 튜브에서 트라이팬 블루 용액을 함유한 우물로 20 마이크로리터의 셀 스톡을 전달합니다.파이펫은 내용물의 혼합을 부드럽게 혼합하고 혈우세포계에 커버 슬립과 계주 챔버 사이에 혼합물의 10 마이크로리터를 전송합니다. 중앙및 4개의 코너 사각형에 있는 세포만 계산하여, 확인된 5개의 사각형에 대한 총 세포 수와 실행 불가능한 셀 수를 따로 집계합니다. 실행 가능한 셀 수를 계산한 후 이미징 중에 참조 마크역할을 하기 위해 12웰 플레이트의 하단을 가로질러 수평 선을 표시합니다.밀리리터당 19, 000 세포의 밀도로 매체로 세포 육수를 희석합니다. 그런 다음 희석 된 세포 육수의 1 밀리리터로 12 웰 플레이트의 각 우물을 시드하여 세포 재고를 주기적으로 혼합하여 12 개의 우물전체에 걸쳐 세포 를 시동하십시오. 여기에 표시된 정보와 함께 각 접시에 레이블을 지정합니다.그리고 세포가 100 %의 합류로 자랄 때까지 섭씨 37도 및 이산화탄소 5 %의 인큐베이터에 놓습니다. 인큐베이터에서 셀이 있는 12웰 플레이트를 검색합니다. 10x 목표를 가진 현미경을 사용하여 세포를 관찰하고 각 우물 내의 합류를 결정합니다.다음으로, 각 우물에서 성장 매체를 흡인하고 처분합니다. 1-200 마이크로리터 멸균 팁으로 P200 파이프터를 조립합니다. 각 우물에서, 스크래치 모의 상처를 생성하기 위해 12:00 위치에서 6:00 위치로 셀 표면을 가로 질러 파이펫 팁을 글라이드.균형 잡힌 소금 용액 1밀리리터로 각각 잘 헹구어 과도한 파편과 세포 덩어리를 제거합니다. 접시를 좌우로 흔들어 세탁을 용이하게 합니다. 그런 다음 각 우물에서 균형 잡힌 소금 용액을 제거하고 폐기하십시오.1, 000 마이크로리터 팁이 있는 P1000 피프터를 사용하여 준비된 비소 주식에서 1, 000 마이크로리터를 치료 그룹과 무작위로 할당된 우물에 추가합니다. 각 웰에 대해 새 파이펫 팁을 사용하고 처리가 추가되는 시간을 기록합니다. 이산화탄소5%로 섭씨 37도에서 플레이트를 배양합니다.플레이트를 이미지화하려면 24시간 동안 4시간마다 10배 의 객관적 배율로 각 우물의 이미지를 캡처합니다. 플레이트 의 하단에 이전에 그려진 선을 참조하여 각 시간 지점에서 각 우물 내의 스크래치를 따라 동일한 위치를 이미지합니다. 이 연구에서는 생체 내 스크래치 테스트 분석이 세포 이동에 대한 비소의 효과를 관찰하는 데 사용됩니다.균일 한 스크래치는 약 0.8 밀리미터의 평균 스크래치 폭으로 모든 치료 그룹에서 관찰됩니다. 대조군 세포는 20시간 후에 완전히 치유된 스크래치를 보여줍니다. 두 비소 그룹은 치유의이 수준을 표시하지 않습니다.10 마이크로 몰러 처리로 24 시간 동안 완전히 폐쇄를 억제합니다. 이러한 결과는 비소의 존재가 세포 이동을 느리게 한다는 것을 보여줍니다. 분석 중에 캡처된 원시 이미지는 자동화된 소프트웨어를 사용하여 상처 너비를 측정한 다음 백분율 클로저를 계산한 다음 마지막으로 곡선 아래 영역을 계산합니다.10-micromolar 처리 단은 그밖 모든 처리 단에 비교된 인간 신생아 진피 섬유아세포의 통계적으로 둔화된 세포 이동을 보여줍니다. 세포를 긁을 때 일관성을 높이기 위해이 기술을 철저히 연습하는 것이 중요합니다. 분석 간의 의도하지 않은 가변성은 잠재적으로 데이터를 왜곡하고 결론을 변경할 수 있습니다.정량적 중합체 연쇄 반응 및 효소-연결된 면역소벤트 분석과 같은 추가 분자 기술은 분석에서 관찰된 세포 이동에 대한 변화를 위한 표적이 될 수 있는 메신저 신호 및 단백질을 식별하기 위해 스크래치 후 분석법을 사용할 수 있다. 이 분석은 암 전이, 새로운 신흥 암 치료, 줄기 세포 및 재생 의학 및 기타 많은 과학적 이정표에 대한 연구원의 이해에 기여했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

이동 능력은 중간엽 기질 세포(MSC)를 포함한 다양한 세포 유형의 핵심 기능입니다. 그러나 피해 후 이동 능력의 변화를 정량화하는 것은 어려운 일입니다. 이 프로토콜은 엄격한 통계를 사용하여 손상 후 MSC 이동 용량의 변화를 정량화하는 쉽게 적용할 수 있는 이동 분석을 설명합니다.

상처 스크래치 분석의 최적화 가용성 담배 연기 추출물에 의한 손상 후 쥐 중간 엽 기질 세포 이동의 변화를 감지 할

이 연구 보고서의 세포 침입과 마이그레이션 분석에 대 한 두 가지 방법: Boyden 챔버 분석 결과 및 체 외에서 비디오 현미경-기반 상처 치유 분석 결과. 이 두 실험에 대 한 프로토콜 설명, 그리고 그들의 장점과 단점 비교 됩니다.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

셀 마이그레이션 개발, 조직 유지 보수 및 수리, 및 tumorigenesis, 필수적 이며, 성장 요인, 발산, 및 cytokines에 의해 규제 됩니다. 이 프로토콜 점 분석 결과를, microenvironmental 신호에 연결 된, 응집력 있는 셀 시트의 철새 형을 평가 하기 위해 2 차원, 무제한 마이그레이션 분석 결과 설명 합니다.

셀 시트의 마이그레이션 분석 하 점 분석 결과 사용 하 여

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

여기는 자동된 광학 카메라 현미경으로는 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 테스트 하는 절차에 설명 합니다. 스크래치 분석 결과 널리 사용 되었습니다 어디 스크래치의 폐쇄는 세트 기간에 대 한 다음. 광학 현미경 세포 이동의 신뢰할만 하 고 저렴 한 감지 수 있습니다.

체 외에서 세포 마이그레이션 자동화 된 광학 카메라의 테스트에 대 한 스크래치 분석 결과 최적화

현재 프로토콜 암 세포 마이그레이션 및 실시간으로 단일 플랫폼에서 침입을 조사 하 고, 세포 이동성 및 형태학 연구를 쉽게 재현할 수 및 시간 효율적인 옵션을 제공 하는 통합된 방법을 설명 합니다.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

여기서, 우리는 1차 섬유아세포를 이용한 시험관내 스크래치 분석및 마우스에서 의 피부 상처 치유 분석실험을 위한 프로토콜을 제시한다. 두 방법 모두 시험관 내 및 생체 내 상처 치유를 평가하는 간단한 방법입니다.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

당사는 장비 집약적 방법을 사용하지 않고 세포 마이그레이션을 결정하는 새로운 접근 방식을 제공하는 스크래치 마이그레이션 분석법에 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 섬유아세포가 이 프로토콜에 사용되었지만, 세포 이동에 대한 추가 세포 유형과 영향을 연구하기 위해 적응하고 활용할 수 있습니다.

비용 효과적이고 적응 가능한 스크래치 마이그레이션 분석

상호 작용 경험 설계 및 사용자 요구 사항 분석의 통합을 통해 재현성, 신뢰성, 실용성, 세포 무결성 및 사용자 경험 측면에서 세포 상처 치유 분석을 향상시키는 혁신적인 세포 스크레이퍼를 소개합니다.

Cell Wound Healing Assay의 신뢰성을 개선하기 위해 안정적이고 재현 가능한 cell-free gaps를 자동으로 생성하는 도구

이 연구는 2차원(2D) 스크래치 상처 이동 분석 및 3차원(3D) 스페로이드 발아 분석과 함께 RNA 추출 및 면역세포화학을 포함한 각각의 다운스트림 분석 방법과 함께 in vitro 혈관 신생을 연구하는 데 적합한 분석법으로 제시합니다.

Scratch Wound Migration Assay와 Spheroid Sprouting Assay를 활용하여 기능적, 분자적 수준에서 혈관신생을 조사합니다.

배우세요 비소가 피부 세포 마이그레이션에 미치는 영향을 스크래치 어세이로 분석하는 방법을. 이 기법은 상처 치유 메커니즘 연구와 임상 치료 전략 개발에 활용됩니다.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

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