Name: 패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 배우세요 접촉 버블 양층막(CBB) 방법을 이용한 지질 이중층 형성 및 단일 채널 전기생리학 기록 기술. 이 혁신적인 기법은 이온 채널 단백질 삽입과 막-채널 상호작용 연구에 활용됩니다.

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저자 마 리코 Yamatake와 마사코 다카시마 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 이 작품은 지원 부분에서 KAKENHI에 의해 부여 번호 16 H 00759 및 17 H 04017 (SO).

1. 리 준비
<ol><li>원하는 농도 (예를 들어, 10 mg/mL)에 클로 프롬에 인지질 (예를 들어, 가루에 10 mg)을 분산.</li>
	<li>클로 프롬을 증발.<ol>
<li>장소는 둥근 바닥 플라스 크 및 회전 하는 증발 기에는 N2 가스 실린더에 연결 ( 테이블의 자료를 참조) 설정에서 인지질 솔루션. 상 온에서 N2 흐름 아래 플라스 크를 돌려 얇은 인지질 영화 (~ 30 분) 후 나타납니다.</li>
		<li>진공 펌프에 연결 된 desiccator에 열려있는 플라스 크를 놓습니다. 진공 펌프를 사용 하는 클로 프롬을 철저 하 게 제거 하는 몇 시간 동안 desiccator 내부 발음.</li>
	</ol>
</li>
	<li>플라스 크에는 전해질 솔루션의 적절 한 볼륨을 추가 하 고 인지질 정지 2 mg/mL를 인지질을 일시 중단.</li>
	<li>초 목욕 sonicator를 사용 하 여 여러 가지 수만 대 한 정지를 sonicate ( 재료의 표참조) 다층된 소포 (MLV) 정지를.</li>
	<li>이온 채널 단백질을 포함 하는 proteoliposomes의 준비에 대 한 추가 단백질 해결책 (solubilized; 적절 한 세제를 사용 하 여 단백질 2% 볼륨은 최대) MLV 정지 하 고 목욕 sonicator를 사용 하 여 몇 초 동안 sonicate.</li>
</ol>2. 큰 구멍 유리 펫 준비
<ol><li>피 펫 끌어당기는 사람에 유리 모 세관을 설정 하 고 micropipettes 당기 하는 2 단계를 통해 좋은 테이퍼 팁과 조작.</li>
	<li>microforge에는 micropipette를 설정 하 고 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 테이퍼 부분에 백 금 필 라 멘 트에 micropipette 팁 문의.</li>
	<li>짧게는 필 라 멘 트가 열 (5 s) 즉시 그것을 해제. 참고: 난방에 균열 지점, 약자는 micropipette의 끝은 잘라, 30 ~ 50 µ m의 직경을 가진 넓은 구멍을 떠나이 조작 형태.</li>
</ol>3. 얕은 오목 잘 (물 마무리에 대 한 Siliconization) 유리 슬라이드의 표면 처리
<ol><li>증류수와 에탄올 얕은 잘 유리 슬라이드 표면 청소.</li>
	<li>구멍 슬라이드 유리에 siliconizing 시 (물)의 (예를 들어, 100 µ L) 적절 한 볼륨을 적용 합니다.</li>
	<li>건조 한 공기에 완전히 시.</li>
	<li>유리 슬라이드는 거꾸로 한 현미경의 스테이지에 배치 합니다.</li>
</ol>4. 형태는 CBB와 Electrophysiological 측정 수행
<ol><li>시 홀 슬라이드 글라스의 얕은 우물에 hexadecane의 100 µ L를 추가 합니다. 참고: 지질-아웃 방법 인지질은 분산 hexadecane (20 mg/mL)에서 미리.</li>
	<li>Micropipette, 투베르쿨린 주사기를 사용 하 여의 절반 길이 전해질 용액을 채우십시오.</li>
	<li>Ag/AgCl 와이어 전극 피 펫 전해질 용액에 담가 허용 압력 포트와 micropipette 홀더에 micropipette를 설정 합니다.</li>
	<li>패치 클램프 증폭기와 전기 지상에 다른 것의 머리 단계로 micropipette 소유자 중 하나를 연결 합니다.</li>
	<li>microinjector micropipette 소유자의 압력 포트에 연결 합니다.</li>
	<li>micromanipulator 조작 하 여는 micropipette는 거꾸로 한 현미경의 스테이지 위에 적절 한 위치를 설정 합니다.</li>
	<li>잠재적인 전극 간격 조정.<ol>
<li>전해질 돔 만드는 구멍 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 micropipette를 채우는 데 사용 되는 동일한 전해질 솔루션의 장소 1 µ L.</li>
		<li>micromanipulator 조작 하 여 전해질 돔에 모두 micropipettes의 끝을 담가.</li>
		<li>패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋된 전위를 조정 합니다.</li>
		<li>CBB는을 위반 하 여 실험의 끝에 올바른 오프셋을 확인 (거품 융해)을 하나로 융합 하 거품 두를 일으키는 응용 프로그램을 통해 높은 막 잠재력의 (전기 고장, 앰프에 전기 충격 기를 사용 하 여).</li>
		<li>진정한 막 잠재력에 대 한 잠재적인 적용된 막을 계산 된 값이 추가 되도록 비대칭 전해질 솔루션 사용 하는 경우에 액체 접합 잠재적인54 를 수정 합니다. 참고: 액체 접합 잠재적인 프로그램 JPCalc55를 사용 하 여 계산 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>팁에서 liposome 솔루션을 그립니다. 참고: 때 수용 성 채널은 지질 아웃 방법을 사용 하 여, suctioning liposome 솔루션의 필요는 없습니다.<ol>
<li>Liposome 솔루션의 1 µ L 구멍 슬라이드 유리 (liposome 포함 된 돔)의 얕은 우물 주위 평평한 표면에 놓습니다.</li>
		<li>micromanipulator 조작 하 고 liposome 포함 된 돔에는 micropipette의 끝을 삽입 합니다.</li>
		<li>Micropipette 홀더는 microinjector를 사용 하 여 내부 압력을 낮추어 liposome 포함 된 솔루션을 발음.</li>
		<li>다른 피 펫에 대 한 절차를 반복 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>micromanipulator 조작 하 고 얕은 우물에서 hexadecane에는 micropipette 끝을 찍어.</li>
	<li>거품 (예를 들어, 50 µ m 직경에서) 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가 시켜 천천히 물 거품을 날 려 버릴 하 고 그 후 동일한 압력을 유지.</li>
	<li>안정 되어 있는 거품의 크기를 유지 하기 어려운 경우 오일에 어 인터페이스를 통해 팁을 전달 하 여 거품을 삭제 합니다.</li>
	<li>4.8 4.9 단계를 반복 하 여 안정적인 거품이 형성 된다.</li>
	<li>(그림 5) 사이 접촉을 허용 하는 거품을 조작 합니다. 참고: 때때로, 거품은 CBB를 자발적으로 서로 접근 한다. 다른 경우에, 거품 가까이 있지만 서로 연락 하지 않습니다. 이 경우에, 밀어 거품 서로 기계적으로.</li>
	<li>크기는 지속적인 내부 거품 압력 에서도 점차적으로 변경 될 수 있습니다 때문에 거품 크기를 유지 하기 위해 압력을 미세 조정할.</li>
	<li>막 패치 클램프 증폭기를 사용 하 여 적절 한 값을 잠재적인 설정 하 고 (그림 6) 등장에 현재 채널에 대 한 기다립니다.</li>
</ol>5. 측정 Bilayer 커패시턴스
<ol><li>잠재적인 램프를 적용 하 여 bilayer 전기 커패시턴스 (C엘)를 측정 합니다. 참고: 때 램프 명령에서 전압 변화의 속도 10 mV/10 ms (1 V/s) 뒤에-10 mV/10 ms, 기울기의 변화에 따라 현재 점프의 진폭에 해당 membrane'scapacitance 값 (예: 읽기 100 pA → 100 pF).</li>
	<li>두 bilayer 영역 평가 거품 다른 하나를 스택 및 초점 bilayer (그림 6)의 가장자리를 보려면 bilayer 수준에서 현미경. 참고: bilayer 형태는 주로 원형, 그리고 지역 반지름에서 계산 됩니다.</li>
	<li>Bilayer 지역 전기 용량을 나누어 특정 막 커패시턴스 (Csp) 계산 (Csp = C엘/A).</li>
	<li>Bilayer 두께 (소수 성 코어의 두께)를 계산 Dc 를 사용 하 여 (여기서 εr 과 ε0 대표는 bilayer의 소수 성 영역의 유전율과 고 유전율 (εrε0) /Csp = 진공의 각각).</li>
</ol>

저자는 공개 충돌의 관심 있다.

지질 bilayer 형성의 CBB 메서드 단층20줄지어 물에 기름 방울의 원리를 기반으로 합니다. 기술적으로, Cbb 형성에 대 한 절차는 쉽게, 특히 패치 클램프 연구자, 유리 micropipettes 조작에 능숙 합니다. Microinjectors와 함께 두 개의 피 펫 조작자 사용할 수 있을 때 패치 클램프에 대 한 electrophysiological 설치 쉽게는 CBB에 사용 됩니다. 다른 한편으로는 CBB 기존의 첨 두 부하의 후임은, 때문에 많은 양의 물리 기술 이었던 누적된8,이 배경으로 표면 화학의 지식에 대 한38 유용 운영에 대 한 고 Cbb 조작 CBB 채널 막 interplays 화학 성분 및 물리적 상태61수정 능력으로 공부에 대 한 다양 한 플랫폼을 제공 합니다. 거품 안 대기 지질 단층 위상 및 전단지는 bilayer의 국경을 넘어...

이온 채널, 세포 막 하지만 되지 않습니다 단순히 지원 자료 파트너 이온 플럭스를 생성 하기 위한. 기능적으로, 막은 이온 채널 포함, 전기 절연체 이며 모든 세포 막 휴식 막 잠재력으로 헤어 하지 않습니다. 전통적으로, 임의의 막 잠재적인 채널을 통해 전기 전류를 측정 하는 외부 회로에서 부과 되었다. 다른 막 잠재력에 이온 플럭스의 양적 평가이 그들의 이온 선택 투과 등 제어 기능1,2채널, 분자 속성을 밝혔다. 이온 채널의 기능 연구에 대 한 막 플랫폼 세포 막 또는 지질 bilayer 막입니다. 역사적으로, 단일 채널 전기 현재 녹음 지질 bilayers3,4에 초연 했다 그리고 패치 클램프 방법 (그림 1A 와 같이 세포 막에 대 한 관련 기술 개발 ),56. 그 이후,이 두 가지 기술을 다른 목적 (그림 1)7,8별도로 진화 했습니다.
막 지질 bilayer 막 하 고 현재 채널 단백질의 기능과 구조를 지 원하는 그들의 역할에 대 한 연구의 초점입니다. 따라서, bilayers에 지질 구성을 변경 하는 방법의 준비 여부 수요가입니다. 평면 지질 bilayer (첨 두 부하)8,,910,11, 물에서 기름 방울 bilayer12, 드롭릿 인터페이스 bilayer (DIB)13, 등 지질 bilayer 형성 방법 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 기술 (그림 1) 일반적인 선택, 다양 한 지질 구성20에서 채널 기능을 조사 하기 위한 기회를 제공 하는. DIB는 기술적으로 훨씬 쉽게 기존의 첨 두 부하 보다 생산 하는 DIB의 대형 패치-clampers 단일 채널 현재 녹음 일반적인 크기의 전도도와 공부에 대 한 적용에 대 한 억제 만들었습니다 (< 100 pS).
배경 잡음을 회피, bilayer 영역을 최소화 해야 합니다. 이 문제는 electrophysiological 지질 bilayers (그림 1) 기술 개발 역사의 반복 회상 합니다. 초기에, 소형 bilayer (1-30 µ m 직경에서) 피 펫 (팁-딥 방법;의 끝에 형성 되었다 그림 1 C) 21 , 22 , 23, 보다는 (그림 1B) 챔버에 소수 성 심장에 독립형 bilayer (~ 100 µ m 직경에서)를 사용 하 여. 팁-딥 방법 훨씬 낮은 배경 잡음24전기 측정에 대 한 허용. 우리의 경험 첨 두 부하25,26, 팁-딥22,,2327, 및 패치 클램프28,,2930, 31 방법 이끌어 냈다 우리 물에서 기름 bilayer의 원리를 사용 하 여 형성 하는 지질 bilayers의 소설을 생각. 우리는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드20,32라고이. 이 방법에서는, 석유 단계 (그림 1D), 물방울 거 보다 물 거품은 날 려 (팁 약 30 µ m의 직경)와 유리 피 펫에서(그림 1와 2), 기름 단계로 어디에 거품은 지속적인 압력을 적용 하 여 유지 됩니다. 거품의 표면에 물-오일 인터페이스에 저절로 단층 양식. 다음, 두 거품 두 유리 펫의 조작을 통해 도킹 하 고 두 monolayers 접근, 서로 평형 bilayer 지역 양보는 bilayer 형성 됩니다. 거품의 크기는 내부 거품 압력 (압력을 들고), 그리고 마찬가지로 bilayer 크기에 의해 제어 됩니다. 50 µ m의 평균 직경은 자주 사용 됩니다. 거품의 볼륨은 작은 (< 100 pL), 대량 전해질 단계 구성 microliter 범위 내에 있는 피 펫 솔루션의 더 큰 볼륨에 연결 된다.
CBB 방법 (표 1)를 사용 하 여 많은 이득이 있다. 지질 bilayer 형성 기술, 다양 한 지질 성분의 세포 막 생성 될 수 있다, 그리고 비대칭 막 더 쉽게 형성된32 보다 그 기존의 접는 방법33. bilayer 조작할 수 있습니다 기계적으로, 액체 정역학 압력 차이34,35으로 구부러진 수 있습니다 기존의 첨 두 부하와는 달리. 지주 압력을 변경 하 여 거품을 확장 하거나 축소, 증가 또는 감소 막 긴장32로 이어지는. bilayer monolayers, 유사한 형태학 연구, 세포 막의 고정-골절 기법36,37 에 기계적으로 분리 하지만, CBB 책략 수 반복 분리 하 고 사이클32 연결에 대 한 . 거품 내 전해질 솔루션의 작은 볼륨 bilayer로 리 채널 재구성의 효율적인 융합 있으며 채널 녹음을 얻기의 확율은 기존의 첨 두 부하 기술 보다 훨씬 높다. 작은 거품 볼륨도 수 (~ 20 ms) 이내 빠른 관류 한번 다른 주입 피펫은 거품 중 하나에 삽입 됩니다. 패치 클램프 방법 달리 즉시 그리고 되풀이 하 여, CBB 막 다시 형성, 일단 하 고 펫 하루에 여러 번 사용할 수 있습니다. 패치 클램프 및 첨 두 부하 방법의 혜택을 통합 하 여는 CBB 제공 하는 막의 물리 화학적 조건을 변경 하는 다양 한 플랫폼 채널 막 상호 작용의 전례 없는 연구에 대 한.
CBB 형성 과정의 상세한 프로토콜을 제시 하기 전에 bilayer 형성의 물리 화학적 배경 막 형성에 관한 실험 어려움을 해결 하기 위해 패치-clampers에 대 한 도움이 될 것입니다 먼저 제시 그는 발생 했습니다.
CBB 실험 표면 화학 과학38의 교훈을 르 친다. CBB는 비누 거품 어디 마찬가지로, 물 거품은 날 려 유기 용 매에는 공중으로 빨 대에서 날 려와 비슷합니다. 한 때 막 지질 물 거품 또는 유기 용 매에 포함 되지 않습니다 물 거품 거의 비정상적 알아차릴 것 이다. Amphipathic 지질의 부재, 물-오일 인터페이스에 표면 장력, 높은 이며 거품 부 대 내 거품 압력 높을 것 이다. 이것은 라플라스 방정식의 실현 (ΔP = 2 γ/R, 어디 ΔP 내부 거품 압력 γ 표면 장력은 이며, R은 거품형 반지름). 유기 단계 또는 전해질 용액에 지질 농도가 높은 경우는 단층에 lipids의 밀도 증가, 깁스 흡착 등온선에 의해 규정 (-dγ = Γ나 dµ나, Γ나 가 표면 초과 화합물의, 그리고 μi 은 부품의 화학 잠재력 i)39, 낮은 표면 장력 및 거품 형성의 용이성. CBB는 bilayer 탄젠트 각도 (그림 2)에서 관찰 될 수 있다 고 단층 bilayer 사이의 접촉 각 측정은. 이 각도 단층의 surface tensions와 bilayer 사이 평형 나타냅니다 (젊은 방정식: γbi = γ모 cos(θ), 어디 γbi bilayer 긴장, γ모 단층 긴장 이며 θ 이다 접촉 각). 단층 긴장에 따른 접촉 각 잠재적인 막의 기능으로 평가 되는 접촉 각의 변화 bilayer 긴장에 있는 변화를 나타냅니다 (영 Lippmann 방정식: γ모 = Cm V2 /4 (cos (θ0)-cos (θv)), 어디 Cm 막 용량, V 막 잠재력, 이며 θ0 θv 는 각각 0과 V mV에서 연락처 각도)40,41 ,42. 두 거품은 충분히 가까이, 그들은 접근 서로 자발적으로. 이것은 반 데르 발스 힘 그리고 우리 시각 CBB 형성에서이 동적 과정을 관찰할 수 있다.
CBB 시스템 가지 고유 단계로 구성 됩니다: 즉, 대량 기름 단계는 단층 및 접촉 bilayer (그림 3)으로 거품을 물. 이들은 여러 단계 첨 두 부하, bilayer 단계와 두 개의 monolayers43,44여 끼여 얇은 유기 단계 용 매 포함 된 토 러 스 등에서 관찰의 연상. CBB에서 단층 단계 bilayer 전단지와 연속 이며 지질 분자 사이는 단층 및 전단지 쉽게 확산. 단층 단계 거품 표면, 지질 저수지 역할 주요 단계 구성의 대부분을 다루고 있습니다. 지질은 단층에서의 소수 성 꼬리 대량 기름 단계에 밖으로 확장, 때문에 bilayer 내부 또는 소수 핵심 대량 기름 단계로 열립니다. 따라서, 소수 성 물질은 bilayer 가까운 석유 단계에 주입 bilayer 인테리어에 쉽게 액세스할 수 있다. 이것은 우리가 개발 했다 최근45, 여는 bilayer의 지질 조성 변경 빠르게 (1 초) 이내 단일 채널 현재 녹음 중 막 관류 기술. 우리는 bilayer에 콜레스테롤 내용 역 켜고45콜레스테롤 관류를 전환 하 여 통제 될 수 발견. 관련 물질의 농도 기온 변화도 연수 효과46, 로 알려져 있는 유포를 통해 즉시 해산 단층 bilayer에 관련 된 물질의 농도 차이가, 그 47. 다른 한편으로는 monolayers에 걸쳐 플립플롭은 느린48,,4950.
CBB 메서드를 사용 하는 bilayer 1 낮은 전해질 pH 등 다양 한 물리 화학적 조건 형성은 51, 3 M까지 (+K, Na+)소금 농도, ±400 mV, 높은 막 잠재력 및 시스템 최대 60 ° c.의 온도
있다는 CBB의 형성에 대 한 몇 가지 옵션 및 채널 분자의 거기에. 물-오일 인터페이스에서 단층의 형성, 대 한 지질 (지질-아웃 방법; 유기 용 매에 추가 됩니다. 그림 4 A, 4 C) 또는 리 (지질에 방법;으로 거품 그림 4 B, 4 D)입니다. 특히, 지질에서 메서드는 비대칭 막15,32의 형성에 대 한 수 있습니다. 채널 단백질으로 재구성 되는 반면 채널 분자 (예를 들어, 채널을 형성 하는 펩 티 드) 수성 해결책에서 녹는 거품 (그림 4A, B)52,53에 직접 추가 리 거품 (그림 4C, D)에 추가 됩니다. 여기, 채널 펩타이드 (polytheonamide B (pTB); 지질 방법에 의해 Cbb의 형성 그림 4 A) 또는 단백질 (KcsA 칼륨 채널, 그림 4C) 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>아졸렉틴 (L-&alpha; -Phosphatidylcholine, Type IV-S)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P3644</td><td></td></tr><tr><td>A / D 변환기</td><td>분자 Divices</td><td>Digidata1550A</td><td></td></tr><tr><td>Ag / AgCl 전극</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1317</td><td></td></tr><tr><td>목욕 초음파 발생기</td><td>Branson</td><td>M1800H-J</td><td></td></tr><tr><td>카메라</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-10C</td><td></td></tr><tr><td>유리 모세관</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0062</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Dojindo</td><td>342-01375</td><td></td></tr><tr><td>구멍 슬라이드 유리</td><td>Matsunami 유리</td><td>S339929</td><td></td></tr><tr><td>도립 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>절연 테이블</td><td>Herz</td><td>TDI-86LA(Y)2</td><td></td></tr><tr><td>Micro Injenctor</td><td>Narishige</td><td>IM-11-2</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>EMM</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 피펫 홀더</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-Hexadecane</td><td>Nacalai</td><td>07819-32</td><td></td></tr><tr><td>패치 클램프 증폭기</td><td>HEKA</td><td>EPC800</td><td></td></tr><tr><td>피펫 풀러</td><td>셔터 기기 Co.</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>POPC(1-팔미토일-2-올레오일-글리세로-3-포스포콜린)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850457</td><td></td></tr><tr><td>POPE(1-팔미토일-2-올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 </td>)<td>Avanti 극성 지</td><td>850757</td><td></td>질</tr>(<tr><td>1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) )Avanti</td> <td>극성 지질</td><td>840457</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨</td><td>Nacalai</td><td>28514-75</td><td></td></tr><tr><td>로터리 증발기</td><td>Iwaki</td><td>REN-1000</td><td></td></tr><tr><td>숙신산</td><td>Nacalai</td><td>32402-05</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Buchi</td><td>V-100</td><td></td></tr></tbody></table>

패치-clampers에 대 한 연락처 거품 bilayers 지질 bilayer 실험

Lipid Bilayer Experiments with Contact Bubble Bilayers for Patch-Clampers

지질 bilayers 수 있도록 다양 한 멤브레인에서 채널 막 상호 작용의 시험 지질 구성 하는 이온 채널의 기능 연구에 대 한 독특한 실험 플랫폼을 제공 합니다. 그 중 물방울 인터페이스 bilayer; 인기를 얻고 있다 그러나, 큰 막 크기 낮은 전기 잡음의 녹음 방해. 우리는 평면 지질 bilayer의 이점을 결합 하는 연락처 거품 bilayer (CBB) 메서드 및 패치 클램프 방법, 지질 구성 변경 하 고 각각 bilayer 기계를 조작 하는 등 설립. 기존의 패치 클램프 실험에 대 한 설치 프로그램을 사용 하 여, CBB 기반 실험 수 쉽게 수행. 간단히, 유리 피 펫에서 전해질 솔루션 단계로 유기 용 매 (hexadecane), 날 려 및 피 펫 압력은 안정 되어 있는 거품 크기를 유지 하 고 있다. 거품은 거품에 리에서 제공 되는 지질 단층 (순수 지질 또는 혼합된 지질), 자발적으로 늘어서 있다. 다음, 두 개의 단층 늘어선 거품 (~ 50 µ m 직경에서) 유리 펫의 팁에서 bilayer 형성에 대 한 도킹 됩니다. 거품으로 채널 재구성 리의 소개 채널 신호 대 잡음 비율 단일 채널 현재 녹음 패치 클램프 기록의 비교를 허용 하는 bilayer의 이끌어 낸다. Cbb는 비대칭 지질 성분과 쉽게 형성 된다. CBB는 이전 거품 밖으로 하 고 새로운 것 들을 형성 하 여 반복적으로 갱신 됩니다. 다양 한 화학 및 물리적 섭 (예를 들어, 막 관류와 bilayer 긴장) Cbb 여기에 부과 될 수 있습니다, 그리고 선물이 CBB 형성에 대 한 기본 절차.

전형적인 CBB (그림 56) 50 µ m의 직경 졌고 hexadecane에 특정 막 커패시턴스 0.65 μ F/c m2했다. 거품 크기는 임의로 내부 거품 압력에 의해 제어 됩니다. 작은 거품은 저 잡음 기록에 필요한 팁 직경 대응 하 게 작은 되어야 합니다. 예를 들어 직경에서 50 µ m의 거품 크기, 팁 직경 30 µ m 이어야 합니다.
CBB는 형성 했다, 일단 채널 분자는 liposome 또는 수성 해결책에서 자연스럽 게 몇 수십 분의 경 간 내의 bilayer에 삽입 되었다. 채널 삽입 적용된 막 잠재적인 아래 현재 진폭 (그림 7)의 단계적 증가 의해 확인 되었다. 작은 막 지역 (&lt; 10...

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

Lipid bilayers provide a unique experimental platform for functional studies of ion channels, allowing the examination of channel-membrane interactions ...

접촉 버블 Bilayer 방법은 기존의 지질 양층에 대한 대체 기술이다. 이 방법을 사용하면 멤브레인을 통해 보다 다재다능한 진동이 가능합니다. CBB 방법은 Planar 지질 Bilayer 및 패치 클램프 방법의 이점을 통합합니다.지질 이중층 기술로임의 지질 조성물을 가진 CBB가 형성될 수 있다. 신호 대 노이즈 비율이 높은 단일 채널 전류 녹음을 위한 CBB를 개발했습니다. 이 방법은 다양한 멤브레인 진동을 허용하고 채널 멤브레인 인터페이스에 대한 방대한 유형 플랫폼을 제공합니다.모두가 비누 거품을 불고 경험했다. 입으로 불어오는 대신 가해지는 압력을 수동으로 미세 조정하여 CBB 형성을 위해 유사한 기동을 수행합니다. 연습과 CBB를 즐길 수 있습니다.이 절차가 되는 것은 둥근 바닥 플라스크에서 원하는 농도에서 클로로포름에 인지질을 분산시한다. 질소 가스 실린더에 연결된 회전 증발기에 인지질 용액을 놓습니다. 얇은 인지질 필름이 나타날 때까지 실온에서 질소 흐름 하에서 플라스크를 회전시다.다음으로 열린 플라스크를 진공 펌프에 연결된 데시카이터에 넣습니다. 진공 펌프를 사용하여 건조기 의 내부를 몇 시간 동안 흡인하여 클로로포형을 완전히 제거합니다. 이어서 플라스크에 적절한 양의 전해질 용액을 추가하고 인지질을 일시 중단하여 밀리리터 인지질 현탁액당 2밀리그마스를 얻습니다.목욕 초음파 처리기를 사용하여 20~ 30초 동안 서스펜션을 손시아테하여 다층 소포 서스펜션을 얻습니다. 이온 채널 단백질을 함유한 프로테올리포좀의 제조를 위해 다층 소포 현탁액에 단백질 용액을 추가합니다. 그리고 목욕 초음파 를 사용하여 몇 초 동안 초음파 처리합니다.큰 보어 유리 파이펫을 준비하려면 유리 모세관을 파이펫 풀러에 넣고 미세 한 테이퍼 팁으로 마이크로 피펫을 2 단계 당기는 것으로 조작합니다. 그런 다음 마이크로 단조에 마이크로 파이프를 설정하고 직경 30 ~ 50 마이크로 미터의 테이퍼 부분에 백금 필라멘트마이크로 마이크로 파이펫의 끝을 접촉. 필라멘트를 짧게 가열하고 즉시 끕니다.증류수와 에탄올을 사용하여 유리 슬라이드의 표면을 얕은 우물로 청소합니다. 다음으로 실리콘 화시약을 유리 슬라이드에 바르고 시약이 완전히 공기 중으로 건조하게 합니다. 그런 다음 반전 된 현미경의 무대에 유리 슬라이드를 놓습니다.실리콘 유리 슬라이드의 얕은 우물에 육사데카인 100 마이크로리터를 추가합니다. 결핵 주사기를 사용하여 마이크로 피펫의 절반 길이까지 전해질 용액을 채웁니다. 다음으로 압력 포트를 사용하여 마이크로 피펫 홀더에 마이크로 파이펫을 설치하여 은/은 염화물 와이어 전극이 파이펫 전해질 용액에 담글 수 있도록 합니다.마이크로파이펫 홀더 중 하나를 패치 클램프 증폭기의 헤드 스테이지에 연결하고 다른 하나는 전기 접지에 연결합니다. 그런 후 마이크로피펫 홀더의 압력 포트에 마이크로인젝터를 연결합니다. 마이크로 피펫을 현미경 조작기를 사용하여 반전된 현미경의 단계 위에 적절한 위치로 조정합니다.전극 오프셋 전위를 조정하려면 유리 슬라이드의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 마이크로 피펫을 채우는 데 사용되는 동일한 전해질 용액의 마이크로리터 1개를 배치하여 전해질 돔을 만듭니다. 전해질 돔에 두 마이크로파이펫의 끝을 담급니다. 그런 다음 패치 클램프 증폭기의 전극 오프셋 전위를 조정합니다.팁에서 리포솜 용액을 그리려면 슬라이드 유리의 얕은 우물 주위의 평평한 표면에 리포솜 용액 1 마이크로리터를 추가합니다. 다음으로 마이크로피펫 끝을 돔이 들어 있는 리포솜에 넣습니다. 마이크로 인젝터를 사용하여 리포솜 함유 용액을 흡인.다른 미르코피펫에 대한 절차를 반복하여 재구성된 리포솜을 증분하는 채널을 습살합니다. 이제 얕은 우물에 육사데칸에 마이크로 피펫의 배치. 거품이 원하는 크기에 도달할 때까지 압력을 증가시켜 천천히 물 거품을 날려 그 후 동일한 압력을 유지하십시오.거품의 크기를 안정적으로 유지하기 어려운 경우 오일 에어 인터페이스를 통해 팁을 전달하여 거품을 폐기하십시오. 두 개의 안정적인 기포가 형성될 때까지 절차를 반복합니다. 두 거품 사이의 접촉을 설정합니다.일정한 거품 압력에서도 크기가 점진적으로 변할 수 있기 때문에 거품 크기를 유지하기 위해 압력을 미세 조정합니다. 패치 클레임 증폭기를 사용하여 멤브레인 잠재력을 적절한 값으로 설정하고 채널 전류가 나타날 때까지 기다립니다. 안정적인 지질 이중 층 형성을 위해 블로터를 청소하는 것이 필수적입니다.유리 모세관 또는 파이펫 제제는 철저히 세척되어야하며 세제 분자에 의한 오염을 피해야합니다. 일단 CBB는 수성 용액또는 리포솜에서 채널 분자를 형성하면 자발적으로 수십 분의 범위 내에서 이중 층으로 삽입되었다. 채널의 삽입은 적용된 멤브레인 전위 하에서 현재 진폭의 단계 현명한 증가에 의해 확인되었다.CBB 방법에 의해 형성된 이중층은 두 개의 단층으로 분해될 수 있다. pTB 채널 전류는 두 개의 단층층을 부착한 직후 나타났다. 그리고 전류가 커지면서 전류의 진폭이 증가하여 CBB의 분리 부착 조작과 동기화되었다.기포의 수가 불어나면 수성 용액의 지질 농도가 감소하고 단층이 형성되지 않는다. 그런 다음 리포솜 섹션에 대한 압력을 완화하십시오. 일단 CBB 형성 및 채널 재구성이 확립되면 증혈또는 소수성 물질을 주입하거나 주입을 통해 수성 용액 및 막의 조성물을 변화시키려고 시도할 수 있습니다.CBB 방법은 채널 멤브레인 상호 연극을 탐구하는 다양한 방법을 열었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

지원되는 평면 bilayers는 면역 버렸네에서 분자 상호 작용을 모델로 사용할 수있는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 지질 bilyer의 위쪽 전단지에 버렸네 형성을 조절하고 TIRF 현미경을 사용하여 버렸네 형성을 시각화하는 것으로 알려진 세포 부착 단백질을 고정하는 방법을 보여줍니다.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

막 단백질 기능은 세포막의 지질 성분에 의해 규제됩니다. 이 비디오 - 문서 변경 막 속성의 기자로 이중층 패치 전극뿐만 아니라 사용하는 방법으로 그램이시딘 채널을 사용하여 패치를 형성하는 방법 세부 사항.

이중층 탄성 등록 정보 모니터링 변경에 대한 단일 분자 방법

평면 지질 bilayers, 또한 불리는 인공 지질 bilayers, 당신이 공부할 수 있도록 이온 실시하는 잘 정의된 환경에서 채널을. 여기, 우리는 이중층 챔버를 준비하는 데 필요한 각 단계의 전극 및 이중층은 단일 채널 측정에 적합한 것을 테스트를 보여줍니다.

전기 생리학 실험을위한 인공 Bilayers의 준비

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

패치 클램프 전기 생리학과 결합 될 때 정의 된 구성의 거대한 리포좀으로 기능 막 단백질을 재구성하는 강력한 방법입니다. 그러나 기존의 거대한 리포좀 생산 단백질의 안정성과 호환되지 않을 수 있습니다. 우리는 순수 지질이나 이온 채널을 포함하는 작은 리포좀의 거대한 리포좀 생산을위한 프로토콜을 설명합니다.

이미징 및 패치 클램프 전기 생리학에 대한 거대한 리포좀 준비

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

이 프로토콜은 높은 용융 온도와 지질에 대한 지질 단층 조립 및 방울 인터페이스 이중 층 형성을 촉진하기 위해 피드백 온도 제어 가열 시스템의 사용을 자세히 설명, 멤브레인의 온도 중심변화를 특성화하는 커패시턴스 측정.

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

배우세요 접촉 버블 양층막(CBB) 방법을 이용한 지질 이중층 형성 및 단일 채널 전기생리학 기록 기술. 이 혁신적인 기법은 이온 채널 단백질 삽입과 막-채널 상호작용 연구에 활용됩니다.

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