Name: 실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 배우세요 CD8+ T 세포가 종양 세포를 사멸시키는 과정을 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 골수성 세포에 의한 면역 억제 메커니즘을 평가하고 새로운 암 면역 치료 전략을 개발하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 (101067/Z/13/Z (JWP), 109657/Z/15/Z (TK), 615KIT/J22738 (TK), 영국), Wellcome 신뢰와 MRC (미스터/N022556/1 (JWP, TK), 영국)에서 교부 금에 의해 지원 되었다. NOC와 DDS 인정 국가 Phenotypic 심사 센터 Phenomics 발견 이니셔티브 및 암 연구 영국 (NOC)에서 지원

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저자는 공개 없다.

이 메서드는 두 별도 공동 문화 단계에 따라: 잠재적인 억압 셀+ T 세포 CD8 공동 경작 하 고 대상 종양 세포 (그림 1)+ T 세포 '사전 조건된' CD8 공동 경작. 첫 번째 공동 문화 단계는 매우 비슷합니다 CD8에 대 한+ T 세포 확산 분석 실험 일반적으로 CD8에 억압 셀의 효과 결정 하는 데 사용+ T 세포 기능. 그러나, T 세포 확산 그들의 세포 독성와 항상 연결 되지 않습니다. 예를 들어 우리 M-MDSCs 또는 MAMs 공동 문화 발견 CD8의 감소 확산 보다 증가 반면 이러한 사전 CD8 단련 CD3/CD28 항 체 (보충 그림 3), 활성화의+ T 세포+ T 세포 증명 대상 암 세포 (그림 4, 그림 5, 그림 6)에 대 한 세포 독성을 감소. 대상 암 세포 apoptosis,이 CD8에 의해 제공에 의해 입증 기능 활동의 평가의 중요성을 강조 하는이 결과+ T 세포 세포 독성 분석 실험.
이 분석 결과에서 그 CD8 확인 했습니다+ T 세포 E0771-LG 마우스 유 방 종양 세포 (그림 5)의 최대 apoptosis를 유도 하기 위하여 공동 문화의 약 15 h 필요. 이 지연 caspase 3 (보충 영화 1의 활성화에 의해 측정 대상에 apoptotic 신호를 유도 하는 데 필요한 시간 뿐만 아니라 목표와 함께 면역 시 냅 스 형성, 효과 기 세포의 초기 접촉 사이 지연 때문일 수도 있습니다. ). 우리는 또한 apoptotic 종양 세포의 수는 T 세포에 의해 대상의 제거 및 죽은 세포에서 형광 신호의 손실 때문에 아마 이다 24 h 후 고원에 도달을 발견. 피크 apoptosis의 시간을 식별 하기 위해이 기능은 최적의 시간 포인트의 결정에 중요 하므로 다른 조건 사이 적절 한 비교가 분석이 결과의 주요 장점 중 하나입니다. 우리의 경우 예를 들어+ T 제어 CD8 세포 독성에 차이가 세포와 CD8 MDSC/맘 교육+ T 세포에서 15-18 h 72 h (그림 5)에 비해 훨씬 더 큰 되었고 따라서 끝점 72 h 잠복기를 사용 하 여 실험 잘못 된 결과 얻을 것 이다.
이 메서드는 또한 CD8의 제한 된 세포 독성을 기본 메커니즘에 대 한 더 큰 통찰력을 제공 하는 실시간 이펙터 목표 셀 상호 작용의 시각화를 통해+ T 세포 중 억제기 세포 incubated. 예를 들어 우리가 관찰 CD8+ T 세포 중 M-MDSCs 또는 MAMs incubated 발생 및 대상 종양 세포와 상호 작용 하지만 항상 apoptosis (보충 영화 4, 보충 영화 5, 보충 영화 6) 유도 하지 않았다. 비록 우리가이 이벤트를 계량 하지 않았다, 그것은 가능 하 고 계량 하 여 남과 apoptosis 유도 상관 관계에서 그들의 상호 작용 시간의 비율을 비교 흥미로운 것입니다. 또 다른 주요 장점은이 방법은 적은 수의 셀 (예: 1 x 103 대상)과 4 x 103 잘 당 효과 기 세포의 요구. 사실,이 프로토콜 수 수 더 소형화 384-잘 플레이트 형식에 대 한 원하는 경우. 따라서,이 분석 결과 어디 셀 숫자는 제한 또는 vivo 샘플 ex vivo에서에서 파생 된 생체 외에서 귀중 한 셀을 사용 하 여 테스트와 같은 높은 처리량 검열 그리고 실험에 적합 합니다.
다른 한편으로, 현재 분석 결과의 제한 일부 조건에서 죽은 효과 기 세포의 중요 한 숫자의 존재 이다. 대상 암 세포의 apoptosis effector CD8의 구별에 정확도 증가 하기 위하여+ T 세포, 셀 표시 대상의 핵과 핵 크기 제한 (그 이펙터 셀 제외)이 데이터 분석에 대 한 적용 분석 결과 (그림 2)입니다. 그러나, 오버레이 (녹색) apoptotic CD8의 집계의+ T 결과 혼동 수 있습니다 비-apoptotic 대상 암 세포에 세포 경우가 있습니다. 이 제한 effector 세포 전에 공동 대상 종양 세포, 효과 기 세포의 충분 한 숫자를 사용할 수 있습니다 가정 문화에서 죽은 세포 제거 열 사용 하 여 완화 될 수 있습니다. 더 복잡 한 현미경 시스템, 또한 수 있습니다 라벨 effector CD8 거짓 긍정적인 신호를 줄이기 위해 대상 셀 핵 및 fluorogenic caspase 3 기판에서 fluorophore와+ T 세포.
이 프로토콜은 CD8 항 일반적인 활성화 조사 이용 되어 지금까지+ T 세포. 비록 MDSCs 및 종양 microenvironment에서 Tam 항 원 비 관련 메커니즘을 통해 T 세포 기능을 억제, 주변 림프 조직에서 MDSCs 억제 T 세포 응답 항 원 특정 방식으로18. CD8를 사용 하 여 생체 외에서 확산 분석 결과 같은 종류의 세포, 면역 진압 기능 조사 OT-1에서+ T 세포 유전자 변형 쥐를 일반적으로 사용 됩니다. 이 분석 결과에서 OT-1 T 세포 (ovalbumin (OVA) 특정 T 세포 수용 체를 표현 하는) 공동 교양 억압 MDSCs OVA 펩 티 드, 앞으로 우리의 세포 독성 분석 결과에서 첫 번째 문화에 대 한 적용 (즉,., T의 활성화 세포 존재 또는 진압의 부재)입니다. 그것은 또한 OVA, OT-1 T 세포 항 원 특정 암 세포 살해를 일으킬 수 있는 표현 대상 암 세포 조작 가능. 따라서, 분석 결과 또한 항 원 특정 T 세포 활성화의 어머니/MDSC 중재 억제의 조사를 하면 수 있습니다. 그것은 또한 인간의 세포에 대 한 인간의 CD3 CD28 항 체 활성화는 상용, 고 임상 샘플에서 인간의 Tam을 프로토콜 설립된19되었습니다 조사를 분석 결과 적용 하.
공동으로,이 분석 결과 매우 다양 한 이며 다른 면역 세포 유형의 세포 독성 검사를 사용할 수 있습니다. 현재, 우리의 실험실에서 다양 한 조건에서 항 원-종속 셀 세포 독성 검사를 확장 하 고 심사도 높은 처리량에 대 한 개발 되 고 키를 누릅니다.

그것은 알려져 그 CD8+ T 그들은 그들의 전체 세포 독성을 발휘 하는 때 세포 종양 세포를 제거할 수 있습니다. T 세포 수용 체 (TCR) CD8의 활성화 후+ T 세포 증식과 세포 독성 효과 기 세포로 분화. 확장 되 고 활성화 된 CD8+ T 세포를 perforin 등 대상 셀으로 전송 됩니다 caspase 3 apoptosis1중재와 같은 다양 한 용균성 경로 시작 하는 granzymes 세포 독성과 립 분 비. CD8+ T 세포 수 또한 유도 종양 세포 apoptosis 종양 괴 사 인자-α (TNF-α)에 대 한 수용 체 등 대상 세포에 수용 체를 활성화 하 여 첫 번째 apoptosis 신호 ligand (FasL), 또는 apoptosis 유도 ligand TNF 관련 (흔적). 또한, 활성화 된 CD8+ T 세포 분 비 인터페론-γ (IFN-γ) 종양 세포 증식을 억제 하 고 CD8 종양 세포의 감도 증가 시킬 수 있는+ T 세포를 통해 업 레 귤 레이 션 FasL 수용 체1의. CD8에 대 한 잠재력을 감안할 때+ T 종양 살해 능력, 그들의 세포 독성 (예를 들어, 검사점 억제제, 암 예방 접종, 그리고 공상 항 원 수용 체 (자동차) 표현 하는 T 세포의 입양 전송)를 강화 하는 몇 가지 전략 설립 되었습니다 그리고 특정 유형의 암2에 표시 된 중요 한 치료 효과. 그러나, 규정 하는 T 세포와 같은 세포 종양 침투 면역, 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs), 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam) CD8 억제 수 있습니다 제안 증거를 축적+ T 세포 기능 및 효능을 제한 immunotherapies3,,45. 이러한 immunotherapies을 개선 하기 위해, 그것은 어떻게 면역 억압 셀 제한 CD8 이해 해야+ 세포 독성 T 세포. CD8 식별+ T 세포 억제 메커니즘 뿐만 아니라 druggable 목표, 그것을 극복 하기 위해 개발 및 생체 외 분석 실험의 활용이 필요 합니다.
CD8 측정 하는 표준 방법은+ 세포 독성 T 세포는 크롬 릴리스 분석 결과는 대상에서 방사성 조사 (51Cr)의 릴리스 세포 CD8에 의해 lysed는+ T 세포, 결정6. 그러나,이 분석 결과 상대적으로 낮은 감도, 높은 배경, 초기 apoptotic 이벤트, 유해 처리 문제, 그리고 자동된 액체 처리와 검색을 지원 하기 위해 제한 된 호환성을 감지 하는 무 능력을 포함 하 여 몇 가지 단점이 있다 더 높은 처리량 응용 프로그램입니다. 또 다른 일반적인 방법은 흐름 cytometric 분석 대상 종양 세포의 apoptosis annexin V7을 바인딩 하 여 감지 합니다. 이 분석 결과에서 그것은 목표 세포 죽음 propidium 요오드 화물 (PI) 또는 7-aminoactinomycin D (7-AAD)와 이펙터 세포 활성화 대상 셀7에에서 apoptosis 이외에 CD107a 또는 CD69 식으로 표시를 사용 하 여 같은 다른 매개 변수를 검색할 수 . 그러나,이 분석 결과 크롬 방출 분석 결과에 비해 억압 세포의 많은 수를 요구 한다. 그것은 또한 분리 및 부착 대상 셀의 피의 요구 하 고이 결과 편견 수 있습니다. 실제로 크롬 릴리스 분석 결과 또는 흐름 cytometric 분석 결과 T 세포 기능에 억압 셀 효과 조사 하기 위해 일반적으로 사용 되지 않습니다. 대신, T 세포에 미리 로드 되는 형광 염료 (예를 들어, CFSE)의 희석으로 표시 하는 T 세포 확산의 측정 자주는 CD8의 억제 평가+ 억제기 세포 T 세포 기능. 경작된 한 T 세포에서 IFN-γ 생산의 T 세포 활성화8,9에 억압 셀의 효과 평가 하기 다른 표준 방법입니다. 그러나, 이러한 분석에서 결과 않습니다 반드시 연관 되지 죽이 CD8의 능력 목표 셀+ T 세포.
우리는 여기에 CD8 세포 독성 억제 세포, 특히 전이성 종양에서 세포의 효과 평가 하는 대체 기능 분석 결과 제시+ T 세포. 이 방법은 결정의 CD8 세포 독성+ T 세포, 종양 세포 apoptosis를 감지 하 여 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체 존재 유무를 교양 사전 fluorogenic caspase 3에서 형광으로 표시 기판6 을 사용 하 여 자동 시간 경과 현미경 (그림 1). 이 프로토콜은; 다른 방법에 비해 몇 가지 장점을 그것은 셀 수가 적은 필요, 높은 감도와 부착 종양 세포 죽음의 탐지를 가능 하 게, 실시간 이펙터 대상 상호 작용 이미지 수 이며 높은 처리량 검열 의무가.
이 프로토콜에 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)와 그들의 조상 monocytic-MDSCs (M MDSCs) 생쥐에서 전이성 종양에서 고립 된 억압 셀으로 사용 됩니다. 전이성 유방암의 마우스 모델에서 대 식 세포의 뚜렷한 인구 특징 F4/80높은Ly6G-CD11b높은Ly6C낮은 축적 전이성 종양을 포함 하는 폐에. 이 대 식 세포 인구 정상적인 폐에서 자주 발견 이며 따라서 라는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs)10. 이 마우스 모델에서 다른 골수성 세포 인구, 정의 F4/80높은Ly6G-CD11b높은Ly6C높은, 또한 축적 주로 어디 그것을 생겨나게 MAMs11전이성 폐에서. 그들의 특성을 바탕으로, CD11b높은Ly6C높은 어머니 조상 세포 M-MDSCs12를 나타낼 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>0.05% 트립신 EDTA (1X)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>12-웰 세포 배양 플레이트</td><td>Freiner Bio-One</td><td>665-180</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅테탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>5mL 플라이스티렌 라운드 바닥 튜브</td><td>FALCON</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 세포 배양 플레이트(원형 하단 )</td> <td>Costar</td><td>3799</td><td>CD8 + T 세포와 정렬 된 골수성 세포 공동 배양</td></tr><tr><td>96 웰 플레이트 (평평한 바닥)</td> <td>Nunc</td><td>165305</td><td>세포 독성 분석을위한 표적 세포와 CD8 + T 세포의 공동 배양</td></tr><tr><td>AF647 안티 마우스 F4 / 80 항체</td><td>BIO-RAD</td><td>MCA497A647</td><td>클론 : CIA3-1, Lot # : 1707, 2 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>AlexaFluor700 안티 마우스 CD8 항체</td><td>Biolegend</td><td>100730</td><td>클론: 53-6.7, Lot#: B205738, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD28 항체</td><td>Biolegend</td><td>102111</td><td>분리된 CD8+ T 세포의 활성화, 클론: 37.51, Lot#: B256340</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD3e 항체</td><td>Biolegend</td><td>100314</td><td>분리된 CD8+ T 세포의 활성화, 클론: 145-2C11, Lot#:</td></tr><tr><td>B233720 APC 안티 마우스 CD3 항체</td><td>Biolegend</td><td>100236</td><td>클론: 17A2, Lot#: B198730, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>APC/Cy7 안티 마우스 Ly6C 항체</td><td>Biolegend</td><td>128026</td><td>클론: HK1.4, Lot#: B248351, 1 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>소 혈청 Albmin</td><td>Sigma</td><td>A1470-100G</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기 (100&mu; m 나일론)</td><td>FALCON</td><td>352360</td> 비장 세포 여과기를 <td>부수기 위해</td></tr><tr><td>(40&mu; m 나일론)</td><td>FALCON</td><td>352340</td><td>폐 소화를 필터링하려면</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Biolegend</td><td>422801</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s 수정된 독수리&프라임; s Medium</td><td>Gibco</td><td>41966-029</td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트</td><td>StemCell Technologies</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>Fetal 소 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FITC 안티-마우스 CD4 항체</td><td>Biolegend</td><td>100406</td><td>클론: GK1.5, Lot#: B179194, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>Geltrex 즉시 사용 가능</td><td>Gibco</td><td>A1596-01</td><td>세포 독성 분석을 위한 96웰 플레이트 코팅</td></tr><tr><td>IncuCyte NucLight 레드 렌티바이러스 시약</td><td>Essen BioScience</td><td>4476</td><td>mKate2를 인코딩하는 Lenti 바이러스 미립자</td></tr><tr><td></td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>검출기(형광 현미경)</td></tr><tr><td>IncuCyte ZOOM 2018A</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>L-글루타민 (100X)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>폐 해리 키트</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-927</td><td>종양 보유 폐의 단세포 현탁액 준비</td></tr><tr><td>MycoAlert 마이코플라스마 검출 키트</td><td>Lonza</td><td>LT07-318</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acid (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>NucView488</td><td>Biotium</td><td>10403</td><td>형광 caspase-3 기판</td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 Ly6G 항체</td><td>Biolegend</td><td>127607</td><td>클론 : 1A8, Lot # : B258704, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>PE/Cy7 안티 마우스 CD11b 항체</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td>클론: M1/70, Lot#: B249268, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>세포의 1차 배양을 위한 페니실린 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 안티 마우스 CD45 항체</td><td>Biolegend</td><td>103132</td><td>클론: 30-F11, Lot#: B249564, 0.5 &mu; L/1x10^6 세포</td></tr><tr><td>폴리브레네(헥사디메트린 브로마이드)</td><td>Sigma</td><td>H9268</td><td></td></tr><tr><td>퓨로마이신</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 완충액(10X)</td><td>Biolegend</td><td>420301</td><td></td></tr><tr><td>재조합 쥐 IL-2</td><td>Peprotech</td><td>212-12</td><td>분리된 CD8+ T 세포의 활성화</td></tr><tr><td>피루브산나트륨(100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>TruStain fcX (anti-mouse CD16/32) 항체</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&nbsp;: Nikon 10X objective (해상도 1.22 &micro; m) &nbsp;: 녹색 채널 여기: 440 - 480 nm &nbsp;: 녹색 채널 방출: 504 - 544 nm &nbsp;: 적색 채널 여기: 565-605 nm &nbsp;: 적색 채널 방출: 625 - 705 nm</td></tr></tbody></table>

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 apoptosis에 cd8에 의해 유도 된+ t 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

CD8의 종양-죽이 능력의 potentiation+ T 세포 종양 그들의 효율적인 종양 침투 함께 성공적인 immunotherapies의 핵심 요소입니다. 여러 연구 결과 종양 침투 골수성 세포 (예: 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs) 및 종양 관련 된 대 식 세포 (Tam))의 CD8 세포 독성 억제 표명+ T 세포 종양 microenvironment 및 그 대상 이러한 규제 골수성 세포 immunotherapies를 개선할 수 있습니다. 여기, 선물이 CD8의 종양 살해 능력에 monocytic MDSCs와 Tam의 면역 진압 효과 평가 하는 체 외 분석 결과 시스템+ T 세포. 이 위해, 우리는 먼저 순진한 교양 비장 CD8+ T 억제기 세포의 유무에서 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 세포 그리고 다음 공동 대상 암 세포는 fluorogenic의 존재를 미리 활성화 된 T 세포 배양 caspase 3 기판입니다. 암 세포에 기판에서 형광 T 세포 유도 된 종양 세포 apoptosis의 지표로 서 실시간 형광 현미경 검사 법에 의해 발견 되었다. 이 분석 결과에서 우리가 성공적으로 CD8에 의해 종양 세포 apoptosis의 증가 검색할 수 있습니다+ T 세포와 Tam 또는 MDSCs 사전 문화에 의해 그것의 억제. 이 기능 분석 결과 조사 CD8 유용+ T 억제 메커니즘 규제 골수성 세포 및 높은 처리량 검열을 통해 그것을 극복 하기 위해 식별 druggable 대상에 셀.

이 메서드는 대상 암 세포 effector CD8+ T의 간단한 공동 문화 기반 셀 억압 셀 안티-CD3/CD28 활성화 항 체의 존재 유무에 관계 없이 미리 배양 되어 있다. CD8 검색+ 공동 문화에 따라의 CD8 세포 독성에 억압 셀의 효과의 평가 활성화 시간이 지남에 T 세포 이용한 암 세포 apoptosis+ T 세포.
일반적으로, 암 세포 증가 그들의 핵에서 녹색 형광 핵 타겟팅 caspase 바이오 센서의 활성화에 따라 때 이러한 세포 CD8 접촉+ T 세포 항 체 억제 세포 (부재에서 여 전 활성화 그림 3; 보충 영화 1)입니다. Caspase 기판에서 녹색 형광 apoptosis 시작 된 후 적어도 15 h에 대 한 감지 했다. + T effector CD8의 몇 가지 자발적인 apoptosis이이 세포 분리 (그림 4; 경작 했다 경우에 세포도 시간이 지남에 따라 관찰 되었다 보충 영화 2). 그러나, 핵 크기 CD8의+ T 세포는 암 세포 보다 작은 및 따라서 apoptotic '이펙터' 셀에서에서 제외할 수 있습니다 '대상' 셀 계산 apoptotic 메서드에서 크기 제한 이미지 분석 (그림 2 및 그림 4). 비록 일부 대상 암 세포 표시 없이 녹색 형광 작은 둥근된 모양,이 영향을 주지 않습니다 분석 이러한 세포 apoptosis (보충 영화 3), 보다는 오히려 유사 분열을 겪고 있다 고 따라서 apoptotic '대상'에서 제외 됩니다. 셀 레드/그린 오버랩 마스크 (보충 그림 2)에 의해 계산 됩니다. 대상 암 세포의 자발적인 apoptosis는 단일 문화 (보충 영화 3)에 가끔 발견 된다. 그러나, 대상 암 공동 문화와 전 활성화 한 CD8 세포+ T 세포가 암 세포 (그림 4)의 단에 자발적인 apoptosis 수준 이상의 증가 된 종양 세포 apoptosis. 일반적으로, 효과 기 세포를 대상 암 세포의 최적 비율을 사용 하 여, 피크 apoptotic 대상 암 세포의 수를 관찰할 수 있습니다 (그림 5A). 이 피크는 더 뚜렷한 데이터 (그림 5B) 타깃 셀의 apoptotic 분수로 표현 되는 때입니다. 이 실험에서 대상 종양 세포의 기저 apoptosis 24 h에 정점 (apoptotic 분수 = 0.08), CD8 하지만+ T 세포 유도 된 apoptosis 17 h에서 최대 수준에 도달 (apoptotic 분수 = 0.66).
우리 더 발견 CD8+ T 셀 MAMs 또는 M-MDSCs incubated 미리 만들 수 있는 대상 암 세포와 접촉 하지만이 연락처 CD8에 비해 암 세포 apoptosis의 적은 경우에 발생 하는 듯+ T 세포는 전 하지 않고 활성화 억제 세포 (그림 3 및 그림 4; 보충 영화 4와 보충 영화 5). 비록는 CD8+ T 전 골수성 세포와 때때로 incubated 세포 암 세포 apoptosis 유도, 거기 또한 apoptosis의 시간 과정을 자극 하지 대상 암 세포의 일부 확산은 실험 (보충 영화 6)입니다. 이러한 결과와 일치, 피크 분수 apoptotic 세포의 CD8과 교양+ T 세포 전 골수성 세포와 인 큐베이 팅 (apoptotic 분수 MDSC와 20 h 0.25 맘-e 23 h 0.38 =) 암 세포의 그것 보다 훨씬 낮은 CD8와 교양+ T 세포 억제기 세포 (그림 6)와 함께 미리 incubated 되지 않은.
<img alt="CD8+ T 세포 활성화 및 암세포 세포사멸 다이어그램; 배양 설정 및 이미징 결과." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 실험 절차를 보여주는 계획. 순진한 비장 CD8+ T 세포 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 없이 안티-CD3/CD28 활성화 항 체와 교양 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포 (M-MDSCs). 4 일 후, CD8 부동+ T 세포를 수집 하 여 fluorogenic caspase 3 기판의 암 세포를 대상으로 공동 경작. Apoptotic 암 세포 실시간 형광 현미경에서 검출 된다. 표시 된 이미지는 라이브 셀 이미징 플랫폼을 사용 하 여 인수 했다 ( 테이블의 자료를 참조). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="형광 현미경 다이어그램, 빨간색/녹색 채널, 세포사멸 검출 마스크, 세포 생존율 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: apoptotic 대상 셀 apoptotic effector 세포에서 별개의 식별. 빨강 채널에서 상위 행: 이미지 수집 대상 검출 마스크 (핑크 분석 마스크) 대상 세포 핵의 식별 수 있습니다. 가운데 행: 이미지 녹색 채널에 인수 apoptotic 이펙터 및 대상 셀을 나타냅니다. Asize 제한 된 apoptosis 마스크 (청록 분석 마스크; 보다 큰 80 µ m2) 단일 apoptotic 효과 기 세포는 분석에서 제외 될 수. 아래쪽 행: 합성 이미지 병합 된 레드와 위상 대비 이미지 (왼쪽)와 빨강/녹색 녹색 채널 중첩 마스크 (오른쪽). 빨간 형광 (노란색 분석 마스크)와 함께 공동 지역화, 크기 제한 녹색 형광의 식별 apoptotic 효과 기 세포 (흰색의 집계를 제외 하 여 대상 핵 (노란색 화살표) apoptotic의 더 정확한 탐지를 허용 화살촉)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="시간 경과에 따른 세포 사멸; 현미경 이미지; 이펙터-표적 상호 작용; 세포사멸 마커; 12-30시." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> CD8 사이 상호 작용 그림 3:+ T 세포와 암 세포. E0771 LG_NLR 대상 세포 (T) 공동 effector CD8과 교양의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸+ T 세포 (E) 이펙터/대상 4:1 비율에. MDSC와 맘 E effector 세포 미리 incubated M MDSCs와 MAMs 각각 나타냅니다. 복합 이미지 (를 포함 하 여 단계 대조, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지)이 표시 됩니다. 화살촉은 다른 필드와 시간 포인트를 통해 동일한 셀 추적 하 고 있다. 노란색 화살표: 이펙터와 연결 하 고 apoptosis, 흰색 화살표를 겪 습 대상: 이펙터 연결 하지만 apoptosis를 받아야 되지 않습니다 대상. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="이펙터-표적 상호작용 분석; 형광 현미경; 복합 및 빨간색 채널 보기; 세포 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: apoptotic 세포의 탐지. 대표적인 필드 이미징 후 18 h에서 시간 경과 영화에서 추출. 복합 이미지 (왼쪽; 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널) 및 빨강에서 이미지 (가운데) 없이 채널 또는 레드/그린 (오른쪽) 중복 마스크 (노란색) 표시 됩니다. 오른쪽 열에 노란색 점 apoptotic 세포를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="세포사멸성 암세포 수 대 다양한 E:T 비율에서의 시간, 실험 그래프, 통계 분석." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 그림 5: CD8+ T 세포 이용한 암 세포 apoptosis. (A) 수 이펙터 C8와 교양된 apoptotic 세포의+ T 세포 대상 비율 (E:T) 다른 이펙터에. 타깃 셀의 (B) Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 평균 영역 (AUC) 곡선 아래 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P &lt; E:T에 비해 0.0001 = 0:1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="암세포 세포사멸 차트; 다양한 치료에 대해 시간 경과에 따른 세포 사멸을 비교하는 실험 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58841/58841fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 그림 6: 효과 종양 침투 골수성 세포의 CD8 세포 독성에+ T 세포. Apoptotic 세포의 (A) 수 (대상: T) C8와 교양+ T 세포 (effector: E) E:T 비율의 4: 1에. CD8+ T 세포 미리 부재 (검은 원) 또는 monocytic-골수성 파생 억제기 세포의 존재에 교양 있었다 (MDSC e: 블루 원) 또는 전이 관련 된 대 식 세포 (맘-e: 빨간색 동그라미). 데이터는 타깃 셀의 ± sd (B). Apoptotic 분수. 데이터는 의미 ± sd. 의미 AUC도 표시 됩니다. T홀-웰 치의 교정 시험 AUC 분석 하는 데 사용 되었다. * P &lt; 0.0001 T에 비해, #P &lt; E + 토니에 비해 0.0001 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/58841fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 1입니다. 전이성 폐암에서 억압 셀을 제어 전략. (A) 대표 점 monocytic 파생 골수성 억압 셀 (M MDSCs) 및 전이 관련 된 대 식 세포 (MAMs) 분리 플롯. Ly6C 레벨 MAMs (Ly6C낮은)와 M-MDSCs (Ly6C높은) 구별을 임계값은 주민 치경 대 식 세포 (RMAC)의 기반으로 합니다. 정렬 된 M-MDSCs의 (B) 순도 (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C높은)와 MAMs (CD45+Ly6G-CD11b+Ly6C낮은). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS1_Rvd.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 2입니다. Mitotic 대상 셀의 대표 이미지입니다. E0771 LG_NLR 대상 셀 모노 문화의 대표적인 시간 경과 영화에서 스틸. 상위: 복합 이미지 단계 대비, 빨간색과 녹색 채널에서 이미지를 포함 한. 하단: 복합 이미지 (빨강과 녹색 채널) 빨강/녹색 중복 마스크. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS2_Rvd.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 그림 3입니다. CD8의 확산에 골수성 세포 종양 침투의 효과+ T 셀. (A) 대표 히스토그램에 CD8 CFSE와 형광 라벨의 희석을 보여주는+ T 세포. 순진한 비장 CD8+ T 세포 격리 프로토콜-3에 설명 된 대로 되었고 CFSE의 15 분 동안 37 ° C에서 5 µ M으로 표시. 레이블이 T 세포의 존재에 일리노이-2 교양 및 안티-CD3/CD28 프로토콜 4에 설명 된 대로 또는 골수성 세포 없이 항 체를 활성화 했다. 4 일 후, T 세포에서 녹색 형광 교류 cytometer에서 검색 되었습니다. (B) CD8의 분할 인덱스+ T 세포는 앞에서 설명한17로 계산. 데이터는 의미 ± SEM. * P &lt; 0.01 제어, #P에 비해 &lt; αCD3/CD28 Ab.에 비해 0.05 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/FigureS3_Rvd.pdf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 1입니다. 그림 3과 4;의 영화 E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS1.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 2입니다. 그림 3과 4;의 영화 이펙터 (E)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS2.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 3입니다. 그림 3과 4;의 영화 대상 (T)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS3.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 4입니다. 그림 3과 4;의 영화 MDSC E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS4.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 5입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS5.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보충 영화 6입니다. 그림 3과 4;의 영화 엄만 E + T (확산). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58841/MovieS6.mp4">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

우리의 프로토콜은 T 세포 유도 종양 세포 세포 사멸증에 있는 골수성 유래 억제기 세포 및 종양 관련 대식세포의 효력을 평가합니다. 잠재적인 치료 내정간섭의 근본적인 기계장치의 조사와 더불어. 이 프로토콜은 T 세포 유발 종양 세포 세포세포를 높은 감도로 직접 평가하고 세포 대 세포 상호 작용의 세로 분석 및 이미징을 가능하게 합니다.검사점 억제제의 효능은 특정 종양 유형에서 종양 침투 골수성 세포에 의해 가장 잘 살펴보았다. 이 기술은 이 종양을 위한 새로운 치료의 확인으로 이끌어 낼 수 있었습니다. 이 방법은 암 면역학 연구를 발전시킬 뿐만 아니라 면역 결핍 및 자가 면역 질환에 대한 통찰력을 잠재적으로 제공할 수 있었습니다.비장 절연 CD8 양성 T 세포의 활성화 및 확장을 위해, 첫 번째 알리쿼트는 96웰 U-바닥 플레이트의 개별 우물로 E-DMEM의 50 마이크로리터에서 다섯 번째 CD8 양성 T 세포에 10번 10회. 다음으로, E-DMEM의 50마이크로리터, 또는 E-DMEM의 50 마이크로리터에서 다섯 번째 억제제 세포에 1회 10번을 T 세포각 웰에 추가합니다. 그런 다음 새로 준비된 활성화 배지 50마이크로리터와 관심 있는 테스트 시약의 유무에 관계없이 50마이크로리터의 E-DMEM을 적절한 우물에 추가합니다.그리고 4 일 동안 95 %의 습도와 37도 섭씨 및 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 사전 활성화된 CD8 양성 T세포 표적 세포 공동 배양을 설정하려면 먼저 1-100 희석 된 성장 인자 감소 용용성 지하 멤브레인 매트릭스 30 마이크로리터를 미세 검사에 적합한 96 웰의 적절한 우물에 추가합니다. 플레이트를 흔들어 매트릭스를 균등하게 펴고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 적어도 1시간 동안 놓는다.플레이트가 평형화되는 동안 대상 셀을 준비합니다. 매체를 흡습하고 PBS로 세척하고 실온에서 05%의 트립신-EDTA 1밀리리터를 1분간 추가합니다. 부드러운 파이펫팅으로 태아 소 세럼으로 보충된 DMEM의 9밀리리터를 추가하고, 해리된 세포를 튜브로 옮킨다.세포를 원심 분리 한 후, E-DMEM의 500 마이크로 리터에서 팔레트를 다시 중단합니다. 셀 스트레이너를 통해 다시 중단된 세포를 필터링하고 라이브 셀을 계산합니다. 그런 다음 얼음에 신선한 E-DMEM에서 밀리리터 당 네 번째 표적 세포에 4 배 10으로 밀도를 조정합니다.다음으로, 미리 활성화된 CD8 양성 T-세포파이펫을 사용하여 세포를 단일 셀 현탁액으로 재보페하고, 부동 T 세포를 조건당 1.5밀리리터 튜브로 이송한다. 200 마이크로리터의 PBS를 가진 남은 세포를 잘 수집하고, 적절한 1.5 밀리리터 튜브 및 원심분리기로 세초를 옮기십시오. 매체를 흡인하고 원심분리를 위해 각 튜브에 1밀리리터의 E-DMEM을 추가합니다.원심분리 후, 튜브 당 신선한 E-DMEM의 100 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단. 계산 후, 각 튜브의 세포를 1.6배 10배의 밀도로 조정하여 제5의 사전 활성화된 CD8 양성 T-세포당 배지의 밀리리터당 양수 T-세포를 조절하고, 세포를 얼음 위에 놓는다. 세포가 준비되면, 96웰 현미경 플레이트의 각 우물에서 지하 막 매트릭스를 흡습하고, 혼합과 함께 플레이트의 내부 60 우물 내의 개별 우물에 표적 세포의 50 마이크로리터를 추가한다.IL2의 밀리리터 당 3단위에 4회 10회 보충된 E-DMEM 25마이크로리터와 10마이크로몰러 형광케-3 기판을 적절한 웰에 첨가한다. 그런 다음 미리 활성화된 CD8 양성 T 세포의 25 마이크로리터를 적절한 우물에 추가합니다. 마지막으로, 적절한 우물에 E-DMEM을 추가하여 최대 100마이크로리터의 총 부피를 만듭니다.PBS 또는 멸균 물 200마이크로리터를 모든 빈 우물에 넣습니다. 접시를 흔들어 서 10 분 동안 평평한 표면에 접시를 둡니다. 세포를 이미지화하기 위해 현미경을 설정하여 상 대비에서 이미지를 습득합니다.뿐만 아니라 핵 제한 형광 단백질에 적합한 형광 채널, 및 실험에 사용되는 형광 활성 caspase-3 기질 형광. 그런 다음 각 실험의 이미지를 위상 대비에서 잘 캡처하고 적어도 72 시간 동안 1 ~ 3 시간마다 두 개의 형광 채널을 캡처합니다. 캡처된 이미지를 분석하려면 기판 신호에 사용되는 형광 채널에서 caspase-3 기판없이 표적 세포 및 매체만 을 포함하는 컨트롤에서 이미지를 엽니다.부적절한 형광 신호가 핵에 의해 방출되는지 관찰한다. 기판 신호가 핵 내에서 명백하다면, 기판 신호가 사라질 때까지 핵 신호에서 제거된 기판 신호의 비율을 증가시키기 위해 스펙트럼 미혼을 사용합니다. 다음으로, 두 형광 채널에서 카스파제-3 기판없이 배지에서 핵만 표지되지 않은 이펙터 세포만을 포함하는 대조군을 잘 본다.신호가 핵에 의해 방출되는지 관찰한다. 개별 채널에서 신호가 보이지 않으면 스펙트럼 언믹싱이 필요하지 않습니다. 형광 채널 모두에서 형광 물체를 해결하려면 샘플에 대한 관련 매개 변수와 가장자리 분할에 적합한 매개 변수가있는 형광 배경 빼기 방법을 사용합니다.표적 세포 단배문화의 이미지를 사용하여 표적 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 설정합니다. 이펙터 세포 단배문화의 이미지를 사용하여 기판 유도 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 설정합니다. 공동 배양 의 이미지를 사용하여 표적 세포에서 기판 유도 세포 핵 형광에 대한 매개 변수를 확인하거나 정제합니다.표적 핵의 최소 크기를 결정하기 위해, 카스파스 기판을 가진 표적 세포만 을 포함하는 우물에서 핵 신호 채널에서 이미지를 사용한다. 세포사멸 효과기 핵의 평균 크기를 결정하기 위해, 카스파제 기판을 가진 이펙터 세포만 을 포함하는 우물에서 기판 신호 채널에서 이미지를 사용한다. 형광 표적 세포 핵의 수를 계산하려면 적절한 최소 크기 제한을 사용하여 분석 절차를 설정합니다.이펙터 세포 단배기 이미지를 사용하여, 세포 세포 이펙터 핵의 평균 크기보다 더 큰 세포 핵의 수를 계산하기 위해 두 번째 분석 절차를 설정합니다. 그런 다음 핵 신호 및 크기 제한 기질 신호가 현저하게 공동 국소화되는 핵 의 수를 계산하여 세포 형 표적 세포의 수를 계산하는 세 번째 분석 절차를 설정합니다. 전형적으로, 암세포는 세포가 억제제 세포의 부재에서 항체에 의해 미리 활성화된 CD8 양성 T 세포와 접촉할 때 핵 표적화 카스파스 바이오센서의 활성화에 따라 핵에서 형광 신호를 증가시다.CD8 양성 T 세포의 핵 크기는 암세포의 핵 크기보다 작습니다. 따라서, 세포세포는 크기 제한 영상 분석 방법에 의해 세포세포 수로부터 배제될 수 있다. 일부 표적 암세포는 기질 형광 없이 작은 둥근 모양을 나타내더라도, 이것은 분석에 영향을 미치지 않습니다.이러한 세포가 세포가 세포사멸보다는 미토시스를 겪고 있기 때문에 핵 기질 신호 중복 마스크에 의해 세포 수에서 제외된다. 사전 활성화된 CD8 양성 T세포를 가진 표적 암세포의 공동 배양은 암세포 단배문화에서 자발적인 세포멸의 수준 이상의 종양 세포 세포 사멸을 증가시킨다. 일반적으로, 표적 암세포의 최적 비율을 이효과를 위한 세포, 세포 세포 에 대한 최적의 비율을 사용할 때, 세포멸 표적 암세포의 수에 있는 피크를 관찰할 수 있다.이 피크는 데이터가 표적 세포 집단의 세포 분수로 표현될 때 더 뚜렷해집니다. 이 프로토콜을 시도할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 분석 마스크 개발에 사용하기 위해 대상 셀과 이펙터 세포의 단일 배양을 설정하는 것입니다. 이 방법은 암 세포 상호 작용에 T 세포의 기간 및 주파수, 그리고 인간과 마우스 세포 둘 다에 있는 유전자 의존적인 세포 독성과 관련되었던 조건에 통찰력을 제공할 수 있습니다.현재 이 분석체는 인간 세포를 이용한 고처리량 스크린으로 개발되어 골수성 세포 매개 면역 억제제를 억제하는 화합물을 식별하고 이를 통해 체크포인트 억제제 효능을 향상시키고 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 사전 활성화된 이펙터 T 세포에 의해 유도된 암세포의 세포사멸 분석을 보여줍니다. 이러한 세포를 형광 핵으로 표시된 암세포와 함께 배양함으로써 카스파제로 절단할 수 있는 형광 기질을 추가합니다. 세포사멸 암세포는 핵에서 다른 색을 표시하여 이중 형광을 유발합니다. 이 이중 형광은 암세포가 세포사멸을 겪고 있음을 나타냅니다.

암세포에 대한 사전 활성화된 CD8+ T 세포의 세포 독성을 연구하기 위한 체외 분석

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

우리는 종양 대상 세포와 incubated 때 T 세포의 세포 독성을 측정 할 수있는 단일 셀 높은 처리량 분석을 설명합니다. 이 방법은 spatially 정의 비율에서 T 세포와 대상 세포를 한정하는 하위 nanoliter 우물 (~ 100,000 우물 / 배열)의 조밀 한, 탄성 배열을 사용하고 이펙터 - 대상 활용 및 후속 apoptosis를 모니터링하는 형광 현미경에 연결된다.

T 세포 양적 높은 처리량 단일 세포 세포 독성 분석

이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

이 프로토콜에서는 이미지 거주 종양 침투 CD8 T 세포 인간 폐 종양 조각 내 붙일 결합 된 항 체와 함께 표시 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 CD8 T 세포 이동의 실시간 분석을 허용 한다.

전 비보 인간의 폐 종양에 거주 CD8 T 림프 톨의 이미징 조각 사용 하 여 Confocal 현미경 검사 법

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

여기에서는 암-면역 주기를 구성하는 단계를 모니터링하고 특성화하기 위한 간단하고 빠르며 신뢰할 수 있는 다중 파라메트릭 유세포 분석 및 종양 온 칩 지원 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다. 실제로, 암과 면역 세포 간의 상호 작용에 대한 철저한 이해는 종양을 능가하고 임상 치료를 안내하는 데 중요한 통찰력을 제공합니다.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

본 프로토콜은 전처리된 종양 세포를 사용한 동종 공동 배양 시스템에서 인간 T 세포 자극의 생체 외 분석을 가능하게 하는 실험 워크플로우를 설명합니다.

전처리된 종양 세포의 동종 공동 배양 환경에서의 인간 T 세포 활성 분석

배우세요 CD8+ T 세포가 종양 세포를 사멸시키는 과정을 실시간 현미경으로 관찰하는 방법을. 골수성 세포에 의한 면역 억제 메커니즘을 평가하고 새로운 암 면역 치료 전략을 개발하는 데 활용할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된⁺ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

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