Name: 단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO2 구슬의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 배우세요 poly(PFPA) 기능성 SiO₂ 구슬을 이용한 단백질 정화 방법을. 항체 고정화와 면역침전을 통해 효과적인 단백질 분리가 가능하며, 약물 전달 및 생물학적 표적 검출에 활용할 수 있습니다.

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이 작품 국방 개발 (부여 번호에 대 한 기관에 의해 지원 되었다 UD170039ID)입니다.

1입니다. Poly(PFPA) 단일 중합체의 준비
<ol><li>AIBN의 recrystallization<ol>
<li>2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN)의 5 g을 250ml 비 커에 메탄올 25 mL 결합. 60 ° C 기름 목욕에서 비 커를 담가 다음 적극적으로 AIBN 완전히 녹아 때까지 저 어 바 혼합물을 저 어.</li>
		<li>필터 종이 (5-8 μ m 입자 보존)를 통해 따뜻한 해결책을 필터링 하 고 천천히 형태를 결정 수 있도록 4 ° C에서 여과 액을 저장.</li>
		<li>여과 의해 박막된 AIBN을 수집 합니다. 신선한 메탄올 25 mL 수집된 제품 결합 고 recrystallization 프로세스를 반복 합니다.</li>
		<li>하룻밤 실 온 (RT)에서 진공 오븐에서 박막된 AIBN x 2를 건조. <-10 ° c.에 어둠 속에서 제품을 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>벤 dithiobenzoate25 의 합성<ol>
<li>마그네틱 볶음 바, refluxing 콘덴서, 떨어지고 퍼 널 및 고무 심장 500 mL 3 목 라운드-하단 술병을 준비 합니다. Refluxing 콘덴서를 통해 질소 가스 라인에 플라스 크를 연결 하 고 내부 밖으로 플러시 질소와 공기. 심장 통해 온도계를 삽입 합니다. 같은 심장 통해 주사기를 통해 tetrahydrofuran (THF)에 41 mL (0.041 mol) phenylmagnesium 브 로마 이드의 1 분 솔루션을 추가 합니다.</li>
		<li>따뜻한는 기름 목욕에서 40 ° C에 phenylmagnesium 브 로마 이드 솔루션. 다음 추가 떨어지고 퍼 널을 통해 이황화 탄소의 3.1 g (0.041 mol) 천천히, 40 ° c.에 솔루션 온도 유지</li>
		<li>7.1 g (0.042 mol) 벤 질 브 로마 이드의 떨어지고 퍼 널 이상 15 분 증가 반응 온도 50 ° c.를 통해 결과 혼합물에 추가 45 분이 온도에서 교 반을 계속 합니다.</li>
		<li>Separatory 깔때기에 반응 혼합물을 전송 하 고 얼음 냉 수의 15 mL로 희석. Diethyl 에테르의 15 mL을 추가 하 여 제품을 추출 하 고 낮은 물 레이어를 제거 합니다. Diethyl 에테르로 추출 두 번 더 반복 합니다.</li>
		<li>풍부한 양의 물, 다음 소금물 (50% (w/v) 물에서 NaCl의 솔루션)와 결합 된 유기 단계를 세척 하 고 무수 황산 마그네슘 이상 제품을 건조.</li>
		<li>진공 회전 증발 기를 사용 하 여 35 ℃에서 용 매를 제거 합니다.</li>
		<li>칼럼 크로마토그래피 eluent, 저조한 레드 오일으로 벤 dithiobenzoate (BDB)의 5 g으로 실리 카 젤 (기 공 크기 60 Å, 63-200 메쉬 입자 크기) 및 석유 에테르 400ml를 사용 하 여 제품을 정화. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 제품 순도 확인: δ 8.02-7.99 (2 H, m), 7.55-7.50 (1 H, m), 7.41-7.29 (7 H, m), 4.60 (2 H, s).</li>
	</ol>
</li>
	<li>통해 뗏목 합9,26 poly(PFPA)의 합성<ol>
<li>상용 PFPA 단위체 억제제의 소량을 포함 되어 있습니다. 중 합, 전에 억제제는 단위체 기본 알 루미나 포장 일회용 주사기를 통해 전달 하 여 제거 합니다.</li>
		<li>20 mL Schlenk 플라스 크를 BDB, 억제제 무료 PFPA 1012 mg (4.25 mmol)과 무수 anisole의 0.7 mL의 박막된 AIBN, 4.3 mg (0.018 mmol)의 0.4 mg (0.0024 mmol)를 추가 합니다.</li>
		<li>Schlenk 선 플라스 크를 연결 하 고 적어도 3 개의 펌프 freeze-thaw 주기를 가진 혼합물을 드. 간단히, 동결 액체 질소 욕조에 반응 혼합물. Headspace에 가스를 제거 하는 진공을 적용 합니다. 플라스 크를 밀봉 다음 콘텐츠를 실시간에 녹여 수 있도록 액체 질소에서 제거</li>
		<li>70 ° C 기름 목욕에서 플라스 크를 놓고 N2 제거에서 4 h 반응 합니다.</li>
		<li>반응 종료, 기름 목욕에서 플라스 크를 제거 하 고 공기에 반응 한 내용을 표시 합니다.</li>
		<li>차가운 메탄올에 폴리머를 침전 후 진공 오븐 40 ° C에 복구 된 폴리머 하룻밤 말리 면.</li>
		<li>고분자 분자량 측정, 젤 투과 크로마토그래피 (GPC)를 사용 합니다. THF를 사용 하 여 1 mL/min 35 ° C에서 모바일 단계 유량 고 단 분산 폴리스 티 렌 표준을 사용 하 여 보정 곡선을 건설. GPC 측정을 취득, 0.2 μ m 일회용 소계 (PTFE) 필터를 통해 THF (1-2 mg/mL)와 필터에 폴리머를 분해. GPC에는 샘플의 100 μ를 주사. 폴리스 티 렌 교정 곡선을 사용 하 여 분자량을 측정된 샘플 보존 시간을 변환 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 준비 Poly(PFPA)의 공업화 SiO2 구슬
<ol><li>항으로 SiO2 구슬의 치료<ol>
<li>SiO2 입자는 5% (w/v) 수성 현 탁 액의 형태로 사용할 수 있습니다. 항 및 저 어 바 장비 20 mL 섬광 유리병에 메탄올의 8 mL 40 mg에 0.8 mL SiO2 서 스 펜 션의 결합.</li>
		<li>활발 한 감동 5 h에 대 한 실시간 진행에 반응을 수 있습니다.</li>
		<li>원뿔 튜브에 솔루션을 전송. 항을 공업화 SiO2 구슬, 원심에서 5 분, 10000 x g 솔루션 다음 제거는 상쾌한. 다시 3 mL 신선한 메탄올에에서 분산 하 여 구슬을 씻어. 혼합, 튜브를 손으로 흔들어 하지만 필요한 경우 향상 분산 몇 초 동안 물 욕조에 쥡니다. 원심 5 분 제거에 대 한 10000 x g에서 비즈는 상쾌한 고 한 번 더 세척 단계를 반복 합니다.</li>
		<li>디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 3 mL와 SiO2 구슬 씻어 메탄올을 결합 한다. 혼합물을 손으로 흔들어 또는 구슬 DMSO에 완벽 하 게 분산 때까지 몇 초 동안 sonicate 필요한 경우. 5 분 동안 10000 x g에서 구슬 원심 다음는 상쾌한을 제거 합니다. DMSO에 메탄올에서 완전 한 용 매 교환 되도록 단계를 반복 합니다. 참고: 마지막 정지 포함 기능성된 항 SiO2 구슬 DMSO의 4 mL에 분산.</li>
		<li>입자 크기 분포를 확인 하려면 DL 분석을 수행 합니다. 일회용 UV 멧으로 준비 단계 2.1.4와 장소에서 현 탁 액의 한 방울을 가져가 라. 그것은 2/3까지 신선한 DMSO와는 베트를 작성 하 여 샘플을 희석 전체. 샘플 데이터 수집을 시작 하려면 셀 홀더에 삽입 합니다. 입자 크기 측정을 위해 다음과 같은 설치 매개 변수를 사용 하 여: 온도: 25 ° C; 평형 시간: 120 s; 측정 기간: 자동.</li>
		<li>표면 조성, 확인 하려면 XPS 분석을 수행 합니다. 준비 단계에서 40 ℃ 진공 오븐에서 2.1.4에서 하룻밤 정지에서 작은 샘플을 건조. 말린된 폴리머와 0.5 cm x 0.5 cm 샘플 홀더에 균일 하 게 팩을 가져가 라. 높은 진공 챔버 (10-8 torr)에 샘플을 로드 하 고 데이터 수집을 시작 합니다. 15에서 운영 단색 알 Kα X-ray를 사용 하 여 photoelectrons를 생성 하는 특정 XPS 악기 사용에 대 한 kV와 6.7 mA 및 수집 50 eV에서 분석기와 하이브리드 모드 확대를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼에 대 한 에너지를 통과 하 고 100 eV 에너지 전달 대 한 원소 설문 조사.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Poly(PFPA) 항에 접목 한 기능성 SiO2 구슬<ol>
<li>20 mL 섬광 유리병에 DMSO의 2 mL에 poly(PFPA)의 20 밀리 그램을 용 해 하 여 poly(PFPA) 솔루션을 준비 합니다. 참고:이 연구는 상대적으로 낮은 분자량 poly(PFPA) (20 k g/mol) 사용 됩니다. 따라서, 고분자 농도 (10mg/mL)에 불구 하 고 고분자 가교의 증거가 관찰 됩니다. 높은 분자량의 폴리머를 사용 하는 폴리머 솔루션 농도 가능한 가교를 피하기 위해 조정 해야 할 수 있습니다.</li>
		<li>항의 1 mL 기능성 SiO2 구슬 poly(PFPA) 솔루션 (2.1.4 단계)에서 DMSO에 추가 합니다. 활발 한 교 반으로 1 시간에 대 한 RT에 반응.</li>
		<li>Poly(PFPA) 융합 SiO2 구슬 5 분 뒤에 상쾌한의 제거에 대 한 10000 x g에서 원심 분리 하 여 격리 합니다. 어느 손 또는 쥡니다의 몇 초 떨고 DMSO와 섞어 3 mL를 추가 하 여 구슬을 씻어. 5 분 동안 10000 x g에서 구슬 원심 다음는 상쾌한을 제거 합니다. DMSO와 poly(PFPA) 융합 SiO2 구슬의 세척 두 번 반복 합니다.</li>
		<li>워시 트리플 증류수 (TDW)으로 두 배 이상 구슬. 이 단계에서 TDW의 3 mL 구슬 결합 다음 손이나 쥡니다의 몇 초를 흔들어 혼합. 5 분 동안 10000 x g에서 구슬 원심 다음는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
		<li>입자 크기 분포를 확인 하려면 DL 2.1.5 단계에 설명 된 절차를 다음을 수행 합니다. 표면 화학을 확인 하려면 XPS 2.1.6 단계에 설명 된 절차를 다음을 수행 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SiO2 의 준비 구슬 못 대체 Poly(PFPA)와 융합
<ol><li>Poly(PFPA) 솔루션을 준비, 20mg 20 mL 섬광 유리병에 DMSO의 2 mL에 poly(PFPA)의 분해.</li>
	<li>못 솔루션을 준비, DMSO의 1 mL에 아민 기능성된 못 분해. 말뚝의 정확한 양을 사용 PFP 대체, 아래 방정식에 의해 결정의 원하는 정도에 따라 결정 됩니다: 양의 아미노 말뚝 (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x % 말뚝-서브) x (MW_PEG / MW_poly(PFPA)) 여기서 N_poly(PFPA) = poly(PFPA)도 중 합 % 말뚝-서브 % 말뚝 대체 = MW_PEG 아미노 PEG의 분자량 = MW_ poly(PFPA) poly(PFPA)의 분자량 =</li>
	<li>Poly(PFPA) 솔루션을 페그 솔루션을 전송 합니다. 활발 한 교 반으로 1 시간에 대 한 RT에 반응.</li>
	<li>항을 준비 하려면 기능성 DMSO에 SiO2 구슬, 같은 단계 2.1에 표시 된 단계에 따라. 3.3 단계에서에서 준비 못 대체 poly(PFPA) 솔루션으로 비드 서 스 펜 션의 1 mL를 전송 합니다. Poly(PFPA) 고 항 간의 접목 기능성 SiO2 구슬 활발 한 교 반으로 1 시간에 대 한 실시간 진행을 허용 합니다.</li>
	<li>5 분 뒤에 상쾌한의 제거에 대 한 10000 x g에서 원심 분리 하 여 구슬을 격리 합니다. 어느 손 또는 쥡니다의 몇 초 떨고 DMSO와 섞어 3 mL를 추가 하 여 구슬을 씻어. 5 분 동안 10000 x g에서 구슬 원심 다음는 상쾌한을 제거 합니다. DMSO 세척 두 번 반복 합니다.</li>
	<li>워시 TDW와 두 번 더 구슬. 이 단계에서는 3 mL TDW, 구슬 결합 다음 손이나 쥡니다의 몇 초를 흔들어 혼합. 5 분 동안 10000 x g에서 구슬 원심 다음는 상쾌한을 제거 합니다.</li>
	<li>하룻밤 건조 진공 오븐에서 40 ° C에서 구슬.</li>
</ol>4. 항 체 Immobilization Poly(PFPA)에 투입 SiO2 구슬
참고: 동일한 절차는 poly(PFPA)에 % 말뚝 대체에 사용 됩니다. TDW에서 PBS 태블릿을 용 해 하 여 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)를 준비 합니다. PBS에 트윈-20의 1/1000을 추가 하 여 0.1% (v/v) 버퍼링 인산 염 분 트윈-20 (PBST)와 함께 준비 합니다.
<ol><li>Poly(PFPA)의 5 mg 투입 SiO2 구슬 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 추가 합니다.</li>
	<li>Vortexing에 의해 잘 800 µ L의 PBS와 믹스를 추가 하 여 구슬을 씻어. 원심 1 분 제거에 대 한 실시간에 10000 x g에서 비즈는 상쾌한 고 세 번 세척 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>신선한 PBS, 50 µ L 0.1% (v/v) PBST, 및 항 체의 6.67 µ g 350 µ L를 추가 합니다. ~ 20 h 4 ° c.에 회전자에 품 어</li>
	<li>워시 언바운드 항 체를 제거 하는 구슬. 400 x g에서 구슬 원심 1 분에 4 ° C는 상쾌한을 제거 하 고 세포의 용 해 버퍼의 400 µ L를 신중 하 게 추가. 부드럽게 다시 5 번 위아래로 pipetting으로 구슬 정지. 참고: 세포의 용 해 버퍼 구슬 세척 하는 데 사용 해야 같은 세포 세포의 용 해 및 IP, 사용 제외 하 고 dithiothreitol 및 프로 테아 제 억제제의 추가 선택 사항 (단계 5 참조).</li>
	<li>이 세척 단계를 세 번 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 가능한 한 많이 제거 합니다.</li>
</ol>5. 세포 세포의 용 해 및 Immunoprecipitation
<ol><li>세포의 용 해 버퍼와 워시 버퍼의 준비<ol>
<li>세포의 용 해 버퍼 (50 m m Tris HCl (pH 8.0), 100 m m KCl, 0.5% (v/v) NP-40, 10% (v/v) 글리세롤, 1 m m dithiothreitol (DTT), 그리고 프로 테아 제 억제 물 칵테일)를 준비 합니다.</li>
		<li>워시 버퍼 (50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 m m KCl, 0.1% (v/v) NP-40, 및 10% (v/v) 글리세롤)를 준비 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 버퍼 솔루션 저장</li>
	</ol>
</li>
	<li>셀의 준비<ol>
<li>시드합니다 세포 (HeLa 세포) IP 실험 하기 전에 하나 또는 두 일 37 ° C, 5% CO2세포를 성장 하 고.</li>
		<li>15 mL 원뿔 튜브에 약 1.4 x 10 셀 스 크레이 퍼와 전송7 셀을 수집 합니다. 원심 분리기 3 분에 대 한 RT에서 380 x g에서 세포는 상쾌한을 제거 하 고 다시 1 mL의 PBS 춥고 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 전송 된 일시 중단</li>
		<li>30 미 제거 상쾌한 청결을 위한 4 ° C에서 10000 x g에서 세포를 원심. 셀 펠 릿은 상쾌한 제거 후-80 ° C에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>세포 lysates의 준비<ol>
<li>다시 세포의 용 해 버퍼의 400 µ L로 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. ultrasonicator을 사용 하 여 셀 sonicate</li>
		<li>쥡니다, 짧게 소용돌이 및 원심 분리기 lysate 20000 x g 4 ° c에서 10 분 후.</li>
		<li>새로운 1.5 mL 원심 분리기 튜브는 상쾌한 전송.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunoprecipitation<ol>
<li>알을 품는 이전 준비 항 체 융합 poly(PFPA) SiO2 구슬에 세포 lysate의 300 µ L를 전송. 새로운 microcentrifuge 튜브에서 입력된 샘플으로 lysate 셀의 30 µ L을 유지 합니다. 4 ° c.에 입력된 샘플 저장 참고: 세포 lysate에서 단백질의 총 금액은 약 4 밀리 그램 해야 합니다.</li>
		<li>4 ° c.에 회전에 3 h lysate/구슬 혼합물을 품 어</li>
		<li>원심 1 분 제거를 위한 4 ° C에 400 x g에서 혼합물은 상쾌한 고 워시 버퍼의 400 µ L를 신중 하 게 추가 합니다. 부드럽게 다시 아래로 약 5 배 pipetting으로 구슬 정지.</li>
		<li>이 세척 단계를 세 번 반복 합니다. 최종 세척 후 상쾌한 가능한 한 많이 제거 합니다.</li>
		<li>나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 염료 (25% (v/v) 글리세롤, 0.1% (w/v) 브로 모 페 놀 블루 (BPB), 60 mM Tris HCl (pH 6.8), 2% (w/v) SDS, 그리고 2.75 m m 2-mercaptoethanol) 로드 x 2를 준비 합니다. -20 ° c.에 2 x SDS 로드 염료를 저장 구슬과 저장된 입력된 샘플을 SDS 로드 염료 x 2의 30 µ L을 추가 하 고 95 ° c.에서 10 분 동안 그들을 열합니다</li>
		<li>난방, 후27, 더럽혀 서를 사용 하 여 샘플 분석 또는-20 ° c.에 샘플 저장</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 없다.

Poly(PFPA)의 합성 SiO2 구슬은 그림 1에 나와 있는 투입. 채용 함으로써 항으로 링커 분자, poly(PFPA) 브러쉬 covalently SiO2 기판에 투입 간단한 2 단계 프로세스를 통해 준비 될 수 있습니다. PFP 단위 중 일부 항에 대 한 반응에 대 한 희생은, 비록 많은 PFP 단위 아미노 말뚝 또는 항 체 이상 반응에 대 한 사용할 수 있는 예상 된다. PFP 그룹 poly(PFPA) 브러쉬 할 물28에서 잘 하지 solvate 낮은 에너지 표면 형성 알려져 있습니다. IP 응용 프로그램에 대 한 항 체 poly(PFPA) 브러쉬에 움직일 필요가 그리고이 교환 반응 항 체의 활동을 유지 하기 위해 수성 버퍼 솔루션에 이루어집니다. 우리의 이전 간행물에서 보고, 아민 기능성된 말뚝 같은 친수성 분자와 PFP 단위의 부분 대체 증가 항 체 immobilization 효율<...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

반응성 폴리머 브러쉬 최근 몇 년 동안에 많은 관심을 받았습니다. 활성화 된 표면 탐지 및 분리1,2,3,4,등의 분야에서 응용 프로그램과 함께 만드는 유기 또는 무기 재료에 기능성 분자를 고정을 사용할 수 있습니다. 5. 보고 반응 고분자 중 pentafluorophenyl 에스테 르 단위를 포함 하는 아민 및 가수분해6향해 저항 그들의 높은 반응성 때문에 특히 유용 합니다. 이러한 한 폴리머 poly(PFPA), 이며 1 차 또는 2 차 아민7,8,,910를 포함 하는 분자와 쉽게 기능성된 후 중 합 될 수 있습니다. 한 예로, poly(PFPA) 브러쉬 빛 반응 표면7만들려고 아미노 spiropyrans로 반응 했다.
Poly(PFPA)와 그 응용 프로그램의 준비 이전 간행물6,7,,89,10,11,12의 숫자에 설명 되었습니다. ,13,,1415,,1617. 특히, Theato와 동료 보고 "에 접목"와 "에서" 방법7,,810,,1112 접목을 통해 poly(PFPA) 브러쉬의 합성 . "접목 에" 접근 방식, 폴 리 (methylsilsesquioxane)에서-폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴) (poly(MSSQ-PFPA)) 하이브리드 폴리머 합성된8,10,,1112했다. Poly(MSSQ) 구성 요소 형태로 강한 접착 코팅된 소재 표면에 브러시 레이어를 형성 하는 poly(PFPA) 구성 요소 되므로 다른 유기 및 무기 표면 수가 있었습니다. "접목 에서" 접근에서 표면 가역 추가 시작 하 고 조각화 체인 전송 (SI-뗏목) 중 합 poly(PFPA) 브러쉬7을 준비 하기 위해 고용 되었다. 이 경우에, 표면 고정된 체인 전송 에이전트 (SI-CTA) covalently silane 실리 카 반응을 통해 기판에 첨부를 먼저 되었다. 고정된 시 CTA 다음 기판에 안정적인 공유를 밀도가 포장된 poly(PFPA) 브러쉬 생성 PFPA 단위체의 뗏목 시 합에 참가 했다.
시-뗏목 중 합을 통해 합성 poly(PFPA) 브러쉬를 이용 하 여 우리는 최근 poly(PFPA) 융합 실리 카 입자와 단백질 정화18에서 그들의 후속 응용 프로그램에 항 체의 동원 정지를 시연. 항 체의 동원 정지에 대 한 poly(PFPA) 브러쉬를 사용 하 여 다양 한 IP 통해 현재 단백질 분리와 관련 된 문제를 해결 하기 위해 발견 되었다. 기존의 IP 항 체 immobilization19,,2021단백질 A/G는 링커로의 사용에 의존합니다. 이후 단백질 A/G를 사용 하 여 항 체를 특정 방향으로 장착할 수, 높은 대상 항 원 복구 효율성 달성 된다. 그러나, 단백질 A/G를 사용 하 여 단백질 복구, 둘 중 배경 잡음의 높은 수준에 기여 하는 동안 일반적인 단백질 상호 작용 뿐만 아니라 항 체의 손실에서 겪고 있다. 이러한 단점을 해결 하려면 고체 지원에 항 체의 직접 가교 탐험된22,,2324되었습니다. 이러한 기술의 효율은 일반적으로 낮은 가교 된 항 체의 임의의 방향으로. Poly(PFPA) 투입 기판에 대 한 항 체의 동원 정지는 영구적, PFP 단위 및 항 체에 아민 기능 사이 교환 반응을 통해 달성입니다. 비록 항 체 오리엔테이션은 여전히 무작위, 시스템 많은 반응 PFP 사이트, 중 합도 의해 제어 하는 데에서 혜택. 또한, 우리 아미노-말뚝와 PFP 단위의 부분 대체 하 여 보여주는 표면 화란 수 수 조정, 추가 시스템18의 단백질 복구 효율성을 향상. 전반적으로, poly(PFPA) 융합 실리 카 입자 합리적인 효율성 뿐만 아니라 많은 청소기 배경 전통적인 ip 효과적인 대안이 될를 표시 했다.
이 기여에 우리는 poly(PFPA) 이식할된 표면 항 체 동원 정지 및 IP 응용 프로그램에 대 한 준비 하는 다른 방법을 보고 합니다. 간단한 2 단계 프로세스에 그림 1에서 볼 수 있듯이 항 링커 분자는 먼저 입금 실리 카 표면에 그 후에 poly(PFPA) 폴리머 covalently에 PFP 단위 사이 반응을 통해 링커 분자에 연결 된 고분자 고 항에 아민 기능입니다. 이 준비 방법은 기판 표면에 poly(PFPA)의 영구 가교에 대 한 수 있지만 시 CTA 합성 및 poly(PFPA) 브러쉬의 중 합 시-뗏목과 관련 된 많은 합병증을 피 한다. 아미노 페그와 PFP 단위의 부분 대체 여전히 수행할 수 있습니다, 고분자 브러쉬 표면 특성의 미세 조정 허용. 우리는 따라서 준비 poly(PFPA) 융합 실리 카 구슬 항 체와 함께 움직일 수 및 IP 통해 단백질 농축 사용할 수 보여줍니다. 자세한 비드 준비 절차, 항 체 immobilization, 그리고 IP 테스트이 문서에 설명 되어 있습니다, 그리고 추구에 관심이 있는 독자에 대 한 기존의 단백질 A/G 대신 IP 기반.

<table><tbody><tr><td>2,2-Azobisisobutyronitrile, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>HPLC용 메틸 알코올, 99.9%</td><td>Duksan Pure Chemicals</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>페닐마그네슘 브로마이드 용액 1.0&nbsp; THF</td><td>시그마-알드리치</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>이황화 탄소 무수, &ge; 99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>벤질 브로마이드, 98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>석유 에테르, 90%</td><td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>에틸 에테르, 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 황산염 무수, 분말,&nbsp; 99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorophenyl acrylate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>함유 억제제</td></tr><tr><td>알루미늄 산화물, 활성, 염기성, Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>무수 아니솔, 99.7%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>실리카 나노 입자</td><td>미세 입자 GmbH</td><td>SiO2-R-0.7</td><td>5 % w / v 수성 현탁액</td></tr><tr><td>3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란, >96.0 %</td> <td>도쿄 화학 산업</td><td>T1255</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭 사이드 HPLC 용, &ge; 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>아미노 말단 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르</td><td>폴리머 소스</td><td>P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수 정제</td><td>Takara</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl(pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>인비트로겐</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>비오세상</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제</td><td>머크</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>브로모 페놀 블루</td><td>시그마-알드리치</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>트리스-HCl(pH 6.8)</td><td>바이오솔루션</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>나트륨 도데 실 설페이트</td><td>Biosolution</td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>PKR 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH 항체</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-32233</td><td></td></tr><tr><td>Normal Rabbit IgG</td><td>세포 신호 기술</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>Korea Cell Line Bank</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>초음파 발생기</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>초음파기</td><td>BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 I</td><td>Eppendorf</td><td>5424 R</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기 II</td><td>LABOGENE</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>회전자</td><td>FINEPCR</td><td>ROTATOR/AG</td><td></td></tr><tr><td>진공 오븐</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>ThermoStable OV-30</td><td></td></tr><tr><td>겔 투과 크로마토그래피(THF)</td><td>애질런트 기술</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>X선 광전자 분광계</td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Probe</td><td></td></tr><tr><td>동적 광 산란</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

단백질 정화에 대 한 poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 sio2 구슬의 준비

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴)을 준비 하는 간단한 방법을 보여 줍니다 (poly(PFPA)) 융합 항 체 동원 정지 및 후속 immunoprecipitation (IP) 응용 프로그램에 대 한 실리 카 구슬. 간단한 2 단계 프로세스를 통해 poly(PFPA) 이식할된 표면 준비 된다. 첫 번째 단계에서 3-aminopropyltriethoxysilane (항)으로 링커 분자 실리 카 표면에 입금 됩니다. 두 번째 단계에서 poly(PFPA) 단일 중합체, 가역 추가 및 조각화 체인 전송 (뗏목) 중 합을 통해 합성에 pentafluorophenyl (PFP) 단위 사이 교환 반응을 통해 링커 분자에 투입 되는 폴리머와 항에 아민 그룹입니다. 항 및 실리 카 입자는 엑스레이 광전자 분광학 (XPS)에 의해 확인으로 입자 크기 변화에 의해 감시에 poly(PFPA)의 증 착 동적 산란 (DL)을 통해 측정. 구슬, 아민 기능성된 poly(ethylene glycol)와 poly(PFPA)의 부분 대체의 표면 화란 개선 (아미노 PEG)도 수행 됩니다. 못 대체 poly(PFPA) 실리 카 구슬 다음 IP 응용 프로그램에 대 한 항 체와 함께 움직일 수 투입. 데모, 단백질 키 니 아 제 RNA 활성화 (PKR)에 대 한 항 체, 고용 및 IP 효율 서쪽 blotting에 의해 결정 됩니다. 분석 결과 항 체 움직일 구슬 실제로 일반적인 단백질 상호 작용은 최소 PKR을 풍부 하 게 사용 될 수 있다는 것을 보여준다.

Poly(PFPA)의 준비에 대 한 회로도와 SiO2 구슬, 투입 하거나 못 없이 대체 그림 1에 표시 됩니다. 항와 접목 과정, 맨 손으로 SiO2 구슬, poly(PFPA) 항 기능성 SiO2 구슬, 그리고 poly(PFPA) 융합 SiO2 구슬 DL (그림 2)와 XPS (그림 3)에 의해 특징입니다. 구슬의 IP 효율성 서쪽 blotting에 의해 결정 됩니다. 그림 4 는 IP에 대 한 결과 더럽혀 서 1% 투입 못 대체 poly(PFPA) 구슬, 구슬 없는 항 체, 일반적인 항 체, 또는 안티-PKR 항 체와 인 큐베이 팅 사용. 그림...

폴 리 (pentafluorophenyl 아크릴)의 준비에 대 한 프로토콜 (poly(PFPA)) 융합 실리 카 비즈 제공 됩니다. Poly(PFPA) 기능성된 표면 다음 항 체와 함께 움직일 하 고 immunoprecipitation 통해 단백질 분리에 대 한 성공적으로 사용.

단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO2 구슬의 준비

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

이 방법은 약물 전달, 생물학적 표적 검출 및 바이오 분리와 같은 분야에서 응용 이면이 있는 생체 분자 활성화 표면을 준비하는 데 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 폴리 PFPA 브러시가 아민으로 반응성이 높고, 항체의 고정화가 몇 시간 동안 완충액의 배양에 의해 달성된다는 것입니다. 이 기술의 의미는 고정된 항체가 표적 항원과 성공적으로 결합할 수 있기 때문에 면역 정화를 통해 단백질 정제를 향해 확장됩니다.이 방법은 항체 동원 및 단백질 정화를 위해 입증되지만, 생체 분자 동원을 요구하는 다른 시스템에도 적용될 수 있다. APTES로 이산화규소 구슬을 처리하려면 먼저 5%의 중량 부피 수성 현탁액의 형태로 이산화규입자를 얻습니다. 0.8 밀리리터의 이산화소및 40밀리그램의 APTES, 8밀리리터의 메탄올을 교반 바가 장착된 20밀리리터 신자극 바이알에 결합합니다.격렬한 교반으로 5 시간 동안 실온에서 반응을 진행할 수 있습니다. 5시간 후 솔루션을 원문 튜브로 전송합니다. APTES 기능성 실리콘 이산화규구슬을 분리하려면 용액을 10, 000 G에서 5분간 원심분리합니다.그런 다음 상체를 제거합니다. 이제 신선한 메탄올 의 세 밀리리터에 그들을 다시 박차하여 구슬을 씻어. 혼합을 위해 손으로 튜브를 흔들어만 필요한 경우 몇 초 동안 수조에서 초음파 처리로 분산을 개선하십시오.원심 분리기는 이전과 같이, 한 번 더 세척 단계를 반복합니다. 메탄올 세척 이산화실리콘 구슬을 디메틸 설프리산화물 3밀리리터 또는 DMSO와 결합합니다. 혼합물을 손으로 흔들거나 필요한 경우 비드가 DMSO에 완전히 분산될 때까지 몇 초 동안 초음파 처리합니다.이전의 원심 분리에 따라 상체를 제거하십시오. 원심분리 단계를 마지막 시간으로 반복하여 메탄올에서 DMSO로의 완전한 용매 교환을 보장합니다. 폴리 PFPA 용액을 준비하려면 20 밀리리터 신자극유리병에 2밀리리터의 DMSO 2밀리리터에 폴리 PFPA 20밀리그램을 녹입니다.PEG 솔루션을 준비하려면 AMSO의 1밀리리터에 아민 기능화된 PEG를 용해하십시오. 이제 PEG 솔루션을 폴리 PFPA 솔루션으로 전송합니다. 격렬한 교반으로 실온에서 1 시간 동안 반응하십시오.DMSO에서 중단된 APTES 기능성 실리콘 이산화규꺼비 1밀리리터를 PEG 대체 폴리 PFPA 용액으로 옮킨다. 폴리 PFPA와 APTES 기능화 실리콘 이산화규물 구슬 사이의 이식이 격렬한 교반으로 실온에서 1시간 동안 진행되도록 합니다. 그런 다음 구슬을 원심분리로 5분간 10, 000G로 분리한 다음 상퍼를 제거합니다.비드 3밀리리터를 추가하여 씻어내고, 손으로 또는 몇 초의 초음파 처리로 섞는다. 구슬을 이전과 같이 원심 분리합니다. 그리고 DMSO 세척을 두 번 반복하기 전에 상체를 제거하십시오.3밀리리터의 3밀리리터로 구슬을 두 번 더 씻으시다. 그런 다음 손으로 또는 초음파 처리의 몇 초와 혼합. 구슬을 이전과 같이 원심분리하고 상체부를 제거합니다.마지막으로 밤새 진공 오븐에서 40도에서 구슬을 건조시. 폴리 PFPA 이식 실리콘 이산화규구5밀리그램을 1.5밀리리터 마이크로센심분리기 튜브에 추가합니다. PBS의 800 마이크로 리터를 추가하여 구슬을 씻고, 소용돌이에 의해 잘 섞습니다.1 분 동안 실온에서 10, 000 G에서 구슬을 원심 분리합니다. 상체를 제거하고 세워 단계를 세 번 반복합니다. 이제 신선한 PBS 350 마이크로리터, 0.1%PBST의 50마이크로리터, 항체의 6.67 마이크로그램을 추가합니다.섭씨 4도에서 회전에 약 20 시간 배양. 다음 날, 구슬과 원심분리기를 400G, 섭씨 4도에서 1분간 씻습니다. 그런 다음 상체를 제거하고 조심스럽게 400 개의 리시스 버퍼를 추가합니다.구슬을 5번 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 재연합니다. 이 워시 단계를 세 번 반복하십시오. 마지막 세척 후, 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 셀 및 리시스 버퍼를 준비합니다. 그런 다음 리시스 버퍼의 400 마이크로 리터로 세포 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 초음파 초음파 처리기로 세포를 초음파 처리합니다.초음파 처리 후, 소용돌이가 간단히. 그런 다음 10 분 동안 섭씨 4도에서 20, 000 G에서 lysate을 원심 분리합니다. 새로운 1.5 밀리리터 원심분리기 튜브로 상체를 옮기.면역 침전을 수행하기 위해, 이전에 준비된 항체 고정 폴리 PFPA 이식 된 실리콘 이산화구슬로 세포 용액 300 마이크로 리터를 전송합니다. 새로운 마이크로센심분리기 튜브에 입력 샘플로서 세포 리세이트 30마이크로리터를 유지한다. 용액 구슬 혼합물을 섭씨 4도의 회전기에서 3시간 동안 배양합니다.인큐베이션에 따라 혼합물을 섭씨 400G에서 1분간 원심분리합니다. 상체를 제거하고 400 마이크로리터의 세척 버퍼를 조심스럽게 추가하십시오. 구슬을 약 5회 위아래로 피펫으로 부드럽게 재보선다.세 번의 세정 후에 가능한 한 많은 상체를 제거하십시오. 구슬과 입력 샘플에 2x SDS 로딩 염료30 마이크로리터를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 95도에서 10 분 동안 가열합니다.가열 후, 서쪽 블로팅을 사용하여 샘플을 분석하거나 샘플을 영하 20도에서 저장합니다. 기능화된 실리카 구슬은 표면 조성물을 결정하기 위해 엑스레이 광전자 분광법 또는 XPS에 의해 검사됩니다. 대표적인 XPS 데이터는 여기에 표시됩니다.APTES 처리 후, 아민 군 영역 APTES와 관련된 질소 1s 피크가 검출된다. 폴리 PFPA 처리에 이어, 폴리머의 PFP 유닛과 관련된 불소 1s 피크가 검출된다. 단백질 키나아제 RNA 활성화, 또는 면역 침전을 통한 PKR 농축이 수행되고, 발성 단백질 샘플은 서양 블로팅을 사용하여 분석된다.예상대로, 항체가 없는 비구슬, 또는 비특이적 항체 혼합은 PKR 회수를 나타내지 않는다. 안티 PKR로 인큐베이션된 구슬은 PKR 밴드의 존재와 GAPDH 밴드의 부재로 표시된 대로 PKR을 성공적으로 풍부하게 할 수 있습니다. 이 절차를 시도하는 동안 시스템을 비교할 때 IP 실험과 후속 서부 블로팅 분석을 동시에 수행해야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다.개발 후, 이 기술은 상이한 생체 분자 또는 물질 기판의 고정화를 위해 사용될 수 있다. 또한 이 메서드는 각 응용 프로그램의 요구에 맞게 조정할 수 있는 표면 속성만 튜닝하는 추가이 있습니다.

preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads

Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

여기 Saccharomyces cerevisiae의에서 단백질 단지를 식별하기위한 새로운 양적 proteomics 기술을 설명합니다. 본 연구에서는, 우리는 높은 특이성과 ER 단백질 Scs2p의 바인딩 파트너를 식별하는 탠덤 질량 분석계 다음 친화 정화와 함께 SILAC 방법을 사용했습니다.

S. cerevisiae의의 양적 proteomics와 단백질 단지의 식별

이 비디오에서는 BFP(biomembrane force probe)를 사용하여 수용체와 리간드 사이의 힘을 측정합니다. 이 기술은 프로브 비드에 접합된 pMHC와 표적 세포의 TCR 사이의 결합을 끊는 데 필요한 압력을 모니터링하여 상호 작용을 감지할 수 있습니다.

수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

펩타이드 차 아미드 (학부모 교사 협의회)를 포함하지만, 펩티드, peptoids 및 N-메틸화 펩티드에 국한되지 않습니다 펩티 도미 메틱의 슈퍼 패밀리입니다. 여기에서 우리는 학부모 교사 협의회의 한 구슬 한 화합물 라이브러리를 합성하는 분할과 풀과 하위 단량체 전략을 결합 합성 방법을 설명합니다.

분할 및 풀 합성 펩타이드 급 아미드 도서관의 특성

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

우리는 폴리디메틸실록산(PDMS)에서 두 마이크로채널 사이에 나노유체 접합을 생성하기 위해 실리카 콜로이드 나노입자의 간단한 자기 조립 기술을 제안합니다. 이 기술을 사용하여 기공 크기가 ~45nm인 나노다공성 비드 멤브레인을 마이크로채널 내부에 구축하고 DNA 샘플의 동전기 사전 농축에 적용했습니다.

콜로이드 입자의 자기 조립 과정을 통해 PDMS 미세 유체 칩의 하위 50 Nm의 나노 유체 접합 만들기

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

여기, 우리는 bioinspired 실리 카 재료를 합성 하 고 거기에 효소를 무력화 하는 프로토콜을 제시. 실리 카는 규 산 나트륨 및 '첨가제'는 아민 제어 속도로 중화 결합 하 여 합성 됩니다. 제자리에서 효소 동원 정지 또는 캡슐화 된 첨가제의 합성 후 산 차입 하 여 물성 및 기능을 변경할 수 있습니다.

Bioinspired 메서드를 사용 하 여 기능성 실리 카의 준비

본 프로토콜은 인간 단핵구 자극 분석법에 대한 재조합 태그 없는 칼슘 결합 단백질 S100A12 및 이온 유도 올리고머에 대한 정제 방법을 기술한다.

면역 세포 자극을 위한 인간 S100A12 및 그 이온 유도 올리고머의 정화

이 워크플로우에서는 정량적 글로벌 프로테오믹스 분석을 위해 동시에 여러 단백질 번역 후 변형(PTM)의 시간 및 비용 효율적인 농축 성능을 설명합니다. 이 프로토콜은 여러 개의 공액 항체를 사용한 펩타이드 수준 PTM 농축을 활용한 다음 데이터 독립적 수집 질량 분석 분석을 통해 PTM 누토크에 대한 생물학적 통찰력을 얻습니다.

정량화 및 사이트 현지화를 위한 두 가지 번역 후 수정의 동시 선호도 강화

아실-RAC(Acyl-Resin Assisted Capture)는 다양한 생물학적 샘플에서 시스테인 잔류물(S-acylation)의 가역적 지질 변형을 검출하는 매우 민감하고 신뢰할 수 있으며 수행하기 쉬운 방법입니다.

아실-레신 보조 포획을 이용한 단백질 S-아실레이션 검출

배우세요 poly(PFPA) 기능성 SiO₂ 구슬을 이용한 단백질 정화 방법을. 항체 고정화와 면역침전을 통해 효과적인 단백질 분리가 가능하며, 약물 전달 및 생물학적 표적 검출에 활용할 수 있습니다.

단백질 정화에 대 한 Poly(pentafluorophenyl acrylate) 기능성 SiO₂ 구슬의 준비

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