Name: 미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: 학습하세요 다색 유세포 분석을 이용하여 살아있는 T 세포와 B 세포에서 미토콘드리아와 리소좀을 정량화하는 방법을. 이 기술은 면역대사 연구와 복잡한 세포 혼합물 분석에 활용됩니다.

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이 프로토콜의 개발은 카스 티 야 수의에 대만 사역의 과학 및 기술 (대부분) NSC103-2320-B-010-002-MY2 및 MOST104-2628-B-010-002-MY4에서 교부 금에 의해 지원 되었다. C.W. 웨이 우수 논문 수상의 연구소의 미생물학 및 면역학, 국립 양 밍 대학의 받는 사람입니다.

여기에 설명 된 마우스 조직 수확 절차 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 국립 양 밍 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 림프 구 림프 기관에서 현 탁 액의 준비
<ol><li>투명 한 아크릴 챔버 죽음을 보장 하기 위해 자 궁 경관 탈 구 뒤에 CO2 흡입 등 승인 된 방법으로 마우스를 안락사. 참고: CO2 챔버, 및 5 psi (평방 인치 당 파운드) 보다 분당 20% 변위에 대 한 유량을 유지 합니다. 그것은 식을 잃고 마우스에 대 한 2-3 분 걸립니다. 유지 CO2 흐름 적어도 1 분 동안 동물 (5-7 분 전체) 호흡을 멈춘 후.</li>
	<li>깨끗 한 보드 (예: 폴리스 티 렌 플라스틱 보드)에 그것의 뒤에 마우스를 놓고 테이프로 사지를 수정 합니다. 70% 에탄올으로 씻어.</li>
	<li>비장을 수확, 잘라내어 11 cm 해가 위 (비장은 위 아래 및 왼쪽된 신장 이상) 복 부 구멍을 엽니다. 집게로 비장을 제거 하 고 결합 조직 (필요한 경우가 위를 사용)에서 청소.</li>
	<li>Thymus 수확, 횡 경 막 위를 해 부와 양쪽에서 빗을 잘라. 집게를 사용 하 여 전체 흉 강을 흉 골 위로 올립니다. Thymus 신중 하 게가 위, 조직 주위에서 하 고 PBS를 가진 젖는 종이 타월에 어떤 잔여 결합 조직을 제거 합니다.</li>
	<li>기계적으로 5 mL 차가운 FACS 버퍼 PBS (보충 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1 mM EDTA)를 포함 하는 6 cm 접시에 주사기 플런저와 조직 분리. 전송 단일 세포 현 탁 액 15 mL 원심 분리기 튜브; 추가적인 2 mL FACS 버퍼 6 cm 접시를 세척 하 고 세척 뿐만 아니라 셀 서 스 펜 션 결합.</li>
	<li>Centrifuge 세포 현 탁 액 (300 x g, 4 ° C에서 5 분) 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 2 mL의 염화 염화 칼륨 (ACK) lysing 버퍼 (155mm NH4Cl, 10 m m KHCO3 와 0.1 m m 나2EDTA) 실 온 (RT) 붉은 혈액 세포를 lyse에서 1 분으로 펠 릿을 일시 중단 합니다. 세포 현 탁 액을 10 mL FACS 버퍼를 추가 하 여 ACK 버퍼를 중화.</li>
	<li>Centrifuge 세포 현 탁 액 (300 x g, 4 ° C에서 5 분) 하 고는 상쾌한 삭제. 다시 완전 한 RPMI 매체의 5 mL에 셀을 일시 중단 (RPMI 1640 매체, 44 m m NaHCO3, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES), 100 U/mL 페니실린, 100 mg/mL 스, 2 mM L-글루타민, 1mm 나트륨 pyruvate, 보충 1 %MEM 비필수 아미노산 및 10 %FBS).</li>
	<li>필터 세포 현 탁 액 셀 덩어리를 제거 하려면 셀 스 트레이너 (숨 구멍 크기 70 µ m)를 통해. Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터 셀을 계산 합니다.</li>
</ol>2입니다. 미토 콘 드리 아와 리소좀의 정량화
참고: 이러한 염료에 대 한 최적의 착 상태는 37 ° c.에 부 화 하기 때문에 먼저 얼룩 세포 기관이 특정 염료를 수행 표면 마커 얼룩 항 체 상한 및 해당 온도에서 국제화 크게 줄일 수 있습니다.
<ol><li>1 x 106 셀 라운드-하단 FACS 튜브 원심 셀 (300 x g, 4 ° C에서 5 분), 상쾌한 삭제 추가 합니다.</li>
	<li>최종 작업 농도에 프로브 재고 솔루션을 희석 (100 nM MitoTracker 녹색 또는 LysoTracker 녹색; 이제 미토 콘 드리 아 또는 리소좀 특정 염료, 각각) 37 ° C에 미리 데워 진된 혈 청 무료 문화 매체에. 이것은 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료에 대 한 작업 솔루션 이다. 참고: 테스트 (미토 콘 드리 아-특정 염료에 대 한 20-200 nM) 및 50-75 nM 여기 사용 리소좀 특정 염료에 대 한 제조 업체에 의해 제안 작업 농도의 범위를 포함 한 여러 농도 최고 효율 얼룩을 얻기 위하여. 대상 (예: 리소좀) 긍정적인 통제로 얼룩의 좋은 표현을 하는 세포 인구를 선택 (예: 인간의 CD14+ monocytes). 좋은 세포 생존 능력 뿐만 아니라 부정적이 고 긍정적인 얼룩, 사이 좋은 분리에 따라 작업 농도 선택 합니다.</li>
	<li>Resuspend 100 µ L의 리소좀 또는 미토 콘 드리 아-특정 셀 작업 솔루션 염색 하 고 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 품 어 15 분 또는 30 분, 각각.</li>
	<li>반응을 중지를 얼음 처럼 차가운 FACS 버퍼의 1 mL를 추가 합니다. 원심 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)에 의해 세포를 작은 고 상쾌한 삭제. 세포 표면 마커 얼룩에 대 한 준비가 지금입니다.</li>
</ol>3. 표면 마커 얼룩
<ol><li>FACS 버퍼 및 분리기 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)의 1 mL와 함께 10 분 워시 셀에 대 한 얼음 표면에 뜨는 미리 적정 한 2.4G2 hybridoma의 100 µ L와 블록 Fc 수용 체. 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>20 분 피 빛에 대 한 얼음에 FACS 버퍼에서 50 µ L 형광 활용 된 항 체를 미리 적정 한 조합으로 세포를 품 어. 참고: 준비는 항 체에 형광 항 체 존재 모두를 포함 하는 단일 색상 스테인드 셀 조합과 셀 흐름에 각 형광 검출기와 보상 조정의 전압을 설정 하기 위한 세포 기관이 특정 염료로만 치료 cytometer입니다. 마찬가지로, 모든 항 체와 함께 하지 않고 세포 기관이 특정 염료 얼룩이 묻은 셀을 사용 하 여 배경 컨트롤에서 1 (FMO)을 뺀 형광 준비.</li>
	<li>원심 (300 x g, 4 ° C에서 5 분)에 의해 FACS 버퍼 및 펠 릿의 1 mL을 추가 하 여 셀을 씻어. 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
	<li>FACS 버퍼 1 µ g/mL propidium 요오드 화물 (PI) 포함의 300 µ L 셀 resuspend 및 즉시 교류 cytometer에 샘플을 분석.</li>
</ol>4. 샘플 컬렉션 교류 Cytometer에
<ol><li>컴퓨터, 교류 cytometer, FACS 수집 소프트웨어 및 컴퓨터 플랫폼에 따라 다른 액세서리 장치를 켭니다. 실행 흐름 라인 되도록 약 1 분 동안 PBS PBS와 칼 집 버퍼 채워집니다. 흐름 스트림 원활 하 게 실행 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	<li>새로운 실험을 열고 하 고 제조업체의 지시에 따라 cytometer 매개 변수 (형광 검출기)를 선택 합니다. 70 µ m 셀 스 트레이너 및 덩어리와 남자 용 상의 형성을 피하기 위해 각 샘플의 인수 전에 소용돌이 통해 셀 필터링.</li>
	<li>셀 크기와 단위, 각각 대표 하는 앞으로 산포 (FSC) 및 측면 살포 (SSC)의 점 음모를 확인 합니다. 관심사의 세포는 플롯에 표시 되도록 FSC 그리고 SSC의 전압을 최적화 합니다. FSC- 대 FSC W (또는 FSC-H)의 점 음모를 확인 하 고 단일 셀에 대 한 게이트를 그립니다.</li>
	<li>점 작 각 형광 매개 변수를 확인 합니다. 흠 없는 세포를 사용 하 여 배경 신호를 확인 하 고 단일 색상 스테인드 컨트롤을 사용 하 여 긍정적이 고 부정적인 세포 인구는 명확 하 게 구별할 수 있도록 하 고 취득의 동적 범위 내에서 각 형광 매개 변수의 전압 조정.</li>
	<li>모든 전압 설정 후 사용 가능한 경우 자동 보정을 사용 하거나 수동으로 컨트롤과 흠 없는 및 단일 색상 스테인드 스펙트럼 일 좀 해결 하기 위해 보상을 조정 합니다. 보정 샘플에 적용 됩니다.</li>
	<li>각 매개 변수의 도트 줄거리를 만들고 실험 설정에 따르면 게이츠를 세우. 예를 들어, FSC- 대 FSC-H (또는 FSC-W) 남자를 제외 하 뒤 FSC-A 대 림프 구 게이팅; 대 한 SSC-A SSC A 대 PI (라이브 셀)와 CD4 대 CD8 (그림 1).</li>
	<li>인구 사이 의미 있는 비교를 위해 충분 한 이벤트 (총 휴대폰 번호)를 수집 합니다. 일반적으로, 관심사의 인구에서 적어도 1000 이벤트20얻어질 필요가 있다.</li>
	<li>모든 샘플, 인수 후 교류 cytometry 분석 소프트웨어에 의해 분석 흐름 데이터를 내보냅니다. 실험 cytometer 설정 및 미래에 비슷한 실험에 적용에 대 한 매개 변수를 유지 하려면 서식 파일로 저장 합니다.</li>
</ol>5. 데이터 분석
참고: 흐름 cytometric 데이터, 둘 다 상업 및 무료 소프트웨어를 분석 하는 많은 도구가 있습니다. 교류 cytometers의 수집 소프트웨어 또한 데이터 분석에 사용할 수 있습니다. 여기 우리는 예를 들어 FlowJo를 사용합니다.
<ol><li>소프트웨어를 시작 하 고 FCS 파일 작업 영역으로 끕니다. 샘플 그래픽 창을 열려면 클릭 하십시오. 선택에 수 여 하는 매개 변수 X 및 Y 축을 클릭 하 여 X 및 Y 축. 도구 모음을 사용 하 여 차동 표현된 마커 또는 세포 인구의 정의 고기 게이츠 그릴.</li>
	<li>그림 1에 표시 된 대로 각 매개 변수를 추가 합니다. 그들이 얻을 동일한 작업 영역에서 모든 샘플에 게이트를 끕니다 게이팅.</li>
	<li>그래픽 보고서를 만들 레이아웃 편집기를 음모를 끕니다.</li>
	<li>그래픽 창에서 통계 단추 (Σ)를 클릭 하 고 "의미"와 적절 한 매개 변수, 예를 들어 세포 기관이 특정 염료를 감지 하는 데 사용 하는 채널 선택의 각 인구를 위한 평균 형광 강도 (MFI)를 표시 합니다. 다음 "추가"를 클릭 합니다.</li>
	<li>테이블 편집기 아이콘을 클릭 하 고 통계 보고서를 만들 테이블 편집기 MFI 드래그 합니다. MFI (세포 기관이 특정 염료)-MFI (FMO)로 델타 MFI (ΔMFI)를 계산 하기 위해 Excel, 텍스트 또는 CSV 파일로 저장 합니다. 참고: 샘플 다른 cytometer 취득 사이 MFI를 계산 하지 않습니다 (전압, 형광 채널 설정 또는 설정 보상). 다른 설정으로 실험에서 파생 된 값의 비교는 무의미 하 고 편 파.</li>
	<li>테이블 및 그림을 만들기 위한 레이아웃 편집기에서 플롯 하 고 작업 영역에서 모든 값을 내보냅니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자 관심 없음 충돌 선언합니다.

이 프로토콜은 세포 기관이 특정 염료와 표면 마커 얼룩 미토 콘 드리 아 또는 다른 T 세포 인구에서 리소좀의 양을 계량 하. 이 방법은 전통적인 방법, 전자 현미경 등 immunoblot 분석에 대 한 셀 번호와 동질성 요구의 한계를 극복 하기 위해 개발 되었다. 희귀 세포 인구를 분석 하 고 동시에 동시에 여러 셀 형식 검사에 특히 유용 합니다.
절차의 기간 및 외피의 온도이 프로토콜의 가장 중요 한 요소. 적절 한 세포 기관이 라벨 세포 기관이 특정 염료의 정확한 적정을 필요합니다. 세포 생존 능력을 강화 하 고 항 체 상한 및 국제화에 얼음에 엄격 하 게 유지 한다 또한. 또한, 이러한 세포 기관이 특정 염료의 형광은 빛 노출 및 온도 변화에 취약 합니다. 따라서, 샘플 착 절차 완료 되 면 즉시 분석은 매우 중요. 우리가 지속적으로 2 시간 이내에 모든 실험을 완료 하는 데 수 있다.
인수 설정 (예: P...

활성화 및 T 세포의 확산 장착 성공적인 면역 반응에 중요 한 단계가 있습니다. 최근 진보 세포질 물질 대사는 개발 및 T 세포의 기능와 밀접 하 게 관련 된 것이 좋습니다. 예를 들어, naïve T 세포 산화 인 산화 (OXPHOS) 2 차 림프 기관 가운데 재순환 동안 에너지 수요를 충족 하기에 크게 의존 합니다. 활성화, naïve T 세포 과감 한 대사 프로그래밍, 호 기성 해당 분해 ATP 생산을 증가 하 고 세포 분화 및 증식 하는 동안 엄청난 대사 요구를 충족의 유도 포함 하 여 받 다. 신진 대사 요구를 통해 수행 하지 못하는 세포 apoptosis1,2다. 신진 대사 프로그래밍 하는 동안 미토 콘 드리 아에 중요 한 역할 때문에 그들은 크게는 셀에 대 한 에너지를 공급 하는 ATP의 생산에 대 한 책임 세포 세포 미토 콘 드리 아 콘텐츠 대사 스위치 중 변동 통해 T 세포 개발 및 활성화3. 그러나, 불필요 하거나 손상 된 미토 콘 드리 아의 축적 지질, 단백질 및 DNA를 손상 하 고 결국 죽음4 셀 이어질 수 초과 선생님을 생성할 수 있습니다.
과도 한 또는 손상 된 미토 콘 드리 아 대사 변경에서 발생 하는 특수 한 형태의 autophagy5, mitophagy로 알려진에 의해 제거 됩니다. 미토 콘 드리 아 autophagosomes에 의해 싸여 있으며 다음 성능 저하 lysosomes로 융합. 이 미토 콘 드리 아 간의 통신 닫고 리소좀 큰 관심6,7생성 합니다. 산화 스트레스를 미토 콘 드리 아에서 파생 된 소포 (MDVs) 리소좀 인산 가수분해 효소 및 tensin 체 (PTEN) 저하에 대 한 타겟으로하는 미토 콘 드리 아를 자극 하는 예를 들어-상 상속 키 니 아 제 1 (PINK1) 유도 및 parkin (E3 유비퀴틴 리가) 종속 방식8. 또한 그 mitophagy 베이 지 화이트 체형 전환9,10에 대 한 필수적입니다 발견 했다. 더 중요 한 것은, 리소좀 단지 저하 구획, 아니라 셀룰러 신호의 레 귤 레이 터 하지 않습니다. 효소 부족으로 인해 과도 한 기판 축적 lysosomal 부전 lysosomal 막 침투성을 방해 하 여 발생 하 고 캘리포니아2 + 항상성11에 영향을 줍니다. T 세포 기능 결함 lysosomal 산 성 리 파 제 (LAL)12 또는 lysosomal 대사 산물 운송업 자 녹아웃 마우스 모델13 에 추가 T 세포 항상성 유지에 리소좀의 중요성을 보여주었다. 미토 콘 드리 아와 리소좀 세포 신진 대사 조절의 불리할 수 없는 부분입니다. 따라서, 세포 미토 콘 드 리아 측정 T 세포 대사 및 기능 상태를 평가 하는 중요 한 표시기 되었습니다.
일반적으로 세포 미토 콘 드리 아 또는 lysosomal 내용을 정량화 하는 데 사용 하는 분석 실험 등 immunoblot, 전자 현미경, immunofluorescent (IF) 얼룩, 미토 콘 드리 아 DNA 복사 번호14,15, 의 PCR 분석 16. 이러한 분석 특정 기술적인 단점 부담 immunoblot 양적 다른 샘플 및 전자 현미경 검사 법17이러한 세포 형태학 적 특징을 시각화 수 있는 경우 전체 단백질 레벨을 비교할 수 있습니다, 하는 동안. 예, 그것은 시간이 걸리는 높은 배율과 해상도와 셀 이미지의 충분 한 번호를 취득 하거나 낮은 처리량 방법으로 간주 됩니다 이러한 분석을 만드는 샘플을 수십에서 단백질의 식 수준을 비교 하. 셀 라인, 같은 동종 세포 인구에 하지만 혼합 인구의 구성 된 조직 샘플을 또한,이 분석 실험의 적용할 수만 있습니다.
그것은 또한 드문 인구, 10에서 숫자는 최소 셀의 요구 사항에 이러한 분석을 적용 하기 어려운6 108 만날 수는 없습니다. 마지막으로, 셀 일반적으로 lysed 또는 호환 되지 않는 추가 정보를 추출 하는 다른 방법으로 그들을 만드는 과정 동안 고정. 전통적인 방법에 비해, 형광 기반 cytometry는 상대적으로 높은 처리량-모든 샘플 내의 셀 혼합된 셀 인구 구성의 정보를 분석 하 고 동시에 수집 된 수 있습니다. 또한, 하나의 동일한 셀에 10 개 이상의 매개 변수를 검색할 하 고 추가 분석에 대 한 원하는 고기에 따라 셀을 정렬할 수 있습니다. 반응 형광 프로브 리소좀 및 라이브 세포에서 미토 콘 드리 아를 사용 하 고 교류 cytometry18,19에 의해 검출 될 수 있다. 이러한 세포 기관이 전용 프로브 셀 침투성 고 특정 subcellular 위치 또는 세포에 집중 될 수 있도록 physico-화학 특성. 편리 하 게,이 프로브 따라서 다 색 분석에 대 한 그들의 응용 프로그램을 사용 하면 다양 한 형광 형식에서 사용할 수 있습니다.
표면 마커 라벨 리소좀을 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료와 염색 법을 결합 하는 방법을 자세하게에서 설명 합니다이 프로토콜 또는 미토 콘 드리 아에서 라이브 셀. 기본 조직 및 장기는 종종 다른 유형의 세포 인구 구성에서 생성 된 샘플에 대 한 특히 유용 합니다. 연구원은 그들의 표면 마커 식으로 관심의 세포 인구를 식별 하 고 이러한 세포에서 세포 기관이 특정 염료를 통해 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 내용을 구체적으로 측정 수 있습니다. 여기, 우리 주요 비장 T 세포 모집단에 lysosomal 또는 미토 콘 드리 아 질량을 계산 하는 흐름 cytometric 분석의 상세한 절차를 보여 줍니다.

<table><tbody><tr><td>10cm Graefe 펜치 (직선 및 톱니 모양)</td><td>Dimeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11cm Iris 가위 (날카롭고 날카로운 머리가 있는 직선)</td><td>Dimeda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 주사기</td><td>TERUMO&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6cm 페트리 접시</td><td>&알파;-플러스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70&마이크로; m 나일론 셀 스트레이너</td><td>SPL Lifesciences</td><td>93070</td><td></td></tr><tr><td>염화암모늄(NH4Cl) &nbsp; &nbsp;</td><td>시그마</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>안티 마우스 CD25</td><td>Biolegend</td><td>102007</td><td>클론 : PC61</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD4</td><td>Biolegend</td><td>100453</td><td>클론 : GK1.5</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD44</td><td>Biolegend</td><td>103029</td><td>클론 : IM7</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD62L</td><td>Biolegend</td><td>104407</td><td>클론 : MEL-14</td></tr><tr><td>안티 마우스 CD8</td><td>Biolegend</td><td>100713</td><td>클론:53-6.7</td></tr><tr><td>안티-마우스 TCR&beta;</td><td>Biolegend</td><td>109233</td><td>클론:H57-579</td></tr><tr><td>BD LSR포르테사</td><td>BD 생명과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)</td><td>바이오 베이직</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>팔콘 5ml 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(FACS 튜브)</td><td>BD 생명과학</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>하이클론</td><td>ATD161145</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo, LLC</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>하이드록시에틸 피페라진에탄술폰산(HEPES)</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민(200mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Green, DND26</td>, <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td></td></tr><tr><td>MEM, 비필수 아미노산(100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr>, <tr><td>MitoTracker Green FM</td><td>, Thermo Fisher Scientific</td><td>M7514</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>중탄산칼륨(KHCO3)</td><td>J.T.baker</td><td>298-14-6</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물 용액</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 매체(분말)</td><td>Gibco</td><td>31800089</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨 (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td></td></tr></tbody></table>

미토 콘 드리 아와 t 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 cytometry 기반 정량화

Multicolor Flow Cytometry-based Quantification of Mitochondria and Lysosomes in T Cells

T 세포 감 별 법 그리고 확산 하는 동안 그들의 기능 요구에 맞게 다른 신진 대사 프로그램을 활용 합니다. 미토 콘 드리 아에는 중요 한 세포 구성 요소 셀 에너지; 공급에 대 한 책임 그러나, 초과 미토 콘 드리 아에는 또한 반응성 산소 종 (선생님) 세포 죽음을 일으킬 수 있는 생산. 따라서, 미토 콘 드리 아의 수 지속적으로 세포의 요구에 맞게 조정 해야 합니다. 이 동적 규칙 일부 흑자/손상 된 세포와 고분자를 제거 하는 리소좀의 기능을 통해 이루어집니다. 따라서, 세포 미토 콘 드리 아와 lysosomal 내용이 세포의 신진 대사 조정 평가 하는 주요 지표 이다입니다. 세포에 대 한 프로브 개발, 잘 특징이 리소좀 또는 미토 콘 드리 아-특정 염료는 세포 리소좀 및 미토 콘 드리 아를 다양 한 형태로 제공 되었다. 다 색 cytometry 프로필 셀 고기를 일반적인 도구 이며 다른 분석 실험와 통합 될 수 있다. 여기, 우리와 결합 하 여 세포 기관이 특정 염료 표면 마커 얼룩에 교류 cytometer 리소좀과 다른 T 세포 인구에 있는 미토 콘 드리 아의 양을 측정 하는 방법의 상세한 프로토콜을 제시.

비장 및 흉 선 주요 T 세포 부분 집합의 식별
간단히, 비장, thymus에서 단일 셀 정지 적혈구의 lysed, 2.4G2 상쾌한와 인 큐베이 팅, 세포 기관이 특정 염료 및 표면 마커 형광 활용 된 항 체 (표 1)와 얼룩. Thymocytes의 개발 진행 공동 수용 체에 항 체를 사용 하 여 기술 될 수 있다 CD4, CD8. 가장 미 숙 thymocytes CD4 또는 CD8 표현 하지 않는 그리고 이중 부정 (DN) 불린다. 다음, 그들은 c d 4와 CD8 최대 조절 하 고 이중 긍정 (DP) 될. 마지막으로, 그들은 CD4 또는 CD8 다운 조절 하 고 성숙한 단일 긍정적인 (SP) 세포 기관 떠날 준비가 되. 셀 공동 수용 체를 표현 하지 않는 때, T 세포 발달의 초기 단계 c d 4와...

이 문서에서는 미토 콘 드리 아 또는 살아있는 세포에서는 리소좀을 계량 하는 강력한 방법을 보여 줍니다. 표면 표식에 놓여있는지 활용 된 항 체와 리소좀 또는 미토 콘 드리 아 특정 염료의 조합 사용 하 여 조직 샘플에서 수확 하는 1 차 셀 같은 혼합된 세포 인구에 이러한 세포의 부 량 수 다 색 cytometry입니다.

미토 콘 드리 아와 T 세포에서는 리소좀의 다 색 흐름 Cytometry 기반 정량화

T cells utilize different metabolic programs to match their functional needs during differentiation and proliferation. Mitochondria are crucial cellular ...

이 방법은 면역 물질 대사 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 장점은 다른 세포 유형의 복잡한 혼합물에서 개별 살아있는 세포에서 미토콘드리아 또는 리소좀의 정량화를 허용한다는 것입니다. T 및 B 세포를 연구하기 위한 이 방법은 또한 대식세포, 수지상 세포, 또는 조직 견본에서 수확된 어떤 1 차적인 세포와 같은 많은 그밖 세포 모형에 적용될 수 있습니다.절차는 내 실험실에서 대학원생 인 친 웬 웨이에 의해 입증될 것입니다. 양자화를 위해 세포기관에 라벨을 붙이려면 먼저 마커당 1라운드 하단 팩스 튜브에 여섯 번째 마우스 T 셀에 1회 10번 을 추가합니다. 그리고 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.세포특정 프로브 스톡 솔루션을 중간크기의 최종 작업 농도로 희석하기 위해 37°C까지 미리 따뜻해져 있다. 그리고 튜브 당 프로브 염료의 100 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단합니다. 다음으로, 적절한 염색 기간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 세포를 배양하고, 튜브 당 얼음 냉간 팩스 버퍼1밀리리터로 인큐베이션의 끝에서 반응을 중지한다.이어서, 또 다른 원심분리로 세포를 수집하고 얼음위에 미리 정된 24G2 hybridoma 상수제의 100마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단한다. 10분 후 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다. 원심분리에 의해 세포를 수집하고 사전 조정된 형광의 50 마이크로리터로 세포를 라벨로 지정하여 관심 있는 항체 칵테일을 접수합니다.테이블에 따라 적절한 농도를 추가합니다. 그리고 빛으로부터 보호 얼음에 20 분 동안 버퍼링합니다. 인큐베이션이 끝나면 튜브당 팩스 버퍼 1밀리리터를 추가합니다.원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 그리고 프로피듐 요오드의 밀리리터 당 하나의 마이크로그램으로 보충 팩스 버퍼의 300 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단. 핵 및 염색체 카운터스테인을 추가한 직후 기계 플랫폼에 따라 유동 세포계 분석 컴퓨터, 흐름 사이토미터, 팩스 획득 소프트웨어 및 기타 액세서리 장치를 켭니다.유동선이 PBS 및 시어테 버퍼로 채워지도록 시스템을 통해 PBS를 약 1분 동안 실행합니다. 새로운 실험을 열고 제조업체의 지침에 따라 사이토미터 매개 변수를 설정합니다. 70 마이크로미터 세포 여과기를 통해 세포를 필터링합니다.그리고 덩어리와 이중 형성을 피하기 위해 각 샘플의 취득 전에 소용돌이. 자동 보정 설정을 열고 각 형광 매개변수에 대한 점 플롯을 만듭니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다.측면 분산 플롯과 전방 분산을 만들고 전압을 최적화하여 관심 있는 셀이 플롯 내에 표시되도록 합니다. 앞으로 분산된 높이 플롯과 방향 분산을 만들고 단일 셀을 게이트합니다. 측면 분산 영역 플롯과 림프구의 게이트에 대한 전방 분산 영역을 만듭니다.프로피듐 요오드 플롯대 전방 분산 영역을 만들고 라이브 셀을 게이트합니다. 모든 전압이 설정된 후 보정을 조정하고 보정을 샘플에 적용합니다. 그런 다음 첫 번째 샘플 튜브를 로드하고, 적절한 세포 표면 마커 플롯을 만들고, 관심 있는 집단의 적어도 1, 000 이벤트를 수집한다.모든 샘플을 실행한 경우 후속 분석을 위해 흐름 데이터를 내보냅니다. 그리고 미래에 유사한 실험에 대한 사이토미터 설정 및 매개 변수를 보존하기 위해 실험을 템플릿으로 저장합니다. 최종 부위 미토콘드리아 함량은 이중 음수 1T 세포에서 가장 낮으며, 이중 음수 단계 2및 3에서 피크를 기록하며, 이중 음수 단계 4에서 약간 감소합니다.CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포보다 더 많은 수의 미토콘드리아를 보여주는 이중 양성 티모사이클로 개발 중에 미토콘드리아 함량이 변동한다는 것을 시사합니다. CD4 및 CD8 단일 양성 티모세포는 비장 CD4 또는 CD8 T 세포보다 더 높은 미토콘드리아 평균 형광 강도를 나타내며, 산소가 풍부한 혈액 환경에서 재순환하는 순진한 T 세포가 티모세포보다 훨씬 낮은 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 시사한다. 흥미롭게도, 미토콘드리아 내용의 이러한 감소는 CD4 T 세포 계보보다 CD8에서 더 두드러지며, T 세포 활성화는 이들 세포세포의 존재를 더욱 감소시다.비교적 낮지만 검출 가능한 리소소말 함량은 모든 티모사이클 집단에서 관찰되며, 이중 음수 1개의 티모사이클에서 더 두드러진 존재가 있습니다. 주변에서, 상대적으로 많은 수의 리소좀이 메모리 및 이펙터 CD8 양성 T 세포에서 검출된다. 유기체 특이적 염료와 표면 마커를 유동 세포측정과 결합하는 것은 복잡한 혼합물에서 세포의 대사 상태를 특성화하는 강력한 방법입니다.추가 소세포 특이적 염료는 내피성 망상, 자가형성 바쿠올 또는 기타 세포내 구획을 검출하는 데 사용될 수 있다.

multicolor-flow-cytometry-based-quantification-mitochondria-lysosomes

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 동영상은 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포, γδ T 세포, B 세포, 자연 살해(NK) 세포 및 단핵구를 식별하기 위해 두 개의 형광 색소를 사용하는 유세포 분석 기반 기술을 보여줍니다. 표면 마커에 대해 형광 색소 접합 항체로 세포를 배양하면 최적의 유세포 분석 게이팅 전략을 사용하여 세포 subset을 식별할 수 있습니다.

말초 혈액 단핵 세포에서 면역 세포 subset을 식별하기 위한 유세포 분석 분석

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유세포분석을 사용한 뉴런의 다중 미토콘드리아 파라미터 측정

여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.

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Multispectral Imaging Flow Cytometry를 사용하여 LC3, p62 및 LAMP1 Co-Localization 측정을 통한 Autophagic Flux 평가

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형광 기자 흐름 Cytometry 사용 pH-종속 mt-Keima에 의해 Mitophagy의 중요 한 측정

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에플로프 펌프 억제를 통해 조혈 줄기 및 전조 세포에서 미토콘드리아 막 전위성 유동 세포 측정 평가의 정확도 향상

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