Name: 시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 autoradiography를 이용하여 마우스 조직에서 단백질 결합 부위를 시각화하는 방법을. 이 기술은 고해상도 이미징으로 약리학적 분석에 활용됩니다.

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작품은 Lundbeck 재단 (그랜트 R133-A12270), Novo Nordisk 기초 (그랜트 NNF0C0028664)에 의해 지원 되었다. 저자 [3H] radioligand의 공급에 대 한 박사 Aleš 마렉을 감사합니다.

모든 동물 처리 덴마크어 동물 실험 검사자에서 지침에 따라 수행 되었다.
참고: 여기에 설명 된 프로토콜 커버 조직 준비 (즉, 마우스 뇌 조직), 생체 외에서 autoradiographic 분석 결과 새로운 실험실에서 메서드, 인광 체 격판덮개를 이미징에 노출 설정에 대 한 충분 한 세부 사항에서 뿐만 아니라 지역화 및 다른 해 부 구조에 radioligand 바인딩 측정의 목적으로 autoradiograms (그림 2)의 후속 densitometric 분석. 비교를 위해 조직학, cresyl 보라색 얼룩이 지는 프로토콜 포함 되어 있습니다. 또한, 일반적인 경쟁 ligand 바인딩 결정 프로토콜 내에서 포함 되어 있습니다. Kd, B최대 또는 K나확인 하는 방법에 대 한 자세한 설명에 대 한 이전 게시4를 참조 하십시오.
1. 조직 준비 Cryosectioning
<ol><li>자 궁 경부 전위에 의해 마우스를 안락사 하 고 즉시가 위와 집게를 사용 하 여 뇌를 해 부. 직접 조직 손상을 방지 하려면 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>스냅-동결 조직 침수에 의해 가루 드라이 아이스, 기체 CO2 또는 isopentane. 직접-20 ° c.에 설정 온도와 냉동된 조직 한 cryostat에 전송 또는 처리까지 조직-80 ° C에 저장 합니다. 참고: 반복된 녹고/동결 조직 손상을 줄이기 위해 피하십시오.</li>
	<li>추가 조직 산 산 조각 방지 하기 처리 하기 전에 20 분 동안 cryostat에-20 ° C에 적응 하는 조직 하자.</li>
	<li>포함 매체는 cryostat 외부 조직 홀더를 커버 하 고 포함 매체는 여전히 액체 동안 신속 하 게 원하는 방향에서 동결된 조직 표본을 장소. 예를 들어, rostral 코로나 섹션을 달성 하기 위하여 수직으로 소 뇌에 쥐의 뇌를 놓습니다. 조직 홀더는 cryostat 다시 전송 하 고 노출 온도 아래에 포함 매체 강화-10 ° C. 참고: 연약한 조직 표본 장착 전에 조직 금형 내에서 매체를 포함에 코팅 한다.</li>
	<li>조직 홀더는 cryostat의 톰에 위치. 경사 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정 합니다.</li>
	<li>잘라 원하는 두께의 섹션에서 stereotaxic 아틀라스18 의 지도 함께 조직 (12 µ m [3H]에 대 한 권장 ligands를 표시). 신중 하 게 제대로 필요한 경우 작은 크기의 브러시와 섹션을 펼쳐 고 해 동 실장 현미경 슬라이드에 섹션. 순차적으로 원하는 기술 복제 (예를 들어, 슬라이드 당 4 섹션)에 대 한 관심의 영역에서 섹션을 수집 합니다.</li>
	<li>1 시간에 대 한 추가 처리 하기 전에 건조를 슬라이드에 섹션 수 있습니다. 참고: 슬라이드 상자를 건조 시키는 물자의 추가 습기 직물 단면도에 구축을 최소화합니다. Procotol 일시 중지 할 수 여기 섹션 장기-80 ° c.에 슬라이드 상자에 저장 하 여</li>
</ol>2. 생체 외에서 Autoradiography
주의: 방사능. 지역 규정에 따라 인증 된 실험실에서 작동 합니다. 보호복을 착용 하십시오. 되거나 방사성 붕괴에 따라 삭제 인증된 회사에 아웃소싱.
<ol><li>실 온 (RT)에서 적어도 30 분 동안 섹션 녹여 실험 조건으로 슬라이드를 레이블을 지정 합니다. 연필을 사용 하 여 슬라이드 후속 얼룩 동안 에탄올에 목욕 것입니다 때문에.</li>
	<li>플라스틱 쟁반에 슬라이드를 가로로 놓습니다. 참고: 슬라이드 플라스틱 트레이 내 상승 된 플랫폼에 위치 그들의 처리를 촉진 한다.</li>
	<li>미리 incubate 섹션 분석 결과 버퍼에서 슬라이드에 조정 문제의 대상 (GHB 프로토콜, 50mm KHPO4 버퍼 pH 6.0 사용)에 대 한 슬라이드 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L)에 적절 한 볼륨을 신중 하 게 적용 하 여. 참고: 모든 섹션 액체와 완전히 덮여 있는지 확인 합니다.<ol>
<li>증발을 방지 하 고 지속적인 부드러운 (20 rpm) 판 통에 떨고 (GHB 프로토콜 사전 incubate RT에서 30 분)에 대 한 관련 온도에서 미리 품 어 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반을 커버.</li>
		<li>일반적인 바인딩 결정에 대 한 분석 결과 버퍼 (GHB 프로토콜, 1mm GHB)에 대 한 unlabelled 화합물의 관련 농도를 보충. 참고: 사전 부 화 필요 없을 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>각 슬라이드에서 사전 부 화 액체를 부 어와 슬라이드를 다시 플라스틱 쟁반에 전송.</li>
	<li>탈수를 피하기 위해, 즉시 원하는 조건에서 분석 결과 버퍼에서 radioligand의 관련 농도 단면도 품 어 (GHB 프로토콜, 1 nM [3H] RT에서 1 h HOCPCA)는 radioligand로 섹션을 취재 하 여 솔루션 (3-4 설치류 코로나 섹션에 대 한 700 µ L).<ol>
<li>닫힌된 뚜껑을 가진 플라스틱 쟁반의 지속적인 부드러운 (20 rpm) 떨고 아래에서 품 어. 참고: radioligand 농도 액체 섬광 카운터에서 약 수를 계산 하 여 유효성 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>액체를 붓는 의해 부 화 솔루션을 제거 하 고 현미경 슬라이드 랙 슬라이드를 전송. 즉시 섹션 탈수를 피하기 위해 다음 단계를 진행 합니다.</li>
	<li>슬라이드를 씻어. GHB 프로토콜에 대 일 분을 제거 하는 방법에 얼음 처럼 차가운 증류수로 가득 쟁반으로 슬라이드 랙 찍기로 두 번 차가운 분석 결과 버퍼 두 번 20 s와 다음 린스 세척. RT에 적어도 1 시간에 대 한 공기에 대 한 선반에서 슬라이드를 수직으로 위치 또는 차가운 온도를 설정 하는 송풍기와 5 분에 대 한 슬라이드를 건조. 참고: 세척 최적화 해야 합니다, 예를 들어, 광범위 한 세척 비 특정 바인딩 감소에 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>슬라이드 fixator paraformaldehyde (PFA) 파우더 PFA RT에서 수증기와 함께 하룻밤 고정을 위한 ligand 대상 단지의 무결성을 보호 하기 위해 포함 된 전송. 주의: PFA 독성이 있다. 에 위치 fixator 후드를 연기 하 고 PFA와 피부/눈 접촉을 피하기 위해.</li>
	<li>다음 날, desiccator 상자 습기를 제거 하는 RT에 3 h에 대 한 실리 카 젤을 포함 하는 슬라이드를 전송 합니다.</li>
</ol>3. 형광 이미징 접시와 검색에 노출
<ol><li>향하도록 하는 조직으로 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치 합니다. Radioligand 바인딩의 후속 정량화에 대 한 모든 카세트 [3H] 미 포함. 섹션을 무작위로 정렬 하 고 같은 카세트에 직접적인 비교에 대 한 섹션을 노출.</li>
	<li>축적 된 신호 저장에서 제거 배경 신호를 제거 하 고 사용 직전 접시를 이미징 움 민감한 형광체를 지웁니다. 따라서, 형광 이미징 시스템으로 접시를 로드 하 고 표시/적외선 제조업체의 지침에 따라 빛에 노출.</li>
	<li>형광 이미징 시스템에서 접시를 제거 하 고 즉시 카세트에 섹션에 놓습니다. 카세트 완전히 닫혀 있는지 확인 합니다. 빛 으로부터 차폐 된 RT에서 3 일 동안 형광 이미징 접시에 섹션을 노출 합니다.</li>
	<li>빛 지웁니다 이미징 접시에서 신호, 때문에 신중 하 게 카세트 어둠 속에서 및 즉시 이미징 접시 인 영상의 어둠 상자에 전송 열거나 형광체 영상 어두운 공간에 둡니다. 참고: 분석 후 디지털 이미지에서 개별 견본을 식별 하기 위해 노출 하는 동안 슬라이드의 공간 배열 notate 있는지 확인 합니다. 따라서 형광 이미징 접시는 또한 디지털 사진에 있는 접시의 정확한 방향을 확인 하기 위해 고유한 각도에서 잘라 한 구석에 표시.</li>
	<li>높은 해상도 디지털 이미지를 얻을 수에 접시를 검사 합니다.</li>
</ol>4. 선택 사항: Cresyl 조직 단면도의 보라색 얼룩
<ol><li>Cresyl 바이올렛 아세테이트 이온된 수 (dH2O)의 500 ml의 5 g을 혼합 하 여 1 %cresyl 바이올렛 솔루션 준비 (약 2 시간) 녹아 때까지. 새로운 500 mL 병으로 깔때기를 사용 하 여 필터 종이 통해 필터링. PH 3.5-3.8를 조정 합니다.</li>
	<li>위치 슬라이드 얼룩 증기 두건에서 설정합니다. 트레이 (크 실 렌)을 제외 하 고 백색 폴 리 프로필 렌 쟁반에서 다음 솔루션으로 준비: a. 50% ethanol/50% dH2O b. 70% ethanol/30% dH2O c. 100% 에탄올 d. 100% 에탄올 e. 100% dH2O f. 1 %cresyl 바이올렛 g. 0.07% 초 산 (dH2O의 250 mL에 아세트산의 175 µ L 추가). 헤 녹색 용 매 저항 트레이 자일 렌 100% i. 100% 녹색 용 매 저항 쟁반에 크 실 렌</li>
	<li>증기 두건에 슬라이드를 이동 하 고 슬라이드 선반에 넣어.</li>
	<li>1 분에 대 한 슬라이드를 담거 서 100% 에탄올 (트레이 a-d)로 dH2O에서에서 에탄올의 증가 등급된 시리즈를 통해 지질을 분해.</li>
	<li>DH2O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션</li>
	<li>Cresyl 보라색 10 분 솔루션에서 표본 담가.</li>
	<li>린스는 표본 0.07% 아세트산에 dH2O 1 분 동안에 담거 서 4-8 미 세척에 대 한 부드럽게 위아래로 슬라이드 슬라이드를 해제 하 여.</li>
	<li>표본 30에 대 한 슬라이드의 침수로 탈수 에탄올 (트레이 a-d)의 농도 오름차순에서 s.</li>
	<li>100% 크 실 렌 (트레이 h와 나) 에탄올을 끄다의 두 쟁반을 통해 표본 전송.</li>
	<li>DH2O 1 분에 대 한 슬라이드를 찍기로 에탄올 (트레이 a-d 트레이 e 뒤에 반대 방향에서)의 농도 내림차순으로 통해 표본 리하이드레이션</li>
	<li>집게와 염 분에서 슬라이드를 제거 합니다. 슬라이드 당 미디어를 장착 하는 유기 용 매를 몇 방울을 추가 하 고 24 x 60 m m coverslip 견본을 보호 하기 위해 상단에 추가. coverslip에 부드럽게 눌러 견본 coverslip 사이의 기포를 제거 합니다. 참고: 크 실 렌 건조 방지 하기 위해 설치 하는 동안 나머지 슬라이드 하십시오.</li>
	<li>건조 슬라이드 실시간에 증기 두건에서 하룻밤</li>
	<li>현미경 및 1.25 X 목표 표본 그림을 가져옵니다.</li>
</ol>5. densitometric 디지털 이미지 분석
<ol><li>각 교정 이미지 분석 소프트웨어와 함께 [3H] 눈금에서 표준의 상대 광학 밀도 (막대)를 측정 합니다.<ol>
<li>메뉴 항목 지역 결정 지역 창조 를 위한 도구를 사용 하 여 [3H] 눈금의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택 합니다. 메뉴 항목 레이블아래 번호 를 클릭 하 여 각 선택된 영역에 번호를 할당 합니다.</li>
		<li>클릭 하 여 표준 교정의 각 지점에 대 한 OD 값을 내보내기 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서. 스프레드시트를 로드 값을 전송 하 고 선택 된 영역의 크기에 의해 정상화. 추가 densitometric 분석에 대 한 표준 곡선을 얻기 위해 선형 회귀를 수행 합니다. 참고: 선택된 영역 일치 막대 값과 샘플 식별 표시는 다는 것을 확인 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>독자적인 영역을 선택 하 여 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 autoradiograms의 정량화를 수행의 (수익 ROI) 모든 섹션 영역 생성 도구를 사용 하 고 그것의 ODs를 측정. 복사 하 고 각 autoradiogram에 대 한 뇌 해부학에서 사소한 변화에 수동으로 조정 관심 영역에 대 한 템플릿을 만들어 모든 섹션에 동일한 영역을 선택 합니다. 뇌 아틀라스18와 autoradiograms의 비교 하 여 투자 수익의 해부학을 식별 합니다. 여러 치료법을 비교 하면 눈을 멀게 하 고 편견된 다양 ROIs 피하기 위하여 무작위로 분석을 수행 합니다.</li>
	<li>수출 막대 값 및 선택 된 영역의 크기를 클릭 하 여 스프레드시트에 파일 | E 내보내기 | 2D 지역 보고서.</li>
	<li>특정 지역 당 밀도 얻기 위해 그것의 지역에 의해 선택 된 ROI의 측정된 막대를 나눕니다.</li>
	<li>접시의 백그라운드의 로드를 측정 하 고 스프레드시트에 해당 하는 막대 값 영역 크기를 수출. 각 투자 수익의 모든 막대 값에서 평균 배경 신호를 뺍니다.</li>
	<li>평균 기술 복제, 즉, 섹션의 봉 같은 동물에서 직물을 사용 하 여 복제 합니다.</li>
	<li>표준 곡선을 사용 하 여 봉 radioligand 바인딩, 즉의 단위로 변환., nCi/mg 조직 등가물 (테). 참고: 용어 테 표준 조직 시뮬레이션 자료로 생성 되 있기 때문에 사용 됩니다.</li>
	<li>Radioligand (식 1)의 특정 활동에 따라 바인딩 nmol/mg 테 nCi/mg의 변환 하 여 표현 한다. <img alt="리간드 결합 계산식, 생화학적 연구와 관련된 nmol/mg TE를 설명하는 방정식." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>특정 바인딩 값을 얻기 위해 일반적인 바인딩을 총 바인딩에서 뺍니다.</li>
	<li>평균 기술의 평균을 사용 하 여 모든 생물 복제의 바인딩 (단계 5.6에서 얻은) 각 동물의 복제 합니다.</li>
</ol>

저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.

Autoradiographic 분석 결과의 품질은 가장 자주는 radioligand의 감도 의해 결정 됩니다. 주요 기여 하는 요소는 적절 한 특정 활동 (즉, 방사능의 양을 ligands를 알려진된 ligands의 가용성에 의해 또는 특정 라벨 기술의 타당성에 의해 주어진 선택 된 방사성 동위 원소 단위는 radioligand의 두더지) 당23와 화학 저하의 제한 금액. 알려진된 ligands의 radioligands의 많은 수는 움9,10,,2425,26, 유추 하는 몇 가지 장점이 있는 이라는. 첫째, 트리 티 움 (3H) 개별 일괄 처리의 장기 저장을 추진...

Autoradiography는 방사성 붕괴의 이미지를 제공 하는 방법입니다. 기술은은 정기적으로 관심 생체 외에서 기반 radiolabelled 화합물과 그 대상 간의 특정 약물 상호 작용에의 한 단백질의 조직 분포를 연구 하는 데 사용 됩니다. 이 대상에 대 한는 리간드의 선택도 대 한 직접적인 정보를 제공합니다. 생체 외에서 autoradiography도 사용할 수 있습니다 결정 뿐만 아니라 약리 바인딩 매개 변수 분리 상수 (Kd) 및 (B최대), 바인딩 사이트의 밀도 같은 radioligands의 양적 결정 경쟁 ligands1,2의 저해 상수 (Ki). 전통적인 homogenate radioligand 바인딩에 비해 autoradiography 공간 해부학을 시각화 수 있는 그리고 지역 식 패턴3의 간결 상세히의 이점이 있다. Autoradiography 방법 따라서 검증 된 항 체의 부재에 (서) 특히 immunocytochemistry에 관련 대안입니다. Autoradiography 쉽게 필요한 약리학 특이성, 톰 cryostat 준비 조직 단면도, 및 적합 한 이미징에 대 한 액세스와 함께 적합 한 radioligand의 가용성을 주어진 표준 방사성 동위 원소 실험실에서 구현 각 조직 섹션에서 방사능의 분포를 분석할 수 있는 장치. 특히,는 radioligand에 대 한 중요 한 선택 기준이 아닌 대상 사이트에 바인딩 제한 금액입니다. 이 다른 단백질, 세포 막 또는 플라스틱 또는 필터, 등 자료 수 있으며 일반적인 바인딩 통칭. 일반적으로, 비 특정 바인딩 비 있는 하지만 있는 특정 오프 대상 단백질을 포함 될 수 있습니다. 사실 특정 바인딩 유효성을 검사 하는 가장 좋은 방법은 조직 부족 대상, 예를 들면, 유전자를 비교 (녹아웃) 조직4설계 된다.
여기, 방법론은 포유류 두뇌에서 γ-hydroxybutyric acid (GHB)의 높은 친 화력 바인딩 사이트의 autoradiographic 묘사와 그림입니다. GHB는 narcolepsy 및 알코올 중독5, 치료 뿐만 아니라 포유류 두뇌와는 레크리에이션의 자연 구성 모두 임상적으로 유용한 약물 관련성의 이다 GHB와 그것의 바인딩 사이트 간의 약리 상호 작용 이해 약6. 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트 처음 쥐 뇌 homogenate7[3H] GHB 바인딩을 사용 하 여 설명 했다. 년 동안, 더 autoradiography 연구 [3H] GHB와 아날로그 [3H] NCS 382 바인딩 사이트 쥐8,,910, 마우스9 개 지역에서의 높은 밀도 보였다는 11와 원숭이/인간 두뇌12돼지. 그러나, 분자 정체성과 이러한 바인딩 사이트의 정확한 기능 관련성은 애매 남아 있다.
의도 바인딩 사이트 추가 하 고 GHB의 생리 적 역할에 대 한 연구를 촉진 하기 위하여, 다른 동위 원소 다른 선호도 부여를 통합 하는 여러 radioligands 개발 되었습니다 ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA와 [125나] BnOPh GHB)13,,1415,16(17에서 검토) (그림 1). 선택적인 높은 선호도 radioligands와 바인딩 사이트 이미징 기술9,11형광체를 사용 하 여 높은-품질 이미지의 생산에 대 한 허용의 매우 높은 조직 밀도의 조합. 세부를 예증 하는 autoradiographic 실험 및 그림 설정에 실용적인 포인트의 개요, 함께 토론 섹션의 방사성 핵 종 i) 선택, ii) 분석 결과 조건, 선택 및 iii) 형광체의 사용을 강조 합니다. x 선 필름 대 이미징 접시입니다. 이 종이의 전반적인 목표는 조직 분포 및 단백질 목표의 약리학 분석에 대 한 알리는 autoradiography 기술에 기술, 방법론 및 과학적인 세부 사항을 제공.

<table><tbody><tr><td>앱솔루트 에탄올</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 이미징 플레이트</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - 트리튬에 민감함</td></tr><tr><td>크레실 바이올렛 아세테이트</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (현미경 검사용 비수성 장착 매체)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. 컴파운드, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 슬라이드</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>현미경 슬라이드</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 수동 슬라이드 염색 세트</td><td>Sakura Finetek Denmark ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>유리</td><td>의 삼중수소 표준미국 Radiolabeld Chemicals, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>크실렌 대체물</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

Autoradiography 생체 외에서 인간 뿐만 아니라 실험 동물에서 조직에 관심사의 단백질의 해부학 적 분포를 시각화 하는 것을 목표로. 메서드를 생물 학적 대상 radioligand의 특정 바인딩을 기반으로 합니다. 따라서, 언된 조직 단면도 radioligand 솔루션, 알을 품는 그리고 대상 바인딩 이후 지역화 방사성 붕괴의 탐지에 의해 예를 들어 감광 필름 또는 인광 체 격판덮개를 이미징 사용 하 여. 결과 디지털 autoradiograms 정량화 및 지역화 radioligand 바인딩 다른 해 부 구조에서의 놀라운 공간 해상도 표시 합니다. 또한, 정량화 바인딩 사이트 (B최대) 선택 된 조직에서의 밀도 뿐만 아니라 분리 상수 (Kd), (K나) 저해 상수에 의하여 ligand 선호도 약리 특성에 대 한 수 있습니다. 따라서, 메서드는 대상 지역화 및 리간드 선택에 대 한 정보를 제공합니다. 여기, 기술은 높은 선호도 γ-hydroxybutyric 산 (GHB) 바인딩 바인딩 분석 결과 관한 방법론 고려 사항에 특별 한 강조와 포유류 뇌 조직에서 사이트의 autoradiographic 묘사와 궁 행 매개 변수는 radioligand 및 검출 방법의 선택.

설명 된 프로토콜을 사용 하 여, 높은 선호도 GHB 바인딩 사이트의 해부학 적 분포 radiolabelled GHB 아날로그 [3H] 함께 가시화 했다 코로나, 화살 및 수평 섹션 (그림 3으로 잘 렸는 쥐의 뇌에 HOCPCA ). 높은 수준의 바인딩 해 마와 대뇌 피 질에서 관찰 되었다가 낮은 바인딩 및 바인딩 없음 검색 되었습니다, 소 뇌에 해당 하는 높은 선호도 GHB 사이트9,10의 이전 보고 식 패턴 11,12. 다음과 같이, 해 부 구조 수 있습니다 시각 될 다른 단면 평면을 사용 하 고 해 부 무결성 cresyl 보라색 얼룩에 의해 지원 될 수 있습니다. ...

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

사인 방사선 사진은 표적에 대한 특정 방사선 리간드를 사용하여 조직에서 단백질 결합 부위의 분포를 연구하는 강력하고 간단한 기술입니다. 또한 면역 히스토케화학에 적합한 대안입니다. 이 기술은 전통적인 필름 노출보다 빠른 디지털 이미지를 통해 공간 해상도로 단백질 발현을 시각화합니다.그것은 또한 단백질 표적의 약리 분석에 사용될 수 있습니다. 이 방법은 유리에 장착 된 마우스 조직을 포함하지만 다른 종또는 커버립에서 자란 세포로 확장 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 Nane Griem-Krey가 할 것입니다.시작하려면, 그것을 동결 스냅 가루 드라이 아이스에 조직을 잠급. 냉동 조직을 영하 20도로 설정된 냉동 조직을 냉동으로 직접 옮기습니다. 조직이 20 분 동안 극저온에서 영하 20도까지 적응하게하십시오.그런 다음 조직 홀더를 극저온 외부의 중간체로 덮고 냉동 조직 표본을 원하는 방향으로 빠르게 배치하고 중간크기는 여전히 액체입니다. 조직 홀더를 다시 극저온으로 옮기고 경화시 영하 10도 이하의 온도에 내장 된 매체를 노출하십시오. 극저온의 마이크로토메에 티슈 홀더를 배치합니다.기울어질 부분을 피하기 위해 조직의 방향을 조정합니다. 원하는 두께의 섹션에서 스테레오 탁스 아틀라스의 지도로 조직을 잘라 필요한 경우 작은 브러시로 섹션을 펼칩니다. 해동은 현미경 슬라이드에 섹션을 마운트합니다.그런 다음 원하는 기술 반복에 대한 관심 영역에서 섹션을 순차적으로 수집합니다. 슬라이드의 섹션이 추가 처리 전에 1시간 동안 공기를 건조하게 합니다. 인증된 방사능 실험실에서 연필을 사용하여 슬라이드에 실험 조건과 라벨을 부착합니다.슬라이드를 플라스틱 트레이에 수평으로 놓습니다. 문제의 대상에 맞게 조정된 적절한 양의 SA 버퍼를 슬라이드에 장착된 섹션에 신중하게 적용합니다. 각 섹션이 완전히 덮여 있는지 확인합니다.비특이적 결합의 판정을 위해 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 SA 버퍼를 보충하십시오. 그런 다음 증발을 피하기 위해 트레이를 뚜껑으로 덮습니다. 20 rpm으로 설정된 플레이트 셰이커에서 30분 동안 관련 온도에서 사전 배양합니다.다음으로 각 슬라이드에서 인큐베이션 전 액체를 부어 슬라이드를 플라스틱 트레이로 다시 옮습니다. 즉시 SA 버퍼에서 radioligand의 관련 농도와 함께 섹션을 완전히 덮습니다. 비특이적 결합의 판정을 위해, 라벨이 없는 화합물의 관련 농도로 radioligand 용액을 보충한다.트레이를 뚜껑으로 덮고 원하는 조건에서 20 rpm에서 일정한 부드러운 흔들림으로 인큐베이션하십시오. 그 후 인큐베이션 용액을 부어 슬라이드를 현미경 슬라이드 랙으로 옮킨다. 슬라이드를 즉시 씻으십시오.GHB 프로토콜의 경우 얼음 차가운 SA 버퍼로 20초 간 세척한 다음 슬라이드 랙을 얼음 차가운 증류수로 채워진 트레이에 찍어 두 번 헹구십시오. 슬라이드를 랙에 수직으로 배치하고 공기건조를 최소 1시간 동안 건조시합니다. 그런 다음 실온에서 하룻밤 고정을 위해 파라포름알데히드를 포함하는 고정소로 슬라이드를 옮김합니다.다음 날, 실온에서 실리카 젤이 들어있는 건조기 상자로 슬라이드를 옮기. 수분을 제거하기 위해 3 시간 동안 건조기 상자에 슬라이드를 둡니다. 첫째, 조직을 향하고 방사선 차폐 이미징 플레이트 카세트에 섹션을 배치합니다.방사성 리간드 결합의 후속 정량화를 위해 모든 카세트에 방사성 마이크로 스케일을 포함한다. 사용 직전에 삼중수소에 민감한 인광 화상 진찰 판을 인광 화상 진찰 기계에 적재하고 제조업체의 지시에 따라 가시적외선에 노출하여 지웁니까. 그런 다음 인광 화상 진찰 기계에서 이미징 플레이트를 제거하고 즉시 카세트의 섹션에 놓습니다.카세트가 완전히 닫혀 있는지 확인합니다. 빛으로부터 보호하면서 실온에서 최적화된 노출 시간을 위해 피광기 이미징 플레이트에 섹션을 노출시하십시오. 노출 후, 조심스럽게 어둠 속에서 카세트를 열고 즉시 인광구 이미저의 어두운 상자에 이미징 플레이트를 전송합니다.디지털 이미지를 얻기 위해 가능한 최고 해상도로 플레이트를 스캔합니다. 먼저 적절한 이미지 분석 프로그램을 엽니다. 메뉴 항목 영역 측정을 선택하여 각 교정 표준에 대한 상대 광학 밀도를 결정합니다.지역 생성을 위한 도구를 선택하고 방사성 마이크로스케일의 각 지점에 대해 동일한 크기의 영역을 선택하는 데 사용합니다. 메뉴 항목 레이블 아래의 번호를 클릭하여 선택한 각 영역에 숫자를 할당합니다. 파일 내보내기를 클릭한 다음 2D 지역 보고서를 클릭하여 교정 표준의 각 지점에 대한 OD 값을 내보냅니다.독점 이미징 소프트웨어에서 영역 생성 도구를 사용하여 모든 섹션에 대한 관심 영역을 선택하고 OD를 측정하여 자동 라디오그램의 정량화를 수행합니다. 관심 영역에 대한 템플릿을 만들어 모든 섹션에서 동일한 영역을 선택하고 각 자동 라디오그램의 뇌 해부학의 사소한 변형으로 복사하여 조정합니다. 이 후 파일 내보내기 2D 지역 보고서를 클릭하여 선택한 영역의 ROD 값과 크기를 스프레드시트로 내보냅니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 radioligand의 바인딩을 결정합니다. 이 연구에서는, 높은 친화성 GHB 결합 부위의 해부학적 분포는 관상, 처탈 및 수평 섹션으로 절단된 마우스 뇌에서 방사성 표지된 GHB 아날로그 방사성 HOCPCA로 시각화됩니다. 높은 수준의 결합은 해마와 피질에서 볼 수 있으며, 낮은 결합 수준은 줄무늬에서 볼 수 있으며 소뇌에서 바인딩이 감지되지 않습니다.여기에 도시된 바와 같이, 해부학적 구조는 상이한 평면을 사용하여 시각화될 수 있고 해부학적 무결성은 크레실 바이올렛 스테인링에 의해 지원될 수 있다. 쥐, 마우스 및 돼지의 대표적인 자동 방사선 사진은 포유류 뇌에서 높은 친화성 GHB 결합 부위의 진화적 보존을 보여줍니다. 방사성 HOCPCA 결합 부위는 그들 사이의 총 뇌 해부학의 비교를 가능하게 하는 모든 3종에서 검출됩니다.높은 선호도 GHB 바인딩 사이트는 바인딩 사이트에 대한 서로 다른 친화성을 표시하지만 유사한 특정 활동을 표시하는 GHB radioligands와 프로브됩니다. 방사성 HOCPCA는 고감도 및 뛰어난 신호 대 잡음 비율을 부여합니다. 방사성 NCS-382의 낮은 감도로 인해 유사한 수준의 결합을 얻기 위해 더 높은 방사성 리간드 농도를 사용해야 합니다.방사성 GHB가 유사한 결합 수준을 달성하기 위해서는 더 높은 방사성 GHB가 필요합니다. 그러나, 더 높은 radioligand 농도는 또한 노이즈 비율에 결과적으로 더 낮은 신호와 비특이적 결합의 수준을 증가시다. 소음 비에 가장 좋은 신호를 얻기 위해 radioligand 농도, 세척 및 노출 시간과 같은 분석 조건을 최적화하는 것이 중요하며 이전에 플레이트를 지우는 것도 매우 중요합니다.절차는 발견 프로젝트에 유용 할 수있는 살아있는 동물의 화합물 바인딩에 대한 아이디어를 얻기 위해 생체 내 조건으로 확장 될 수있다. 인증된 완전한 방사성 물질이 있는 실험실에서 일하고 방사능 또는 파라포름알데히드를 취급할 때 보호복을 착용해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.

신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사

이 프로토콜은 전반사 형광 현미경을 사용하여 살아있는 세포 표면의 단일 수용체를 시각화 및 추적하여 수용체 측면 이동성, 수용체 복합체의 크기를 분석하고 일시적인 수용체-수용체 상호 작용을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 다른 막 단백질로 확장될 수 있습니다.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

수용체는 리간드 매매 시그널링 및 세포 반응성을 조절하고, 그 자체의 리간드 - 유도 된 세포 신호 전달을 포함한 조건에 응답한다. 여기, 우리는 양적 immunolabeling 및 colocalizational 분석을 사용하여 약물 유발 수용체 인신 매매를 평가하기위한 강력하고 유연한 기술을 설명합니다.

Colocalizational 분석에 의한 수용체 후 국제화 인신 매매에 약물 유발의 이동을 추적

약물 적재 단백질을 주형으로 사용하는 초소형 형광 금 나노클러스터(Au NC)의 현장 합성을 기반으로 하는 소분자 약물 스크리닝을 위한 프로토콜이 제시됩니다. 이 방법은 단백질 템플릿 Au NC에서 방출되는 가시적인 형광 신호에 의해 표적 단백질에 대한 약물의 결합 친화도를 간단하게 결정할 수 있습니다.

단백질 표적 소분자 약물 검사를위한 신속하고 정량적적인 형광 방법

여기에서는 안지오텐신 II의 요오드-125 표지 유사체를 사용하여 정량적, 농도 측정, 체외 수용체 자가방사선 촬영을 통해 쥐의 뇌에서 안지오텐신 II 유형 1 수용체의 국소화를 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

안지오텐신 II 수용체의 현지화 시각화에 대한 수용체자가 방사선 프로토콜

여기, 우리는 계량의 rhodopsin 돌연변이 망막 화와 관련 된 전송 하는 콘텐츠 이미징 방법을 설명 합니다. 다중 파장 득점 분석 rhodopsin 단백질 세포 표면에 또는 전체 셀에서 계량에 사용 되었다.

이 콘텐츠 이미징 분석 Rhodopsin 전송 분석 결과

여기서, 우리는[11C]SNAP-7941의 완전 자동화된 방사성 라벨링 및 P-gp 발현 및 비발현 세포에 대한 이 PET-추적자의 실시간 역학의 분석을 위한 프로토콜을 나타낸다.

[11C]SNAP-7941의 자동 합성및 실시간 역학 평가의 기술적 측면

당사는 예를 들어 심장 표적 펩타이드를 사용하여 파라핀 임베딩, 단면 및 공초점 형광 현미경 검사법을 선행한 전 생체 이미징 시스템을 활용한 세포 관통 펩티드에 의한 침투 정도를 평가하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리의 프로토콜에서, 단 하나 동물은 동일 기관의 화상 진찰 평가의 두 모형을 취득하기 위하여 이용될 수 있고, 따라서 연구 결과에 필요한 동물의 수를 반으로 삭감합니다.

심장 표적 펩타이드의 트랜스포션 효율성의 생체 내 이미징

이 프로토콜은 이러한 화합물의 전임상 스크리닝에 사용할 수 있는 광전환 가능한 항암 펩타이드의 평가를 위해 채택된 일련의 실험을 제시합니다. 여기에는 2D 및 3D 세포 배양에서의 세포 독성 평가, 생체 외 (모델 조직) 광이성질화 효율 평가 및 생체 내 효능이 포함됩니다.

광제어 생물학적 활성 화합물의 시험관 내 및 생체 내 평가 - 암 광약리학을 위한 잠재적 약물 후보

우리는 이광자 여기 형광 현미경(2PEF)과 통합된 산화중수소(중수D2O) 탐침 자극 라만 산란(DO-SRS) 현미경을 사용하여 아미노산에 의해 조절되는 세포에서 대사 활동을 직접 시각화하는 프로토콜을 제시합니다.

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

이 프로토콜은 "루프 방법"[11C]메틸화를 통해 4개의 탄소-11 방사성 추적자를 준비하는 자세한 절차를 제시합니다. [11C]ER-176을 3개의 추가 방사성 추적자([11C]MRB, [11C]mHED 및 [11C]PiB)에 대한 데이터와 함께 합성하는 절차를 설명합니다. 루프 방법은 전통적인 반응 용기 [11C] 메틸화에 대한 증가된 방사성 화학적 수율로 효율적인 합성을 제공합니다.

Enhancing Efficiency and Radiolabeling Yields of Carbon-11 Radioligands for clinical research with the loop method(루프 방법을 사용한 임상 연구를 위한 탄소-11 방사성 리간드의 효율성 및 방사성 표지 수율 향상)

배우세요 autoradiography를 이용하여 마우스 조직에서 단백질 결합 부위를 시각화하는 방법을. 이 기술은 고해상도 이미징으로 약리학적 분석에 활용됩니다.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

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