Name: 높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 배우세요 대식세포 모델에서 NBD-콜레스테롤을 이용한 고처리량 콜레스테롤 유출 분석 방법을. 이 기술은 방사성 물질 없이 심혈관 질환 위험 평가에 활용됩니다.

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이 작품은 부분적으로 지원 된 연구 기관 드 건배 카를로스 III에 마드리드, 스페인;에서 FIS (PS12/00866) 부여 Fondo Europeo 파라 엘 개발 지역 (페더); 레드 드 Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) 및 검색 프로그램 / Generalitat 드 Catalunya. 저자는 Retrovirology 인 d'Investigacions Biomèdiques 8 월 Pi 나 Sunyer (IDIBAPS)의 바이러스 Immunopathology 실험실을 감사합니다. 우리 감사 합니다 T. Escribà, C. Rovira, 및 C. Hurtado 그들의 지원 및 지식 및 기술 이전 사무실에서 S. Cufí에 대 한 발명을 보호에 대 한 그녀의.

이 연구에 대 한 윤리 위원회 승인 (다 Ètic d'Investigació Clínica, 병원 클리닉, 바르셀로나, 승인 번호 HCB/2014/0756) 및 서 면, 정보 동의 모든 과목에서 얻은 했다.
1. NBD-콜레스테롤 준비
<ol><li>NBD-콜레스테롤 (MW 494.63; 참조 테이블의 재료) 순수 에탄올에 주식 (2mm)를 분해. 10 mg 유리병 2 m m 재고를 에탄올의 10.1 mL 볼륨에 전체 유리병 내용 분해.</li>
	<li>5 μ M의 최종 농도 도달 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% 페니실린/스 (R10 매체) 보충 RPMI 1640 년에서 재고에서 NBD 콜레스테롤 희석 (예:, 5 μ M 최종 농도에서 NBD 콜레스테롤의 10 mL를 얻을)에 의해 25 μ r 10 매체에 NBD 콜레스테롤 재고 (2 mM)의 희석 이 볼륨은 96 잘 접시에 대 한 충분 합니다.</li>
</ol>2. 세포 문화 및 시드 (주 2)
<ol><li>37 ° c, 5% CO2R10 매체에서 문화 THP-1 셀. 3 일 마다 106 셀/mL x 0.3을 조정 합니다.</li>
	<li>시드 106 셀/잘 R10 매체 (잘 당 100 μ) x 0.2에서 평면, 분명 바닥 흰색 96 잘 접시에 셀입니다.</li>
	<li>100 nM phorbol myristate 12 13-아세테이트와 셀 치료 (PMA; 10 μ M 재고에서) 37 ° C에서 배양 하는 48-72 h THP-1을 차별화 하는 데 5% CO2 dmTHP-1에 셀. 참고: R10 매체의 500 μ에서 PMA 재고 (10 μ M)의 5 μ를 사용 하도록 추천 된다. 이 앞서, 준비는 10 μ M PMA 재고 동결 건조 된 1 g 유리병 디 메 틸 sulfoxide (DMSO), aliquot, 및-20 ° c.에 재고의 10 mL에 용 해 하 여</li>
	<li>또는 (제안) 결합 2.2 및 2.3을 위한 단계 더 균질. 15 mL 튜브에서 THP-1 셀의 10 mL를 준비 하 고, PMA 재고 (10 μ M)의 200 μ를 추가 하 고 부드럽게, 믹스 한 즉시 접시에 잘 당 100 μ 씨앗. 2.3 단계에서 설명한 대로 셀을 품 어.</li>
</ol>3. Apolipoprotein B 고갈 세럼 (ABDS) 준비 (2 또는 3 일)
<ol><li>폴 리 에틸렌 글리콜 (PEG) 솔루션을 준비, 글리신 pH 7.4에서 200 mM의 농도를 (살 균 H2O)와 10 %PBS 희석. 페그를 던지다 8000의 10 g 40 mL 200 m m 글리신의 추가 20% (w/v). 균질을 적극적으로 솔루션을 믹스.</li>
	<li>4 적용 20%의 혈 청/플라즈마 1.5 mL 튜브에 각 혈 청/혈장 샘플의 10 개 부분 당 목이 부분과 25 분17 얼음 혼합물을 두고 (예를 들어, 100 μ 플라스마 또는 혈 청, 추가 20 @ μ 던지다 솔루션).</li>
	<li>13000 x g 4 ° c.에서 15 분에 못 apolipoprotein B 침전 물은 원심</li>
	<li>침전을 삭제 합니다. 새로운 튜브에는 상쾌한을 전송. 참고: (신선한) 3 일에는 ABDS를 준비 하는 것이 좋습니다. 그것은 가능, 하루에 2는 ABDS를 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서 그것을 유지.</li>
</ol>4. NBD-콜레스테롤 셀 로드 (주 2)
<ol><li>DmTHP-1의 문화 매체를 삭제 하 고 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 1 두 번 씻어.</li>
	<li>로드 5 μ M와 셀 NBD-콜레스테롤 (잘 당 100 μ) R10 매체에서 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어 고.</li>
</ol>5. 콜레스테롤 수락자 (주 3)를 가진 외피
<ol><li>매체를 삭제 하 고 PBS로 두 번 셀을 씻어.</li>
	<li> </li><li></li></ol><ol><li><ol><li><li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></ol></li><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg"></li><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg"></li></ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death">http://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/the-top-10-causes-of-death</a> (2018).</li>
<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
<li>Ilhan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atherosclerosis+and+the+role+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Clinical+Cases%22%5BJournal%5D)">Atherosclerosis and the role of immune cells.</a> World Journal of Clinical Cases. 3 (4), 345(2015).</li>
<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
<li>Yamamoto, S., Narita, I., Kotani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+its+related+cholesterol+efflux+as+a+HDL+function+index+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">The macrophage and its related cholesterol efflux as a HDL function index in atherosclerosis.</a> Clinica Chimica Acta. 457, 117-122 (2016).</li>
<li>Escolà-Gil, J. C., Rotllan, N., Julve, J., Blanco-Vaca, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+macrophage-specific+RCT+and+antioxidant+and+antiinflammatory+HDL+activity+measurements%3A+New+tools+for+predicting+HDL+atheroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">In vivo macrophage-specific RCT and antioxidant and antiinflammatory HDL activity measurements: New tools for predicting HDL atheroprotection.</a> Atherosclerosis. 206 (2), 321-327 (2009).</li>
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</ol>

저자 권리 특허 출원 (EPO, 18382337.6-1118, 17 5 월 2018)의 발명가 선언 하고자 "콜레스테롤 경과 확인 하기 위한 방법"이이 방법에 따라.

형광 표시 콜레스테롤은 분석 하 고 속성 및 자연 콜레스테롤 체 외의 물질 대사를 조사 하는 유망한 전략 이다. 그것의 주요 이점은 그것은 세포에 의해 채택 될 수 있다, 세포내 수 막 유통 연구, 콜레스테롤 경과 분석 실험 등이 프로토콜 (그림 7)에 적용할 수 있습니다. 일부 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 추적 BODIPY-콜레스테롤, dansyl 콜레스테롤, dehydroegrosterol, 및 22 및 25-NBD-콜레스테롤12를 포함 하 여 생체 외에서 수 있습니다. 특히, 22-NBD-콜레스테롤은 콜레스테롤 역학을 공부 하는 다른 세포 유형으로 고 라디오 라는 콜레스테롤18의 대용으로 적합 합니다. 합의 방법 콜레스테롤 경과 분석 결과에서 형광 신호 평가에 있다. 노래 외14 수확 매체와 세포 lysates 별도로; FI...

세계 보건 기구에 따르면는 현재 교장의 죽음은 전세계 원인은 허 혈 성 심장 질환과 뇌졸중 (15.2 백만 죽음의 총에 대 한 회계)1. 둘 다 심장 혈관 질병 (CVD) 동맥 경화 및 혈관2,3atheroma 플 라크의 파열에 의해 선행 될 수 있습니다.
동맥 경화는 혈관 벽 염증 성 질환 대 식 세포, T 세포, 돛대 세포 그리고 수지상 세포는 내 피를 침투와 결국 동맥 경 화성 플 라크를 형성 하는 혈액에서 축적 이다. 동맥 경 화성 플 라크는 지질 코어 및 콜레스테롤 결정, 경 동맥 intima 미디어 두께4,5의 고해상도 B 모드 초음파 측정에 의해 입증 제시. 세포, 지질 수락자 입자 쪽으로 콜레스테롤 경과 ABCA1, ATP 의무적인 카세트 G 인도의 회원 1 ATP 묶는 카세트 (ABC) 수용 체의 수단 (ABCG1), 및 SR-BI 폐품 수용 체에 의해 수행 됩니다. 콜레스테롤 유입 및 세포에 경과의 불균형 동맥 경화 개시6핵심 과정으로 간주 됩니다. 콜레스테롤 경과 플라즈마 주변 조직에서 콜레스테롤 제거에 중요 한 단계 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT) 라는 프로세스에서 간으로 간주 됩니다. 콜레스테롤은 세포 apolipoprotein A1에 주로 (ApoA1) 고밀도 지단백 (HDL) 입자의 표면에서 발견에서 전송 됩니다. HDLs는 다음 배설 및 재 사용률7,,89간 콜레스테롤 수송.
전통적으로, 트리 티 움 (3H) 라디오 이라는 콜레스테롤 콜레스테롤 경과10에 사용 되었습니다. Radioisotopes의 방출 신호는 매우 민감한10; 그러나, 라디오 이라는 콜레스테롤 긴 프로토콜, 이온화 방사선에 노출의 위험과 방사성 방출의 안전한 취급을 위해 특별 한 방사능 시설 및 장비에 대 한 필요성 등 분명 한 장애를 선물 한다. 그와 반대로, 형광은 형광 신호 검색과 fluorophores 사용할 수의 광범위 한, 그것의 안전11에 그것의 단순 진단 기법에 성공적으로 통합 되었습니다. 여러 형광 표시 스 테 롤 콜레스테롤 물질 대사 (본질적인 형광)와 dehydroergosterol, dansyl 콜레스테롤, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) 연구에 사용 되었습니다-콜레스테롤, 및 22-(N-(7- Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3β-Ol (NBD-콜레스테롤)입니다. 특히, NBD 콜레스테롤 인간 세포12효율적인 통풍 관을 선물 한다. 두 개의 다른 NBD 표시-콜레스테롤 현재 사용할 수 있습니다: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) 및 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; 그림 1)입니다. 25-NBD-콜레스테롤은 세포 막 역학 연구13,14에서 주로 사용 하는 동안 22 NBD moiety 함께 셔 서 콜레스테롤 콜레스테롤 경과 연구에 맞게 최고의 수 있습니다.
일반적으로 생체 외에서 콜레스테롤 경과 분석 실험에서 사용 하는 셀 라인 인간의 백혈병 파생 THP-1 셀, murine Raw 264.7 세포15또는 J774.1 같은 monocyte 모양의 세포 이다. 이러한 셀의 모든 phorbol myristate 12 13-아세테이트 (PMA)를 사용 하 여 체 외에서 세포로 분화 될 수 있다 하지만 THP 1 파생 된 대 식 세포 (dmTHP-1) 최고의 반영 하 고 인간의 세포16모방.
현재 연구에서 우리는 최적화 하 고 22 NBD 콜레스테롤 [3H] 하는 대신 사용 하 여 dmTHP-1, 혈 청 샘플의 콜레스테롤 경과 용량을 결정 하는 형광 높은 처리량 방법을 표준화-콜레스테롤. 또한, 우리는 표준 방사성 아날로그와 최적화 된 형광 기법을 비교합니다.

<table><tbody><tr><td>96웰 수집 플레이트</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3912</td><td>흰색 96웰 플레이트(불투명 투명 바닥 포함</td></tr>) <tr><td>96웰 배양 플레이트</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>흰색 96웰 플레이트(편평하고 투명한 바닥 포함</td></tr><tr><td><)>em콜레스테롤 유출 분석 키트(세포 기반)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>상업용 고처리량 세포 기반 분석 키트를 결정하는 것을 목표로 합니다. 콜레스테롤 유출</td></tr><tr><td>무색 RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 (페놀 레드 없음</td></tr><tr><td>Gen5 데이터 분석 소프트웨어</td><td>포함) BioTek</td><td></td><td>버전 2.0</td></tr><tr><td>글리신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>글리신, 비 동물 사용</td></tr><tr><td>발광계</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>다중 검출 마이크로 플레이트 리더</td></tr><tr><td>용해 용액 1</td><td>사내</td><td></td><td>50 mM Tris Buffer, 150 mM NaCl 및 H2O</td></tr><tr><td>용해 용액 2</td><td>사내</td><td></td><td>순수 에탄올 및 세포 용해 용액 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-콜레스테롤</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Amino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>인산염 완충&nbsp; 식염수</td></tr><tr><td>, PEG 8000</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>202452-250G</td>, <td>폴리에틸렌 글리콜</td></tr>, <tr><td>PMA,</td><td>시그마-알드리치</td>, <td>79346</td>, <td>포르볼, 12-메리스테이트 B-아세테이트.</td></tr><tr><td>R10</td><td>원내</td><td></td><td>RPMI 1640에는 10%의 소 태아 혈청과 5%의 페니실린/스트렙토마이신이 함유되어 있습니다.</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 1.5g/L 중탄산나트륨 및 4.5g/L 포도당 THP-1 세포를 함유하는 2mM L-글루타민이 있는 RPMI 1640</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td> ATCC, 1세 아기 Tween 80의 <td>백혈병에서 유래한</td><td>#TIB-202</td> 단핵구 유사 라인</tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량 nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

동맥 경화는 심장 혈관 질병 (CVD)에 리드. 그것은 여전히 분명 콜레스테롤-HDL (cHDL) 농도 롬 개발에 인과 역할을 담당 하는 여부입니다. 그러나, atheroma 플 라크 형성의 초기 단계에서 중요 한 요소는 콜레스테롤 경과 용량 HDL (동의 대 식 세포에서 콜레스테롤을 HDL 입자의 능력)을 거품 세포 형성을 피하기 위하여. 이것은 endothelium 및 반전 콜레스테롤 수송 (RCT)를 통해 콜레스테롤 제거의 부분에 콜레스테롤의 축적을 방지에 중요 한 단계 이다. 혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마 콜레스테롤 경과 용량 동맥 경화에 대 한 biomarker로 사용 될 수 있는 유망한 도구입니다. 전통적으로, [3H]-콜레스테롤은 콜레스테롤 경과 분석 실험에 사용 되었습니다. 이 연구에서 우리 THP 1 파생 된 세포에 콜레스테롤 통풍 관 및 경과 과정을 추적 하는 세포 분석 결과에서 형광 표시-콜레스테롤 (NBD-콜레스테롤)을 사용 하 여 안전 하 고 빠른 전략을 개발 목표로 합니다. 마지막으로, 우리 최적화 및 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

콜레스테롤 경과 분석 결과의 목표는 주어진된 혈 청, 플라스마, 또는 HDL 입자를 포함 하는 상쾌한의 콜레스테롤 경과 용량 생체 외에서 결정 하는. 메서드는 표준 대 식 세포 세포 선의 문화에 셔 서 콜레스테롤을 로드 하 고 접촉을 유도 하는 세포와 FBS 무료 미디어로 희석 테스트 샘플로 이루어져 있다. 마지막으로, 미디어에 세포 lysate에 NBD에서 형광 레벨 측정 됩니다. 측정을 최적화 하려면 셀에서 미디어의 effluxed 콜레스테롤 에탄올을 포함 하는 용 매에의 한 볼륨 혼합입니다. 셀에 남아 있는 NBD 콜레스테롤은 에탄올 또는 측정 하기 전에 세제를 포함 하는 용 매로 resuspended. 마지막으로, effluxed/총 이라는 콜레스테롤의 비율에 따라 결정 됩니다. 기술을 설정 하려면, apolipoprotein B 고갈 혈 청 (ABDS) 건강 한 기증자의 수영장에서 사용 되었다.
매체와 에탄올에 NBD 콜레스테롤에 대 한 최고의 희석 조건 조사 되었다. ...

혈 청 또는 대 식 세포 세포 모델에서 플라즈마를 생체 외에서 콜레스테롤 경과 용량 측정은 동맥 경화에 대 한 biomarker로 유망한 도구입니다. 현재 연구에서 우리 최적화 및 형광 NBD 콜레스테롤 경과 방법을 표준화 하 고 96 잘 접시를 사용 하 여 높은 처리량 분석을 개발.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

이 프로토콜은 뇌혈장에서 콜레스테롤 역류의 콜레스테롤 종결을 위한 우리의 세포 기지를 둔 방법입니다. 특히 상영에서. 이것은 심장 혈관 리스크를 진단하기 위하여 적용될 수 있고, 콜레스테롤을 확인하거나 평가하기 위하여 더 낮은 유지 보수.이 기술은 유사한 품질 수준을 가진 결과를 제공함으로써 방사된 물질을 취급하는 안전성으로서의 위험과 부담을 피하고, 콜레스테롤 역류의 것과 연관된 것으로 보고되어, 허용되는 혈장 또는 뇌콜레스테롤 역류를 비교할 수 있고, 우리의 기준 대조군과 비교하여, 이러한 방법으로 고통받는 위험을 제공할 수 있다. , 다른 인간 세포주 또는 심지어 1 차적인 매크로 단계와 같이. 매크로 상 또는 인간 유도 스프레이 버튼 줄기 세포. 이 절차를 시작하려면, 2개의 마이크로몰러의 최종 농도를 가진 주식 용액을 얻기 위하여 순수 에탄올에 NPD 콜레스테롤을 녹입니다.AR 10 배지에서 NBD 콜레스테롤 재고의 25 마이크로리터를 희석하여 5개의 마이크로몰라의 최종 농도에 도달합니다. 배양 thp-1 세포는 이산화탄소 5%를 가진 섭씨 37도에서 우리의 10 배지에 있습니다. 3일마다 밀리리터당 세포 밀도를 300000세포로 조절합니다.그런 다음 평평한 투명 바닥으로 96 웰 플레이트를 얻습니다. 더 나은 균질화를 위해 15 밀리리터 튜브에 10 밀리리터의 thp-1 세포를 준비하고 200 마이크로리터의 PMA 스톡을 추가하십시오. 부드럽게 혼합하고 잘 당 200, 000 세포에서 접시 우물에 혼합물의 100 마이크로 리터를 시드.그리고 48~72시간 동안 5%의 이산화탄소로 섭씨 37도에서 배양하여 thp-1 세포를 DM thp-1 세포로 분화시한다. 먼저 멸균물로 10%PBS로 글리신을 희석하고, pH 7.4에서 200 마이크로몰라농도로 희석한다. 희석된 글리신 40밀리리터를 10그램의 페그 8000에 넣고 20%페그 용액을 준비하고, 균질화하기 위해 힘차게 섞습니다.다음으로 1.5ml 튜브에 각 혈청 또는 플라즈마 샘플에 샘플 10개 부분당 20%의 4부분을 적용합니다. 혼합물을 얼음 위에 25분 간 둡니다. 원심분리기 페그 아폴리포프로틴 B는 13,000배, 섭씨 4도에서 15분 동안 침전시켰다.침전을 버리고 상체를 새 튜브로 옮기십시오. 분화 된 thp-1 셀을 포함하는 플레이트를 검색합니다. 배양 배지를 제거하고 폐기한 다음 1X PBS로 셀을 두 번 세척합니다.AR-10 배지에 5마이크로몰러 MVD 콜레스테롤100마이크로리터를 각 웰에 추가합니다. 이산화탄소 5%와 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 폐기하고 매체를 폐기하십시오.PBS로 세포를 두 번 세척한 다음 100개의 마이크로리터 ABDS를 추가하거나, rpmi 1630 배지에서 희석된 정제지질 수용기를 각각 양호한 농도로 첨가한다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 콜레스테롤 수용자가 긍정적 인 대조군으로 포함되지 않는 부정적인 제어를 포함하고 4 ~ 6 시간 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 한편, 텍스트에 설명된 대로 셀 용해 용액의 200 밀리리터 스톡을 준비한다.이 솔루션을 일대일 체피 비율로 에탄올과 혼합하여 용액을 얻습니다. 미디어 및 BD 콜레스테롤 검출의 경우 불투명한 평평한 바닥으로 새로운 흰색 96웰 플레이트에서 수집된 플레이트에서 세포 배지를 제거합니다. 100 마이크로리터의 순수 에탄올을 각 중간 시료의 100 마이크로리터에 추가하여 새로운 플레이트에서 일대일 비율을 얻습니다.조명계를 사용하여 463 나노미터의 발산과 536 나노미터의 방출에서 형광의 강도를 측정합니다. 세포 내 NBD 콜레스테롤 검출을 위해 PBS로 세포를 두 번 씻으시면 됩니다. 각 웰에 용해 용액 100 마이크로리터를 추가하고 실온에서 25분 동안 흔들리면 배양합니다.그런 다음 소프트웨어에서 감도 매개 변수를 50으로 조정하면서 형광의 강도를 측정합니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 콜레스테롤 efflux의 최종 측정에서 콜레스테롤 efflux 비율을 결정합니다. 순수 에탄올에서 NBD 콜레스테롤을 희석하면 가장 높은 형광강도 값을 생성하고 수성 용액의 함량이 높으며 강도를 낮춥춥습니다.이것은 이 분자의 형광의 방출이 포함하는 매체에 높게 의존한다는 것을 건의합니다. 일대일 비율로 미디어와 에탄올의 혼합물을 사용하는 경우, 형광의 강도는 콜레스테롤 아날로그의 농도와 함께 비례적으로 증가하는 것으로 보이며, 이러한 조건하에서 프로브가 적절하다고 제안합니다. 콜레스테롤 수용기로 로드된 세포를 배양하는 데 필요한 시간을 결정하기 위해 세포 매체는 다른 시점에서 수확됩니다.콜레스테롤 efflux는 ABDS가 세포에 추가된 후에 6 시간 포착되는 최대 신호와 함께 0에서 6 시간까지 선형적으로 진화했습니다. 포화 임계값 및 동적 범위는 미디어를 포함하는 HDL의 다른 비율로 콜레스테롤 efflux를 측정하여 테스트됩니다. 높은 처리량 자산에서, efflux는 1에서 7%ABDS로 선형적으로 진화하여 콜레스테롤 efflux 용량의 피크에 도달하여 7% 이상의 농도에서 ABDS 백분율과의 역관계에서 플루로센트의 강도가 감소합니다.형광 계 방법의 성능은 표준 무선 표지 기술과 비교하여 평가된다. 두 기술은 ABDS의 다른 농도를 사용할 때 매우 상관 관계가 있습니다. 상기 기술된 방법은 5~15%의 콜레스테롤 효율값 내의 수용체 농도의 증가에 민감하여 셀루아라이저에 골재가 포함되어 있지 않도록 하는 것이 중요하다.임계점은 환경을 포함하는 집계 에탄올을 채점하고, 균질하고, 최적의 중량으로 형광을 측정하는 것입니다. 이 절차에 따라, 이름 기술 콜레스테롤을 측정할 수 있고, 콜레스테롤 efflux 통로에 있는 약의 효력을 결정할 수 있습니다. 또한 학교는 결국 심장 혈관 위험을 소인하는 진단으로 사용됩니다.우리는이 방법이 방사성 표준 방법보다 훨씬 쉽고 안전하다고 믿습니다. 그러나 여전히 셀에 의존적입니다. 에탄올은 인화성이며 그에 따라 저장및 처리해야 한다는 것을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

콜레스테롤 분석은 교양 세포에서 콜레스테롤 유출의 속도와 세포에서 풀려나는 콜레스테롤을 수락하기위한 플라즈마 acceptors의 용량을 quantitate하도록 설계되었습니다. 분석은 세포 내 수영장과 세포 수용체에 콜레스테롤의 릴리스 간의 콜레스테롤 콜레스테롤, 평균으로 세포를 레이블링으로 구성되어 있습니다.

콜레스테롤 유출 분석

Proteoliposomes는 잘 정의된 생화학적 환경에서 재구성된 정제된 채널과 수송체를 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 단백질에 의해 매개되는 유출을 측정하기 위한 실험적 절차가 설명됩니다. 프로테오리포좀을 준비하고, 기록을 수행하고, 데이터를 분석하여 재구성된 단백질의 기능적 특성을 정량적으로 결정하는 단계가 설명됩니다.

Proteoliposome 기반 유출 분석은 CL의 단일 분자의 속성을 확인하는<sup&gt; -</sup&gt; 채널 및 전송기

세균성 병원균과 호스트 사이의 상호 작용을 조사하는 것은 생물학적 연구의 중요한 영역입니다. 여기서는 BLAM 기판을 사용하여 siRNA의 유전자 사일런 동안 Coxiella burnetii에 의해 이펙터 전위를 측정하기 위해 필요한 기술들을 설명한다.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

여기 HDL-지질 과산화의 결정에 대 한 fluorometric 셀 무료 생화학 분석 결과 설명합니다. 이 신속 하 고 재현성 분석 결과 대규모 연구에서 HDL 함수를 확인 하는 데 사용 수 고 인간의 질병에 HDL 함수에 대 한 우리의 이해에 기여할 수 있다.

고밀도 지단백에 지질 과산화의 높은 처리량 측정을 위한 생 화 확 적인 세포-무료 Fluorometric 효소 분석 결과

이 연구의 목적은 약물 효과 콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질을 낮추는 생체 외에서 평가 했다. 지질 저하 약물의 비교 콜레스테롤 입자의 형태학 적 기능 변조에 그들의 효과에서 변화를 밝혔다.

콜레스테롤 입자의 형태를 변조에 지질 저하 약물의 차동 효과

이 프로토콜에는 라이브 셀 이미징 다양 한 셀 형식에 시스템을 사용 하 여 실시간으로 유입 속도와 LDL 콜레스테롤 흡수를 측정 하는 효율적인 접근 방식을 제공 합니다. 이 기술은 세포 형태학 및 그러므로 잠재적인 세포 독성에 대 한 모니터링 하면서 LDL 유입에 영향을 미치는 화합물의 약리 활동 화면 플랫폼을 제공 합니다.

LDL 콜레스테롤 이해 분석 결과 라이브 셀 이미징 분석 셀을 사용 하 여 상태 모니터링

여기에 제시된 것은 클릭 화학을 통해 디아실글리세릴 펩타이드와 알킨-인지질을 기질로 사용하여 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제 활성을 모니터링하기 위한 민감한 형광 분석입니다.

효소 특성화에서 고처리량 스크리닝까지 아포지단백질 N-아실트랜스퍼라제에 대한 클릭 화학 기반 형광 분석

이 프로토콜은 장쇄 및 초장쇄 포화 지방산의 BODIPY-C12 및 BODIPY-C16 형광 유사체로 자극 시 내피 세포에서 세포 지질 흡수를 측정하기 위한 시험관 내 분석을 자세히 설명합니다. 이 방법은 효율적이고 다른 세포 유형에 적응할 수 있어 지질 대사를 연구하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

형광 지방산 유사체를 이용한 내피 지방산 흡수의 정량화

본원에서, 우리는 전체 인간 혈장 또는 혈청에 존재하는 고밀도 지단백질(HDL)에 의해 지질 공여자 입자로부터 특이적으로 제거된 형광 인지질의 양을 측정하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 HDL 기능의 이 지표가 발생 심혈관 질환을 예측한다는 것을 보여주었습니다.

고밀도 지단백질 특이적 인지질 유출 분석

단백질 치료제 생산을위한 생산 세포주 개발의 높은 처리량, 자동화된 플랫폼은 설명합니다. BD FACS 아리아 세포 분류기의 구현, CloneSelect 영상기 및 TECAN 자유 에보 (Evo) 액체 처리 시스템이 향상 세포주의 품질과 높은 재현성과 세포주 개발에 크게 증가 처리 능력을 보여주었다.

단백질 치료제 제조 셀 라인의 개발을위한 높은 처리량 자동 플랫폼

배우세요 대식세포 모델에서 NBD-콜레스테롤을 이용한 고처리량 콜레스테롤 유출 분석 방법을. 이 기술은 방사성 물질 없이 심혈관 질환 위험 평가에 활용됩니다.

높은 처리량 Nitrobenzoxadiazole 표시 된 콜레스테롤 경과 분석 결과

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